DE10233958B4

DE10233958B4 - Restriction endonucleases, process for their preparation and their use

Info

Publication number: DE10233958B4
Application number: DE10233958A
Authority: DE
Inventors: Merlind Dr. Mücke; Monika Dr. Reuter; Detlev Prof. Dr. Krüger
Original assignee: Universitatsklinikum Charite Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2022-07-20
Also published as: DE10233958A1

Abstract

Restriktionsendonuclease mit einer DNA-Bindungsstelle, hergestellt aus einer Restriktionsendonuclease, die eine C- und N-terminalen Domäne und zwei DNA-Bindungsstellen besitzt, durch proteolytische Spaltung in die beiden Domänen oder durch Klonierung des für die Domänen codierenden Genabschnittes und Expression der Domänen, und Auswahl der nucleolytischen Domäne, die eine DNA-Bindungsstelle aufweist, wobei die hergestellte Restriktionsendonuclease eine höhere Aktivität aufweist und DNA schneller und effizienter schneidet als das Ausgangsmolekül und die Aminosäuresequenzen ID Nr. 1, ID Nr. 2 oder solche, die zu diesen Sequenzen zu mindestens 80 % homolog sind, enthält.restriction endonuclease with a DNA binding site prepared from a restriction endonuclease, the one C- and N-terminal domain and two DNA binding sites possesses, by proteolytic cleavage in the two domains or by cloning the for the domains coding gene section and expression of the domains, and Selection of the nucleolytic domain, having a DNA binding site, wherein the produced restriction endonuclease a higher one activity and DNA cuts faster and more efficiently than the parent molecule and the DNA amino acid sequences ID No. 1, ID No. 2 or those which belong to these sequences to at least 80% homologous, contains.

Description

Die Erfindung betrifft neue aktive Restriktionsendonucleasen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Die Anwendungsgebiete der Erfindung liegen in der Gentechnologie sowie in der funktionellen Genomanalyse.The This invention relates to novel active restriction endonucleases, methods for their manufacture and their use. The application areas The invention relates to genetic engineering as well as to functional genome analysis.

Restriktionsendonucleasen werden zur spezifischen Spaltung der DNA-Moleküle verwendet, um die DNA zu analysieren, um die entstandenen DNA-Spaltprodukte gezielt neu zu verkoppeln, um spezifische Methylierungen einzelner Nucleotide nachzuweisen und um Protein-Protein und Protein-Ligand-Wechselwirkungen zu studieren.restriction endonucleases are used to specifically cleave the DNA molecules to the DNA analyze in order to recalculate the resulting DNA cleavage products coupled to detect specific methylations of individual nucleotides and to study protein-protein and protein-ligand interactions.

Restriktionsendonucleasen bzw. Restriktionsenzyme sind Proteine zumeist bakterieller Herkunft, die die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen eines DNA-Moleküls im Bereich definierter Basensequenzen spalten. Bei solchen Restriktionen entstehen DNA-Spaltprodukte, die als DNA-Restriktionsfragmente bezeichnet werden. Erst die Verfügbarkeit von Restriktionsendonucleasen hat es ermöglicht, die DNA in vitro in definierte Fragmente oder Bestandteile zu zerlegen und so für weitere gentechnische Arbeitsmethoden, wie beispielsweise der Genkartierung oder dem Klonieren, zugänglich zu machen. Restriktionsendonucleasen gehören daher zu den wichtigsten Enzymen für gentechnische Experimente und biotechnologische Verfahren.restriction endonucleases or restriction enzymes are proteins of mostly bacterial origin, the phosphodiester bonds in both strands of a DNA molecule in the range split defined base sequences. With such restrictions arise DNA cleavage products called DNA restriction fragments become. Only the availability Restriction endonucleases have allowed the DNA to be defined in vitro Fragments or constituents and thus for further genetic engineering working methods, such as gene mapping or cloning, accessible to do. Restriction endonucleases are therefore among the most important Enzymes for genetic engineering experiments and biotechnological processes.

Restriktionsendonucleasen werden in drei Klassen, nämlich Typ I, Typ II und Typ III, eingeteilt. Typ I Restriktionsendonucleasen bestehen aus drei Untereinheiten und erkennen eine spezifische DNA-Sequenz, schneiden die DNA dann aber an einer zufälligen Position. Typ III Restriktionsendonucleasen bestehen aus zwei Untereinheiten, erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden 20–25 Nucleotide entfernt davon. Typ II Restriktionsendonucleasen schneiden als einzige die DNA an genau definierten Stellen, wobei der Schnittort zumeist innerhalb der Erkennungssequenz liegt. Die meisten heute im Labor verwendeten Restriktionsendonucleasen vom Typ II erkennen eine Sequenz von 4, 6 oder 8 Basen. Etwas seltener verwendet man in Laboren Restriktionsenzyme, die eine Sequenz von 5 Basen erkennen.restriction endonucleases be in three classes, namely Type I, Type II and Type III, divided. Type I restriction endonucleases consist of three subunits and recognize a specific DNA sequence, cut the DNA but then at a random Position. Type III restriction endonucleases consist of two subunits, recognize specific DNA sequences and cut 20-25 nucleotides away from it. Type II restriction endonucleases are the only one to cut the DNA at well-defined locations, with the cut location mostly lies within the recognition sequence. Most today in the lab Type II restriction endonucleases recognize a sequence of 4, 6 or 8 bases. A little less often in laboratories, restriction enzymes are used, which recognize a sequence of 5 bases.

Die bekannten orthodoxen Typ II Restriktionsendonucleasen erkennen spezifisch kurze palindromische DNA-Sequenzen und spalten. die DNA endonucleolytisch und spezifisch innerhalb oder nahe dieser DNA-Sequenz. Die Restriktionsendonucleasen können DNA-Moleküle so spalten, dass entweder stumpfe Enden oder 5'- bzw. 3'-überhängende, so genannte kohäsive Enden entstehen. Beispielsweise erzeugt die Restriktionendonuclease EcoRII aus Escherichia coli (daher Eco, Gen codiert vom Resistenzplasmid, R) Spaltprodukte oder DNA-Fragmente mit 5'-kohäsiven Enden und erfordert im Gegensatz zu anderen bekannten Typ II Restriktionsendonucleasen die simultane Wechselwirkung mit zwei Kopien ihrer DNA-Erkennungssequenz („Site"). Die DNA-Erkennungssequenz von EcoRII besteht aus der Nucleotidfolge 5'CCWGG. EcoRII stellt den Prototyp einer ganzen Gruppe von Typ-II-Restriktionsendonucleasen dar, die die Wechselwirkung mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz oder zwei Sites für ihre endonucleolytische Aktivität benötigen. Infolge der essentiellen Wechselwirkung mit zwei Sites ist die Spaltung der DNA durch EcoRII im Vergleich zu so genannten orthodoxen Restrionsendonucleasen langsamer bzw. findet im Falle einer geringen Häufigkeit von Erkennungssequenzen in einem DNA-Substrat gar nicht statt.The known orthodox type II restriction endonucleases recognize specifically short palindromic DNA sequences and cleavage. the DNA is endonucleolytic and specifically within or near this DNA sequence. The restriction endonucleases can DNA molecules split so that either blunt ends or 5'- or 3'-overhanging, so-called cohesive Ends arise. For example, restriction endonuclease generates EcoRII from Escherichia coli (hence Eco, gene encoded by the resistance plasmid, R) cleavage products or DNA fragments with 5'-cohesive ends and, in contrast to other known type II, requires restriction endonucleases the simultaneous interaction with two copies of their DNA recognition sequence ("site") .The DNA recognition sequence of EcoRII consists of the nucleotide sequence 5'CCWGG. EcoRII represents the prototype of a whole group of type II restriction endonucleases which interacts with two copies of their recognition sequence or two sites for their endonucleolytic activity need. As a result of the essential interaction with two sites is the split the DNA by EcoRII compared to so-called orthodox Restrionsendonucleasen slower or occurs in the case of low frequency of recognition sequences in a DNA substrate not at all.

Restriktionsendonucleasen können neben dem Schneiden von DNA-Molekülen auch für Methylierungsstudien der DNA eingesetzt werden. Der Schutz, den die Restriktionsendonucleasen Bakterien gegen eindringende fremde DNA bieten, beruht auf der Unterscheidung der bakterieneigenen DNA von fremder DNA durch deren spezifische Methylierungsmuster. Spezifisch methylierte DNA-Erkennungssequenzen können daher von vielen Restriktionsendonucleasen nicht erkannt und demzufolge nicht verdaut oder gespalten werden. Es gibt jedoch Endorestriktionsnucleasen, die eine unterschiedliche Methylierungsempfindlichkeit aufweisen, d.h., dass bestimmte Restriktionsenzyme auch methylierte DNA-Stränge erkennen und schneiden. Restriktionsendonucleasen, die die gleiche Sequenz erkennen und in unterschiedlicher Weise schneiden, werden als Isoschizomere bezeichnet; z.B. ist BstNI eine zu EcoRII isoschizomere Restriktionsendonuclease. Durch den Vergleich der von den Isoschizomeren generierten DNA-Fragmente kann aufgrund der unterschiedlichen Methylierungsempfindlichkeit bei gleicher Erkennungssequenz auf die Methylierung der ursprünglichen DNA geschlossen werden.restriction endonucleases can in addition to cutting DNA molecules also for methylation studies of DNA can be used. The protection that the restriction endonucleases Providing bacteria against invading foreign DNA is based on the distinction the bacterial DNA of foreign DNA by their specific DNA Methylation patterns. Specific methylated DNA recognition sequences can therefore not recognized by many restriction endonucleases and consequently not digested or split. However, there are endorestriction nucleases, which have a different methylation sensitivity, i. e. that certain restriction enzymes also recognize methylated DNA strands and cut. Restriction endonucleases having the same sequence recognize and cut in different ways are called isoschizomers designated; e.g. BstNI is an EcoRII isoschizomeric restriction endonuclease. By comparing the DNA fragments generated by the isoschizomers may be due to the different methylation sensitivity with the same recognition sequence on the methylation of the original DNA to be closed.

Obwohl der Restriktionsverdau der DNA mit Restriktionsendonucleasen zu den am häufigsten durchgeführten Versuchen im Bereich der Grundlagen- oder klinischen Forschung gehört, weist die Arbeit mit diesen Enzymen zahlreiche Nachteile auf. Viele Restriktionsendonucleasen spalten die DNA nicht vollständig, insbesondere solche, die mit mehreren Erkennungssequenzen auf der DNA wechselwirken müssen, um die DNA endonucleolytisch zu schneiden. Obwohl nahezu das gesamte Ausgangsmaterial – die DNA – nach einer gewissen Zeit mindestens einmal gespalten ist, liegt nur eine ungenügend hohe Anzahl von vollständig abgebauter DNA – im Sinne von an allen Orten geschnitten – Fragmenten bzw. Spaltstücken vor. Aber selbst diese unvollständige Fragmentierung nimmt noch Zeiträume von bis zu 1 – 2 Stunden in Anspruch. Die bisherigen Versuche, die unvollständige Spaltung innerhalb kurzer Zeiträume zu optimieren, beinhalten beispielsweise die Erhöhung der Salzkonzentration des Puffers, eine Erniedrigung des pH-Wertes, die Verhinderung des Einsatzes organischer Lösungsmittel oder eine niedrige Glycerinkonzentration. Diese Modifikationen des Versuchsansatzes führen jedoch zum einen dazu, dass die Spezifität der Restriktionsendonucleasen relaxiert wird und zum anderen wird der Anteil der vollständig geschnittenen Fragmente nicht erhöht. Weiterhin ist es möglich, die endonucleolytische Spaltung durch Zusatz von spezifischen Oligonucleotiden zu erhöhen. Der Zusatz solcher Oligonucleotide ist jedoch für weitere Verfahrensschritte nachteilig.Although restriction digestion of DNA with restriction endonucleases is one of the most widely used approaches in the field of basic or clinical research, work with these enzymes has many disadvantages. Many restriction endonucleases do not completely cleave the DNA, esp especially those that must interact with multiple recognition sequences on the DNA to endonucleolytically cut the DNA. Although almost all of the starting material - the DNA - is cleaved at least once after a certain time, there is only an insufficiently high number of completely degraded DNA fragments, or fragments, in the sense of cut at all sites. But even this incomplete fragmentation still takes periods of up to 1 - 2 hours to complete. Previous attempts to optimize incomplete cleavage within a short period of time include, for example, increasing the salt concentration of the buffer, lowering the pH, preventing the use of organic solvents, or low glycerol concentration. However, these modifications of the experimental approach, on the one hand, relaxes the specificity of the restriction endonucleases and, on the other hand, does not increase the proportion of fully cut fragments. Furthermore, it is possible to increase the endonucleolytic cleavage by addition of specific oligonucleotides. However, the addition of such oligonucleotides is disadvantageous for further process steps.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, effizienter und vor allem vollständig spaltende Restriktionsendonucleasen zur Verfügung zu stellen, deren Spezifität unverändert ist und die gegenüber den bekannten Restriktionsendonucleasen eine höhere Aktivität aufweisen, wobei die neuen Restriktionsendonucleasen einfach und kostengünstig herstellbar sein sollen.Of the Invention is therefore based on the object, more efficient and before everything completely to provide cleavage of restriction endonucleases whose specificity is unchanged and the opposite the known restriction endonucleases have a higher activity, wherein the new restriction endonucleases can be prepared simply and inexpensively should be.

Die Erfindung löst diese technische Aufgabe durch die Bereitstellung von Restriktionsendonucleasen mit einer DNA-Bindungsstelle, hergestellt aus einer Restriktionsendonuclease, die eine C- und N-terminale Domäne und zwei DNA-Bindungsstellen besitzt, durch proteolytische Spaltung in die beiden Domänen hergestellt werden oder durch Bestimmung der Kristallstruktur der Domänen und die Auswahl und Klonierung des für die Domäne codierenden Genabschnittes und der Expression der Domänen und der anschließenden Auswahl der nucleolytischen Domäne, die eine DNA-Bindungsstelle aufweist.The Invention solves This technical task by the provision of restriction endonucleases with a DNA binding site, prepared from a restriction endonuclease having a C and a C N-terminal domain and has two DNA binding sites, by proteolytic cleavage in the two domains or by determining the crystal structure of the domains and the selection and cloning of the domain coding gene portion and the expression of the domains and the subsequent one Selection of the nucleolytic domain, which has a DNA binding site.

Restriktionsendonucleasen, die aus zwei Domänen bestehen, einer C- und einer N-terminalen Domäne, und die dadurch zwei DNA-Bindungstaschen oder DNA-Bindungsstellen aufweisen, können in ihre Domänen aufgetrennt werden. So führt z.B. die Behandlung der Restriktionsendonucleasen mit Proteasen dazu, dass eine ursprüngliche – insbesondere Typ II-Restriktionsendonuclease – in ihre beiden Domänen proteolytisch gespalten wird, wodurch die N- bzw. C-terminale Domäne getrennt voneinander vorliegen. Durch dem Fachmann bekannte Verfahren ist es dann möglich, die endonucleolytische Domäne, d.h., die Domäne, die in der Lage ist, DNA endonucleolytisch bzw. enzymatisch zu spalten, auszuwählen. Diese endonucleolytische Domäne besitzt im Gegensatz zu ursprünglich eingesetzten Restriktionsendonucleasen nicht mehr zwei DNA-Bindungstaschen, sondern nur noch eine DNA-Bindungstasche oder DNA-Bindungssequenz. Es ist beispielsweise möglich, die Restriktionsendonuclease EcoRII durch eine Protease wie Trypsin in die N- und die C-terminale Domäne zu spalten und die endonucleolytische Domäne, vorliegend die C-terminale Domäne, auszuwählen. Da diese endonucleolytische C-terminale Domäne nur noch eine DNA-Bindungstasche oder DNA-Bindungsstelle aufweist, braucht sie im Gegensatz zum vollständigen Enzym EcoRII, welches DNA nur bei der Wechselwirkung mit zwei Erkennungsorten auf der DNA schneiden kann, nur noch einen Erkennungsort, um DNA zu spalten. Demgemäß bindet und schneidet die erfindungsgemäße Restriktionsendonuclease die zu fragmentierende DNA schneller und effizienter.restriction endonucleases, the two domains exist, a C- and an N-terminal domain, and thereby two DNA binding pockets or DNA binding sites can be separated into their domains become. So leads e.g. the treatment of restriction endonucleases with proteases to that an original - in particular Type II restriction endonuclease - proteolytic in its two domains is cleaved, whereby the N- or C-terminal domain is separated present each other. By methods known to those skilled in the art it then possible the endonucleolytic domain, that is, the domain, which is able to cleave DNA endonucleolytically or enzymatically, select. This endonucleolytic domain owns unlike originally used restriction endonucleases no longer two DNA binding pockets, but only a DNA binding pocket or DNA binding sequence. For example, it is possible the restriction endonuclease EcoRII by a protease such as trypsin to cleave into the N- and the C-terminal domain and the endonucleolytic Domain, in the present case, the C-terminal domain to select. There this endonucleolytic C-terminal domain only one DNA binding pocket or DNA binding site, it needs in contrast to the complete enzyme EcoRII, which DNA only when interacting with two recognition sites on the DNA can cut, only one place of recognition to DNA to split. Accordingly binds and the restriction endonuclease of the invention cuts the DNA to be fragmented faster and more efficiently.

Von einigen Restriktionsendonucleasen sind Strukturmodelle, insbesondere Kristallstrukturen bekannt. Beispielsweise liegen für die Restriktionsendonuclease NaeI mehrere Strukturmodelle vor. Der Fachmann kann aufgrund dieser vorliegenden Modelle gut bestimmen, welche Größe die einzelnen Domänen haben. Beispielsweise ist bei NaeI aufgrund der bekannten Kristallstrukturen erkennbar, welche Aminosäuresequenzen die N-terminale und die C-terminale Domäne bilden. Entsprechend dem Fachmann bekannter Verfahren kann er daraufhin die Genabschnitte auswählen, die für die entsprechenden Domänen codieren, sie dann klonieren, exprimieren und folgend die nucleolytische Domäne, die eine DNA-Bindungsstelle aufweist, auswählen. Der vorliegend verwendete Begriff Expression soll die Transkription und/oder Codierung der Sequenz einer Domäne beschreiben. Bei der Expression wird zuerst eine DNA-Kette, die die Sequenz einer Domäne codiert, in eine komplementäre RNA transkribiert, bei der es sich häufig um eine mRNA handelt; dann wird die so transkribierte mRNA in die vorstehend erwähnte Domäne translatiert. Die Expression umfasst auch die Transkription einer DNA, die in Bezug auf ihre Regulationselemente in antisense-Richtung insertiert worden ist. Eine Expression, die konstitutiv verläuft und möglicherweise durch ein von außen kontrolliertes Promoterfragment weiter gesteigert werden kann, umfasst auch die Bildung mehrerer RNA-Kopien und die Herstellung großer Mengen der ausgewählten Domänen, d.h., sie umfasst auch die Überproduktion der Domänen.From Some restriction endonucleases are structural models, in particular Crystal structures known. For example, are for the restriction endonuclease NaeI present several structural models. The expert can because of this present models well determine the size of each domain. For example, NaeI is due to the known crystal structures recognizable, which amino acid sequences form the N-terminal and the C-terminal domain. According to that He then knows the gene sections choose, the for the corresponding domains then clone, express, and subsequently nucleolytic Domain, which has a DNA binding site. The presently used Term expression is intended to be the transcription and / or coding of the Sequence of a domain describe. When expressed first a DNA chain, the the sequence of a domain coded, in a complementary RNA transcribed, which is often an mRNA; then the thus transcribed mRNA is translated into the aforementioned domain. Expression also includes the transcription of a DNA that is present in Inserted with respect to their regulatory elements in antisense direction has been. An expression that is constitutive and possibly through an outside Controlled promoter fragment can be further increased includes also the formation of multiple RNA copies and the production of large quantities the selected one domains that is, it also includes overproduction of the domains.

Dem Fachmann ist hierbei bekannt, dass die Domänen über eine Hinge-loop-Region miteinander verbunden sein können. Diese Region ist für die räumliche Anordnung der Domänen mitverantwortlich. In welchem Bereich des Hinge-loops der Fachmann die Domänen trennt, ist nicht von entscheidender Bedeutung. wichtig ist, dass eine vollständige Domäne erhalten werden muss, inwieweit an dieser vollständigen Domäne ein kürzerer oder längerer Bereich der Hinge-loop-Region vorhanden ist, ist weniger bedeutsam. Die Herstellung der Domänen erfolgt also insbesondere durch Bestimmung der Kristallstruktur, Auswahl eines Genabschnittes, der für eine Domäne codiert, der Klonierung und der Expression der Domäne. Die Aufreinigung der so gewonnenen Domänen erfolgt nach bekannten proteinchemischen, beispielsweise chromatographischen, Verfahren.the It is known in the art that the domains are linked via a hinge-loop region can be connected to each other. This region is for the spatial Arrangement of the domains partly responsible. In which area of the Hinge-loops the specialist the domains separates is not crucial. it's important, that a complete domain to what extent this domain has a shorter or longer range the hinge-loop region is present is less significant. The production of the domains takes place ie in particular by determination of the crystal structure, selection of a gene section, which for a domain coded, the cloning and the expression of the domain. The Purification of the domains thus obtained is carried out according to known protein chemical, for example, chromatographic, method.

Beispielsweise ist es möglich, dass die beiden Domänen säulenchromatographisch, wie z.B. durch Gelfiltration, gewonnen werden oder durch eine präparative Gelelektrophorese bzw. durch Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauscher, isoelektrische Fokussierung, Chromatofokussierung, durch die Trennung mit Hilfe von Hydroxylapatit, durch Lektinchromatographie, Ligandenchromatographie oder durch andere, dem Fachmann bekannte Methoden. Die getrennten Domänen können während dieser Isolierung und Gewinnung beispielsweise fraktioniert bzw. aliquotiert werden. Durch Testung einzelner Fraktionen oder Aliquots auf ihre endonucleolytische oder nucleolytische Aktivität kann die Fraktion gezielt ausgewählt werden, die die nucleolytische Domäne beinhaltet. Erstmals wird durch die Erfindung beschrieben, dass durch das Fragmentieren oder Trunkieren einer Restriktionsendonuclease mit zwei Bindungssequenzen eine neue, effektiv spaltende Restriktionsendonuclease generiert wird. Die neue Restriktionsendonuclease ist mit Vorteil in der Lage, insbesondere kohäsive Enden zu generieren, die vorteilhaft für die Ligation oder das Binden von spezifischen Sequenzen sind.For example Is it possible, that the two domains column, such as. be obtained by gel filtration, or by a preparative Gel electrophoresis or by ammonium sulfate precipitation, ion exchanger, isoelectric Focusing, chromatofocusing, by separation with the help of Hydroxyapatite, by lectin chromatography, ligand chromatography or by other methods known to those skilled in the art. The separated domains can while This isolation and extraction, for example, fractionated or be aliquoted. By testing individual fractions or aliquots on their endonucleolytic or nucleolytic activity, the Group selected which includes the nucleolytic domain. For the first time described by the invention that by fragmenting or Trunkieren a restriction endonuclease with two binding sequences a new, effectively cleaving restriction endonuclease is generated. The new restriction endonuclease is capable of advantage, in particular cohesive Generate ends that are beneficial for ligation or binding of specific sequences.

Diese Restriktionsendonucleasen stellen in einer bevorzugten Ausführungsform Typ II Restriktionsendonucleasen dar. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen hergestellt aus EcoRII, NaeI, Alw26I, BbvI, BsrI, EarI, NarI, BspMI, HpaII, SacII, Eco57I, AtuBI, Cfr9I, SauBMKI, Ksp632I, HphI, MboII, SfaNI oder Tth111I und ganz besonders bevorzugt aus EcoRII. Mit Vorteil schneiden diese Restriktionsendonucleasen die Sequenz, die sie auch erkennen, d.h., das Fragmentieren, Schneiden oder Spalten der DNA erfolgt nicht außerhalb der Sequenz, die von der Restriktionsendonuclease erkannt wird.These Restriction endonucleases provide in a preferred embodiment Type II restriction endonucleases. In a particularly preferred embodiment The invention relates to the restriction endonucleases according to the invention prepared from EcoRII, NaeI, Alw26I, BbvI, BsrI, EarI, NarI, BspMI, HpaII, SacII, Eco57I, AtuBI, Cfr9I, SauBMKI, Ksp632I, HphI, MboII, SfaNI or Tth111I and most preferably from EcoRII. With Advantageously, these restriction endonucleases cut the sequence that they also recognize, i.e., fragment, cut or split the DNA is not outside the sequence recognized by the restriction endonuclease.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Restriktionsendonuclease mit einer Bindungsstelle, die Aminosäuresequenz SLQQAPVNHKYILPEDWHLRFPSGSEIIQYAASHYVKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIFLL VEELHVLDIIRKGFGSVDEFIALANSVSNRRKSRAGKSLELHLEHLFIEHGLRHFATQA ITEGNKKPDFLFPSAGAYHDTEFPVENLRMLAVKTTCKDRWRQILNEADKIHQVHLFTL QEGVSLAQYREMRESGVRLVVPSSLHKKYPEAVRAELMTLGAFIAELTGLYADIP oder eine Aminosäuresequenz, die zu dieser zu mindestens 80 %, vorzugsweise zu mindestens 90 %, homolog ist. Der Begriff der Aminosäuresequenz bezieht sich auf den Teil der Aminosäuresequenz, der von einem Genabschnitt codiert wird, wobei die Regulationssequenzen, die die Initation oder Termination der Transkription steuern, ausgeschlossen werden. Die Aminosäuresequenz bzw. die zu dieser zu mindestens 80 %, vorzugsweise zu mindestens 90 % homologe Aminosäuresequenz betrifft die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz, ebenso wie beliebige Modifikationen, Mutanten oder Derivate jedes der Bestandteile dieser Aminosäuren. Die Aminosäuremodifikationen können beispielsweise Inversionen, Deletionen, Insertionen, Substitutionen, Anlagerungen, Denaturierungen oder Oxidationen umfassen. Diese Homologie kann beispielsweise durch den „Smith-Waterman"-Homologiesuche-Algorithmus, beispielsweise mit dem „MPSRCH"-Programm (Oxford Molecular), bestimmt werden, wobei eine affinity gap search (affine Lückensuche) mit den folgenden Parametern verwendet wird gap open penalty 12, gap extension penalty 1.In a further preferred embodiment of the invention comprises the restriction endonuclease with a binding site, the amino acid sequence SLQQAPVNHKYILPEDWHLRFPSGSEIIQYAASHYVKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIFLL VEELHVLDIIRKGFGSVDEFIALANSVSNRRKSRAGKSLELHLEHLFIEHGLRHFATQA ITEGNKKPDFLFPSAGAYHDTEFPVENLRMLAVKTTCKDRWRQILNEADKIHQVHLFTLQEGVSLAQYREMRESGVRLVVPSSLHKKYPEAVRAELMTLGAFIAELTGLYADIP or an amino acid sequence, to this at least 80%, preferably at least 90 %, is homologous. The term amino acid sequence refers to the part of the amino acid sequence, which is encoded by a gene segment, the regulatory sequences, which exclude the initiation or termination of transcription. The amino acid sequence or to this at least 80%, preferably at least 90% homologous amino acid sequence concerns the course occurring amino acid sequence, as well as any modifications, mutants or derivatives each the components of these amino acids. The amino acid modifications can for example, inversions, deletions, insertions, substitutions, Include deposits, denaturations or oxidations. This homology can be determined, for example, by the "Smith Waterman" homology search algorithm, For example, with the "MPSRCH" program (Oxford Molecular), with an affinity gap search (affine Gap Detection) with the following parameters is used gap open penalty 12, gap extension penalty 1.

Dem Fachmann ist aus der Strukturanalyse, beispielsweise der Röntgenkristallstrukturanalyse bekannt, dass die Domänen in Restriktionsendonucleasen durch unterschiedlich lange Verbindungssequenzen – die Hinge-loop-Region – verbunden sind, die im Wesentlichen die Funktion erfüllen, eine gewisse räumliche Anordnung der Domänen zueinander zu bestimmen. Der Fachmann kann die Aminosäuresequenz oder den Genabschnitt, der die N- bzw. C-terminale Domäne codiert, so auswählen, dass nur die Domäne bzw. die Domäne mit unterschiedlich langen Bestandteilen der Hinge-loop-Region erhalten wird. Die Domäne im Sinne der Erfindung kann daher die eigentliche Domäne sein bzw. die Domäne mit einem Teil des Hinge-loop bzw. der gesamten Hinge-loop-Region. Dem Fachmann ist daher bekannt, dass die Aminosäuresequenz der Restriktionsendonuclease ca. ± 6 weitere Aminosäuren umfassen kann. Weiterhin ist es selbstverständlich möglich, dass an die Aminosäuresequenz His₆-tag Sequenzen oder ähnliche angefügt werden, die der Proteinreinigung dienen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Restriktionsendonuclease die Aminosäuresequenz MTELPLQFAEPDDDLERVRATLYSLDPDGDRTAGVLRDTLDQLYDGQRTGRWNFDQLHK TEKTHMGTLVEINLHREFQFGDGFETDYEIAGVQVDCKFSMSQGAWMLPPESIGHICLV IWASDQQCAWTAGLVKVIPQFLGTANRDLKRRLTPEGRAQVVKLW oder einer Aminosäuresequenz, die zu dieser mindestens 80 % homolog ist, vorzugsweise zu mindestens 90 %. Diese Aminosäuresequenz kann ebenfalls, wie vorstehend ausgeführt, weitere Aminosäuren der Hinge-loop-Region umfassen.It is known to the person skilled in the art from structural analysis, for example X-ray crystal structure analysis, that the domains in restriction endonucleases are linked by linkage sequences of different lengths, the hinge-loop region, which essentially fulfill the function of determining a certain spatial arrangement of the domains relative to each other. The person skilled in the art can select the amino acid sequence or the gene segment which encodes the N- or C-terminal domain in such a way that only the domain or the domain with different lengths of the hinge-loop region is obtained. The domain in the sense of the invention can therefore be the actual domain or the domain with a part of the hinge-loop or the entire hinge-loop region. It is therefore known to the person skilled in the art that the amino acid sequence of the restriction endonuclease can comprise about ± 6 further amino acids. Furthermore, it is of course possible that His ₆ -tag sequences or the like are added to the amino acid sequence, which serve the protein purification. In a further preferred embodiment of the invention, the restriction endonuclease comprises the amino acid sequence MTELPLQFAEPDDDLERVRATLYSLDPDGDRTAGVLRDTLDQLYDGQRTGRWNF DQLHK TEKTHMGTLVEINLHREFQFGDGFETDYEIAGVQVDCKFSMSQGAWMLPPESIGHICLV IWASDQQCAWTAGLVKVIPQFLGTANRDLKRRLTPEGRAQVVKLW or an amino acid sequence which is at least 80% homologous to it, preferably at least 90%. This amino acid sequence can also comprise other amino acids of the hinge loop region, as stated above.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Restriktionsendonucleasen mit einer DNA-Bindungsstelle, wobei aus einer Restriktionsendonuclease mit zwei DNA-Bindungsstellen und zwei Domänen die N- und C-terminale Domäne proteolytisch voneinander getrennt werden, die endonucleolytische Domäne gewonnen und so die neue aktive Restriktionsendonuclease erhalten wird. Das Verfahren zur Herstellung der aktiven neuen Restriktionsendonucleasen besteht also darin, dass eine Restriktionsnuclease, vorzugsweise vom Typ II, besonders bevorzugt vom Typ IIe bzw. Typ IIs, die zwei DNA-Bindungstaschen oder DNA-Bindungsstellen und zwei Domänen aufweisen, proteolytisch in die N- und in die C-terminale Domäne getrennt werden. Diese proteolytische Trennung kann beispielsweise durch Proteasen erfolgen. Dem Fachmann sind verschiedene geeignete Proteasen bekannt. Proteasen im Sinne der Erfindung sind alle Enzyme, welche die proteolytische Spaltung der Peptidbindung in den Restriktionsendonucleasen mit zwei Bindungsstellen katalysieren. Bei den Proteasen kann es sich beispielsweise um saure, neutrale oder alkalische Proteasen handeln. Insbesondere können Endopeptidasen zur Spaltung der zwei Domänen eingesetzt werden. Insbesondere können Serin-Endopeptidasen, Cystein-, Asparginsäure- und/oder Metallo-Endopeptidasen eingesetzt werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, Proteasen einzusetzen, deren katalytischer Mechanismus bisher unbekannt ist, es handelt sich hierbei z.B. um Enzyme, die bisher in der Enzym-Gruppe EC 3.4.99 klassifiziert werden. Nach der Trennung der beiden Domänen wird die endonucleolytische Domäne gewonnen, und so die neue Restriktionsendonuclease erhalten. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten bekannt, die nucleolytische Domäne zu gewinnen, beispielsweise durch säulenchromatographische Isolierung.The The invention also relates to a process for the preparation of restriction endonucleases with a DNA binding site derived from a restriction endonuclease with two DNA binding sites and two domains the N- and C-terminal domain are separated proteolytically from each other, the endonucleolytic domain recovered and thus the new active restriction endonuclease is obtained. The Process for the preparation of active new restriction endonucleases Thus, it is that a restriction nuclease, preferably Type II, more preferably Type IIe or Type IIs, the two DNA binding pockets or DNA binding sites and two domains have proteolytically separated into the N- and into the C-terminal domain become. This proteolytic separation can for example by Proteases take place. The person skilled in the art is aware of various suitable proteases known. Proteases within the meaning of the invention are all enzymes which the proteolytic cleavage of the peptide bond in the restriction endonucleases catalyze with two binding sites. It can be with the proteases For example, acidic, neutral or alkaline proteases act. In particular, you can Endopeptidases are used to cleave the two domains. Especially can Serine endopeptidases, cysteine, aspartic acid and / or metallo-endopeptidases be used. Of course it is also possible Use proteases whose catalytic mechanism so far unknown is, it is e.g. to enzymes that were previously in the enzyme group EC 3.4.99. After the separation of the two domains will be the endonucleolytic domain to obtain the new restriction endonuclease. the Specialists are different possibilities known, the nucleolytic domain to win, for example, by column chromatography isolation.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die Restriktionsendonucleasen mit zwei Bindungsstellen und zwei Domänen mit einer Protease gespalten, vorzugsweise mit Trypsin oder Chymotrypsin. Die Proteasen können durch den Fachmann vorteilhafterweise so ausgewählt werden, dass sie in der Lage sind, die Restriktionsendonucleasen in funktionelle Domänen so zu spalten, dass die C- oder N-terminale endonucleolytische Domäne mit einer Bindungsstelle erhalten wird. Trypsin beispielsweise spaltet bevorzugt an Arginin und Lysin. Chymotrypsin ist eine Protease, die bevorzugt auf der Carboxyseite der aromatischen Aminosäuren, wie Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin sowie des Methionins spaltet. Neben den bevorzugten Proteasen Chymotrypsin und Trypsin können insbesondere die Proteasen V8, Elastase, Thermitase, Papain, Pepsin, Mycolysin und andere eingesetzt werden.In a further advantageous embodiment of the invention the restriction endonucleases with two binding sites and two domains cleaved with a protease, preferably with trypsin or chymotrypsin. The proteases can be selected by the skilled person advantageously so that they are in the Thus, the restriction endonucleases are capable of functional domains cleave the C- or N-terminal endonucleolytic domain with a Binding site is obtained. For example, trypsin cleaves preferentially on arginine and lysine. Chymotrypsin is a protease that is preferred on the carboxy side of the aromatic amino acids, such as tyrosine, tryptophan and phenylalanine as well as the methionine cleaves. In addition to the preferred Proteases Chymotrypsin and trypsin can in particular the proteases V8, elastase, thermitase, papain, pepsin, mycolysin and others are used become.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Restriktionsendonucleasen mit zwei DNA-Bindungsstellen oder DNA-Bindungstaschen EcoRII, NaeI, Alw26I, BbvI, BsrI, EarI, NarI, BspM, HpaII, SacII, Eco57I, AtuBI, Cfr9I, SauBMKI, Ksp632I, HphI, MboII, SfaNI oder Tth111I eingesetzt. Diese Restriktionsendonucleasen sind vorzugsweise Typ II, insbesondere Typ IIe und Typ IIs Restriktionsendonucleasen.In a further preferred embodiment The invention are as restriction endonucleases with two DNA binding sites or DNA binding pockets EcoRII, NaeI, Alw26I, BbvI, BsrI, EarI, NarI, BspM, HpaII, SacII, Eco57I, AtuBI, Cfr9I, SauBMKI, Ksp632I, HphI, MboII, SfaNI or Tth111I used. These restriction endonucleases are preferably type II, in particular type IIe and type IIs restriction endonucleases.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur gentechnischen Herstellung einer Restriktionsendonuclease mit einer DNA-Bindungsstelle oder DNA-Bindungstasche, wobei ein für die nucleolytische C- oder N-terminale Domäne codierender Genabschnitt kloniert, exprimiert und das gewonnene Genprodukt gereinigt und so die Restriktionsendonuclease mit einer DNA-Bindungsstelle erhalten wird. Bei dem Verfahren zur gentechnischen Herstellung der Restriktionsendonucleasen wird durch dem Fachmann bekannte Methoden der Genabschnitt kloniert, der für die endonucleolytische C- oder N-terminale Domäne codiert. Es ist beispielsweise möglich, dass der Fachmann zunächst eine proteolytische Spaltung der Restriktionsendonuclease vornimmt, und so, wie oben beschrieben, die nucleolytische Domäne gewinnt. Er kann jedoch nach der proteolytischen Spaltung die nucleolytische Domäne sequenzieren und aufgrund dieser Informationen den entsprechenden codierenden Genabschnitt für die weitere gentechnische Herstellung der nucleolytische Domäne auswählen. Es ist jedoch auch möglich, dass der Fachmann aufgrund von Strukturanalysen die nucleolytische C- oder N-terminale Domäne auswählt und so den die nucleolytische Domäne codierenden Genabschnitt für die gentechnische Herstellung auswählt. Der Genabschnitt kann hierbei so ausgewählt werden, dass er einen Teil der Hinge-loop-Region teilweise, vollständig oder nicht mit umfasst. Nachdem der Fachmann den für die nucleolytische C- oder N-terminale Domäne codierenden Genausschnitt ausgewählt hat, wird dieser kloniert. Nach der Isolierung und anschließenden Vermehrung des spezifischen DNA-Genabschnitts wird über eine Polymerase-Kettenreaktion oder über die bekannten Methoden, in denen der DNA-Genabschnitt mit einem Vektor verknüpft und in einem Wirtsorganismus oder einer Zelle vermehrt wird, die nucleolytische Domäne erhalten.The The invention also relates to a process for the genetic engineering a restriction endonuclease having a DNA binding site or DNA binding pocket, with a for the gene portion encoding the nucleolytic C- or N-terminal domain cloned, expressed and the recovered gene product purified and so obtained the restriction endonuclease with a DNA binding site becomes. In the process for the genetic engineering of the restriction endonucleases is cloned by methods known to those skilled in the gene section, the for encodes the endonucleolytic C or N-terminal domain. For example, it is possible that the expert first performs a proteolytic cleavage of the restriction endonuclease, and as described above, the nucleolytic domain is recovered. He can, however after proteolytic cleavage sequence the nucleolytic domain and based on this information the corresponding coding Gene section for select the further genetic engineering of the nucleolytic domain. It but it is also possible that the expert on the basis of structural analysis, the nucleolytic C- or N-terminal domain selects and so the nucleolytic domain encoding gene section for the selecting genetic engineering. The gene segment can be selected to be a part the hinge-loop region is partially, completely or not included. After the specialist for the nucleotide C- or N-terminal domain coding gene excerpt selected has, this is cloned. After isolation and subsequent propagation of the specific DNA gene segment is via a polymerase chain reaction or over the known methods in which the DNA gene section with a Vector linked and is propagated in a host organism or cell which nucleolytic domain receive.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird der für die Aminosäuresequenz
SLQQAPVNHKYILPEDWHLRFPSGSEIIQYAASHYVKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIFLL VEELHVLDIIRKGFGSVDEFIALANSVSNRRKSRAGKSLELHLEHLFIEHGLRHFATQA ITEGNKKPDFLFPSAGAYHDTEFPVENLRMLAVKTTCKDRWRQILNEADKIHQVHLFTL QEGVSLAQYREMRESGVRLVVPSSLHKKYPEAVRAELMTLGAFIAELTGLYADIP
oder
MTELPLQFAEPDDDLERVRATLYSLDPDGDRTAGVLRDTLDQLYDGQRTGRWNFDQLHK TEKTHMGTLVEINLHREFQFGDGFETDYEIAGVQVDCKFSMSQGAWMLPPESIGHICLV IWASDQQCAWTAGLVKVIPQFLGTANRDLKRRLTPEGRAQVVKLW codierende Genabschnitt verwendet. Der Begriff Genabschnitt bedeutet in diesem Zusammenhang eine die N- bzw. C-terminale Domäne codierende DNA-Sequenz und Regulationselemente, die die Expression dieser DNA-Sequenz kontrollieren. Der Begriff codierende Sequenz bezieht sich hierbei auf den Teil des Gens, der eine C- bzw. N-terminale Domäne bzw. die N-terminale Domäne und einen Teil der Hinge-loop-Region codiert, wobei die Regulationssequenzen, die die Initiation oder Termination der Transkription steuern, ausgeschlossen werden. Die codierende Sequenz oder das Regulationselement kann eines sein, das normalerweise in der Zelle vorhanden ist, die so genannten autologen Elemente, oder es kann eines sein, das normalerweise nicht in der Zelle lokalisiert ist, es handelt sich hierbei um heterologe Elemente. Nachdem die ausgewählten Genabschnitte, die die nucleolytischen Domänen codieren, kloniert wurden, können sie entweder zellfrei in Liposomen, bzw. in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden. Exprimiert heißt hierbei, dass die Transkription und/oder Codierung der Sequenz des Genproduktes erfolgt; d.h., bei der Expression wird zuerst eine DNA-Kette, die die Sequenz der nucleolytischen Domäne codiert, in eine komplementäre RNA transkribiert und dann wird die so transkribierte mRNA in das vorstehend erwähnte Genprodukt, – die nucleolytische Domäne – translatiert. Die gewonnene nucleolytische Domäne kann mit bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.In another particular embodiment, that for the amino acid sequence
SLQQAPVNHKYILPEDWHLRFPSGSEIIQYAASHYVKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIFLL VEELHVLDIIRKGFGSVDEFIALANSVSNRRKSRAGKSLELHLEHLFIEHGLRHFATQA ITEGNKKPDFLFPSAGAYHDTEFPVENLRMLAVKTTCKDRWRQILNEADKIHQVHLFTL QEGVSLAQYREMRESGVRLVVPSSLHKKYPEAVRAELMTLGAFIAELTGLYADIP
or
MTELPLQFAEPDDDLERVRATLYSLDPDGDRTAGVLRDTLDQLYDGQRTGRWNFDQLHK TEKTHMGTLVEINLHREFQFGDGFETDYEIAGVQVDCKFSMSQGAWMLPPESIGHICLV IWASDQQCAWTAGLVKVIPQFLGTANRDLKRRLTPEGRAQVVKLW coding gene section used. The term gene segment in this context means a DNA sequence coding for the N- or C-terminal domain and regulatory elements which control the expression of this DNA sequence. The term coding sequence here refers to that part of the gene which encodes a C- or N-terminal domain and / or the N-terminal domain and a part of the hinge-loop region, wherein the regulatory sequences which are the initiation or termination control the transcription, be excluded. The coding sequence or regulatory element may be one normally present in the cell, the so-called autologous elements, or it may be one that is not normally located in the cell; these are heterologous elements. After the selected gene segments encoding the nucleolytic domains have been cloned, they can either be expressed cell-free in liposomes or in a suitable host cell. Expressed here means that the transcription and / or coding of the sequence of the gene product takes place; ie, upon expression, first a DNA chain encoding the sequence of the nucleolytic domain is transcribed into a complementary RNA, and then the mRNA so transcribed is translated into the aforementioned gene product, the nucleolytic domain. The recovered nucleolytic domain can be isolated and purified by known methods.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteine oder Domänen als Restriktionsendonucleasen. Die gewonnenen Domänen, Proteinfragmente oder Peptide können mit Vorteil als Enzyme zur Spaltung von DNA verwendet werden. Mit Hilfe der gewonnenen Proteine gelingt es, DNA ohne die bekannten Nachteile zu spalten, da die Proteine nicht die essentielle Wechselwirkung mit zwei Erkennungssequenzen benötigen. Die Proteine weisen selbst nur noch eine DNA-Bindungstasche oder Bindungsstelle auf, so dass die Interaktion mit einer Erkennungssequenz vorteilhafterweise hinreichend ist. Da es für die endonucleolytische Wirkung der gewonnenen Proteine ausreichend ist, wenn die eine Bindungssequenz mit dem Substrat, d.h., mit der DNA, interagiert, spaltet das gewonnene Protein die DNA schneller und vollständiger als die bekannten Enzyme. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Aminosäuresequenzen ID Nr. 1, ID Nr. 2 oder Aminosäuresequenzen, die mit diesen zu mindestens 80 homolog sind, vorzugsweise zu mindestens 90 %, als Restriktionsendonuclease verwendet.The The invention also relates to the use of the method according to the invention produced proteins or domains as restriction endonucleases. The won domains, protein fragments or peptides can be used with advantage as enzymes for the cleavage of DNA. With Help of the obtained proteins succeeds DNA without the well-known Disadvantages to split, because the proteins are not the essential interaction with two recognition sequences. The proteins themselves have only one DNA binding pocket or Binding site on, allowing interaction with a recognition sequence is advantageously sufficient. As for the endonucleolytic effect the recovered proteins is sufficient if the one binding sequence interacts with the substrate, i.e., with the DNA, cleaves the recovered one Protein the DNA faster and more complete than the known enzymes. In a preferred embodiment become the amino acid sequences ID No. 1, ID No. 2 or amino acid sequences, which are at least 80 homologous with these, preferably at least 90%, used as restriction endonuclease.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen oder die genannten Domänen zur Spaltung von DNA-Molekülen oder von Oligonucleotidduplexen, zum Nachweis von DNA-Methylierungen, zur Genomanalyse und zur Herstellung von Basenpaarüberhängen und zur Neuverkopplung von DNA- Molekülen verwendet. DNA-Moleküle bzw. Oligonucleotidduplexe können mit den erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen mit Vorteil schnell und effektiv gespalten werden. Damit liegt die Verwendung der neuen Restriktionsendonucleasen in der Spaltung von DNA-Molekülen und Oligonucleotidduplexen mit höherer Effizienz als durch die bekannten Restriktionsendonucleasen, wobei insbesondere das Problem der Abhängigkeit des Schneidens der DNA vom Vorliegen zweier Erkennungssequenzen bzw. Erkennungssites beseitigt ist. Eine weitere Verwendung liegt in der effektiven Bestimmung der DNA-Methylierung durch vergleichenden Verdau mit isoschizomeren Restriktionsendonucleasen. Die ursprüngliche methylierungssensitive Restriktionsendonuclease mit zwei Bindungsstellen wird durch die Verwendung der nucleolytischen Domäne in ihrer Wirkung optimiert. Beispielsweise erfolgt der Nachweis der natürlichen DNA-Methylierung 5-Methylcytosin in der zweiten Position der Sequenz 5'-CCWGG durch vergleichende Spaltung mit EcoRII und dem gegenüber dieser Methylierung nicht sensitiven Isoschizomer BstNI (aus Bacillus stearothermophilus N). Dabei wird EcoRII durch die vorstehend genannte Methylierung am Schneiden der DNA gehindert, während BstNI – unabhängig vom Vorliegen von 5-Methylcytosin – die DNA nach der zweiten Position schneidet. Diese Methylierungsbestimmung wurde bisher durch die eingeschränkte Aktivität von EcoRII kompromittiert, da man bei Resistenz der entsprechenden DNA nicht mit abschließender Sicherheit sagen konnte, ob diese aufgrund der Methylierung oder aufgrund des seltenen Vorliegens der Erkennungssequenz in der DNA oder der eingeschränkten Aktivität von EcoRII nicht gespalten wurde. Diese Fehlerquellen können durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen ausgeschlossen werden, so dass ein sicherer Methylierungsnachweis durch den Einsatz der nucleolytischen Domäne möglich ist. Ähnlich wie die Methylierungsbestimmung wird auch die Genomanalyse durch die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen verbessert, z.B. wird die Typisierung des Hepatitis-C-Virusgenoms durch Untersuchung des Restriktionslängenpolymorphismus (RFLP) mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen durchgeführt. Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Restriktionsendonuclease wird dieses Typisierungsverfahren verbessert, da die Fehlerquelle, die sich aus der eingeschränkten Aktivität der Restriktionsendonuclease mit zwei DNA-Bindungstaschen, z.B. bei EcoRII ergibt, ausgeschaltet ist. Außerdem stellen die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen, die z.B. aus EcoRII gewonnen werden, die bisher einzigen aktiven Restriktionsendonucleasen dar, die bei 37 °C die DNA-Sequenz 5'-CCWGG mit 5 Basenpaaren (bp) 5'-Überhang effizient spalten und dabei einzelne Sites für die endonucleolytische DNA-Spaltung akzeptieren. Der hohe CG-Anteil der kohäsiv geschnittenen Enden ist vorteilhaft für die Ligation, insbesondere da die spezifische Sequenz zu so genannten „sticky" Enden führt. Die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen können des Weiteren bei der Spaltung von DNA-Molekülen und zur Analyse der DNA sowie zu ihrer Neuverkopplung (Klonierungen), insbesondere zur effektiven Neuverkopplung von DNA-Molekülen durch Herstellung besonders kohäsiver Enden verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen finden ferner Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von DNA-Molekülen oder -Genomen über definierte Restriktionsspaltmuster. Unter solchen Restriktionsspaltmustern wird eine genau definierte Anzahl von DNA-Fragmenten definierter Größe verstanden, die durch die Behandlung einer bestimmten DNA mit einer Restriktionsendonuclease entstehen. Diese Restriktionsspaltmuster werden durch Gel-Elektrophorese sichtbar gemacht.In a particularly preferred embodiment, the restriction endonucleases or the domains according to the invention are used for the cleavage of DNA molecules or oligonucleotide duplexes, for the detection of DNA methylations, for genome analysis and for the production of base pair overhangs and for the Neuverkopplung of DNA molecules. DNA molecules or oligonucleotide duplexes can advantageously be cleaved rapidly and effectively with the restriction endonucleases according to the invention. Thus, the use of the new restriction endonucleases is in the cleavage of DNA molecules and oligonucleotide duplexes with higher efficiency than by the known restriction endonucleases, in particular eliminating the problem of the dependence of DNA cleavage on the presence of two recognition sites. Another use is in the effective determination of DNA methylation by comparative digestion with isoschizomeric restriction endonucleases. The original methylation-sensitive restriction endonuclease with two binding sites is optimized by the use of the nucleolytic domain in their effect. For example, the detection of the natural DNA methylation 5-methylcytosine in the second position of the sequence 5'-CCWGG is carried out by comparative cleavage with EcoRII and with respect to this methylation not sensitive isoschizomer BstNI (from Bacillus stearothermophilus N). In this case, EcoRII is prevented by the abovementioned methylation from cutting the DNA, while BstNI - regardless of the presence of 5-methylcytosine - cuts the DNA to the second position. This methylation assay has so far been compromised by the limited activity of EcoRII, as resistance of the corresponding DNA could not be conclusively told whether it was not cleaved due to methylation or due to the rare presence of the recognition sequence in the DNA or the restricted activity of EcoRII , These sources of error can be excluded by the use of the restriction endonucleases according to the invention, so that a reliable methylation detection by the use of the nucleolytic domain is possible. Similar to the methylation determination, the genome analysis is improved by the restriction endonucleases according to the invention, eg the typing of the hepatitis C virus genome is carried out by examination of the restriction length polymorphism (RFLP) with various restriction endonucleases. The use of the restriction endonuclease according to the invention improves this typing method, since the source of error which results from the restricted activity of the restriction endonuclease with two DNA binding pockets, for example in the case of EcoRII, is eliminated. In addition, the restriction endonucleases according to the invention, which are obtained for example from EcoRII, represent the only active restriction endonucleases which efficiently cleave the DNA sequence 5'-CCWGG with 5 base pairs (bp) 5'-overhang at 37 ° C and thereby individual sites for accept the endonucleolytic DNA cleavage. The high CG content of the cohesively cut ends is advantageous for ligation, especially since the specific sequence results in so-called "sticky" ends The restriction endonucleases according to the invention can furthermore be used in the cleavage of DNA molecules and for analysis of the DNA as well as its The restriction endonucleases of the invention are also used for the identification and characterization of DNA molecules or genomes via defined restriction cleavage patterns By DNA fragments of defined size, resulting from the treatment of a particular DNA with a restriction endonuclease, these restriction cleavage patterns are visualized by gel electrophoresis.

Die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen weisen mehrere Vorteile auf. Da sie im Gegensatz zu den Restriktionsendonucleasen, aus denen sie gewonnen werden, nicht zwei, sondern nur eine DNA-Bindungssequenz, -stelle oder -tasche aufweisen, die mit der DNA wechselwirkt, schneiden die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen die DNA sehr effektiv und vollständig innerhalb kürzester Zeit, wobei die Spezifität der erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen gegenüber der Restriktionsendonuclease mit zwei Bindungssequenzen unverändert ist. Die neuen Restriktionsendonucleasen leiten sich beispielsweise von Wildtyp-Restriktionsendonucleasen ab und stellen insbesondere die verkürzte, trunkierte Form dieser dar. Dadurch, dass die neuen Restriktionsendonucleasen nur eine C- bzw. N-terminale Domäne umfassen, die eine DNA-Bindungssequenz aufweist, sind sie einfach und kostengünstig herstellbar. Es ist daher mit bekannten Verfahren und Methoden leicht möglich, die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen durch gentechnische Verfahren bzw. durch Proteolyse zu gewinnen. Die gentechnischen Verfahren können hierbei so beschaffen sein, dass entweder zellfreie Systeme, wie beispielsweise die PCR oder zellumfassende Systeme, wie beispielsweise die Transfektion von Säuger- oder Insektenzellen eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen können vorteilhafterweise in verschiedensten Bereichen der Grundlagen- und klinischen Forschung verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen in ihrer Wirkung nicht mehr dadurch kompromittiert werden, dass sie mit zwei Erkennungssequenzen wechselwirken müssen, um DNA zu spalten, schneiden sie effektiver, weil bereits die Wechselwirkung mit einer einzigen Erkennungssequenz auf dem DNA-Molekül ausreicht. Daher kann die erfindungsgemäße Restriktionsendonuclease für zahlreiche Versuche, wie beispielsweise den Methylierungsnachweis, das Studium der Protein-Protein- und Protein-Ligand-Wechselwirkung eingesetzt werden.The Restriction endonucleases according to the invention have several advantages. Since, in contrast to the restriction endonucleases, from which they are won, not two, but only one DNA binding sequence, have a site or pocket that interacts with the DNA cut the restriction endonucleases according to the invention the DNA is very effective and complete within the shortest possible time Time, being the specificity the restriction endonucleases according to the invention across from the restriction endonuclease with two binding sequences is unchanged. The new restriction endonucleases are derived, for example, from Wildtype restriction endonucleases, and in particular the shortened, truncated form of this dar. In that the new restriction endonucleases only one C- or N-terminal domain which have a DNA binding sequence, they are simple and cost-effective produced. It is therefore easy with known methods and methods possible, the restriction endonucleases according to the invention to win by genetic engineering or by proteolysis. The genetic engineering methods can be such that either cell-free systems, such as For example, the PCR or cell-comprehensive systems, such as the transfection of mammalian or insect cells be used. The restriction endonucleases according to the invention can advantageously in various areas of the basic and clinical research. As the restriction endonucleases according to the invention in their effect no longer be compromised by that they must interact with two recognition sequences to cleave DNA, cut It's more effective because it already interacts with a single one Detection sequence on the DNA molecule is sufficient. Therefore, the Restriction endonuclease according to the invention for many Experiments, such as the methylation detection, the study used the protein-protein and protein-ligand interaction become.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Produkte gelingt es, die bekannten Nachteile – Verlangsamung bis Ausbleiben der Spaltung der DNA infolge der essentiellen Wechselwirkung mit zwei Sites – zu überwinden. Das trunkierte EcoRII-Protein beispielsweise spaltet überraschenderweise DNA-Substrate unabhängig von der Häufigkeit der Sites im DNA-Substrat, und zwar mit einer Aktivität, die dem ursprünglichen, kompletten EcoRII weitaus überlegen ist und der Aktivität orthodoxer Restriktionsendonucleasen entspricht. Erfindungswesentlich und hier erstmals beschrieben ist die Erkenntnis, dass das Trunkieren einer Restriktionsendonuclease eine neue, aktivere Restriktionsendonuclease generiert.With Help of the products according to the invention manages the known disadvantages - slowing down to failure the cleavage of DNA due to the essential interaction with two sites - overcome. The truncated EcoRII protein for example, surprisingly cleaves DNA substrates independent of the frequency the sites in the DNA substrate, with an activity the original, far superior to complete EcoRII is and the activity orthodox restriction endonucleases. essential to the invention and described here for the first time is the realization that truncation a restriction endonuclease a new, more active restriction endonuclease generated.

Die Erfindung besteht auch in einer Kombination aus bekannten Elementen- Restriktionsendonucleasen, Nachweis der natürlichen DNA-Methylierung – und neuen Elementen – trunkierten, aktiveren Restriktionsendonucleasen, sicherer Methylierungsnachweis z.B. durch den Einsatz von der trunkierten Form von EcoRII – was dazu führt, dass DNA-Substrate unabhängig von der Häufigkeit der Sites im DNA-Substrat effizient gespalten werden.The Invention also consists in a combination of known elements Restriction endonucleases, detection of natural DNA methylation - and new ones Elements - truncated, more active restriction endonucleases, secure methylation detection e.g. through the use of the truncated form of EcoRII - what about leads, that DNA substrates independently from the frequency of sites in the DNA substrate be split efficiently.

Die erfindungsgemäße Verwendung der neuen trunkierten Restriktionsendonucleasen liegt mit Vorteil in ihrem Einsatz in der Gentechnologie, in der Genomanalyse (u.a. Charakterisierung von Genen über den Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) und/oder in der molekularbiologischen Analyse von DNA (u.a. Charakterisierung von DNA-Molekülen durch Restriktionskarten), insbesondere wenn Restriktionsendonucleasen benötigt werden, die nicht von der Wechselwirkung mit zwei DNA Sites abhängen und damit auch einzelne Sites effektiv und spezifisch spalten.The use according to the invention the new truncated restriction endonucleases is advantageous in their use in genetic engineering, in genome analysis (including characterization from genes over the restriction fragment length polymorphism) and / or in the molecular biological analysis of DNA (including characterization of DNA molecules by restriction maps), especially when restriction endonucleases needed which do not depend on the interaction with two DNA sites and so that even individual sites effectively and specifically split.

Die trunkierten Restriktionsendonucleasen können auch zum Nachweis von Sequenzen eingesetzt werden, die entsprechende DNA-Bindungsstellen oder Schnittstellen für die Restriktionsendonucleasen umfassen. Ausgewählte Genome von Krankheitserregern können solche DNA-Bindungsstellen bzw. Schnittstellen aufweisen. So umfassen beispielsweise bestimmte Typen oder Subtypen eines Hepatitis C Virus die Sequenz CCWGG, wobei W A oder T sein kann. Diese Virus-Typen können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Restriktionsendonucleasen von den Typen unterschieden werden, die diese Sequenz nicht aufweisen. Durch Detektion der Sequenzen oder der Spaltstücke des Virusgenenoms nach Behandlung mit der Restriktionsendonuclease, die beispielsweise von EcoRII abgeleitet sein kann, ist mittels Elektrophorese feststellbar, ob eine Spaltung stattgefunden hat oder nicht, wodurch Rückschlüsse auf die Anwesenheit der genannten Sequenz und somit auf bestimmte Typen oder Subtypen des Virus bzw. Krankheitserregers möglich sind.The truncated restriction endonucleases can also be used to detect sequences that convert appropriate DNA binding sites or restriction endonuclease sites believe it. Selected genomes of pathogens may have such DNA binding sites or interfaces. For example, certain types or subtypes of a hepatitis C virus include the sequence CCWGG, where WA or T may be. These virus types can be distinguished by the restriction endonucleases according to the invention from the types which do not have this sequence. By detection of the sequences or cleavage fragments of the viral genome after treatment with the restriction endonuclease, which may be derived from EcoRII, for example, it can be determined by electrophoresis whether cleavage has taken place or not, thus indicating the presence of said sequence and thus certain types or Subtypes of the virus or pathogen are possible.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.The Invention is based on embodiments described in more detail without being limited to these examples.

Ausführungsbeispieleembodiments

Herstellung/Gewinnung trunkierten Formen von RestriktionsendonucleasenProduction / recovery truncated forms of restriction endonucleases

Die Gewinnung der erfindungsgemäßen trunkierten Restriktionsendonucleasen erfolgt z.B. in der Weise, dass die jeweiligen Genabschnitte einer Wildtyp-Restriktionsendonuclease mittels PCR (Polymerase Kettenreaktion) amplifiziert, danach in einem Expressionsvektor kloniert, in eine passende Zelle transformiert und die jeweiligen exprimierten trunkierten Proteine der Restriktionsendonuclease auf gereinigt werden. Alternativ kann das Wildtyp-Protein durch Proteolyse passend verkürzt und auf gereinigt werden.The Obtaining the truncated invention Restriction endonucleases are e.g. in the way that the respective ones Gene sections of a wild-type restriction endonuclease by PCR (Polymerase chain reaction) amplified, then in an expression vector cloned, transformed into a suitable cell and the respective ones expressed truncated restriction endonuclease proteins getting cleaned. Alternatively, the wild-type protein can be suitably shortened by proteolysis and to be cleaned up.

So wird der Abschnitt der Restriktionsendonuclease EcoRII, der für die Aminosäuren 173-404 codiert, in den Vektor pQE-30 kloniert (Plasmid-DNA, QIAexpress vector 30, der unter anderem den N-terminalen His₆-tag codiert – 6 × Aminosäurerest Histidin, Referenz: Firma QIAGEN, Heidelberg, Deutschland, Product Guide 2001, S. 56–59, www.qiagen.com). Dann werden Escherichia coli-Zellen mit diesem DNA-Konstrukt transformiert. Das exprimierte Protein EcoRII-trunc oder EcoRII-C wird gereinigt und biochemisch charakterisiert.Thus, the portion of the restriction endonuclease EcoRII encoding amino acids 173-404 is cloned into the vector pQE-30 (plasmid DNA, QIAexpress vector 30, encoding, inter alia, the N-terminal His ₆ -tag - 6x amino acid residue histidine , Reference: Company QIAGEN, Heidelberg, Germany, Product Guide 2001, pp. 56-59, www.qiagen.com). Then Escherichia coli cells are transformed with this DNA construct. The expressed protein EcoRII-trunc or EcoRII-C is purified and characterized biochemically.

Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung trunkierter Restriktionsendonucleasen bestehen darin, dass z.B.

– das verkürzte Gen der Restriktionsendonuclease EcoRII, nämlich die Aminosäuren 173-404 von EcoRII, kloniert, exprimiert und das Genprodukt EcoRII-trunc gereinigt wird oder
– die natürliche Restriktionsendonuclease EcoRII mittels Chymotrypsin gezielt proteolytisch fragmentiert und das Fragment – bestehend aus den Aminosäuren 173-404 von EcoRII, nämlich EcoRII-trunc – auf gereinigt wird.

The inventive method for obtaining truncated restriction endonucleases are that, for example

- The truncated gene of the restriction endonuclease EcoRII, namely the amino acids 173-404 of EcoRII, cloned, expressed and the gene product EcoRII-trunc is purified or
- The natural restriction endonuclease EcoRII fragmented by chymotrypsin proteolytically targeted and the fragment - consisting of the amino acids 173-404 of EcoRII, namely EcoRII-trunc - is purified.

Bei den erfindungsgemäßen trunkierten Derivaten von Typ II Restriktionsendonucleasen handelt es sich also um verkürzte Abschnitte (Fragmente) der Restriktionsendonucleasen; beispielsweise bei dem trunkierten EcoRII-Protein (EcoRII-trunc) um jenen Teil der natürlichen EcoRII-Polypeptidkette, der durch Abspaltung eines Teils des Proteins entsteht. Im Detail:at the truncated invention Derivatives of type II restriction endonucleases are therefore shortened Sections (fragments) of the restriction endonucleases; for example in the truncated EcoRII protein (EcoRII-trunc) around that part of the natural RII-polypeptide chain which results from cleavage of a part of the protein. In detail:

Beispiel 1: Klonierung und Expression verkürzter Gene entsprechender RestriktionsendonucleasenExample 1: Cloning and expression shortened Genes corresponding restriction endonucleases

Der Abschnitt des Gens der Restriktionsendonuclease EcoRII, der für die Aminosäuren 173-404 kodiert, wurde mittels PCR amplifiziert. Das PCR-Template war das vom pQE-30 Expressionsvektor (Firma QIAGEN, Product Guide 2001, S. 56-59, www.qiagen.com) abstammende Plasmid pQE-RII (Reuter et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 8294-8300). Die PCR wurde mit der Vent-Polymerase (New England Biolabs, www.neb.com) in Gegenwart von 10 % Glycerin durchgeführt. Für das N-terminal verkürzte Protein EcoRII-trunc wurden die PCR-Primer 5'CGCGGATCCT CTCTACAGCA AGCGCCAGTA AATCATAAA und 5'GTACCTATGG AATATCTGCG TAAAGCCCTG T verwendet. Der pQE-30 Vektor wurde nacheinander mit den Restriktionsendonucleasen SmaI und BamHI gespalten und mittels alkalischer Phosphatase (Roche) dephosphoryliert. Das 703 by lange PCR-Produkt wurde ebenfalls mit BamHI gespalten, mit T4 Polynucleotidkinase (New England Biolabs) und ATP phosphoryliert und mit Hilfe von T4 DNA Ligase (New England Biolabs) in den zuvor geöffneten Vektor pQE-30 ligiert. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde durch Sequenzierung mit dem Thermosequenase Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences) überprüft und dann in Calciumdichloridkompetenten Escherichia coli JM109 (pDK1r^–m⁺)-Zellen transformiert. Die Aminosäurepositionen beziehen sich auf die EcoRII-Sequenz AJ224995, die mit Met³ von EcoRII beginnt. Der Vektor pQE-30 kodiert auch für den N-terminalen His₆-Schwanz beider Mutanten (Aminosäuresequenz: MRGSHHHHHHGS). Das mit einem N-terminalen His₆-tag exprimierte Protein EcoRII-trunc wurde per Affinitätschromatographie über eine Ni-NTA-Säule (Ni-NTA, Nickel-Nitrilotrieessigsäure, Firma QIAGEN, www.qiagen.com) gereinigt (Reuter et al. J. Biol. Chem. (1998), 273, 8294–8300). Anschließend wurde das Protein per Ionenaustauschchromatographie über eine Heparinagarosesäule (HiTrap Heparin affinity columns der Firma Amersham Biosciences, Puffer A: 20 mmol/l K₂HPO₄ pH7,6; 2 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Puffer B: 20 mmol/l K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH7,6; 2 mmol/l EDTA, 1 mol/l NaCl; Gradient linear 0–100 % Puffer B in Puffer A in 10 Säulenvolumina) gereinigt. EcoRII-trunc wurde in 50 % Glycerin; 200 mmol/l NaCl; 20 mmol/l Tris-HCl; pH7,6; 1 mmol/l EDTA; 1 mmol/l β-Mercaptoethanol bei –20°C gelagert.The portion of the restriction endonuclease EcoRII gene encoding amino acids 173-404 was amplified by PCR. The PCR template was the plasmid pQE-RII derived from the pQE-30 expression vector (QIAGEN, Product Guide 2001, pp. 56-59, www.qiagen.com) (Reuter et al (1998) J. Biol. Chem. 273, 8294-8300). PCR was performed with Vent polymerase (New England Biolabs, www.neb.com) in the presence of 10% glycerol. For the N-terminal truncated protein EcoRII-trunc, the PCR primers 5'CGCGGATCCT CTCTACAGCA AGCGCCAGTA AATCATAAA and 5'GTACCTATGG AATATCTGCG TAAAGCCCTG T were used. The pQE-30 vector was sequentially cleaved with the restriction endonucleases SmaI and BamHI and dephosphorylated by alkaline phosphatase (Roche). The 703 bp PCR product was also cleaved with BamHI, phosphorylated with T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs) and ATP and ligated into the previously opened vector pQE-30 using T4 DNA ligase (New England Biolabs). The obtained recombinant plasmid was verified by sequencing with the Thermosequenase Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences) and then in Calciumdichloridkompetenten Escherichia coli JM109 ^- transformed cells (pDK1r m ^+). The amino acid positions refer to the EcoRII sequence AJ224995, which starts with Met ³ of EcoRII. The vector pQE-30 encodes also for the N-terminal His ₆ tail of both mutants (amino acid sequence: MRGSHHHHHGS). The protein EcoRII-trunc expressed with an N-terminal His ₆ -tag was purified by affinity chromatography over a Ni-NTA column (Ni-NTA, nickel-nitrilotriacetic acid, QIAGEN, www.qiagen.com) (Reuter et al Biol. Chem. (1998), 273, 8294-8300). The protein was subsequently purified by ion exchange chromatography over a heparin agarose column (HiTrap Heparin affinity columns from Amersham Biosciences, buffer A: 20 mmol / l K ₂ HPO ₄ pH 7.6, 2 mmol / l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), buffer B: 20 mmol / l K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ , pH 7.6, 2 mmol / l EDTA, 1 mol / l NaCl, gradient linear 0-100% buffer B in buffer A in 10 column volumes). EcoRII-trunc was 50% glycerol; 200 mmol / l NaCl; 20 mmol / l Tris-HCl; pH 7.6; 1 mmol / l EDTA; 1 mmol / l β-mercaptoethanol stored at -20 ° C.

Beispiel 2: Limitierte Proteolyse natürlicher Restriktionsendonuclease-ProteineExample 2: Limited Proteolysis of natural Restriction endonuclease proteins

Der proteolytische Abbau vom 400 μg EcoRII (4,3 nmol Dimer) durch Chymotrypsin wurde bei einem Massenverhältnis m_EcoRII/m_Chymotripsin von 80/1 in 10 mmol/l Tris-HCL, pH 8,5 in einem Reaktionsvolumen vom 200 μl bei 25°C durchgeführt. Nach 4 h wurde die Proteolysereaktion durch Zugabe von Proteaseninhibitor PMSF gestoppt. Nach der limitierten Proteolyse wurde das trunkierte Protein (EcoRII-trunc) mittels Anionenaustauschchromatographie über eine Heparinagorasesäule (HiTrap Heparin affinity columns, Firma Amersham Bioscience, Durchführungsbestimmungen wie in Beispiel 1) gereinigt. Die Lagerung des Proteins erfolgte wie in Beispiel 1.The proteolytic degradation of 400 μg EcoRII (4.3 nmol dimer) by chymotrypsin was at a mass ratio m _EcoRII / m _chymotripsin of 80/1 in 10 mmol / l Tris-HCl, pH 8.5 in a reaction _volume of 200 μl at 25 ° C performed. After 4 hours, the proteolysis reaction was stopped by the addition of protease inhibitor PMSF. After limited proteolysis, the truncated protein (EcoRII-trunc) was purified by anion exchange chromatography over a column of heparin agarase (HiTrap Heparin affinity columns, Amersham Bioscience, procedures as in Example 1). The storage of the protein was carried out as in Example 1.

Figurencharacters

1 zeigt, dass EcoRII-trunc nicht-methylierte DNA des Plasmids pBR322 mit einer weitaus höheren Geschwindigkeit und höheren Effizienz als das natürliche EcoRII spaltet. Das Spaltmuster zeigt, dass alle 5'CCWGC Sites im DNA-Molekül durch EcoRII-trunc sequenzspezifisch geschnitten werden; das Spaltmuster entspricht dem durch die Restriktionsendonuclease BstNI generierten Kontrolle. 1 shows that EcoRII-trunc cleaves non-methylated DNA of plasmid pBR322 at a much higher rate and efficiency than the natural EcoRII. The cleavage pattern shows that all 5'CCWGC sites in the DNA molecule are cut sequence specific by EcoRII-trunc; the cleavage pattern corresponds to the control generated by the restriction endonuclease BstNI.

2 stellt klar, dass die genomische DNA des Bakteriophagen T3, die wegen der niedrigen Häufigkeit des Auftretens von EcoRII Sites durch das Wildtyp EcoRII nicht gespalten werden kann, durch EcoRII-trunc spezifisch fragmentiert wird. 2 clarifies that the genomic DNA of bacteriophage T3, which can not be cleaved by the wild type EcoRII due to the low abundance of EcoRII sites, is specifically fragmented by EcoRII-trunc.

3 schließlich beweist, dass EcoRII-trunc genau wie das Wildtyp EcoRII durch Methylierung des zweiten Cytosins in der Erkennungssequenz (Site) an der DNA-Spaltung gehindert wird. Im Gegensatz zur unmethylierten DNA (pBR322 dcm^–) wird die EcoRII-spezifisch methylierte DNA (pBR322 dcm⁺) durch beide Enzyme nicht gespalten. Weiterhin ist nochmals gezeigt, dass die DNA-Sequenzspezifität von EcoRII-trunc und EcoRII-Wildtyp identisch ist und dass die Aktivität beider Enzyme von der Gegenwart von Mg²⁺-Ionen abhängt. 3 Finally, it proves that EcoRII-trunc, like the wild type EcoRII, is prevented from DNA cleavage by methylation of the second cytosine in the recognition site. In contrast to unmethylated DNA (pBR322 dcm ^- ), the EcoRII-specific methylated DNA (pBR322 dcm ⁺ ) is not cleaved by both enzymes. Furthermore, it is shown again that the DNA sequence specificity of EcoRII-trunc and EcoRII wild-type is identical and that the activity of both enzymes is dependent on the presence of Mg ²⁺ ions.

Legenden zu den FigurenLegends too the figures

1: 1 :

Kinetik der endonucleolytischen Hydrolyse linearisierter, nichtmethylierter DNA des Plasmids pBR322 (Dcm^–) durch Wildtyp-EcoRII und EcoRII-trunc (hier: EcoRII^173-404). Dargestellt ist die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Moleküle und -Fragmente. Oben im Bild: Reaktionszeiten; BstNI: positive Kontrolle für das Spaltmuster durch Spaltung mit der isoschizomeren Restriktionsendonuclease BstNI; M: Molekulargewichtsmarker.Kinetics of the endonucleolytic hydrolysis of linearized, unmethylated DNA of the plasmid pBR322 (Dcm ^- ) by wild-type EcoRII and EcoRII-trunc (here: EcoRII ^173-404 ). Shown is the electrophoretic separation of the DNA molecules and fragments. At the top of the picture: reaction times; BstNI: positive control for the cleavage pattern by cleavage with the isoschizomeric restriction endonuclease BstNI; M: molecular weight marker.

2: 2 :

Spaltung der DNA des Bakteriophagen T3 mit EcoRII-trunc (hier: EcoRII^173-404) und Wildtyp-EcoRII. Oben: eingesetzte Enzymmengen; linke Bahn: T3 DNA ohne Restriktionsendonuclease; BstNI: positive Kontrolle des Spaltmusters; rechte Bahn: Molekulargewichtsmarker.Cleavage of the bacteriophage T3 DNA with EcoRII-trunc (here: EcoRII ^173-404 ) and wild-type EcoRII. Above: used amounts of enzyme; left lane: T3 DNA without restriction endonuclease; BstNI: positive control of the slit pattern; right track: molecular weight markers.

3: 3 :

Vergleich der sequenzspezifischen Erkennung der methylierten Erkennungssequenz durch Spaltung methylierter pBR322-DNA durch EcoRII-trunc und Wildtyp-EcoRII. Von links: M, Molekulargewichtsmarker; Negativkontrolle (NK), pBR322 dcm^–, dann aufeinanderfolgend, pBR322 dcm^– DNA gespalten mit: EcoRII-trunc und Mg²⁺; EcoRII-Wildtyp und Mg²⁺; EcoRII-trunc ohne Mg²⁺; EcoRII-Wildtyp ohne Mg²⁺; NK, pBR322 dcm⁺ DNA (Negativkontrolle); pBR322 dcm⁺ DNA inkubiert mit Mg²⁺ und EcoRII-trunc bzw. EcoRII-Wildtyp; BstNI; Spaltung mit der isoschizomeren Restriktionsendonuclease BstNI (Positivkontrolle).Comparison of the sequence-specific recognition of the methylated recognition sequence by cleavage of methylated pBR322 DNA by EcoRII-trunc and wild-type EcoRII. From left: M, molecular weight marker; Negative control (NK), pBR322 dcm ^- , then sequentially, pBR322 dcm ^- DNA digested with: EcoRII-trunc and Mg ²⁺ ; EcoRII wild-type and Mg ²⁺ ; EcoRII-trunc without Mg ²⁺ ; EcoRII wild type without Mg ²⁺ ; NK, pBR322 dcm ⁺ DNA (negative control); pBR322 dcm ⁺ DNA incubated with Mg ²⁺ and EcoRII-trunc and EcoRII wild-type, respectively; BstNI; Cleavage with the isoschizomeric restriction endonuclease BstNI (positive control).

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENCE LISTING

Claims

Restriction endonuclease with a DNA binding site, prepared from a restriction endonuclease having a C and a C N-terminal domain and two DNA binding sites possesses, by proteolytic cleavage in the two domains or by cloning the for the domains coding gene section and expression of the domains, and Selection of the nucleolytic domain, having a DNA binding site, wherein the produced restriction endonuclease a higher one activity and DNA cuts faster and more efficiently than the parent molecule and the DNA amino acid sequences ID No. 1, ID No. 2 or those which belong to these sequences to at least 80% homologous, contains.

A restriction endonuclease according to claim 1, comprising Amino acid sequences, at least 90% homologous to the sequences ID No. 1 or ID No. 2 are.

Process for the preparation of a restriction endonuclease with a DNA binding site according to claim 1, characterized in that from a restriction endonuclease with two DNA binding sites and two domains the N- and C-terminal domain be separated proteolytically, the nucleolytic domain recovered and so does the restriction endonuclease with a DNA binding site is obtained.

Process for the preparation according to claim 3, characterized characterized in that the proteolytic separation with a protease takes place, preferably with trypsin or chymotrypsin.

Process for the genetic engineering of a restriction endonuclease with a DNA binding site according to claim 1, characterized in that that one for the nucleolytic C or N-terminal domain of a restriction endonuclease with two DNA binding sites and two domains coding gene section cloned and expressed and so the restriction endonuclease obtained with a DNA binding site.

Use of the domains according to one of claims 1 to 5 as restriction endonucleases.

Use of the domain according to claim 6 for cleavage of DNA molecules or oligonucleotide duplexes, for detecting DNA methylations, for genome analysis, for the preparation of base pair overhangs and for the recombination of DNA molecules.