DE10234905A1 - Transferring molecules of active agents in cells comprises use of pulsed acoustic waves to generate shear forces on the sample volume containing scattered bodies in vivo or in vitro - Google Patents

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Abstract

Transferring molecules of active agents in human, animal and/or vegetable cells in vivo and in vitro, comprises use of pulsed acoustic waves (5) to generate shear forces on the sample volume containing the scattered bodies (1). The sonic density of the scattered bodies differs from the sonic density of the carrier fluid (4) with the cells (2a,2b) and the agents (3) to be transferred.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transferieren von Molekülen medizinisch wirksamer Stoffe (Agenzien wie zum Beispiel DNA, Oligos, bestimmte Chemikalien etc. – in Zellen von Menschen, Tieren und/oder Pflanzen mittels durch akustische Energie erzeugten Scherkräften, und zwar in vitro wie auch in vivo.The invention relates to a Process for the transfer of molecules of medically effective substances (Agents such as DNA, oligos, certain chemicals etc. - in cells of humans, animals and / or plants by means of acoustic Energy generated shear forces, in vitro as well as in vivo.

Die Membran lebender Zellen bildet sowohl bei Einzellern in Nährlösungen wie bei Vielzellern im Gewebeverband einen natürlichen Schutz gegen das Eindringen unerwünschter Moleküle, Gene oder Viren.The membrane of living cells forms both with unicellular organisms in nutrient solutions such as natural protection against penetration in multicellular tissues undesirable molecules Genes or viruses.

Im Rahmen der Biotechnologie oder der Therapie ist es jedoch erforderlich, die Zellmembran zu überwinden und bestimmte Moleküle mit meist höherem Molekulargewicht – sogenannte Biomoleküle, Genabschnitte (Oligos) oder Gene – in das Zytoplasma der Zelle einzubringen, ohne die Lebens- und/oder die Proliferationsfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.As part of biotechnology or Therapy, however, requires that the cell membrane be overcome and certain molecules with mostly higher Molecular weight - so-called Biomolecules, gene segments (Oligos) or genes - in to introduce the cytoplasm of the cell without the life and / or the ability to proliferate of the cells.

Hierzu kommen heute physikalische Verfahren, wie zum Beispiel die Elektroporation wie auch biologische Methoden, zum Beispiel in Form von viralen Vektoren zur Anwendung. Leider haben diese Verfahren auch Nachteile vor allem in Bezug auf die Überlebensrate der zu transfizierenden Zellen.Today there are physical ones Processes such as electroporation as well as biological Methods, for example in the form of viral vectors for use. Unfortunately, these methods also have drawbacks, especially with regard to the survival rate of the cells to be transfected.

Seit einiger Zeit verspricht auch der Einsatz akustischer Energie in Form von Ultraschall oder Stosswellen Fortschritte im Hinblick auf Effektivität und Anwendungsbreite, was in zahleichen Versuchen mittels akustischer Verfahren nachgewiesen wurde.Has been promising for some time now the use of acoustic energy in the form of ultrasound or shock waves Advances in effectiveness and breadth of what has been proven in numerous experiments using acoustic methods.

Bei der akustischen Transfektion, der sogenannten Sonication, stand an erster Stelle die zuerst von Delius vertretene Hypothese, dass die Ausbildung von Kavitationsjets das eigentliche Wirkprinzip sei; durch diese Jets würden die in der Umgebung der Zelle befindlichen Moleküle, Genabschnitte, Oligonukleotide oder Gene mitgerissen und im Zytoplasma der Zellen deponiert. Dieser Mechanismus erklärt einen Teil der Effekte angesichts der Erkenntnis, dass durch Überdruck der Molekültransfer erheblich reduziert werden kann. Diese Hypothese erklärt auch die Beobachtung, dass nur ein kleiner Teil der Zellen pro Puls transfiziert wird, jedoch ein erheblicher Teil der Zellen der Zerstörung anheimfällt. Ein Vergleich der Größenverhältnisse der zu transfizierenden Zellen (5 bis 30 μm) mit denjenigen der Kavitationsereignisse (40 bis 1000 μm) erklärt diese Problematik.With acoustic transfection, the so-called Sonication, came first from Delius hypothesized that the formation of cavitation jets the actual working principle is; through these jets they would Molecules, gene segments, oligonucleotides in the vicinity of the cell or entrained genes and deposited in the cytoplasm of the cells. This Mechanism explained some of the effects given the realization that overpressure the molecular transfer can be significantly reduced. This hypothesis also explains the observation that only a small part of the cells transfected per pulse However, a significant proportion of the cells are destroyed. A comparison the proportions of the cells to be transfected (5 to 30 μm) with those of the cavitation events (40 to 1000 μm) explained this problem.

Eine zweite Hypothese sieht in der Einwirkung von Scherkräften auf die Zellen den vorwiegenden Wirkungsmechanismus für den Molekültransfer, wobei die Scherkräfte sekundär durch Kavitationsereignisse hervorgerufen werden.A second hypothesis is that Exposure to shear forces on the cells the predominant mechanism of action for the molecular transfer, whereby the shear forces secondary caused by cavitation events.

Flotierende Zellen können physikalisch als eine Hülle mit hoher Formanpassungsfähigkeit betrachtet werden, die eine Flüssigkeit umschließt, die ihrerseits durch das Zytoskelett gegenüber der Umgebung eine erhöhte Viskosität mit höheren inneren Reibungsverlusten aufweist. Das Zytoskelett ist eine Art Faserstruktur, die den Innenraum der Zelle ausfüllt und mit der Zellmembran in Verbindung steht, was einer Formveränderung der Zelle durch äußere Kräfte entgegenwirkt. Bei einer Deformation der Zelle über eine bestimmte Schwelle hinaus kann es zu kurzzeitiger Durchlässigkeit der Zellmembran kommen; bei weiterer Deformation stellen sich jedoch irreversible Schäden an den Zellen ein.Floating cells can be physically as a shell with high adaptability be considered a liquid encloses which in turn has an increased viscosity with higher internal friction losses due to the cytoskeleton compared to the environment having. The cytoskeleton is a kind of fiber structure that covers the interior fills the cell and communicates with the cell membrane, causing a change in shape counteracts the cell by external forces. If the cell deforms over A certain threshold beyond this can lead to short-term permeability the cell membrane come; with further deformation, however, arise irreversible damage on the cells.

Die Deformation einer flotierenden Zelle wird bewirkt durch Zug- oder Scherspannungen, die in Fluiden durch inhomogene Strömungen erzeugt werden können.The deformation of a floating Cell is caused by tensile or shear stresses in fluids due to inhomogeneous currents can be generated.

Es wird heute davon ausgegangen, dass eine Zelle unter Einwirkung von Scherspannungen auslösenden Strömungen ihre Form derart ändert, dass sich dadurch kurzzeitig ihre Zellmembran für den Transfer von Molekülen aus dem extrazellulären Raum öffnet. Beobachtungen an Vollblut, das bei turbulenten Strömungen mit hohen Scherkräften der Hämolyse unterliegt, legt die Wirkung von Scherkräften auf Zellen nahe. Als Schwelle für die Zerstörung von roten Blutkörperchen werden Scherspannungen von 500 dyn/cm2 angegeben. Außerdem wurde in durchströmten Blutgefäßen mit turbulenzerhöhenden Hindernissen im Epithel die Abgabe von Wirkstoffen aus den Zellen gemessen. Physiologische Scherspannungen liegen dagegen im Bereich von 2 bis 5 dyn/cm2.It is assumed today that a cell changes its shape under the influence of shear stress currents in such a way that its cell membrane opens briefly for the transfer of molecules from the extracellular space. Observations on whole blood, which is subject to hemolysis in turbulent flows with high shear forces, suggest the effect of shear forces on cells. Shear stresses of 500 dynes / cm 2 are given as the threshold for the destruction of red blood cells. In addition, the release of active substances from the cells was measured in flow-through blood vessels with turbulence-increasing obstacles in the epithelium. By contrast, physiological shear stresses are in the range from 2 to 5 dynes / cm 2 .

Der Erfindung liegt damit die Aufgabe zugrunde, zur Verbesserung des Molekültransfers in Zellen von Lebewesen unter gleichzeitiger Erhöhung der Überlebensrate der Zellen beim Transferieren in der betreffenden Nährlösung bzw. Suspensionsflüssigkeit Scherkräfte zu erzeugen, die gleichmäßig über das gesamte Probenvolumen verteilt, vorteilhaft in der Größenordnung von 5 bis 500 dyn/cm2 liegen.The invention is therefore based on the object of producing shear forces to improve the molecular transfer in cells of living organisms while simultaneously increasing the survival rate of the cells during transfer in the nutrient solution or suspension liquid in question, which is distributed uniformly over the entire sample volume, advantageously in the order of 5 up to 500 dynes / cm 2 .

Gelöst ist diese Aufgabe im wesentlichen durch das Kennzeichen des Patentanspruches 1. Die Erfindung ist damit primär darin zu sehen, dass die Scherkräfte durch Einwirkung der akustischen Wellen auf in dem gesamten Probenvolumen verteilte Streukörper erzeugt werden. Die Streukörper fungieren als akustische Hindernisse. Ihre Größenordnung entspricht in etwa derjenigen der Zellen. Ihre Schalldichte weicht jedoch von derjenigen der Nährlösung mit den darin enthaltenen Zellen und den zu transferierenden Molekülen deutlich ab. Die erfindungsgemäß zu erzeugenden Scherkräfte entstehen, sobald das Probenvolumen mit einer akustischen Welle durchschallt wird. Letztere kann in Form von gepulstem Ultraschall oder beispielsweise auch als akustische Stoßwelle eingestrahlt werden.This object is essentially achieved by the characterizing part of patent claim 1. The invention is therefore primarily to be seen in the fact that the shear forces are generated by the action of the acoustic waves on scattering bodies distributed throughout the sample volume. The scattering bodies act as acoustic obstacles. Their size corresponds approximately to that of the cells. However, their sound density differs significantly from that of the nutrient solution with the cells it contains and the molecules to be transferred. The shear forces to be generated according to the invention arise as soon as the sample volume is transmitted through an acoustic wave. The latter can be in the form of pulsed ultrasound or, for example, as acousti be shocked.

Die erfindungsgemäß möglichst gleichmäßig in der Nährlösung verteilten Streukörper erfahren infolge ihrer unterschiedlichen Schalldichte bei der Pulsbeaufschlagung durch die Schallwelle eine Eigenbewegung, die dem Durchlauf der akustischen Welle nachfolgt. Die Eigenbewegung der Streukörper gipfelt in einer Relativbewegung gegenüber ihrer Umgebung, wodurch kurzzeitig lokale Scherspannungen in Streukörpernähe erzeugt werden bzw. entstehen. Die Scherspannungen können durch die Intensität und durch das Zeitprofil der akustischen Welle, durch die Größe und Schalldichte der erfindungsgemäßen Streukörper, durch die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche der Streukörper und durch die Viskosität der Probenflüssigkeit bedarfsweise modifiziert bzw. so eingestellt werden, dass sie die jeweilige Transferaufgabe so optimal wie möglich lösen.The invention as evenly as possible in the Distributed nutrient solution diffuser experience due to their different sound density when pulsing through the sound wave an own movement, which the passage of the acoustic wave follows. The scatterers' own movement culminates relative to one another their environment, which briefly generates local shear stresses near the scattering bodies will or arise. The shear stresses can be determined by the intensity and by the time profile of the acoustic wave, by size and sound density the diffuser according to the invention the hydrophilic properties of the surface of the scattering bodies and by the viscosity the sample liquid if necessary modified or adjusted so that they the Solve each transfer task as optimally as possible.

Weitere Einzelheiten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Patentansprüchen 2 bis 9.More details under the inventive method result from the patent claims 2 to 9.

In den Abbildungen ist die Erfindung zeichnerisch anhand von Beispielen erläutert.In the figures is the invention illustrated using examples.

Es zeigen: 1a einen Großausschnitt aus einem Probengefäß mit zu transfizierenden Molekülen, Zellen und Sreukörpern.Show it: 1a a large section of a sample vessel with molecules, cells and sucker bodies to be transfected.

1b eine vergrößerte Darstellung eines Streukörpers mit seiner unmittelbaren Umgebung gemäß Ausschnitt 7 aus der 1a 1b an enlarged view of a scattering body with its immediate surroundings according to detail 7 from the 1a

2 ein Diagramm „Verformung V über der Zeit t" mit Ortskurven eines Partikels der Suspension und eines Streukörpers. 2 a diagram "Deformation V over time t" with locus of a particle of the suspension and a scattering body.

3 drei Probengefäße vergleichsweise nebeneinander mit unterschiedlichen Streukörpern. 3 three sample vessels comparatively side by side with different scatter bodies.

Gemäß 1a befinden sich in einem ausschnittweise dargestellten Probengefäß neben Zellen 2a, 2b und zu transferierenden Molekülen 3 sogenannte akustische Hindernisse in Form von Streukörpern 1. Alle Teilmengen 1 bis 3 schweben in einer Nähr- bzw. Suspensionslösung 4.According to 1a are located in a sample container shown next to cells 2a . 2 B and molecules to be transferred 3 so-called acoustic obstacles in the form of scattering bodies 1 , All subsets 1 to 3 float in a nutrient or suspension solution 4 ,

Wie weiterhin aus der 1 hervorgeht, sind die erfindungsgemäßen Streukörper 1 und die Zellen 2a, 2b größen- und zahlenmäßig in etwa gleich bemessen; erfindungsgemäß unterscheiden sie sich jedoch deutlich hinsichtlich ihrer Schalldichte, die vorteilhafterweise bei den Streukörpern 1 wesentlich größer ist als bei den Zellen 2a, 2b und der Flüssigkeit. Des weiteren ist in der 1a zeichnerisch angedeutet, dass das vorgenannte Gemisch aus den Teilmengen 1 bis 4 mit akustischen Pulsen 5, beispielsweise mit Stoßwellen beaufschlagbar ist. Die erfindungsgemäße Folge einer Pulsbeaufschlagung ist aus der 1b erkennbar, die eine starke Vergrößerung des Ausschnitts 7 aus der 1a darstellt.How continue from the 1 emerges are the scattering bodies according to the invention 1 and the cells 2a . 2 B measured in size and number approximately the same; According to the invention, however, they differ significantly in terms of their sound density, which is advantageous in the case of the scattering bodies 1 is much larger than that of the cells 2a . 2 B and the liquid. Furthermore, in the 1a indicated in the drawing that the aforementioned mixture consists of the subsets 1 to 4 with acoustic pulses 5 , for example with shock waves. The sequence of pulse application according to the invention is shown in FIG 1b recognizable that a large enlargement of the section 7 from the 1a represents.

Gemäß 1b befindet sich eine noch nicht transfizierte Zelle 2a kurz vor dem Auftreffen auf einen Streukörper 1, der durch seine schnellere Bewegung in seiner Umgebung Scherspannungen im Bereich der Stromlinien 6 erzeugt. Bei den gestrichelten Linien 6a handelt es sich um Linien gleicher Scherspannungen.According to 1b there is a cell that has not yet been transfected 2a shortly before hitting a diffuser 1 which, due to its faster movement in its environment, shear stresses in the area of the streamlines 6 generated. With the dashed lines 6a are lines of equal shear stresses.

Sobald die Zellen 2a in den Bereich der Stromlinien 6 gelangen, erfahren sie eine Deformation durch die dort vorherrschenden Scherspannungen, während der sie ihre Membran zur Aufnahme der Moleküle 3 kurzzeitig öffnen. Nach Verlassen des Stromlinienbereiches 6 nehmen die Zellen 2b im wesentlichen wieder ihre ursprüngliche Form an; in diesem Zustand befinden sich dann allerdings in ihrem Inneren die transferierten Moleküle 3.Once the cells 2a in the area of streamlines 6 arrive, they experience a deformation due to the shear stresses prevailing there, during which they use their membrane to hold the molecules 3 open briefly. After leaving the streamlined area 6 take the cells 2 B essentially returns to its original shape; in this state, however, the transferred molecules are then inside 3 ,

Die 2 zeigt in einem Diagramm „Verformung V über der Zeit t" die Ortskurve 9 eines Streukörpers 1 im Vergleich zu der Ortskurve 8 eines Partikels 3 der Suspension 4.The 2 shows in a diagram "Deformation V over time t" the locus 9 of a scatter body 1 compared to the locus 8th of a particle 3 the suspension 4 ,

Gemäß dem Probengefäß 10a in 3 sind die Streukörper 1 vorteilhafterweise kugelförmig ausgebildet, damit sie durch ihre glatte Oberfläche keine Verletzungsgefahr für die Zellen 2 darstellen.According to the sample vessel 10a in 3 are the scattering bodies 1 advantageously formed spherical, so that there is no risk of injury to the cells due to their smooth surface 2 represent.

Das Probengefäß 10b zeigt im Rahmen der Erfindung Streukörper in Form von Streunetzen 11 innerhalb der Suspensionslösung 4.The sample vessel 10b shows scattering bodies in the form of scattering nets in the context of the invention 11 within the suspension solution 4 ,

Ein weiteres Beispiel für mögliche Streukörperausbildungen zeigt das Probengefäß 10c in 3, in welchem sich Sreuwolle bzw. Streugewebe 12 als akustisches Hindernis befindet. Die charakteristischen Durchmesser 13 der Streukörper 1, 11, 12 liegen in der Größenordnung der zu transfizierenden Zellen, das heißt im Bereich von 5 bis 30 μm.The sample vessel shows another example of possible scattering body designs 10c in 3 , in which there is sewing wool or scattering fabric 12 as an acoustic obstacle. The characteristic diameter 13 the diffuser 1 . 11 . 12 are in the order of magnitude of the cells to be transfected, that is to say in the range from 5 to 30 μm.

Streukörper in Form von Netzen 11 und Geweben 12 haben den Vorteil, dass sie nach der Transfektion einfach entfernt werden können, während Streukörper in Partikelform zum Entfernen zentrifugiert oder sedimentiert werden müssen.Scattering bodies in the form of nets 11 and tissues 12 have the advantage that they can be easily removed after the transfection, while scattering particles in particle form have to be centrifuged or sedimented for removal.

11
Streukörper (akustische Hindernisse)Scattering bodies (acoustic obstacles)
2a2a
Zellen vor ihrem Transfercell before their transfer
2b2 B
Zellen nach ihrem Transfercell after their transfer
33
Zu transfizierende MoleküleTo transfecting molecules
44
Nähr- bzw. SuspensionslösungNutritional or suspension solution
55
Akustischer Puls (hier Stosswelle)audible Pulse (here shock wave)
66
Stromlinienstreamlines
77
Ausschnittvergrößerung aus Fig. 1a Cutout enlargement Fig. 1a
88th
Ortskwve eines Partikels 3 der Suspension 4Ortskwve a particle 3 of the suspension 4
99
Ortskurve des Streukörpers 1,11,12locus of the scatter body 1,11,12
10a bis 10c10a to 10c
Probengefäßesample containers
1111
Streukörper in Form von NetzenScattering body in Form of networks
1212
Streukörper in Form von Wolle bzw. GewebeScattering body in Form of wool or fabric
1313
Charakteristischer Durchmesser der Streukörpercharacteristically Diameter of the scattering bodies

Claims (9)

Verfahren zum Transferieren von Molekülen medizinisch wirksamer Stoffe (Agenzien)..., – wie zum Beispiel DNA, Oligos, bestimmte Chemikalien etc. – in Zellen von Menschen, Tieren und/oder Pflanzen mittels durch akustische Energie erzeugten Scherkräften, und zwar in vitro wie auch in vivo, dadurch gekennzeichnet, dass die Scherkräfte durch Einwirkung der akustischen Wellen auf in dem gesamten Probenvolumen verteilte Streukörper (1,11,12) erzeugt werden.Method of transferring molecules medicinally active agents (agents) ..., - such as DNA oligos, certain chemicals, etc. - in cells of humans, animals and / or plants by means of acoustic energy generated by shear forces, in vitro and in vivo, characterized characterized in that the shear forces due to the action of the acoustic waves on scattering bodies distributed throughout the sample volume ( 1 . 11 . 12 ) be generated. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Schalldichte der Streukörper (1,11,12) von der Schalldichte der Trägerflüssigkeit (4) mit den darin enthaltenen Zellen (2a,2b) und den zu transferierenden Agenzien (3) unterscheidet.A method according to claim 1, characterized in that the sound density of the scattering body ( 1 . 11 . 12 ) from the sound density of the carrier liquid ( 4 ) with the cells it contains ( 2a . 2 B ) and the agents to be transferred ( 3 ) differs. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1,11,12) aus inertem Material mit hoher Schalldichte wie zum Beispiel aus Quarz, aus Keramik und/oder aus Edelmetallen bestehen.A method according to claim 1 and 2, characterized in that the scattering bodies ( 1 . 11 . 12 ) consist of inert material with high sound density such as quartz, ceramic and / or precious metals. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das die Größe der Streukörper (1) in etwa der Größe der Zellen (2a,2b) entspricht.Method according to claims 1 to 3, characterized in that the size of the scattering bodies ( 1 ) approximately the size of the cells ( 2a . 2 B ) corresponds. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1) kugelförmig sind und in Suspension gehalten werden.Method according to claims 1 to 4, characterized in that the scattering bodies ( 1 ) are spherical and kept in suspension. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper in Form von Fasern, Netzen (11), Wolle, Fäden und/oder Gewebe (12) und dergleichen in das Probenvolumen für die Zeit des Molekültransfers eingebracht werden.Method according to claims 1 to 4, characterized in that the scattering bodies in the form of fibers, nets ( 11 ), Wool, threads and / or fabric ( 12 ) and the like can be introduced into the sample volume for the time of the molecular transfer. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Streukörper (1) pro Volumeneinheit in etwa der Zahl der zu tranferierenden Zellen (2a,2b) entspricht.Method according to one or more of claims 1 to 6, characterized in that the number of scattering bodies ( 1 ) per unit volume, roughly the number of cells to be transferred ( 2a . 2 B ) corresponds. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1,11,12) durch geeignete Vorbehandlungen hydrophil sind.Method according to one or more of claims 1 to 7, characterized in that the scattering bodies ( 1 . 11 . 12 ) are hydrophilic by suitable pretreatments. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1,11,12) durch geeignete Vorbehandlungen die zu transferierenden Moleküle (3) an sich binden.Method according to one or more of claims 1 to 8, characterized in that the scattering bodies ( 1 . 11 . 12 ) by suitable pretreatments the molecules to be transferred ( 3 ) bind to yourself.
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