DE10228133A1 - Method for detecting and removing endotoxins, useful for treating e.g. recombinantly produced pharmaceuticals or nucleic acid, by incubation with phage tail protein - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Abreicherung von Endotoxinen aus einer Probe.The present invention relates to a method for the detection and depletion of endotoxins a sample.
Endotoxin (ET) bezeichnet eine Familie von Lipopolysacchariden, die zusammen mit Proteinen und Phospholipiden die äußere Zellwand Gram-negativer Bakterien bilden. Endotoxine kommen ausschließlich in dieser Bakteriengruppe vor und spielen eine wichtige Rolle in der Organisation, Stabilität und Barrierefunktion der äußeren Membran. Zahlreiche Bakteriophagen nutzen Endotoxin bzw. allgemein Lipopolysaccharid zur spezifischen Erkennung ihrer Wirtsbakterien.Endotoxin (ET) means a family of lipopolysaccharides, along with proteins and phospholipids the outer cell wall Form gram-negative bacteria. Endotoxins only come in this Bacterial group and play an important role in the organization, stability and barrier function of the outer membrane. Numerous bacteriophages use endotoxin or lipopolysaccharide in general for the specific detection of their host bacteria.
Alle Endotoxinvarianten bestehen aus einem Heteropolysaccharid, das kovalent an Lipid A, gebunden ist (Holst, O., 1999, Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. In: Endotoxin in health and disease (Brade, H., Morrison, D.C., Opal, S., Vogel, S. eds.), Marcel Dekker Inc. New York)). Lipid A verankert Endotoxin in der äußeren Bakterienmembran. Das Heteropolysaccharid, das aus einem Herzoligosaccharid und dem O-Antigen besteht, zeigt in die umgebende Lösung und bestimmt die serologische Identität des Bakteriums. Das O-Antigen besteht aus repetitiven Oligosaccharideinheiten, deren Zusammensetzung stammspezifisch ist (siehe hierzu Holst et al., supra). Charakteristische Bausteine des Herzoligosaccharids sind 2-Keto-3-desoxyoctonsäure (KDO) und L-Glycero-D-manno-heptose (Hep).All endotoxin variants exist from a heteropolysaccharide that is covalently bound to lipid A. (Holst, O., 1999, Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. In: Endotoxin in health and disease (Brade, H., Morrison, D.C., Opal, S., Vogel, S. eds.), Marcel Dekker Inc. New York)). lipid A anchors endotoxin in the outer bacterial membrane. The heteropolysaccharide, which consists of a heart oligosaccharide and the O-antigen exists, points into the surrounding solution and determines the serological identity of the bacterium. The O-antigen consists of repetitive oligosaccharide units, whose composition is strain-specific (see Holst et al., supra). Characteristic building blocks of cardiac oligosaccharide are 2-keto-3-deoxyoctonic acid (KDO) and L-glycero-D-manno-heptose (Hep).
Der konservativste Teil von Endotoxin verschiedener Gattungen ist das Lipid A. Ähnlich konserviert wie Lipid A ist die innere Herzregion, die äußere Herzregion weist bereits eine höhere Variation auf. Die innere Herzregion, KDO und Lipid A selbst tragen mehrere Phosphatgruppen als Substituenten und sind so für die negative Ladung von Endotoxin verantwortlich. Darüber hinaus können die Phosphatgruppen am Lipid A und der Herzregion variabel mit Arabinose, Ethanolamin und Phosphat substituiert sein. Einzelne Saccharidbausteine des O-Antigens sind acetyliert, sialysiert oder glycosyliert. Das O-Antigen variiert außerdem bezüglich der Anzahl repetitiver Einheiten, weshalb die Endotoxin-Population jedes Bakteriums eine gewisse Heterogenität aufweist (Palva E.T., Makela P.H., Lipopolysaccharide heterogeneity in Salmonella typhimurium analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Eur J Biochem. 1980;107(1):137–43; Goldman R.C., Leive L., Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2., Eur J Biochem. 1980;107(1):145–53).The most conservative part of endotoxin Lipid A is of various genera. Preserved similarly to lipid A is the inner heart region, the outer heart region already shows a higher one Variation on. Wear the inner heart region, KDO and Lipid A yourself several phosphate groups as substituents and are so for the negative Charge of endotoxin responsible. In addition, the Phosphate groups on lipid A and the heart region variable with arabinose, Ethanolamine and phosphate can be substituted. Individual saccharide building blocks of the O-antigen are acetylated, sialysed or glycosylated. The O-antigen also varies regarding the Number of repetitive units, which is why the endotoxin population each Bacterium has a certain heterogeneity (Palva E.T., Makela P.H., Lipopolysaccharide heterogeneity in Salmonella typhimurium analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Eur J Biochem. , 1980; 107 (1): 137-43; Goldman R.C., Leive L., Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2., Eur J Biochem. , 1980; 107 (1): 145-53).
Endotoxine sind Biomoleküle, die ohne entsprechende Vorsichtsmaßnahmen in praktisch allen wässrigen Lösungen vorzufinden sind. Endotoxine können bei Mensch und Tier zu Sepsis, einer starken Fehlreaktion des Immunsystems führen. Daher sind z.B. bei der Herstellung von Pharmaproteinen Verunreinigungen mit Endotoxin exakt nachzuweisen und in der Folge komplett zu entfernen. Endotoxin stellt ein Problem bei gentechnisch hergestellten Arzneimitteln, Gentherapeutika oder Substanzen dar, die in Mensch oder Tier (z.B. Tiermedizinische Behandlung oder bei Tierversuchen) injiziert werden. Doch nicht nur bei medizinischen, sondern auch bei Forschungsanwendungen, wie bei Transfektionsexperimenten von Säugerzellen kann eine Hemmung bzw. ein Senken der Transfektionseffizienz durch Endotoxin beobachtet werden.Endotoxins are biomolecules that without appropriate precautions in practically all watery ones solutions are to be found. Endotoxins can in humans and animals to sepsis, a strong malfunction of the immune system to lead. Therefore e.g. impurities in the manufacture of pharmaceutical proteins Detect endotoxin exactly and subsequently remove it completely. Endotoxin poses a problem with genetically engineered drugs Gene therapy drugs or substances that are found in humans or animals (e.g. veterinary Treatment or in animal experiments). But not only in medical, but also in research applications, such as inhibition may occur during mammalian transfection experiments or a decrease in transfection efficiency by endotoxin was observed become.
Um Proteine im Rahmen von klinischen Studien einsetzen zu können, verlangen die europäische und die amerikanische Pharmacopeia, dass die Proteine bestimmte Grenzwerte an Endotoxinbelastung unterschreiten (z.B. Immunserum Globulin 0,91 EU/ml , dies entspricht 5 EU/kg Körpergewicht & Dosis; EU = Endotoxin Unit; FDA (Food and Drug Administration): Guideline on Validation of LAL as End Product). Falls ein Medikament bzw. darin enthaltene Proteine eine zu hohe Endotoxinbelastung aufweisen, kann dies bis zum Tod des Probanden führen. Die fehlgeleitete Immunabwehr schädigt durch eine Überreaktion den Patienten. Dies kann zu Gewebeentzündungen, Blutdruckabfall, Herzrasen, Thrombose, Schock etc. führen. Bereits eine länger anhaltende Endotoxin-Exposition in Picogramm-Mengen kann zu chronischen Nebenwirkungen wie z.B. Immunschwächen, septischen Symptomen etc. führen. Im Rahmen der Substanzherstellung wird daher, insbesondere bei Prozessen unter „Good Manufacturing Practice" (GMP) Bedingungen versucht, Endotoxin soweit wie möglich abzureichern. Allerdings ist die Endotoxin-Entfernung bei Proteinen, Polysacchariden und DNA problematisch. Gerade bei Proteinen gibt es große Probleme durch deren intrinsische Eigenschaften wie Ladungszustand oder Hydrophobizität, die eine Endotoxinentfernung nahezu verhindern bzw. zu großen Produktverlusten bei der Entfernungsprozedur führen können.To proteins in the context of clinical To be able to use studies demand the European and the American Pharmacopeia that the proteins determined Below the limit values for endotoxin exposure (e.g. immune serum Globulin 0.91 EU / ml, this corresponds to 5 EU / kg body weight &dose; EU = endotoxin Unit; FDA (Food and Drug Administration): Guideline on Validation of LAL as End Product). If a drug or contained therein Proteins have too high an endotoxin load, this can up to lead to the death of the subject. The misguided immune system damages through an overreaction the patient. This can lead to tissue inflammation, a drop in blood pressure, rapid heartbeat, Lead to thrombosis, shock etc. Already a longer one Prolonged exposure to endotoxins in picogram amounts can become chronic Side effects such as Immunodeficiency, septic symptoms etc. lead. In the context of substance production, therefore, especially in processes under “Good Manufacturing Practice "(GMP) Conditions tries to deplete endotoxin as much as possible. Indeed is the endotoxin removal from proteins, polysaccharides and DNA problematic. Especially with proteins there are big problems due to their intrinsic Properties such as state of charge or hydrophobicity, the one Almost prevent endotoxin removal or lead to large product losses lead in the removal procedure can.
Derzeit sind nur drei Verfahren zum Endotoxin-Nachweis in biologischen Lösungen beschrieben, wobei nur die beiden ersten Verfahren von der FDA zugelassen sind. 1. „Rabbit Pyrogen Testing": Ein Verfahren, bei dem einem lebenden Kaninchen eine Endotoxin-Lösung injiziert und damit eine Immunreaktion ausgelöst wird. Diese Endotoxin-verursachte Immunantwort wird über die Entwicklung von Fieber nachgewiesen. 2. Deutlich besser standardisierbar ist der „Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)"-Test, der derzeit am häufigsten verwendete Test (BioWhittacker, Inc., Charles River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., alle USA). Bei diesem Verfahren wird die Verklumpung des Blutes des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus) durch Endotoxin-Kontakt gemessen. 3. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz eines speziellen Zellkultursystems (Sterogene Inc., USA), mit dem die Aktivierung von Monozyten über die Entstehung bestimmter Zytokine verfolgt wird.There are currently only three procedures for Endotoxin detection in biological solutions is described, whereby only the first two procedures are approved by the FDA. 1. "Rabbit Pyrogen Testing ": A process at which injected an endotoxin solution into a live rabbit and thus an Immune response is triggered. This endotoxin-induced immune response is about the development of fever demonstrated. 2. The “Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) "test, the most used currently Test (BioWhittacker, Inc., Charles River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., all U.S.). With this procedure, the clumping the blood of horseshoe crab (Limulus polyphemus) through contact with endotoxin measured. 3. Another way is the use of a special cell culture system (Sterogene Inc., USA) with which the activation of monocytes on the emergence of certain Cytokine is tracked.
Die beiden erstgenannten Verfahren sind jedoch sehr teuer (vgl. Konkurrenzvergleich Endotoxin-Nachweis) und durch den großen Bedarf an Versuchstieren bzw. an Blut des sehr seltenen Pfeilschwanzkrebses nicht zuletzt aus Tierschutzgründen bedenklich. Der LAL-Test kann zwar auch miniaturisiert und automatisiert werden, hat aber aufgrund geringer Stabilität der Komponenten massive Nachteile in der Anwendung. Eine einmal geöffnete LAL-Lösung muß direkt weiterverarbeitet und aufgebraucht werden, da die Komponenten innerhalb weniger Stunden aggregieren. Für alle Testverfahren ist geschultes Personal nötig und die Verfahren sind sehr störanfällig, weil z.B. das Immunsystem von Kaninchen auf die gleiche Endotoxindosis durchaus unterschiedlich reagieren kann. Das Zellkultur-Verfahren der Firma Sterogene ist, wie alle Zellkulturverfahren, ebenfalls sehr aufwändig und weist Probleme bei der Standardisierung auf.However, the first two methods are very expensive (cf. Endoto competitor comparison xin detection) and due to the great need for experimental animals and blood of the very rare horseshoe crab, not least because of animal welfare reasons. Although the LAL test can also be miniaturized and automated, it has massive disadvantages in use due to the low stability of the components. Once a LAL solution has been opened, it must be processed and used immediately, since the components aggregate within a few hours. Trained personnel are required for all test procedures and the procedures are very susceptible to interference because, for example, rabbits' immune systems can react differently to the same endotoxin dose. The cell culture process from Sterogene, like all cell culture processes, is also very complex and has problems with standardization.
Insgesamt kann festgestellt werden, dass es kein einfach handhabbares kostengünstiges Verfahren zum Endotoxinnachweis gibt und die derzeit eingesetzten Methoden eine Reihe von Nachteilen aufweisen. Es besteht daher der Bedarf für ein Verfahren, das diese Nachteile umgeht.Overall, it can be determined that it is not an easy-to-use, inexpensive method for endotoxin detection there and the methods currently used have a number of disadvantages exhibit. There is therefore a need for a method that does this Avoids disadvantages.
Zur Endotoxinabreicherung aus biologischen Lösungen allgemein gibt es eine Reihe von Verfahren. Insbesondere bei Proteinen gibt es allerdings bislang keine allgemein anwendbaren Standardverfahren. Die jeweils verwendeten Verfahren sind angepasst an die spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Proteins und auf den entsprechenden Produktionsprozess des Proteins. Es gibt verschiedene Möglichkeiten zur Endotoxinabreicherung, wobei jedes dieser Verfahren spezifische Vor- und Nachteile aufweist.For endotoxin depletion from biological solutions there are generally a number of procedures. Especially with proteins so far, however, there are no generally applicable standard procedures. The methods used are adapted to the specific Properties of the respective protein and on the corresponding Production process of the protein. There are different possibilities for endotoxin depletion, each of these methods being specific Has advantages and disadvantages.
Die Ultrafiltration (Petsch, D. & Anspach, F.B., 2000, J. Biotechnol. 76, 97–119 und Referenzen darin) wird für Endotoxin-Abreicherungen aus Wasser und Lösungen mit niedermolekularen Bestandteilen wie Salze, Zucker und Antibiotika verwendet, ist jedoch nicht für hochmolekulare Proteine oder DNA geeignet.Ultrafiltration (Petsch, D. & Anspach, F.B., 2000, J. Biotechnol. 76, 97-119 and references in it) is for Endotoxin depletion from water and solutions with low molecular weight Ingredients such as salts, sugar and antibiotics are used, however not for high molecular weight proteins or DNA.
Die 2-Phasen-Extraktion (z.B.
Ebenfalls wird für die Endotoxinabreicherung
aus DNA und basischen Proteinen ein Anionenaustauscher (DEAE)-Verfahren
verwendet (z.B.
Ein weiteres Verfahren zur Endotoxinabreicherung aus DNA und Proteinen (z.B. BSA, Myoglobin, gamma-Globulin, Cytochrom C) ist die Affinitäts-Adsorption (z. B. Polymyxin B, Histamine, Histidin, Polylysin) z.B. GB 2192633 (Hammersmith Hospital), die jedoch im Fall von Polymyxin B toxisch ist und bei niedrigen Ionenstärken zur Protein Co-Adsorption führt.Another method for endotoxin depletion from DNA and proteins (e.g. BSA, myoglobin, gamma globulin, cytochrome C) is affinity adsorption (e.g. polymyxin B, histamine, histidine, polylysine) e.g. GB 2192633 (Hammersmith Hospital), which, however, is toxic in the case of Polymyxin B. and at low ionic strengths leads to protein co-adsorption.
Weiterhin wird die Immun-Affinitäts-Chromatographie
eingesetzt, wobei die Spezifität
für bestimmte Endotoxine
nur über
teure Antikörper
(
Ferner wird das S3delta-Peptid (
In der Anwendung in der pharmazeutischen Industrie befinden sich für Proteinlösungen, angepasst an die Eigenschaften der Zielproteine im wesentlichen drei Verfahren:In application in the pharmaceutical Industry are for Protein solutions, essentially adapted to the properties of the target proteins three procedures:
- – Anionenaustauscherchromatographie- Anion exchange chromatography
- – Reversed-Phase Chromatographie; Diese hat den Nachteil, dass sie nicht für alle Proteine gleichermaßen geeignet, – insbesondere bei hydrophoben Proteinen problematisch ist. Darüberhinaus ist dieses Verfahren sehr zeitintensiv.- Reversed phase chromatography; This has the disadvantage that it is not for all proteins equally suitable, - in particular is problematic with hydrophobic proteins. Furthermore this process is very time consuming.
- – RemTox (Fa. Millipore): Dieses Verfahren hat den Nachteil, das neben einer sehr langen Inkubationsdauer, der unspezifische Bindungsanteil hoch ist, und die Proteinwiederfindung oftmals nicht ausreichend ist.- RemTox (Millipore): This process has the disadvantage that in addition to a very long incubation period, the non-specific binding proportion high , and protein recovery is often not sufficient.
Eine grobe Endotoxin-Abreicherung von Proteinen auf einen Wert bis zu 10 EU/ml ist mit den bestehenden Verfahren in vielen Fällen möglich. Die verbleibende Konzentration an Endotoxin wirkt jedoch immer noch toxisch. Eine weitere Abreicherung (=Feinreinigung) ist daher geboten bzw. abhängig von der Dosis des Proteins in der medizinischen Anwendung, von der Europäischen Pharmacopeia (z.B. 5 EU/kg Körpergewicht und Stunde in intravenösen Anwendungen) und der FDA verbindlich vorgeschrieben. Allerdings ist diese Feinreinigung mit vorhandenen Methoden oft nicht zufriedenstellend gewährleistet. Die marktgängigen Verfahren weisen hier erhebliche Nachteile auf und sind bei bestimmten Proteinen oft nicht, oder nur unter erheblichen Verlusten des Zielproteins, anwendbar.A rough endotoxin depletion from proteins to a value up to 10 EU / ml is with the existing ones Procedure in many cases possible. However, the remaining concentration of endotoxin is still effective toxic. A further depletion (= fine cleaning) is therefore necessary or dependent from the dose of the protein in medical application, from the European Pharmacopeia (e.g. 5 EU / kg body weight and Hour in intravenous Applications) and the FDA. Indeed this fine cleaning is often unsatisfactory with existing methods guaranteed. The marketable Processes have considerable disadvantages here and are specific Proteins often do not, or only with considerable loss of the target protein, applicable.
Daher liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, das Endotoxine in Proben nachweisen kann. Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Endotoxine aus wässrigen Lösungen entfernt werden können.Therefore, the object of the invention based on providing a method that samples endotoxins can demonstrate. The invention is also based on the object to provide a method by which endotoxins from aqueous solutions can be removed.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.The task is carried out in the claims defined object solved.
Die nachfolgenden Figuren erläutern die Erfindung.The following figures explain the Invention.
Der Begriff "Endotoxinabreicherung" wie hier verwendet bedeutet vollständige oder teilweise Entfernung von Endotoxin aus Probenmaterial.The term "endotoxin depletion" as used herein means complete or partial removal of endotoxin from sample material.
Der Begriff "Endotoxin" wie hier verwendet bezeichnet bakterielles Lipopolysaccharid, das Bestandteil der äusseren Membran gram-negativer Bakterien ist.The term "endotoxin" as used herein means bacterial Lipopolysaccharide, the component of the outer membrane gram-negative Bacteria.
Der Begriff "unspezifische Immobilisierung" oder "ungerichtete Immobilisierung" wie hier verwendet bedeutet, dass die Kopplung eines Proteins an eine Matrix über Proteinreste (z.B. primäre Amine) erfolgt, die über die gesamte Proteinoberfläche verteilt sind. Die Auswahl der, für die Kopplung des einzelnen Proteinmoleküls verwendeten Gruppe ist zufällig.The term "non-specific immobilization" or "undirected immobilization" as used here means that the coupling of a protein to a matrix via protein residues (e.g. primary amines) takes place over the entire protein surface are distributed. The selection of, for coupling the individual protein molecule group used is random.
Der Begriff "gerichtete Immobilisierung" wie hier verwendet bedeutet, dass die Kopplung über Aminosäurereste oder andere Reste (z.B. Glykosyslierungen des Proteins) erfolgt, deren Position im Protein (z. B. N- oder C-terminal) bekannt ist. Die Auswahl dieser Gruppen für die Kopplung erfolgt durch die Auswahl geeigneter Reaktionspartner/Linker, die bevorzugt mit diesen Resten reagieren (z.B. Kopplung von Sulfhydrylresten an Iodoacetatreste; Iodoacetat reagiert tausendmal schneller mit Sulfhydrylresten als mit Aminoresten).The term "directional immobilization" as used here means coupling over amino acid residues or other residues (e.g. glycosylation of the protein), whose position in the protein (e.g. N- or C-terminal) is known. Choosing these groups for the coupling takes place through the selection of suitable reaction partners / linkers, who prefer to react with these residues (e.g. coupling of sulfhydryl residues on iodoacetate residues; Iodoacetate reacts a thousand times faster Sulfhydryl residues than with amino residues).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Endotoxin, umfassend die Schritte:The present invention relates to a method for the detection of endotoxin, comprising the steps:
- a) Inkubieren einer Probe mit einem Bakteriophagenschwanzprotein,a) incubating a sample with a bacteriophage tail protein,
- b) Nachweis von an Bakteriophagenschwanzproteine gebundenes Endotoxin.b) Detection of bound to bacteriophage tail proteins Endotoxin.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem der Nachweis mittels spektroskopischer Verfahren, z.B. Fluoreszenzemission, Fluoreszenzpolarisation, Absorption oder Circulardichroismus, oder mittels Kapazitätsmessung, z.B. elektrische Signale, oder indirekt mittels Kompetitionsnachweis durchgeführt wird.The invention preferably relates a method in which the detection by means of spectroscopic methods, e.g. Fluorescence emission, fluorescence polarization, absorption or Circular dichroism, or by means of capacity measurement, e.g. electrical Signals, or carried out indirectly by means of proof of competition.
Gegebenenfalls wird nach Schritt a) und vor Schritt b) ein zusätzlicher Schritt a') Abtrennung von Bakteriophagenschwanzprotein-Endotoxin-Komplex von der Probe eingeführt.If necessary, after step a) and before step b) an additional one Step a ') separation of bacteriophage tail protein-endotoxin complex from the sample introduced.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Entfernung von Endotoxin aus einer Probe, umfassend die Schritte:The present invention relates to further comprising a method of removing endotoxin from a sample the steps:
- a) Inkubation einer Probe mit Bakteriophagenschwanzproteinen, die unspezifisch oder gerichtet, an einem festen Träger immobilisiert sind,a) incubation of a sample with bacteriophage tail proteins, the non-specific or directed, immobilized on a solid support are,
- b) Trennen des Bakteriophagenschwanzprotein-Endotoxin-Komplexes von der Probe.b) separation of the bacteriophage tail protein-endotoxin complex from the sample.
Vorzugsweise wird vor der Inkubation die Ionenzusammensetzung der zweiwertigen Ionen z.B. Ca2+, Mg2+ und/oder der pH-Wert eingestellt, um eine optimale Endotoxin-Bakteriophagenschwanzprotein-Bindung zu erhalten. Ferner bevorzugt wird bei oder nach der Inkubation eine „Demaskierung" des gebundenen Endotoxins durch Zugabe von Detergentien/Salzen, z.B. Tween, Triton, NaCl oder Ammoniumsulfat, oder anderer Substanzen, z.B. Chitosan, Zucker oder Lipide, die ein Ablösen der Endotoxine von z.B. Proteinen oder Nukleinsäuren beschleunigen.Before the incubation, the ion composition of the divalent ions, for example Ca 2+ , Mg 2+ and / or the pH is preferably adjusted in order to obtain an optimal endotoxin-bacteriophage tail protein binding. Also preferred during or after the incubation is “unmasking” of the bound endotoxin by adding detergents / salts, for example Tween, Triton, NaCl or ammonium sulfate, or other substances, for example chitosan, sugar or lipids, which detach the endotoxins from, for example, proteins or accelerate nucleic acids.
Das Bakteriophagenschwanzprotein kann ein natürlicherweise vorkommendes oder ein molekularbiologisch oder biochemisch modifiziertes sein. Das Bakteriophagenschwanzprotein kann aus verschiedenen Gründen gentechnisch und/oder biochemisch modifiziert sein. Für die erfindungsgemäßen Verfahren können jedoch nicht nur die natürlicherweise vorkommenden Bakteriophagenschwanzproteine verwendet werden, sondern auch deren Varianten. Varianten bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass die Bakteriophagenschwanzproteine eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen. Diese können durch Screening der natürlich auftretenden Varianten, oder durch Zufalls-Mutagenese oder gezielte Mutagenese, aber auch durch chemische Modifikation erhalten werden. Die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Bakteriophagenschwanzproteine können durch eine gezielte oder zufällige Mutagenese in ihrer Spezifität bzw. ihren Bindungseigenschaften an Trägerstrukturen angepaßt werden. Diese Bindung an die Träger kann fest, z.B. kovalent oder über eine spezifische oder unspezifische Biotinylierung erfolgen, aber auch reversibel z.B. über eine reduzierbare Disulfidbrücke erfolgen. Ferner kann durch eine Modifikation die Stabilität erhöht werden. Durch die Mutagenese werden Mutationen eingeführt, die Aminosäureadditionen, -deletionen, -substitutionen oder chemische Modifikationen sein können. Diese Mutationen können eine Veränderung der Aminosäuresequenz in der Bindungsregion der Bakteriophagenschwanzproteine bewirken, mit dem Ziel, Spezifität und Bindungsaffinität an Testbedürfnisse anzupassen, z.B. die Bindung der Endotoxine an die Bakteriophagenschwanzproteine zu erhöhen oder irreversibel zu machen, um den Nachweis oder die Abreicherung zu verbessern. Darüber hinaus kann eine gentechnische oder biochemische Modifikation der Phagenproteine durchgeführt werden, mit dem Ziel, die gegebenenfalls vorhandene enzymatische Aktivität auszuschalten, um dadurch die Bindung zu verbessern oder irreversibel zu machen.The bacteriophage tail protein can be a natural occurring or a molecular biological or biochemically modified his. The bacteriophage tail protein can be genetically engineered for several reasons and / or be biochemically modified. For the method according to the invention can however not just the naturally occurring bacteriophage tail proteins are used, but also their variants. Variants means in the sense of the present Invention that the bacteriophage tail proteins have an altered amino acid sequence exhibit. these can by screening the course occurring variants, or by random mutagenesis or targeted Mutagenesis, but also be obtained by chemical modification. The for the method according to the invention Bacteriophage tail proteins used can be targeted or targeted random Mutagenesis in its specificity or their binding properties are adapted to support structures. This bond to the wearer can be fixed, e.g. covalent or over specific or non-specific biotinylation take place, however also reversible e.g. about a reducible disulfide bridge respectively. Furthermore, the stability can be increased by a modification. Mutagenesis introduces mutations, the amino acid additions, -deletions, -substitutions or chemical modifications can. These mutations can a change the amino acid sequence in the binding region of the bacteriophage tail proteins the goal of specificity and attachment affinity of test needs adapt, e.g. the binding of the endotoxins to the bacteriophage tail proteins to increase or make it irreversible to the proof or depletion to improve. About that In addition, genetic engineering or biochemical modification of the Phage proteins carried out are, with the aim of the possibly existing enzymatic activity turn off to improve binding or irreversible close.
Arbeiten zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von T4 p12 hatten gezeigt, dass bei erhöhter Temperatur proteolytische Fragmente von 33 kDa und 45 kDa erzeugt werden können, die N- und C-terminal (33 kDa) bzw. nur N-terminal (45 kDa) verkürzt sind. Im Gegensatz zu dem 33 kDa Fragment ist das 45 kDa Fragment noch in der Lage an Bakterien zu binden. Demzufolge ist der C-Terminus an der Zellbindung beteiligt.Work to educate the three-dimensional structure of T4 p12 had shown that at elevated temperature 33 kDa and 45 kDa proteolytic fragments can be generated N- and C-terminal (33 kDa) or only N-terminal (45 kDa) are shortened. In contrast to the 33 kDa fragment, the 45 kDa fragment is still able to bind to bacteria. Hence, the C-terminus involved in cell binding.
Die Modifikation kann ferner insbesondere den Zweck haben, einen direkten Nachweis z.B. mittels Messung der Tryptophanfluoreszenz zu ermöglichen. Beispielsweise besitzt P12 fünf Tryptophan-Reste. Das Fluoreszenzspektrum des nativen Proteins deutet darauf hin, dass diese Reste weitestgehend lösungsmittel-unzugänglich sind. Aus einer Vielzahl von wissenschaftlichen Arbeiten ist bekannt, dass fast immer aromatische Aminosäuren an der Biudung von Zuckerresten, wie sie auch in Endotoxin vorkommen, beteiligt sind. Die Bindung der Zuckerreste an Proteine kann durch einen Quench der Trypthophanfluoreszenz, bzw. gegebenenfalls auch zusätzlich durch eine Veränderung des Fluoreszenzmaximums verfolgt werden. Eigene Arbeiten lassen vermuten, dass die ungünstige Verteilung der Fluorophore des natürlichen p12 eine Ausnutzung der Fluoreszenz-Eigenschaften von p12 zur Bindungsmessung verhindert. Die Fluoreszeneigenschaften von p12 werden durch die fünf Tryptophanreste dominiert, deren Fluoreszenz durch die Zugabe von Endotoxin nicht messbar verändert wird. Diese Daten lassen erwarten, dass eher Tyrosinreste als Tryptophanreste an der Bindung beteiligt sind, deren Signaländerung vor dem hohen Tryptophan-Hintergrund nicht sichtbar gemacht werden kann. Auf der Basis der Proteolyseergebnisse kommen sechs Tyrosine am C-Terminus von p12 für den Endotoxin-Nachweiskit in Frage, die entsprechend „sichtbar" gemacht werden können. Durch einen selektiven molekularbiologischen Austausch der fünf Tryptophan-Reste gegen Tyrosine werden in einem ersten Schritt die spektroskopischen Eigenschaften so gezielt verändert, dass die Endotoxin-Bindung per Fluoreszenzsignaländerung eines einzelnen Tryptophanrestes messbar ist. Anschließend wird durch einen gezielten Austausch von jeweils einem der sechs Tyrosine am C-Terminus gegen einen Tryptophanrest die Intensität des messbaren Signals signifikant erhöht, um für die Entwicklung eines Endotoxin-Nachweiskits attraktive Signalunterschiede zu erhalten.The modification can also in particular have the purpose of providing direct evidence e.g. by measuring the Allow tryptophan fluorescence. For example, P12 has five Tryptophan residues. The fluorescence spectrum of the native protein indicates indicates that these residues are largely solvent-inaccessible. It is known from a large number of scientific papers that almost always aromatic amino acids in the formation of sugar residues, as they also occur in endotoxin. The connection the sugar residues on proteins can be quenched by trypthophane fluorescence, or, if necessary, additionally through a change of the fluorescence maximum are tracked. Let your own work suspect the inconvenient Distribution of the fluorophores of the natural p12 an exploitation which prevents fluorescence properties of p12 for binding measurement. The fluorescence properties of p12 are due to the five tryptophan residues dominates, whose fluorescence cannot be measured by the addition of endotoxin changed becomes. These data suggest that tyrosine residues are more likely than tryptophan residues are involved in the binding, their signal change against the high tryptophan background cannot be made visible. Based on the proteolysis results come six tyrosines at the C-terminus of p12 for the endotoxin detection kit into question, which can be made "visible" accordingly a selective molecular biological exchange of the five tryptophan residues the first step against tyrosine is the spectroscopic Properties so deliberately changed that endotoxin binding by fluorescence signal change of a single tryptophan residue is measurable. Subsequently through a targeted exchange of one of the six Tyrosine at the C-terminus against a tryptophan residue the intensity of the measurable Signal significantly increased, um for the development of an endotoxin detection kit attractive signal differences to obtain.
Welche Bakteriophagenschwanzproteine verwendet werden, hängt davon ab, welche Endotoxine nachgewiesen oder abgereinigt werden sollen. Bereits jetzt steht eine große Zahl bekannter Bakteriophagen für einen Großteil der bisher beschriebenen Bakterien zur Verfügung und kann für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die Phagen und die entsprechenden Wirtsbakterien sind u.a. bei folgenden Stammsammlungen erhältlich: ATCC (USA), DSMZ (Deutschland), UKNCC (Großbritannien), NCCB (Niederlande) und MAFF (Japan).Which bacteriophage tail proteins are used depends on which endotoxins are to be detected or purified. A large number of known bacteriophages are already available for a large part of the bacteria described hitherto and can be used for the methods according to the invention. The phages and the corresponding host bacteria are available from the following strain collections: ATCC (USA), DSMZ (Germany), UKNCC (Great Britain), NCCB (Netherlands) and MAFF (Japan).
Vorzugsweise stammen die Bakteriophagenschwanzproteine für die erfindungsgemäßen Verfahren von Bakteriophagen, deren Wirtsbakterien medizinisch oder biotechnologisch relevante Bedeutung haben, wie z.B. E. coli, das bei der Produktion rekombinanter Proteine oder von Nukleinsäuren für die Gentheraphie verwendet wird. Besonders bevorzugt sind Bakteriophagenschwanzproteine, die stark konservierte Bereiche von Endotoxin binden, wie z.B. die Herzregion oder Lipid A. Insbesondere bevorzugt sind p12 und p12-ähnliche Bakteriophagenschwanzproteine Bei einer Kombination von Endotoxin-Verunreinigungen aus verschiedenen Wirtsbakterien kann eine Kombination der entsprechenden Endotoxinerkennenden Bakteriophagenschwanzproteine eingesetzt werden.The bacteriophage tail proteins are preferably derived for the inventive method of Bacteriophages, their host bacteria, medically or biotechnologically have relevant meaning, e.g. E. coli that is in production recombinant proteins or nucleic acids used for gene therapy becomes. Particularly preferred are bacteriophage tail proteins that bind highly conserved areas of endotoxin, e.g. the heart region or lipid A. Particularly preferred are p12 and p12-like bacteriophage tail proteins With a combination of endotoxin contaminants from different host bacteria can be a combination of the corresponding endotoxin-detecting bacteriophage tail proteins be used.
Der Nachweis oder die Abreicherung von Endotoxin in oder aus einer Probe erfolgt über die Bindung von Endotoxin an die Bakteriophagenschwanzproteine. Diese Bindung kann z.B. durch direkte Messung mittels spektroskopischer Verfahren, z.B. über Fluoreszenzemission, Fluoreszenzpolarisation, Absorption oder Circulardichroismus nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann die Bindung durch elektrische Signale, z.B. eine Kapazitätsmessung sichtbar gemacht werden. Weiterhin kann die Bindung von Endotoxin an die Bakteriophagenschwanzproteine auch indirekt über Verdrängungsexperimente nachgewiesen werden.Evidence or depletion of endotoxin in or from a sample occurs via the binding of endotoxin to the bacteriophage tail proteins. This bond can e.g. by direct measurement using spectroscopic methods, e.g. about fluorescence emission, Fluorescence polarization, absorption or circular dichroism detected become. About that in addition, the binding can be effected by electrical signals, e.g. a capacity measurement be made visible. Furthermore, the binding of endotoxin to the bacteriophage tail proteins also indirectly through displacement experiments be detected.
Für den erfindungsgemäßen Nachweis können die Bakteriophagenschwanzproteine bei Bedarf einer Abtrennung der Bakteriophagenschwanzprotein-Endotoxin-Komplexe von der Probe auf geeigneten Trägerstrukturen, z.B. Magnetpartikeln, Agarosepartikeln, Mikrotiterplatten, Filtermaterialien oder Durchflußzellkammern, gekoppelt werden (indirekter Nachweis). Die Trägerstrukturen können z.B. aus Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat, PMMA, Celluloseacetat, Nitrozellulose, Glas, Silizium oder Agarose bestehen. Die Kopplung kann z.B. durch Adsorption oder kovalente Bindung erreicht werden.For the detection according to the invention can the bacteriophage tail proteins if necessary, a separation of the Bacteriophage tail protein-endotoxin complexes from the sample suitable support structures, e.g. Magnetic particles, agarose particles, microtiter plates, filter materials or flow cell chambers, be coupled (indirect evidence). The support structures can e.g. made of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, PMMA, cellulose acetate, Nitrocellulose, glass, silicon or agarose exist. The coupling can e.g. can be achieved by adsorption or covalent bonding.
Für das erfindungsgemäße Abreicherungsverfahren sind die Bakteriophagenschwanzproteine an feste Träger gekoppelt. Die festen Träger können Materialien für Chromatographiesäulen (z.B. Sepharosematerialien), Filtrationsmedien, Glaspartikel, Magnetpartikel, Zentrifugations- oder Sedimentationsmaterialien (z.B. Agarosepartikel) sein.For the depletion process according to the invention the bacteriophage tail proteins are coupled to solid supports. The solid support can Materials for chromatography columns (e.g. Sepharose materials), filtration media, glass particles, magnetic particles, Centrifugation or sedimentation materials (e.g. agarose particles) his.
Wichtig hierbei ist eine funktionelle Kopplung, d.h. Bakteriophagenschwanzproteine verfügen trotz Bindung an das Trägermaterial über für Endotoxin zugängliche Strukturen. Die Kopplung der Bakteriophagenschwanzproteine kann unspezifisch, oder aber bevorzugt gerichtet, über z.B. eine selektive Biotinylierung, oder gekoppelt über einen Spacer oder Linker erfolgen.A functional one is important here Coupling, i.e. Despite that, bacteriophage tail proteins have Binding to the carrier material via for endotoxin accessible Structures. The coupling of the bacteriophage tail proteins can non-specific, or preferably directed, e.g. selective biotinylation, or coupled via a spacer or linker.
Dazu können die Bakteriophagenschwanzproteine mit niedermolekularen Substanzen z.B. Biotin verknüpft sein, um über diese niedermolekularen Substanzen an Polypeptide z. B. Streptavidin zu binden, die ihrerseits auf dem Träger immobilisiert wurden. Statt Biotin kann ferner der sogenannte Strep-Tag (Skerra, A. & Schmidt, T. G. M. Biomolecular Engineering 16 (1999), 79– 86) verwendet werden, der eine kurze Aminosäuresequenz ist und an Streptavidin bindet. Ferner kann der His-Tag verwendet werden, der über zweiwertige Ionen (Zink oder Nickel) oder einen für ihn spezifischen Antikörper (Qiagen GmbH, Hilden) an ein Trägermaterial binden kann. Der Strep-Tag sowie der His-Tag wird vorzugsweise über DNA-Rekombinationstechnologie an die rekombinant hergestellten Bakteriophagenproteine gebunden. Diese Kopplung kann gerichtet, z.B. am N- oder C-Terminus oder ungerichtet erfolgen. Die gerichtete Kopplung erfolgt über eine geeignete, reaktive natürlicherweise bei Phagenproteinen nicht häufig oberflächenexponierte Aminosäure wie Cystein, das an geeigneter Stelle gezielt eingeführt würde. Da Phagenschwanzproteine im Cytoplasma synthetisiert werden, ist nicht mit Disulfidbrücken zu rechnen. Vorzugsweise kann auch über andere Aminosäure direkt, oder wie auch bei Cystein über einen „Spacer" oder „CrossLinker" (Monofunktionell oder bifunktionell) indirekt gekoppelt werden.The bacteriophage tail proteins can do this with low molecular substances e.g. Be linked to biotin, um over these low molecular weight substances on polypeptides z. B. streptavidin to bind, which in turn were immobilized on the carrier. Instead of The so-called strep tag (Skerra, A. & Schmidt, T.G. M. Biomolecular Engineering 16 (1999), 79-86) can be used, the a short amino acid sequence and binds to streptavidin. His day can also be used be the one about divalent ions (zinc or nickel) or one specific for it antibody (Qiagen GmbH, Hilden) to a carrier material can bind. The strep tag as well as the his tag is preferably used via recombinant DNA technology the recombinantly produced bacteriophage proteins are bound. This Coupling can be directed, e.g. at the N or C terminus or undirected respectively. The directional coupling takes place naturally via a suitable, reactive not common with phage proteins surface-exposed amino acid like cysteine, which would be introduced at a suitable point. There Phage tail proteins are not synthesized in the cytoplasm with disulfide bridges to count. Preferably also directly via other amino acids, or as with cysteine above a "spacer" or "CrossLinker" (monofunctional or bifunctional) can be indirectly coupled.
Bei der Cysteinkopplung sind alle bifunktionellen Crosslinker mit NH- und SH-reaktiven Gruppen, mit und ohne Zwischenspacer, z.B. 11-Maleimidoundecanoic acid sulfo-NHS oder Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-l-carboxy-[6-amido]caproate möglich. Sofern keine Spacer vorhanden sind, können 8–12 C-Atom-Spacer mit endständiger NH-Gruppe eingefügt werden. Vorzugsweise erfolgt die Cysteinkopplung über eine spezifische Biotinylierung des Cysteins durch z.B. EZ-Link-PEO-Maleimide activated Biotin (Pierce).Everyone is in cysteine coupling bifunctional crosslinker with NH and SH reactive groups, with and without intermediate spacer, e.g. 11-Maleimidoundecanoic acid sulfo-NHS or succinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-l-carboxy- [6-amido] caproate possible. If there are no spacers, 8–12 C-atom spacers with a terminal NH group can be used added become. The cysteine coupling is preferably carried out via a specific biotinylation of the cysteine by e.g. EZ-Link PEO-maleimide activated biotin (Pierce).
Zweiwertige Ionen, wie z.B. Ca2+ oder Mg2+ sind für eine Bindung von Endotoxinen an Phagenproteine wie p12 wichtig. Durch Zugabe von geeigneten Chelatoren, wie z.B. EDTA oder EGTA, kann diese Bindung jedoch gelöst werden. Ca2+-Konzentration im Bereich von 100 nM bis 1 mM sind für die Bindung bevorzugt. Erniedrigt man die Konzentration zweiwertiger Ionen durch Zugabe von 1 mM EDTA unter 100 nM, so wird die Bindung von Endotoxin an p12 gelöst. Mg2+-Konzentrationen über 10 mM verschlechtern die Bindung von Endotoxin an p12, was sich in einer Erhöhung der Dissoziationskonstante bemerkbar macht. Ohne Zugabe von Mg2+ ergibt sich ein Kd-Wert von 50 nM und in einem Puffer mit 10 mM Mg2+ wurde ein Kd-Wert von 1 μM gemessen. Zink zeigte eine noch stärker hemmende Wirkung. 1 mM Zn erhöht den Kd-Wert auf 10 μM. Eine Einstellung der Konzentration zweiwertiger oder anderer Ionen (z.B.: Cu2+, Al3+, Zn2+, Fe2+, Ca2+, Ba2+, Mg2+, Cd2+) auf einen für die Bindung optimalen Bereich kann durch Substanzen, wie HEDTA, NTA bzw. allgemein Chelatoren/Puffer (ADA: N[2-Acetamido]-2-iminodiacetic acid; 5-AMP: Adenosin-5'-Monophosphat; ADP: Adenosin-5'-Diphosphat; ATP: Adenosin-5'-Triphosphat; Bapta: 1,2-bis(2-Aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid; Citrat: Zitronensäure; EDTA: Ethylendiamintetraacetic acid; EGTA: Ethleneglycol-bis(β-aminoethyl Ether) N,N,N',N'-Tetraacetic acid; HEDTA: Nhydroxyethylethylenediaminetriacetic acid; NTA: Nitrilotiracetic acid; SO4. Sulfat) erfolgen, die als Puffer für zweiwertige Ionen benutzt werden können.Divalent ions such as Ca 2+ or Mg 2+ are important for binding endotoxins to phage proteins such as p12. By adding suitable chelators, such as EDTA or EGTA, this bond can be released. Ca 2+ concentrations in the range of 100 nM to 1 mM are preferred for binding. If the concentration of divalent ions is reduced to below 100 nM by adding 1 mM EDTA, the binding of endotoxin to p12 is released. Mg 2+ concentrations above 10 mM impair the binding of endotoxin to p12, which is reflected in an increase in the dissociation constant. Without addition of Mg 2+ , a K d value of 50 nM results and a K d value of 1 μM was measured in a buffer with 10 mM Mg 2+ . Zinc showed an even more inhibitory effect. 1 mM Zn increases the K d value to 10 μM. Adjustment of the concentration of divalent or other ions (eg: Cu 2+ , Al 3+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Ca 2+ , Ba 2+ , Mg 2+ , Cd 2+ ) to an optimal range for the binding can by substances such as HEDTA, NTA or generally chelators / buffers (ADA: N [2-acetamido] -2-iminodiacetic acid; 5-AMP: adenosine 5'-monophosphate; ADP: adenosine 5'-diphosphate; ATP : Adenosine 5'-triphosphate; Bapta: 1,2-bis (2-aminophenoxy) ethane-N, N, N ', N'-tetraace tic acid; Citrate: citric acid; EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid; EGTA: ethleneglycol bis (β-aminoethyl ether) N, N, N ', N'-tetraacetic acid; HEDTA: Nhydroxyethylethylenediaminetriacetic acid; NTA: Nitrilotiracetic acid; SO 4th Sulfate), which can be used as a buffer for divalent ions.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können daher ferner Waschschritte umfassen. Je nachdem, ob ein direkter oder indirekter Nachweis oder die Abreicherung eine Abtrennung von Probe und Bakteriophagenschwanzprotein nötig macht, können Waschschritte eingebaut werden. Da Ca2+ oder andere Metallionen (z.B. Mg2+) essentiell für die Bindung sind, kann die Bindung von Endotoxin an z.B. p12 durch geeignete Waschschritte gelöst werden. Je nach Ziel, ob Endotoxin auf dem Bakteriophagenschwanzprotein, z.B. p12 gebunden bleiben soll, wird mit EDTA-freiem Puffer gewaschen, wenn die Bindung gelöst werden soll mit EDTA-haltigem Puffer, wobei die EDTA-Konzentrationen im Bereich von mindestens 0,05 mM bis mehr als 10 mM, vorzugsweise im Bereich von 2 mM bis 5 mM liegt.The methods according to the invention can therefore further comprise washing steps. Depending on whether a direct or indirect detection or depletion of a separation of sample and bacteriophage tail protein may require washing steps to be built in. Because Ca2 + or other metal ions (e.g. Mg2 +) are essential for the Binding, the binding of endotoxin to e.g. p12 by suitable Washing steps solved become. Depending on the target, whether endotoxin is on the bacteriophage tail protein, e.g. p12 should remain bound, is washed with EDTA-free buffer, when the bond is released should be with EDTA-containing buffer, the EDTA concentrations in the range of at least 0.05 mM to more than 10 mM, preferably is in the range of 2 mM to 5 mM.
Die Abtrennung erfolgt nach Inkubation der Probe mit dem entsprechenden mit Bakteriophagenschwanzproteinen gekoppelten Trägermaterial für etwa 5–60 min oder etwa 30– 180 min oder bei Bedarf auch über Nacht. Dazu wird die Probe z.B. aus der Chromatographiesäule eluiert, oder filtriert, oder die entsprechenden Partikel abzentrifugiert oder absedimentiert, bzw. durch Anlegen eines Magnetfeldes magnetisch separiert.The separation takes place after incubation the sample with the corresponding with bacteriophage tail proteins coupled carrier material for about 5-60 min or about 30-180 min or over if necessary Night. For this, the sample is e.g. eluted from the chromatography column, or filtered, or the corresponding particles are centrifuged off or sedimented, or magnetically by applying a magnetic field separated.
Der Abtrennschritt kann z.B. im Abreicherungsverfahren zur Regenerierung der Bakteriophagenschwanzproteine benutzt werden, die an den festen Träger gekopplet sind. Dadurch kann der feste Träger, z.B. eine Matrix in einer Chromatographiesäule wiederverwendet werden. Die Regenerierung erfolgt durch Entfernen des gebundenen Endotoxins durch einen geeigneten Regenerierungspuffer enthaltend EDTA oder einen entsprechenden Chelator. Bei EDTA wird eine Konzentration von größer 2 mM EDTA bevorzugt, inbesondere größer 10 mM EDTA.The separation step can e.g. in the depletion process are used to regenerate the bacteriophage tail proteins, the to the solid support are coupled. This allows the solid support, e.g. a matrix in one chromatography column be reused. Regeneration is done by removing the bound endotoxin with a suitable regeneration buffer containing EDTA or a corresponding chelator. At EDTA a concentration greater than 2 mM EDTA preferred, in particular greater than 10 mM EDTA.
Da ionische Wechselwirkungen grundsätzlich immer durch Veränderungen der Ionenstärke beeinflussbar sind, können auch Erhöhungen oder Erniedrigungen anderer Salze in Lösung, wie z.B. NaCl oder KCl, die Bindung von Endotoxin an die Bakteriophagenschwanzproteine beeinflussen.Since ionic interactions always through changes the ionic strength can be influenced also increases or lowering other salts in solution, e.g. NaCl or KCl, the Affect binding of endotoxin to the bacteriophage tail proteins.
Um die Bindung im Nachweisverfahren direkt oder indirekt sichtbar zu machen, kann auch das Protein molekularbiologisch oder biochemisch verändert werden, um die Messung zu ermöglichen, bzw. zu verbessern. Um eine Bindung von Endotoxin z.B. an p12 direkt sichtbar zu machen, kann ein molekularbiologischer Austausch von Tyrosinresten gegen Tryptophan durchgeführt werden. Für eine Reduktion des Signalhintergrundes kann es dabei nötig sein, die ursprünglich enthaltenen Tryptophane gegen Tyrosine auszutauschen. Um auch in proteinhaltigen Lösungen messen zu können, kann p12 nach Tryptophan-Einführung zusätzlich chemisch modifiziert werden. Dabei werden Tryptophanreste durch Koshland-Reagenz (2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid) hinsichtlich ihrer spektrokopischen Eigenschaften verändert. Bei Verdrängungsexperimenten kann markiertes, z.B. fluoreszenzmarkiertes Endotoxin (z.B. Sigma) durch in der Probe befindliches Endotoxin z.B. von p12 verdrängt und die Konzentration von freiem fluoreszierendem Endotoxin bestimmt werden.To bind in the detection process The protein can also be made visible directly or indirectly by molecular biology or changed biochemically to enable the measurement or improve. To bind endotoxin e.g. directly to p12 Molecular biological exchange of Tyrosine residues can be carried out against tryptophan. For a reduction of the signal background it may be necessary to include the originally contained Exchange tryptophans for tyrosines. To also in protein solutions to be able to measure can p12 after tryptophan introduction additionally chemical be modified. Tryptophan residues are removed by Koshland reagent (2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide) changed in terms of their spectroscopic properties. at displacement experiments can marked, e.g. fluorescence-labeled endotoxin (e.g. Sigma) by endotoxin in the sample e.g. displaced by p12 and determines the concentration of free fluorescent endotoxin become.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Endotoxin aus und in allen wässrigen Lösungen nachgewiesen und entfernt werden. Diese Lösungen können: Proteine, Plasmid-DNA, genomische DNA, RNA, Protein-Nukleinsäurekomplexe wie z.B. Phagen oder Viren, Saccharide, Impfstoffe, Arzneimittel, Dialysepuffer (Medizin), Salze oder andere durch Endotoxin-Bindung verunreinigte Substanzen enthalten.With the method according to the invention can detect and remove endotoxin from and in all aqueous solutions become. These solutions can: Proteins, plasmid DNA, genomic DNA, RNA, protein-nucleic acid complexes such as. Phages or viruses, saccharides, vaccines, medicines, Dialysis buffer (medicine), salts or others through endotoxin binding contain contaminated substances.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Bakteriophagenproteine, an die sogenannte Tags, z.B. der Strep- oder der His-Tag, vorzugsweise an das 3'- oder 5'-Ende, besonders bevorzugt an das 5'-Ende, gekoppelt sind. Bevorzugt ist die Kopplung oder Verknüpfung der Tags mit den Bakteriophagenproteinen über DNA-Rekombinationstechnologie. Herstellung der Nukleinsäure, umfassend die Sequenz des Bakteriophagenproteins und des Tags und die Herstellung des Expressionsprodukts sind Stand der Technik und brauchen hier nicht gesondert erläutert zu werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz, die ein Bakteriophagenprotein zusammen mit dem Strep- oder His-Tag codiert. Ein besonders bevorzugtes mit dem Strep- oder His-Tag modifiziertes Bakteriophagenprotein ist das p12-Protein vom Phagen T4, jedoch sind alle anderen Bakteriophagenproteine von in der obigen Tabelle aufgeführten Bakterien ebenfalls bevorzugt.Another aspect of the invention are bacteriophage proteins to which so-called tags, e.g. the strep or the His tag, preferably at the 3 'or 5' end, particularly preferably at the 5 'end are. Coupling or linking of the tags with the bacteriophage proteins via recombinant DNA technology is preferred. Production of the nucleic acid, comprising the sequence of the bacteriophage protein and the tag and the production of the expression product is state of the art and need not be explained separately here. Another Aspect of the invention is the nucleic acid sequence, which is a bacteriophage protein encoded along with the Strep or His tag. A particularly preferred one bacteriophage protein modified with the Strep or His tag is the p12 protein from phage T4, however all other bacteriophage proteins are from listed in the table above Bacteria also preferred.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Bakteriophagenproteine, mit einem Tag, der ein oberflächenexponiertes Cystein zur spezifischen, gerichteten Biotinylierung aufweist, z.B. die Tags gemäß SEQ ID NO:5, 6 und 7. Ein Beispiel für ein p12 mit Tag ist die in SEQ ID NO:8 aufgeführte Aminosäuresequenz. Bevorzugt ist ein p12 mit einem Tag, insbesondere mit einem Tag mit einem oberflächenexponierten Cystein, insbesondere ein p12 mit dem Tag gemäß SEQ ID NO: 6 und 7. Diese gerichtete Biotinylierung kann zusätzlich durch einen geeigneten Spacer oder Linker vermittelt werden. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Aminosäuren mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO:5, 6 und 7. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Nukleinsäuren, codierend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, 6 und 7.Another aspect of the invention are bacteriophage proteins, with a tag that is a surface exposed Cysteine for specific directed biotinylation, e.g. the tags according to SEQ ID NO: 5, 6 and 7. An example of a p12 with tag is the amino acid sequence listed in SEQ ID NO: 8. A is preferred p12 with one day, especially with a day with a surface exposed Cysteine, in particular a p12 with the tag according to SEQ ID NO: 6 and 7. This Directed biotinylation can also be carried out by a suitable Spacers or linkers can be taught. Furthermore, the present concerns Invention the amino acids with a sequence according to SEQ ID NO: 5, 6 and 7. Furthermore, the present invention relates to coding nucleic acids the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 5, 6 and 7.
Die erfindungsgemäßen Verfahren bieten gegenüber den Nachweis- und Reinigungsverfahren für und von Endotoxin Vorteile in der Performance entsprechender Anwendungen. Ferner ist die Herstellung von Antikörper gegen LPS-Herzoligosaccharide sehr schwierig, was entsprechende Verfahren auf Antikörper-Basis sehr teuer werden lässt.The methods according to the invention offer compared to Detection and purification procedures for and from endotoxin benefits in the performance of corresponding applications. Furthermore, the manufacture of antibody against LPS cardiac oligosaccharides very difficult, which is corresponding Antibody-based process very much expensive.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen. Sofern nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standardmethoden verwendet, wie z.B. von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben.The following examples illustrate the Invention and are not to be construed as limiting. Unless otherwise stated, standard molecular biological methods were used, such as. by Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
1. Glasgefäße, Plastikgefäße und Puffer1. Glass jars, plastic jars and buffers
Für die Endotoxinentfernung wurden alle Glasgefäße durch Ausbacken bei 200°C (4h) entpyrogenisiert und ausschließlich pyrogenfreie Plastikmaterialen (z.B. Pipettenspitzen, Microtiterplatten) verwendet. Andere, nicht hitzebeständige Geräte oder Gefäße, wurden entweder mit 3% Wasserstoffperoxid behandelt oder mit 1% Natriumdeoxoycholat gewaschen. Anschließend wurde sie mit endotoxinfreiem Wasser gespült. Die Puffer wurden aus weitgehend endotoxinfreien Puffersubstanzen (Sigma) hergestellt und mit endotoxinfreiem Wasser angesetzt. Salze, wie z.B. NaCl, die auf 200°C erhitzt werden können, wurden ausgebacken (200°C, 4h). Für chromatographische Reinigungen verwendete Puffer wurden entgast und filtriert.For the endotoxin removal, all glass vessels were de-pyrogenized by baking at 200 ° C (4h) and exclusively pyrogen-free plastic materials (e.g. pipette tips, microtiter plates) used. Other, non-heat-resistant devices or vessels were either Treated with hydrogen peroxide or washed with 1% sodium deoxoycholate. Subsequently it was rinsed with endotoxin-free water. The buffers were largely out endotoxin-free buffer substances (Sigma) and with endotoxin-free water stated. Salts, e.g. NaCl, which can be heated to 200 ° C, were baked (200 ° C, 4h). For chromatographic Buffers used for cleaning were degassed and filtered.
2. Endotoxinnachweis mittels LAL-Test2. Endotoxin detection using the LAL test
Endotoxin-Kontrollnachweise wurden mit einem chromogenen LAL-Test (Limulus-Amebocyte-Lysate Test, Endosafe, Charles-River) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Zur Konzentrationsbestimmung wurden Endotoxin-Standards (Endosafe Charles-River) im Bereich von 0.02–50 EU/ml eingesetzt. Die Absorptionsmessung bei 405 nm erfolgte in einem temperierbaren Mikrotiterplatten-Reader (Genios, Tecan GmbH).Endotoxin control evidence was provided with a chromogenic LAL test (Limulus-Amebocyte-Lysate Test, Endosafe, Charles River) according to the manufacturer's instructions. to Endotoxin standards (Endosafe Charles-River) were used to determine the concentration in the range of 0.02-50 EU / ml used. The absorption measurement at 405 nm was carried out in a temperature-controlled microtiter plate reader (Genios, Tecan GmbH).
3. Western-Blot zum p12-Nachweis3. Western blot for p12 detection
Der Nachweis von p12 im Überstand von mit Beads behandelten Proben bzw. in den Fraktionen der Affinitätschromatographie erfolgte durch Western Blots. Zum Teil wurden die Proteine vorher durch NaDOC/TCA-Fällung (Natriumdeoxycholat/Tetrachloracetat) aufkonzentriert. Die Proben wurden dazu auf 12%-igen SDS Gelen elektrophoretisch aufgetrennt und auf PVDF Membranen (Immobilon, Millipore) übertragen. Die Membranen wurden mit PBS 30 min gewaschen, mit 5% Milchpulver blockiert (1 h) und anschließend mit polyklonalem anti-p12 Antikörper inkubiert (1h, Verdünnung: 1: 1000). Nach Inkubation mit einem, mit alkalischer Phosphatase konjugierter Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen IgG) erfolgte die Entwicklung der Proben mit BCIP/NBT (5-Brom-4-chloroindolylphosphat/Nitroblau-Tetrazoliumsalz).The detection of p12 in the supernatant of samples treated with beads or in the fractions of affinity chromatography was done by Western blots. Some of the proteins were previously by NaDOC / TCA precipitation (Sodium deoxycholate / tetrachloroacetate) concentrated. Samples were electrophoresed on 12% SDS gels and transferred to PVDF membranes (Immobilon, Millipore). The membranes were washed with PBS for 30 min, blocked with 5% milk powder (1 h) and then with polyclonal anti-p12 antibody incubated (1h, dilution: 1: 1000). After incubation with, with alkaline phosphatase conjugated secondary antibody (goat anti rabbit IgG) the samples were developed with BCIP / NBT (5-bromo-4-chloroindolylphosphate / nitroblue tetrazolium salt).
4. Endotoxin-Reinigung4. Endotoxin purification
Die Reinigung von Endotoxin wurde nach der Vorschrift von Galanos, C., Lüderitz, O. & Westphal, O. 1969, Europ. J. Biochem. 9, 245–249 durchgeführt.The cleaning of endotoxin has been done according to the instructions of Galanos, C., Lüderitz, O. & Westphal, O. 1969, Europ. J. Biochem. 9, 245-249 carried out.
Beispiel 5: Spezifische Kopplung von p12 an immobilisierte Jodoacetylreste:Example 5: Specific Coupling of p12 to immobilized iodoacetyl residues:
Um eine gerichtete Bindung von p12
an die Oberfläche
zu erreichen wurde die Aminosäure
Serin an Position
Es wurde ein 1 ml Sulfolink Coupling Gel (Pierce) gegossen, mit 6 ml 1 % Natriumdeoxycholat gewaschen und mit 6 ml Kopplungspuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.5) equilibriert. Anschließend wurden 1 ml p12S3C (=N-StrepS3Cp12) (1–1.5 mg/ml in Kopplungspuffer) injiziert, die Säule 15 min leicht geschüttelt, weitere 30 min ohne Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, und nochmals 1 ml p12S3C injiziert und die Inkubationsschritte wiederholt. Diese Kopplung von p12S3C wurde insgesamt 4 mal wiederholt, und anschließend die Säule mit 6 ml Kopplungspuffer gewaschen. Die Durchläufe wurden gesammelt und die jeweilige p12S3C Konzentration durch Absorptionsmessung bei 280 nm bestimmt. Es wurden 2.2–2.8 mg p12S3C pro ml Gel gebunden. Anschließend wurden überzählige Jodoacetylreste durch Inkubation (45 min) mit 1 ml Cystein (50 mM in 50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8.5) blockiert. Nach Waschen der Säule mit 16 ml 1M NaCl und 16 ml 20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5 war die Säule fertig zum Gebrauch.There was a 1 ml Sulfolink coupling Poured gel (Pierce), washed with 6 ml of 1% sodium deoxycholate and with 6 ml coupling buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.5) equilibrated. Then were 1 ml p12S3C (= N-StrepS3Cp12) (1-1.5 mg / ml in coupling buffer), the column was shaken gently for 15 min, others 30 min without shaking incubated at room temperature, and injected again with 1 ml of p12S3C and the incubation steps repeated. This coupling of p12S3C was Repeated a total of 4 times, and then the column with 6 ml of coupling buffer washed. The runs were collected and the respective p12S3C concentration by absorption measurement determined at 280 nm. 2.2-2.8 mg p12S3C per ml of gel were bound. Subsequently became excess iodoacetyl residues by incubation (45 min) with 1 ml cysteine (50 mM in 50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8.5) blocked. After washing the column with 16 ml of 1M NaCl and 16 ml of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5, the column was ready for use.
Die Fähigkeit dieses Gels Endotoxin
aus Proteinlösungen
zu entfernen, wurde mit BSA (2–4
mg/ml), Carbon Anhydrase (1–2
mg/ml) und Lysozym (3–4
mg/ml) getestet. BSA und Lysozym Lösungen wurden mit Endotoxin
von E. coli O55:B5 (Endosafe, Charles-River) oder E. coli HMS
Beispiel 6: Unspezifische Kopplung von p12 an NHS-aktiviertes Trägermaterial:Example 6: Unspecific Coupling p12 to NHS-activated carrier material:
N-hydroxysuccinimid (NHS) wird aus Verbindungen durch primäre Aminoreste verdrängt und deshalb zum Koppeln von Proteinen an Oberflächen benutzt. NHS-aktivierte Sepharose Säulen (HiTrap NHS-activated HP, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) wurden zunächst mit 6 ml eiskalter 1 mM Salzsäure gewaschen. Anschließend wurden bei Raumtemperatur 10–15 ml p12S3C (1.0–3.5 mg/ml) in 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3 zirkulär über die Säule gepumpt (Flussrate 0.8 ml/min). Nach 60 min wurde der Durchlauf fraktionsweise gesammelt und die Säule mit 6 ml Puffer gewaschen. Aus diesen Fraktionen wurde das NHS durch Entsalzen der Lösung über HiTrap-Desalting Säulchen (5 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) abgetrennt und anschließend die p12-Menge durch Absorptionsmessung bei 280 nm bestimmt. 20–25 mg p12S3C wurden an die Säule gebunden. Die Säule wurde nach der Kopplung entsprechend den Herstellerangaben wiederholt mit jeweils 6 ml Blockierungspuffer (0.5 M Ethanolamin, 0.5 M NaCl, pH 8.3) und Waschpuffer (0.1 M Acetat, 0.5 M NaCl, pH 4.0) gespült. Anschließend wurde die Säule mit 6 ml Gebrauchspuffer (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 oder 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.5) equilibriert.N-hydroxysuccinimide (NHS) is displaced from compounds by primary amino residues and is therefore used to couple proteins to surfaces. NHS-activated Sepharose columns (HiTrap NHS-activated HP, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) were first washed with 6 ml of ice-cold 1 mM hydrochloric acid. Then 10-15 ml p12S3C (1.0-3.5 mg / ml) in 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3 were pumped circularly over the column at a room temperature (flow rate 0.8 ml / min). After 60 min the run was collected fractionally and the column washed with 6 ml buffer. The NHS was separated from these fractions by desalting the solution using HiTrap-Desalting columns (5 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) and then the amount of p12 was determined by absorption measurement at 280 nm. 20-25 mg p12S3C were bound to the column. After coupling, the column was repeatedly rinsed in accordance with the manufacturer's instructions with 6 ml of blocking buffer (0.5 M ethanolamine, 0.5 M NaCl, pH 8.3) and washing buffer (0.1 M acetate, 0.5 M NaCl, pH 4.0). The column was then equilibrated with 6 ml of use buffer (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 or 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5).
Die Endotoxinentfernung über diese
Säule wurde
mit Lysozymlösungen
(3–4 mg/ml
in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 oder 20 mM Tris, 150 mM NaCl,
pH 8.5) getestet. Die Lysozymlösungen
wurden mit Endotoxin von E. coli HMS 174 gespickt (500 EU/ml). Es
wurden 0.5 ml Proteinlösung
auf die Säule
gegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die
Säule mit
Puffer gewaschen. Das Lysozym wurden fraktionsweise gesammelt und
der Endotoxingehalt vor und nach der Säule mittels eines chromogenen LAL-Tests
(Endosafe, Charles-River) bestimmt. Außerdem wurde die Proteinwiederfindung
durch Absorptionsmessungen bei 280 nm ermittelt. Die Endotoxine
wurden zu 85–90%
aus der Lösung
entfernt, wie in
Beispiel 7: Gerichtete Kopplung von p12 an über Diaminoethan und N-Succinimidyl-iodoacetat (SIA) als Spacer an NHS-aktiviertes Trägermaterial-Säule.Example 7: Directed Coupling from p12 to via Diaminoethane and N-succinimidyl iodoacetate (SIA) as spacers on NHS-activated Support material column.
Um eine gerichtete Bindung an das Chromatographie Trägermaterial zu erreichen wurde ein bifunktioneller Linker an NHS-aktivierte Oberfläche gebunden, der eine Kopplung von p12S3C über dessen freies Cystein und Jodoacetylreste des bifunktionalen Linkers ermöglicht.To be bound to that Chromatography support material to achieve a bifunctional linker on NHS-activated surface bound by a coupling of p12S3C via its free cysteine and Iodoacetyl residues of the bifunctional linker enables.
NHS-aktivierte Sepharose Säulen (HiTrap NHS-activated HP, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biutech) wurden zunächst mit 6 ml eiskalter 1 mM Salzsäure gewaschen, danach 1 ml Ethylendiamin (10 mg/ml in 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3) injiziert und die Säule 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Blockieren überzähliger NHS-Gruppen mit Ethanolamin (0.5 M Ethanolamin, 0.5 M NaCl, pH 8.3) und Waschen (0.1 M Acetat, 0.5 M NaCl, pH 4.0) der Säule wurde die Säule mit 6 ml Boratpuffer ( 50 mM Natriumborat, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.3) equilibriert. Anschließend wurde 30 min lang10 ml N-Succinimidyl-iodoacetat (SIA, Pierce, 200 μl SIA-Stammlösung in 10 ml Boratpuffer; SIA-Stammlösung: 1.4 mg SIA in 1 ml DMSO) zirkulär über die Säule gespült. Die Säule wurde danach mit 6 ml Boratpuffer gewaschen und 1 Stunde lang p12S3C (1 mg/ml, 50 ml in Boratpuffer) über die Säule gespült. Überschüssige Iodoacetylreste wurden mit 1 ml Cysteinlösung (5 mM Cystein in Boratpuffer, 15 min bei Raumtemperatur inkubieren) abgesättigt, bevor die Säule mit den Gebrauchspuffern (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 oder 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5) equilibriert wurden. Die Kopplungsreaktionen mit SIA wurden im Dunkeln durchgeführt.NHS-activated Sepharose columns (HiTrap NHS-activated HP, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biutech) were first washed with 6 ml of ice-cold 1 mM hydrochloric acid, then 1 ml of ethylenediamine (10 mg / ml in 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl , pH 8.3) and the column was incubated for 30 min at room temperature. After blocking excess NHS groups with ethanolamine (0.5 M ethanolamine, 0.5 M NaCl, pH 8.3) and washing (0.1 M acetate, 0.5 M NaCl, pH 4.0) the column was washed with 6 ml borate buffer (50 mM sodium borate, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.3). 10 ml of N-succinimidyl iodoacetate (SIA, Pierce, 200 μl of SIA stock solution in 10 ml of borate buffer; SIA stock solution: 1.4 mg of SIA in 1 ml of DMSO) were then circularly rinsed over the column for 30 min. The column was then washed with 6 ml borate buffer and p12S3C (1 mg / ml, 50 ml in borate buffer) rinsed over the column for 1 hour. Excess iodoacetyl residues were saturated with 1 ml cysteine solution (5 mM cysteine in borate buffer, incubate for 15 min at room temperature) before the column with the use buffers (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 or 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5 ) were equilibrated. The coupling reactions with SIA were carried out in the dark.
Die Endotoxinentfernung über diese
Säule wurde
mit Lysozymlösungen
(3–4 mg/ml
in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 oder 20 mM Tris, 150 mM NaCl,
pH 8.5) getestet. Die Lysozymlösungen
wurden mit Endotoxin von E. coli HMS 174 gespickt 0500 EU/ml). Es
wurde 0.5 ml Proteinlösung
auf die Säule
gegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die
Säule mit
Puffer gewaschen. Das Lysozym wurde fraktionsweiße gesammelt und der Endotoxingehalt
vor und nach der Säule
mittels eines chromogenen LAL-Tests (Endosafe, Charles-River) bestimmt.
Außerdem
wurde die Proteinwiederfindung durch Absorptionsmessungen bei 280
nm ermittelt. Die Endotoxine wurden zu 90% aus der Lösung entfernt,
wie in
Beispiel 8: unspezifische Kopplung von biotinyliertem p12 an magnetische Streptavidin-Beads.Example 8: non-specific Coupling of biotinylated p12 to magnetic streptavidin beads.
sp12 (3 mg/ml in PBS, 0.05% Tween20) wurde mit Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce), im Verhältnis 1:10 bis 1:20 eine Stunde bei RT inkubiert und anschließend gegen Puffer (z.B. PBS oder 20 mM Hepes, 150 nM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.5) dialysiert. NHS-aktiviertes Biotin bindet dabei an primäre Aminoreste von p12. Anschließend wurden zu 1ml Streptavidin Beads (MagPrep Streptavidin Beads, Merck) 50 μl biotinyliertes p12 (1 mg/ml) gegeben, 2h bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend überschüssiges p12 durch viermaliges Waschen mit 1.5 ml 20 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.5 entfernt.sp12 (3 mg / ml in PBS, 0.05% Tween20) with 1:10 sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce) incubated at 1:20 at RT for one hour and then against Buffer (e.g. PBS or 20 mM Hepes, 150 nM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.5) dialyzed. NHS-activated biotin binds to primary amino residues from p12. Subsequently became 1 ml streptavidin beads (MagPrep streptavidin beads, Merck) 50 ul biotinylated p12 (1 mg / ml), shaken at room temperature for 2 hours and then excess p12 by washing four times with 1.5 ml of 20 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.5 removed.
Die Endotoxinentfernung wurde mit
Puffer (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5) und Proteinlösungen (
Beispiel 9: unspezifische Kopplung von biotinyliertem p12 an immobilisiertes Streptavidin.Example 9: non-specific Coupling of biotinylated p12 to immobilized streptavidin.
P12 (3 mg/ml in PBS, 0.05% Tween20) wurde mit Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce), im Verhältnis 1:10 bis 1:20 eine Stunde bei RT inkubiert und anschließend gegen Puffer (z.B. PBS oder 20 mM Hepes, 150 mM NaCl 5 mM EDTA, pH 7.5) dialysiert. NHS-aktiviertes Biotin bindet dabei an primäre Aminoreste von p12. Das biotinylierte p12 wird anschließend 1 h bei Raumtemperatur mit Streptavidin beladenen Chromatographiematerial (ImmunoPure immobilized Streptavidin: 6% quervernetzte Agarose Beads) inkubiert und überschüssiges p12 durch Waschen mit PBS entfernt.P12 (3 mg / ml in PBS, 0.05% Tween20) was with sulfo-NHS-LC-LC-biotin (Pierce), in a ratio of 1:10 to Incubate 1:20 at RT and then against buffer (e.g. PBS or 20 mM Hepes, 150 mM NaCl 5 mM EDTA, pH 7.5) dialyzed. NHS-activated Biotin binds to primary Amino residues of p12. The biotinylated p12 is then 1 h Chromatography material loaded with streptavidin at room temperature (ImmunoPure immobilized streptavidin: 6% cross-linked agarose beads) incubated and excess p12 removed by washing with PBS.
Die Endotoxinentfernung wurde mit
Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0) und BSA (0.5 mg/ml in 20
mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0) getestet. Je 1 ml Puffer bzw. BSA-Lösung wurden
mit 10 EU/ml gespickt, 50 μl
p12-Agarose zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Die
p12 Agarose wurde anschließend
abzentrifugiert und die Endotoxin- und Proteinkonzentration im Überstand
gemessen. Aus dem Puffer konnten 99% und aus der BSA-Lösung 86 % Endotoxin entfernt
werden (
Beispiel 10: Untersuchungen über die p12-Endotoxin Bindung mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz-MessungenExample 10: Studies on the p12 endotoxin binding by means of surface plasmon resonance measurements
Die Bindung von p12 an Endotoxin
oder an Bakterien, über
die Lipopolysaccharide in der äußeren Zellmembran,
wurde mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz
Messungen untersucht (Biacore J). Um die Dissoziationskonstante
(Kd) zu ermittelt, wurde Endotoxin von E.
coli O55:B5 (Sigma) auf einem hydrophoben HPA-Chip entsprechend
der Anleitung des Herstellers immobilisiert und p12 in verschiedenen
Konzentrationen injiziert (
Tabelle 1: Links: Dissoziationskonstanten von Endotoxin an p12 in Abhängigkeit von dem pH-Wert der Lösung. Rechts: Struktur der Endotoxin-Herzregion verschiedener E.coli-Mutanten. Table 1: Left: Dissociation constants of endotoxin at p12 depending on the pH of the solution. Right: Structure of the endotoxin heart region of various E. coli mutants.
Um die Bindung von Bakterien an p12
zu untersuchen, wurde biotinyliertes p12 auf Streptavidin-Chips immobilisiert
und verschiedene E. coli Stämme
injiziert. Die Bakterien wurden für die Messungen in PBS aufgenommen.
Es wurden E. coli Stämme
verwendet, die Lipopolysaccharide mit unterschiedlichen Polysaccharid-Anteilen
besitzen. Der Polysaccharidteil besteht aus einer „Herz"-Region, die mit
dem Lipid A verknüpft
ist und dem sogenannten O-Antigen. Das O-Antigen variert sehr stark
zwischen verschiedenen Bakterienarten und auch Bakterienstämmen, während die „Herz"-Region stark konserviert
ist. Stämme,
die die „Herz"-Region und O-Antigen
(z.B. E. coli), sowie Stämme
die eine vollständige „Herz"-Region (E. coli
D21) besitzen wurden von p12 gebunden, während Stämme mit einem stark verkürzter „Herz"-Region (z.B. E.
coli D21f2) nicht mehr von p12 erkannt wurden (
Beispiel 12: rekombinante p12-KonstrukteExample 12: recombinant p12 constructs
-
1. Konstruktion von p12 mit N-terminalem Strep-Tag (N-Strep-p12):
Mittels PCR wurde an das 5'-Ende
des T4p12-Gens die Nukleotidsequenz für den Strep-Tag (US patent
5,506,121 5,506,121 - 2. Einfügen eines N-terminalen Cysteinrests in N-Strep-p12 (N-Strep-S3C-p12 und N-Strep-Sl4C-p12): Die Einfügung eines N-terminalen Cysteinrestes wurde wie unter 1. beschrieben durchgeführt, wobei dafür zwei neue Primer für das 5'-Ende konstruiert wurden. Für das N-Strep-S3C-p12 wurde der Primer 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO:3), für das N-Strep-Sl4C-p12 wurde der Primer 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ 1D NO:4) verwendet.2. Paste an N-terminal cysteine residue in N-Strep-p12 (N-Strep-S3C-p12 and N-Strep-Sl4C-p12): The insertion an N-terminal cysteine residue was described as under 1. carried out, being for that two new primers for constructed the 5 'end were. For the N-Strep-S3C-p12 became the primer 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3 '(SEQ ID NO: 3), for the N-Strep-Sl4C-p12 became the primer 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3 '(SEQ 1D NO: 4) used.
- 3. Reinigung von N-Strep-p12 Protein: Der E. coli Stamm BL21(DE3) mit dem Plasmid pNS-T4p12p57 wurde in 2 1 Schüttelkulturen (LB-Medium mit Ampicillin 100 μg/ml) bis zu einer 0D600 von 0.5–0.7 bei 37°C gezogen und die Expression des N-Strep-pl2-Proteins wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG (Isopropyl-β-thio-galactopyranoside) induziert. Nach Inkubation bei 37°C für 4h wurden die Zellen abgeerntet. Geerntete Zellen aus 10 1 Kultur wurden in 50 ml Natriumphosphat, 20 mM pH 7.2, 2 mM MgSO4, 0.1 M NaCl aufgenommen, durch dreimalige French-Press-Behandlung (20.000 psi) aufgebrochen und anschließend 30 min bei 15.000 rpm (SS34) abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen im gleichen Puffer wurde das N-Strep-p12 Protein aus dem Pellet das Pellet 3x mit durch Rühren für 30 min in 40 mM TrisHCl pH 8.0, 10 mM EDTA extrahiert, der Ansatz für 30 min bei 15.000 rpm (SS34) zentrifugiert und das abgelöste NS-p12 im Überstand bei 4°C gelagert. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt. und die vereinigten Überstände wurden auf eine Streptactin-Affinitätssäule (15 ml), äquilibriert mit Puffer „W" (100 mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl), aufgetragen (IBA GmbH, Göttingen). Nach Waschen mit 5 Säulenvolumina Puffer „W" wurde mit 3 Volumina Puffer „W" mit 2.5 mM Desthiobiotin in Puffer „W" eluiert. Nach mehrmaliger Dialyse gegen Puffer „W" und Aufkonzentration wurde über SDS-PAGE und UV-Spektroskopie (Burda et.al. 1999) die Konzentration und Reinheit von N-Strep-T4p12 ermittelt. Aus 10 Liter Kultur wurden so ca. 100 mg N-Strep-T4p12 gereinigt.3. Purification of N-Strep-p12 protein: The E. coli strain BL21 (DE3) with the plasmid pNS-T4p12p57 was in 2 1 shake cultures (LB medium with ampicillin 100 μg / ml) up to a 0D600 of 0.5-0.7 at 37 ° C. and the expression of the N-Strep-pl2 protein was reduced by adding 1 mM IPTG (isopropyl-β -thio-galactopyranoside) induced. After incubation at 37 ° C for 4 h, the cells were harvested. Harvested cells from 10 l culture were taken up in 50 ml sodium phosphate, 20 mM pH 7.2, 2 mM MgSO 4 , 0.1 M NaCl, broken up by three French press treatments (20,000 psi) and then centrifuged at 15,000 rpm (SS34) for 30 min , After washing twice in the same buffer, the N-Strep-p12 protein from the pellet was extracted 3 times with the pellet by stirring in 40 mM TrisHCl pH 8.0, 10 mM EDTA for 30 min, the mixture was centrifuged for 30 min at 15,000 rpm (SS34) and the detached NS-p12 was stored in the supernatant at 4 ° C. The extraction was repeated twice. and the combined supernatants were applied to a streptactin affinity column (15 ml) equilibrated with buffer "W" (100 mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) (IBA GmbH, Goettingen). After washing with 5 column volumes Buffer "W" was eluted with 3 volumes of buffer "W" with 2.5 mM desthiobiotin in buffer "W". After repeated dialysis against buffer “W” and concentration, the concentration and purity of N-Strep-T4p12 were determined via SDS-PAGE and UV spectroscopy (Burda et.al. 1999). Approx. 100 mg N were thus obtained from 10 liters of culture -Strep-T4p12 cleaned.
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DE10393326T DE10393326D2 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for detection and removal of endotoxin |
EP03760571A EP1516188B1 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for identifying and extracting endotoxin |
CNB038145731A CN100343671C (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for identifying and extracting endotoxin |
AU2003250270A AU2003250270B2 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for identifying and extracting endotoxin |
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PL375203A PL209568B1 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for identifying and extracting endotoxin |
AT03760571T ATE345502T1 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | METHOD FOR DETECTION AND REMOVAL OF ENDOTOXIN |
DK03760571T DK1516188T3 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for detection and removal of endotoxin |
CA2490467A CA2490467C (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method for detecting and for removing endotoxin |
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RU2004135062/15A RU2344425C2 (en) | 2002-06-24 | 2003-06-24 | Method of identification and endotoxin extraction |
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10360844B4 (en) * | 2003-12-20 | 2007-05-16 | Profos Ag | Method for detection and removal of endotoxin |
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