DE1022358B - Production and extraction of the antibiotic 101a - Google Patents
Production and extraction of the antibiotic 101aInfo
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Description
Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums 101 a Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines neuen Antibiotikums, das hierin als Antibiotikum 101 a bezeichnet wird.Production and extraction of the antibiotic 101 a The invention relates focus on the manufacture of a new antibiotic, which is referred to herein as an antibiotic 101 a is designated.
Das neue Antibiotikum kann erfindungsgemäß erhalten werden mittels eines Fermentationsverfahrens, in welchem Streptomyces sp. 101 in wäßrigem Nährmedium kultiviert und, nachdem diesem eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit verliehen ist, daraus gewonnen wird.According to the invention, the new antibiotic can be obtained by means of a fermentation process in which Streptomyces sp. 101 in an aqueous nutrient medium cultivated and, after this, given an essential antibiotic activity is obtained from it.
Streptomyces sp. 101 ist eine neue Art, die aus einer Bodenprobe, die in Dallas, Texas, entnommen wurde, isoliert wurde. Eine Kultur des lebenden Organismus -wurde bei der Abteilung für Fermentation der Northern Utilization Research Branch, des U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und der ständigen Sammlung als NRRL 2494 einverleibt. Dieser neue Mikroorganismus unterscheidet sich deutlich durch die Bildung von Pigmentkörnern sowohl im vegetativen als auch im Luft-Mycel. Nur zwei andere Sorten, Streptomyces fulvissimus und Streptomyces rubrireticuli, bilden ebenfalls Pigmentkörner. Beide Species bilden jedoch Antibiotika, die sich vom Antibiotikum 101 a deutlich unterscheiden. Die erste Abart bildet Valinomycin, das sich von 101 a durch seine farblosen Kristalle unterscheidet. Das andere bildet Streptin und Oxystreptin (Reticulin), die sich beide durch ihre Unlöslichkeit in Aceton, Chloroform und Äther von 101a unterscheiden. Eine weitere Charakterisierung dieses Species sowie verschiedene seiner Spiel- und Abarten, die alle 101 a produzieren, werden nachstehend angeführt.Streptomyces sp. 101 is a new species that emerged from a soil sample, taken in Dallas, Texas. A culture of the living Organism - was registered with the Fermentation Department of Northern Utilization Research Branch, of the U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, and the permanent collection incorporated as NRRL 2494. This new microorganism is different clearly through the formation of pigment grains both in the vegetative and in air mycelium. Only two other varieties, Streptomyces fulvissimus and Streptomyces rubrireticuli, also form pigment grains. However, both species produce antibiotics, which differ significantly from antibiotic 101 a. The first variety is valinomycin, which differs from 101 a in its colorless crystals. The other educates Streptin and oxystreptin (reticulin), both of which are distinguished by their insolubility in Differentiate acetone, chloroform and ether from 101a. Another characterization this species as well as various of its game and varieties, all of which produce 101 a, are listed below.
Das makroskopische und mikroskopische Aussehen von Streptomyces sp. 101 auf verschiedenen Medien ist von allen im -Manual of Determinative Bacteriology« von Bergy, 6. Auflage, und in rActinomycetes and Their Antibiotics<; von Waksman und Lechevalier beschriebenen Kulturen verschieden. Sein vorgeschlagener Name ist Streptomyces spectabilis.The macroscopic and microscopic appearance of Streptomyces sp. 101 on different media is of all in the -Manual of Determinative Bacteriology « von Bergy, 6th Edition, and in rActinomycetes and Their Antibiotics <; by Waksman and Lechevalier described cultures differently. Its suggested name is Streptomyces spectabilis.
Streptomyces sp. 101, wie es ursprünglich aus einer Bodenprobe isoliert
wurde, zeigt die in Tabelle I zusammengestellten Eigenschaften der Kulturen. Jede
Beimpfung erfolgte mit einem in Entwicklung befindlichen, in 100 ml Trypton-Hefeextraktbouillon
(enthaltend 0,5 °/o Trypton und 0,30/, Hefeextrakt) auf einem hin und her
gehenden Schütteltisch bei 28° C gezüchteten Inokulum. Nach 48 Stunden wurde das
Inokulum 1 Minute gemischt (Waring-Mischer) und dann je 0,2 ml davon auf Altarplatten
gegeben. Die Altarplatten wurden bei 28° C bebrütet. Die Bestimmungen erfolgten
am 4. und 7. Tage.
1. Na-Caseinat 2,0; lösliche Stärke 1,0, K,HP04, 0,2, MgS 04 - 7 H2 0 0,2, Fe S 0,, - 7 H2 0 Spuren, Agar 15.1. Na caseinate 2.0; soluble starch 1.0, K, HP04, 0.2, MgS 04 - 7 H2 0 0.2, Fe S 0 ,, - 7 H2 0 traces, agar 15.
2. NaN03 2,0, K,HP04 1,0, MgS04 - 7 H20 0,5, KCl 0,5, Fe S04 - 7 H20 0,01, Saccharose 30,0, auf pH 6,6 gestellt, Agar 15,0.2. NaN03 2.0, K, HP04 1.0, MgS04-7 H2O 0.5, KCl 0.5, Fe SO4-7 H2O 0.01, sucrose 30.0, adjusted to pH 6.6, agar 15.0.
3. Maltose 10,0, Tryptone 5,0, K2HP04 0,5, Na Cl 0,5, FeS04 - 7 H20 Spuren, Agar 15,0. (Tryptone: Pankreatisches Abbauprodukt von Casein mit hohem Tryptophangehalt.) 4. Hefeextrakt 1,0, Rindfleischextrakt 1,0, N - Z Amine A (enzymatisches Caseinabbauprodukt) 2,0, Glukose 10,0, Medium auf pH 7,0 gestellt, Agar 15,0.3. Maltose 10.0, Tryptone 5.0, K2HP04 0.5, NaCl 0.5, FeS04-7H20 Lanes, agar 15.0. (Tryptone: Pancreatic breakdown product of casein with a high tryptophan content.) 4.Yeast extract 1.0, beef extract 1.0, N - Z amine A (enzymatic casein breakdown product) 2.0, glucose 10.0, medium adjusted to pH 7.0, agar 15.0.
5. Maisstärke 10,0, K,HP0, 0,3, MgCO3 1,0, NaCl 0,5, NaN03 1,0, Medium auf pH 7,0 gestellt, Agar 15,0. 6. Lösliche Stärke 2,0, K2 H P 04 0,5, Mg S 0, - 7 H., 0 0,2, CaC12 0,05, NaN03 0,05, Asparagin 0,05, FeS04 - 7 H20 Spuren, Medium auf pH 7,4 gestellt, Agar 20,0.5. Corn starch 10.0, K, HP0, 0.3, MgCO3 1.0, NaCl 0.5, NaN03 1.0, medium adjusted to pH 7.0, agar 15.0. 6. Soluble starch 2.0, K2 H P 04 0.5, Mg S 0, - 7 H., 0 0.2, CaC12 0.05, NaN03 0.05, asparagine 0.05, FeS04 - 7 H2O traces, medium adjusted to pH 7.4, agar 20.0.
7. Rindfleischextrakt 3,0, Peptone (Hydrolysat von animalischem Protein mit niedrigem Molekulargewicht) 5,0, lösliche Stärke 2,0, Medium auf pH 7,0 gestellt, Agar 15,0.7. Beef Extract 3.0, Peptones (hydrolyzate of animal protein with low molecular weight) 5.0, soluble starch 2.0, medium adjusted to pH 7.0, Agar 15.0.
B. Peptone 15,0, Proteose Peptone (Hydrolysat von animalischem Protein von hohem Molekulargewicht) 5,0, Ferri-ammoniumcitrat 0,5, Dikaliumphosphat 1,0, Natriumthiosulfat 0,08, Agar 15,0.B. Peptone 15.0, Proteose Peptone (hydrolyzate of animal protein high molecular weight) 5.0, ferric ammonium citrate 0.5, dipotassium phosphate 1.0, Sodium thiosulfate 0.08, agar 15.0.
Streptomyces sp. 101 zeigt bei der Kultur auf folgende Medien kennzeichnende morphologische und Kultureigenschaften. Die Mengen der Bestandteile sind in Gramm pro Liter destilliertem Wasser angegeben. Die Medien werden 15 Minuten 120° C und 1,05 kg. cm2 im Autoklav sterilisiert.Streptomyces sp. When cultivated on the following media, 101 shows characteristic morphological and cultural properties. The amounts of the ingredients are given in grams per liter of distilled water. The media become 120 ° C and 1.05 kg for 15 minutes. cm2 sterilized in the autoclave.
Reine Gelatine (Gelatine 120).Pure gelatin (Gelatin 120).
Nährgelatine (Rindfleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Gelatine 120, eingestellt auf p.. 7,0). Nähragar (Rindfleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, eingestellt auf pH 7,0, Agar 15,0).Nutrient gelatin (beef extract 3.0, peptone 5.0, gelatin 120, adjusted on p. 7,0). Nutrient agar (beef extract 3.0, peptone 5.0, adjusted to pH 7.0, Agar 15.0).
Nährbouillon (Rindfleischextrakt 3,0, Pepton 5,0) d-Glukose Bouillon (Rindfleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Glukose 10,0).Nutrient broth (beef extract 3.0, peptone 5.0) d-glucose broth (Beef extract 3.0, peptone 5.0, glucose 10.0).
2-Glukose-Agar (Rindfleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Glukose 10,0, eingestellt auf pH 7,0, Agar 15,0. Trypton-Bouillon (Trypton 10,0).2-glucose agar (beef extract 3.0, peptone 5.0, glucose 10.0, adjusted to pH 7.0, agar 15.0. Tryptone Broth (Tryptone 10.0).
Tyrosin-Agar von Waksman [Glukose 10,0, Tyrosin 1,0, (NH4)2SO4 0,5, K,HP0,, 0,5, pl, auf 7,0 eingestellt, Agar 15,0j.Waksman tyrosine agar [glucose 10.0, tyrosine 1.0, (NH4) 2SO4 0.5, K, HP0 ,, 0.5, pl, adjusted to 7.0, agar 15.0j.
Tyrosin-Bouillon (Tyrosin 1,0 auf pH 7,0 eingestellt). Lackmusmilch (Trockenmilch mit Lackmuszusatz). Nitrat-Nährbouillon (Rindfleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, KN03 1,0).Tyrosine broth (tyrosine 1.0 adjusted to pH 7.0). Litmus milk (Dried milk with litmus added). Nitrate nutrient broth (beef extract 3.0, peptone 5.0, KN03 1.0).
Synthetische Nitrat-Nährbouillon (K2 H P O,, 0,5 N a Cl 0,5, MgS0, - 7 H20 0,2, Na-';0, 2,0, Glukose 10,0). Calcium-maleinat :gar (Calciummaleinat 10,0, NH,Cl 0,5, Ii@ H P 0, 0,5, Einstellen auf PH 7,0, Agar 18,0. Verdünnungen des Organismus, hergestellt aus steriler Erde, wurden auf Bennetsche und Maltose Agar-Platten aufgestrichen. Man fand vier verschiedene Varianten (nach 6 Tagen Bebrütung bei 28' C), eine mit den Eigenschaften des Stammes, d. h. eine orangegefleckte, eine von sehr dunklem Orange mit keinem Wachstum an der Luft, eine mit weißem Wachstum an der Luft und eine farblose, d. h. mit gleicher Farbe wie das Medium. Die gleichen Varianten wurden erhalten beim Aufbringen der orangegefleckten Variante und derjenigen mit weißem Wachstum an der Luft; dunkelorange und farblose Varianten durch Aufbringen der dunkelorangen Form. Die farblose Varietät blieb stabil. Die Kulturmerkmale der Variante mit weißem Wachstum an der Luft waren die gleichen wie bei der orangegefleckten Variante.Synthetic nitrate nutrient broth (K2 H P O ,, 0.5 N a Cl 0.5, MgS0, - 7 H 2 O 0.2, Na - '; 0, 2.0, glucose 10.0). Calcium maleate: even (calcium maleate 10.0, NH, Cl 0.5, Ii @ H P 0, 0.5, adjust to pH 7.0, agar 18.0. Dilutions the organism, made from sterile soil, were based on Bennetsche and maltose Spread agar plates. Four different variants were found (after 6 days of incubation at 28 'C), one with the properties of the stem, d. H. an orange spotted one one very dark orange with no growth in air, one with white growth in the air and a colorless, d. H. with the same color as the medium. The same Variants were obtained when applying the orange-spotted variant and those with white growth in the air; dark orange and colorless variants by applying the dark orange form. The colorless variety remained stable. The cultural characteristics of the Variants with white growth in the air were the same as the orange-spotted ones Variant.
Die Kulturmerkmale der Varietäten auf verschiedenen Medien sind in
der Tabelle II zusammengestellt, und zwar nach 1-1 Tagen Bebrütung bei 28 - C. Die
Beimpfung erfolgte wie bei den Kulturen der Tabelle 1.
3. Nach weiteren 48 Stunden wurde die überstehende Flüssigkeit abdekantiert.
Die vegetative Kultur wurde, wie oben beschrieben und im Warin-Mischer, 1 Minute
mit 100 ml sterilem, destilliertem Wasser vermischt.
4. Die Agarkeile
wurden mit 0,2 ml des vermischten Inokulums beimpft.
Alle Varietäten entwickeln sich bei Temperaturen von 24 bis 37° C, die günstigsten Temperaturen liegen zwischen 24 und 28° C. In Bennets Agar entsteht bei 37- C nach 24 bis 48 Stunden Bebrütung ein stark gelbes Pigment.All varieties develop at temperatures of 24 to 37 ° C, the most favorable temperatures are between 24 and 28 ° C. Bennet's agar at 37 ° C produces a strong yellow pigment after 24 to 48 hours of incubation.
Die mikroskopische Untersuchung zeigt sehr lange gerade Conidienketten, die sich monopodial aus den Luftmycelium erheben. Diese kann man in Pilzkulturplättchen nach Brown in situ entwickeln sehen. Ein typisches Merkmal dieses Organismus ist die Bildung von Pigmentkörnern sowohl im vegetativen als auch im Luftmycel. Auf den Pilzkulturplättchen nach Brown erscheinen diese exogen und endogen in Zonen von verschmelzendem oder ineinander übergehendem Mycel. Die Körner sind bei den nicht pigmentierten Varietäten farblos und bei den gefärbten Varietäten orangerot.The microscopic examination shows very long straight chains of conidia, which rise monopodially from the aerial mycelium. These can be found in mushroom culture plates see Brown develop in situ. A typical feature of this organism is the formation of pigment grains in both the vegetative and aerial mycelium. on the fungal culture platelets according to Brown these appear exogenous and endogenous in zones of merging or merging mycelium. The grains are with the non-pigmented varieties are colorless and the colored varieties are orange-red.
Bei Tüpfelpräparaten und nassen Präparaten von nicht geflecktem Material, wo das Mycel abgetrennt wird, erscheinen die Körner in mehr oder weniger geordneten Reihen. Bei Tüpfelpräparaten ist das die Körner enthaltende Mycel opak und hat einen Durchmesser von 0,78 bis 1,569 Lösungsmittelextrakte aus dem Pigment aus Schrägagarkulturen haben antibiotische Wirksamkeit. Eine gleiche antibiotische Wirksamkeit zeigen farblose und gefärbte Varietäten auf Agar-Strichplatten.For spotted specimens and wet specimens of non-spotted material, where the mycelium is separated, the grains appear in more or less ordered form Rows. In the case of spot preparations, the mycelium containing the grains is opaque and has a Diameter from 0.78 to 1.569. Solvent extracts from the pigment from agar slant cultures have antibiotic effectiveness. Colorless ones show the same antibiotic effectiveness and stained varieties on agar graticules.
101 a kann erhalten werden, indem man Streptomyces sp.101 in wäßrigem Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, wobei das Medium vorzugsweise sowohl ein assimilierbares Kohlehydrat und eine Stickstoffverbindung enthält. Obschon eine Anzahl geeigneter Medien zur Verfügung steht, wird man aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, der höchsten Ausbeute an antibiotischem Material und der leichten Isolierbarkeit gewisse Kulturmedien bevorzugen. Die zur Zeit bevorzugten Kohlehydratquellen sind Glukose, Dextrin, Melassen und Stärke sowie Mischungen dieser Stoffe. Andere geeignete Quellen sind Maltose, Galactose, Mannit, Sojabohnenöl u. dgl. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Sojabohnenmehl, Fischmehl, Baumwollsamenmehl, Kay Soy (feingepulvertes entfettetes Sojabohnenmehl) u. dgl. Andere geeignete Quellen sind Erdnußmehl, Bierhefe, Mais-Glutenmehl, Maiseinweichwasser usw.101 a can be obtained by treating Streptomyces sp.101 in aqueous Culture medium cultivated under submerged aerobic conditions, the medium preferably contains both an assimilable carbohydrate and a nitrogen compound. Although a number of suitable media is available, one will, for reasons of economy, the highest yield of antibiotic material and easy isolation prefer certain culture media. The currently preferred sources of carbohydrates are Glucose, dextrin, molasses and starch and mixtures of these substances. Other suitable Sources are maltose, galactose, mannitol, soybean oil and the like. Preferred nitrogen suppliers are soybean meal, fish meal, cottonseed meal, kay soy (finely powdered defatted Soybean meal) and the like. Other suitable sources are peanut meal, brewer's yeast, corn gluten meal, Corn soaking water, etc.
Das Medium enthält vorteilhaft auch anorganische Nährsalze wie Kalium-, Natrium-, Calcium-phosphat oder -sulfat u. dgl. Wichtige Spurenelemente, wie Magnesium, Mangan, Zink, Eisen u. dgl., können ebenfalls im Kulturmedium zur Züchtung von Streptomy ces sp. 101 enthalten sein. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich mit den anderen Bestandteilen des Mediums in Form von Verunreinigungen eingeführt.The medium advantageously also contains inorganic nutrient salts such as potassium, Sodium, calcium phosphate or sulfate and the like. Important trace elements such as magnesium, Manganese, zinc, iron and the like can also be used in the culture medium for growing Streptomy ces sp. 101 should be included. Such trace elements are commonly used with the others Components of the medium introduced in the form of impurities.
Die im Verfahren verwendeten -Medien können außer den Nährkomponenten auch noch Precursors enthalten, die zu wertvollen Produkten führen. So kann man beispielsweise eine assimilierbare Kobaltquelle zusetzen, falls man die Entstehung von Cobaltaminen (Vitamin B1 und vitamin-B"artige Produkte) wünscht, und diese Nebenprodukte dann nach üblichen Methoden isolieren. Ferner kann man Steroidprecursors, wie Progesteron, Reichsteins Verbindung S oder SAcetat, zusetzen, um ein in 11-Stellung oxydiertes Steroid zu erhalten.The media used in the process can, in addition to the nutrient components also contain precursors that lead to valuable products. So you can for example, add an assimilable source of cobalt, if the emergence of cobaltamines (vitamin B1 and vitamin-B "like products) desires, and these by-products then isolate by conventional methods. Furthermore, one can use steroid precursors such as progesterone, Reichstein's compound S or S acetate, add to an 11-position oxidized Get steroid.
Zur Erzielung des besten Wachstums von Streptomyces sp. 101 sollte man vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus das Kulturmedium auf ein pn zwischen etwa 6,5 bis 7,5 einstellen.To get the best growth of Streptomyces sp. 101 should before inoculation with the microorganism, the culture medium on a pn between set about 6.5 to 7.5.
Die bevorzugte Art der Durchführung der Fermentierung ist bei der Produktion großer Mengen von 101 a die submerse aerobe Kultur. Zur Herstellung von begrenzten Mengen des Antibiotikums kann man in Schüttelflaschenkulturen oder mit Oberflächenkulturen in Flaschen arbeiten. Wenn man die Kultur in großen Behältern oder Tanks durchführt, so ist es empfehlenswert, für die Beimpfung eine im Wachstum befindliche Form des 1likroorganismus zu verwenden, um eine ausgesprochene Verzögerung der Bildung des Antibiotikums und die damit verbundene ungenügende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Es ist deshalb erwünscht, zuerst ein sich entwickelndes Saatgut des Mikroorganismus zu erzeugen, indem man eine verhältnismäßig kleine Menge Kulturmedium mit von einer Schrägagarkultur abgekratztem .Material beimpft, und wenn ein junges, sich kräftig entwickelndes Inokulum entstanden ist, dieses aseptisch in die großen Behälter oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Saatgut hergestellt wird, kann das gleiche sein, wie das bei der Herstellung des Antibiotikums verwendete, oder aber von diesem verschieden.The preferred way of carrying out the fermentation is in the Production of large quantities of 101 a submerged aerobic culture. For production of Limited amounts of the antibiotic can be obtained in shake flask cultures or with Working surface cultures in bottles. If you have the culture in large containers or tanks, so it is recommended to use one in growth for inoculation to use the existing form of the microorganism in order to avoid a pronounced delay the formation of the antibiotic and the associated insufficient utilization of the Avoid attachment. It is therefore desirable to have a developing seed first of the microorganism by adding a relatively small amount of culture medium inoculated with material scraped from an agar slant, and if a young, vigorously developing inoculum has arisen, this aseptically into the large Containers or tanks transferred. The medium in which the vegetative seeds are produced can be the same as that used in making the antibiotic, or different from this.
Die besten Ausbeuten an Antibiotikum 101 a erhält man bei Temperaturen zwischen etwa 24 und 37°C, vorzugsweise zwischen etwa 28 und 342 C, während einer Periode von etwa 2 bis etwa 6 Tagen.The best yields of antibiotic 101 a are obtained at temperatures between about 24 and 37 ° C, preferably between about 28 and 342 C, during one Period of about 2 to about 6 days.
Das Verfahren gemäß der Erfindung beschränkt sich nicht auf die Herstellung des Antibiotikums 101 a mit Streptomyces sp. 101. Man kann selbstverständlich auch andere dieses Antibiotikum produzierenden Stämme oder Varianten solcher verwenden, wie sie z. B. leicht erzeugt und isoliert werden können durch routinemäßige IsolieruDgs- und/oder Modifizierungsmethoden, wie Auswahl kultivierter Mikroorganismen und Modifizierung derselben durch physikalische Einwirkung mittels Röntgenstrahlen und ultraviolettem Licht oder mittels mutagener chemischer Agcrzien, wie Stickstoffsenfe und Colchicin.The method according to the invention is not limited to manufacture of the antibiotic 101 a with Streptomyces sp. 101. Of course you can too other strains producing this antibiotic, or variants use such as z. B. can be easily generated and isolated by routine isolation and / or modification methods, such as selection of cultured ones Microorganisms and modification of the same through physical action by means of X-rays and ultraviolet light or by means of mutagenic chemical agents, such as nitrogen mustard and colchicine.
Die Bildungsgeschwindigkeit und Konzentration des Antibiotikrms 101 a im Kulturmedium läßt sich während der WaclsturrsFericde des Mikrcorganismus leicht verfolgen, irccm Tran ccm Kulturmedium entnommene Proben auf ihre antibictische Wirksernkeit gegen einen Mikroorganismus prüft, vcn dem man weiß, daß er auf das Antibiotikum ansFricht, wie z. B. Myccbacterium ranae oder Micrococcus pyogenes Varietät aureus, wobei man den Standard-Agar-Diffusionstest oder die turbidimetrische Prüfung anwendet. Im allgemeinen ist die maximale Produktion des Antibiotikums bei subrrerser aerober Kultur etwa 2 bis 6 Tage nach der Beimpfung des Kulturmediums erreicht.The rate of formation and concentration of the antibiotic arm 101 A in the culture medium can easily be found during the growth period of the microorganism track, irccm Tran ccm culture medium samples taken on their antibictic Tests effectiveness against a microorganism that is known to be sensitive to the Antibiotic to the front, such as B. Myccbacterium ranae or Micrococcus pyogenes Variety aureus, using the standard agar diffusion test or the turbidimetric Exam applies. In general, the maximum production of the antibiotic is at Submerged aerobic culture about 2 to 6 days after inoculation of the culture medium achieved.
Das antibiotische Material kann aus dem Kulturmedium durch Extraktion oder Adsorption gewonnen werden, z. B. indem man das Antibiotikum an Kohle adsorbiert und aus dieser durch geeignete Eluierungsmittel eluiert. Für die technische Herstellung bevorzugt man die Extraktion mit Lösungsmitteln, da sie weniger Zeit beansprucht, billiger ist und höhere Ausbeuten ergibt.The antibiotic material can be extracted from the culture medium or adsorption can be obtained, e.g. B. by adsorbing the antibiotic on charcoal and eluted therefrom by suitable eluents. For technical production extraction with solvents is preferred as it takes less time, is cheaper and gives higher yields.
Ein bev orzugtes' Extraktionsverfahren zur Gewinnung des antibiotisch wirksamen Materials aus dem fermentierten Nährmedium besteht darin, das Nährmedium bei einem pH zwischen etwa 4,0 und 8,0 zu filtrieren und dann mit einem in Wasser unlöslichen organischen Lösungsmittel wie niedrige Alkylacetate, z. B. Amyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl- und Isobutylacetat ; niedrig aliphatische Ketone, z. B. Methyläthyl-, Methylisobutyl- und Methyl-isopropylketon; halogenierten äiphatischen Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Äthylendichlorid, Tetrachlorkohlenstoff und Chloroform; Kohlenwasserstoffen wie Benzol, Toluol, Cyclohexan und Methylcyclohexan. Äthylacetat und Methylenchlorid «-erden besonders bevorzugt. Die Kohlenwasserstoffe, die für die schwächer polaren Komponenten, z. B. 101 a-4 und 101 a-5, selektiver sind, werden mit Vorteil zusammen mit einem oder mehreren Lösungsmitteln anderer Gattung verwendet.A preferred extraction method for obtaining the antibiotic effective material from the fermented nutrient medium is the nutrient medium at a pH between about 4.0 and 8.0 and then with one in water insoluble organic solvents such as lower alkyl acetates, e.g. B. amyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and isobutyl acetate; low aliphatic ketones, z. B. methyl ethyl, methyl isobutyl and methyl isopropyl ketone; halogenated aiphatic Hydrocarbons such as methylene chloride, ethylene dichloride, carbon tetrachloride and chloroform; Hydrocarbons such as benzene, toluene, cyclohexane and methylcyclohexane. Ethyl acetate and methylene chloride «earths are particularly preferred. The hydrocarbons those for the weaker polar components, e.g. B. 101 a-4 and 101 a-5, more selective are to advantage together with one or more solvents of others Genus used.
Der Extrakt wird dann konzentriert und getrocknet, um das antibiotische Material zu erhalten. Wenn man das so erhaltene Produkt in einem geeigneten Lösungsmittel wie Cyclohexan, Benzol, Methylcyclohexan, Toluol, Äthy lacetat u. dgl. auflöst und dann mit technischem n-Hexan (im wesentlichen aus n-Hexan bestehender Petroläther) versetzt, so erhält man das antibiotische Material in Form gelber Kristalle.The extract is then concentrated and dried to make the antibiotic Material. If the product thus obtained is in a suitable solvent such as cyclohexane, benzene, methylcyclohexane, toluene, ethyl acetate and the like. Dissolves and then with technical n-hexane (petroleum ether consisting essentially of n-hexane) added, the antibiotic material is obtained in the form of yellow crystals.
Das Antibiotikum 101 a ist ein Komplex von nahe verwandten Komponenten, von denen jede antibiotische Wirkung besitzt. In den meisten Kulturen findet man fünf Komponenten 101 a-1, 101 a-2, 101 a-3, 101 a-4 und 101 a-5. In einigen Kulturen wurden auch noch weitere Komponenten 101 a-6 und 101 a-7 festgestellt. Auch wurde 101 a-2, eine stark acylierte Komponente, durch Behandlung mit Acetylierungskatalysatoren und durch Behandlung mit Ammoniak in die anderen Komponenten umgewandelt, was in den Beispielen 10, 11 und 12 beschrieben wird.The antibiotic 101 a is a complex of closely related components, each of which has antibiotic effects. In most cultures one can find five components 101 a-1, 101 a-2, 101 a-3, 101 a-4 and 101 a-5. In some cultures Further components 101 a-6 and 101 a-7 were also found. Also was 101 a-2, a highly acylated component, by treatment with acetylation catalysts and converted into the other components by treatment with ammonia, resulting in Examples 10, 11 and 12 will be described.
In der Zeichnung zeigt Fig. 1 A ein Papierchromatogramm, das in einem
Phosphatpufferlösungsmittelsystem für ein typisches, nach Beispiel 1 erhaltenes
Fermentierungsprodukt entwickelt wurde und die Komponenten 101 a-1, 101 a-2, 101
a-3, 101 a-4 und 101 a-5 zeigt. Fig. 1 B und 1 C sindPapierchromatogramme, die in
einemLösungsmittelsystem (Benzol-Methanol-Wasser im Volumenverhältnis 2 : 1 : 1)
mit dem gleichen Produkt entwickelt wurden. Sie zeigen die Zerlegung in den Komponenten
101 a-1,101 a-2,101 a-3 und eine Mischung von 101 a-4 und 101 a-5. Fig. 1 D ist
ein quantitatives Papierchromatogramm, das in einem modifizierten Lösungsmittelsystem
(Benzol-Methanol-Wasserim Volumenverhältnis 1:1:2) bei Zimmertemperatur entwickelt
wurde. Es zeigt die gleichen fünf Ecmponenten. Fig. 1 E ist ein Papierchromatcgramm
einer anderen nach Beispiel 1 hergestellten und in obigem Lösungsmittelsystem entwickelten
Kultur und zeigt die Anwesenheit von sieben Komponenten. Aus dicscn ur_d ardcrcn
papierchromatographischen Analysen wurden die R f-Werte, d. h. das Verhältnis der
von der Komponente zurückgelegten Distanz zu der vom Lösungsmittel zurückgelegten
Distanz für die sieben Komponenten, folgende Zahlen ermittelt.
Bei Zimmertemperatur ist 101 a im pH-Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,0 3 bis 4 Tage haltbar, bei 80' C und pH 2,0 1 Stunde. In Alkalien ist das antibiotische Material unstabil und erleidet einen allmählichen Verlust an antibiotischer Wirksamkeit, wenn man es bei Zimmertemperatur beim pH 7,8 2 oder 3 Tage stehenläßt.At room temperature 101 a is in the pH range from about 2.0 to about 6.0 Shelf life 3 to 4 days, at 80 ° C and pH 2.0 1 hour. In alkalis this is antibiotic Material is unstable and suffers a gradual loss of antibiotic effectiveness, if it is left to stand at room temperature at pH 7.8 for 2 or 3 days.
Das Infrarot-Absorptionsspektrum (Natriumchloridprisma) von 101 a in Mineralölsuspension gemäß Fig. 2 zeit charakteristische Absorptionsbanden (in cm-' aus- 925, 875, 797, 735.The infrared absorption spectrum (sodium chloride prism) of 101 a in mineral oil suspension according to FIG. 925, 875, 797, 735.
101 a ist ein neutrales oder schwach saures Material. Bei Behandlung mit verdünntem Alkali wird es hydrolysiert. Bei Umsetzung einer äthanolischen Lösung dieses Materials mit einer wäßrigen Methylorangelösung erhält man das Helianthat des Komplexes; bei der Reaktion mit Acylierungsmitteln erhält man die entsprechenden Acylderivate wie z. B. die Acetyl- und Benzoylderivate.101 a is a neutral or weakly acidic material. With treatment it is hydrolyzed with dilute alkali. When implementing an ethanol solution this material with an aqueous methyl orange solution gives the heliantate of the complex; in the reaction with acylating agents the corresponding ones are obtained Acyl derivatives such as B. the acetyl and benzoyl derivatives.
101 a ist gekennzeichnet durch seine Wirksamkeit gegen folgende Organismen:
Man kann den Komplex auch nur teilweise zerlegen, wozu man sich des Gegenstromverfahrens nach Craig bedient. Fig. 3 zeigt die Verteilung der fünf Komponenten in den Craig-Fraktionen, bei Verwendung mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser-Äthanol-Cyclohexan-Äthylacetat (1 : 1 : 1 : 1 Volumteile). Man sieht, daß eine einwandfreie Trennung der Komponenten 101 a-1, 101 a-4 und 101 a-5 erreicht wird, daß aber die Komponenten 101 a-2 und 101 a-3 nicht zerlegt werden.The complex can also only be partially dismantled, for which purpose the Countercurrent process according to Craig. Fig. 3 shows the distribution of the five components in the Craig fractions when used with a water-ethanol-cyclohexane-ethyl acetate solvent system (1: 1: 1: 1 parts by volume). You can see that a perfect separation of the components 101 a-1, 101 a-4 and 101 a-5 is achieved, but that the components 101 a-2 and 101 a-3 cannot be disassembled.
Durch Kombination einer Säulentrennung mit einer Trennung nach Craig werden alle fünf Komponenten zerlegt. So kann man die bei der Trennung mit der Säule anfallende Mischung der Komponenten -4 und -5 nach dem Verfahren von Craig zerlegen oder aber die bei der Trennung nach Craig anfallende Mischung der Komponenten 101 a-2 und 101 a-3 mittels der Säule trennen.By combining a column separation with a Craig separation all five components are disassembled. So you can do the separation with the column Separate resulting mixture of components -4 and -5 according to the method of Craig or the mixture of components 101 obtained in the Craig separation Separate a-2 and 101 a-3 using the column.
Die Fig. 4 zeigt die Bewegung der Craig-Fraktionen auf dem Papierstreifen bei Verwendung des obigen Lösungsmittelsvstems Benzol-Methanol-Wasser. Chromatogramm A zeigt, daß die erste Craig-Fraktion nur 101 a-2 und 101 a-3 enthielt, Chromatogramm B zeigt, daß die zweite Craig-Fraktion nur 101 a-1 enthielt. Chromatogramm C zeigt das Ergebnis mit der dritten und vierten Craig-Fraktion. Da sowohl 101a-4 als auch 101 a-5 im Lösungsmittelsystem das gleiche R f haben, dient ein Chromatogramm zur Illustration beider Fraktionen.Fig. 4 shows the movement of the Craig fractions on the paper strip when using the above solvent system benzene-methanol-water. Chromatogram A shows that the first Craig fraction contained only 101 a-2 and 101 a-3, chromatogram B shows that the second Craig fraction contained only 101 a-1. Chromatogram C shows the result with the third and fourth Craig factions. Since both 101a-4 and 101 a-5 have the same R f in the solvent system, a chromatogram is used for Illustration of both factions.
Eine typische quantitative Verteilung der Komponenten ist in Tabelle
VIII zusammengestellt. Das Kulturmedium (1850 ml) wurde filtriert und die klare
Flüssigkeit mit Äthvlacetat extrahiert.
Die Komponenten geben mit FeCI, und jodoform positive Reaktionen.The components give positive reactions with FeCl and iodoform.
Das Antibiotikum 101a und seine Komponenten sind wertvolle Mittel zur Bekämpfung vieler durch Bakterienintektion im 2vIenschen und Tier verursachter Krankheiten. Zu diesem Zweck kann man das Antibiotikum als solches oder in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger, der fest, pulverförmig oder flüssig sein kann, verwenden. Das Mittel kann in Form von gepreßten Tabletten, Brausetabletten, Pulver, Granalien, Kapseln (harte und «-eiche Gelatinekapseln), wäßrigen Lösungen, Suspensionen in genießbaren Ölen oder Wasser oder anderen für die orale Verabreichung geeigneten Formen gebraucht werden. Zur parenteralen Verwendung benutzt man sterile flüssige Präparate. Das Medium kann ein steriles Lösungs- oder Suspensionsmittel sein, das ein injizierbares Öl oder wasserhaltige hydrophile Kolloide, wie Na-Carboxymethylcellulose, VIethylcellulose, Polevinylpyrrolidon, Gelatine, Tragant usw., enthält. Das wirksame antibiotische Material kann mit festen Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen für die Tablettierung vermischt sein, wie Maisstärke, Lactose, Talkum, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Gummiharzen u. dgl. 1Ian kann das Antibiotikum auch als Pulver abfüllen und so verwenden.Antibiotic 101a and its components are valuable agents to combat many caused by bacterial infection in humans and animals Diseases. For this purpose one can use the antibiotic alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier which is solid, powder or liquid can be use. The agent can be in the form of compressed tablets, effervescent tablets, Powder, granules, capsules (hard and oak gelatine capsules), aqueous solutions, Suspensions in edible oils or water or others for oral administration suitable forms are needed. Sterile ones are used for parenteral use liquid preparations. The medium can be a sterile solvent or suspending medium which is an injectable oil or hydrous hydrophilic colloids such as Na-carboxymethylcellulose, VIethylcellulose, polevinylpyrrolidone, gelatin, tragacanth, etc. contains. The effective one antibiotic material can be used with solid diluents or excipients the tableting be mixed, such as corn starch, lactose, talc, stearic acid, Magnesium stearate, gum resins and the like can also be used as a powder for the antibiotic Fill and use like that.
Das Antibiotikum 101 a und seine Komponenten und Derivate können auch als Suspension in einem fetten Öl, wie Kokosnußöl, Arachidöl u. d;,yl., die etwa 2 °; o Aluminiummonostearat als Suspensionsmittel enthält, als solche oder in Kapseln verabreicht werden. Man kann es auch in Vaselinesalben, wasserlöslichen Salbengrundlagen, wie Carbowaxe (feste Polyäthylenglykole vom Molekulargewicht 1500 und Mischungen von Polyäthyleng!ykolen mit höherem und niedrigerem Molekulargewicht) einarbeiten, um es als Salben örtlich zu verwenden. Ferner kann es in Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-Emulsionen und Lotionen einverleibt werden. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist in Form von Nasentropfen, Pastillen und Suppositorien gegeben. Für tierärztlichen Gebrauch eignen sich besonders Bougies, Kapseln, Tabletten, Mastitissalben, Ölsuspensionen u.dgl.The antibiotic 101 a and its components and derivatives can also as a suspension in a fatty oil, such as coconut oil, arachid oil and the like, which are approximately 2 °; o Contains aluminum monostearate as a suspending agent, as such or in capsules administered. It can also be used in vaseline ointments, water-soluble ointment bases, such as Carbowaxe (solid polyethylene glycols with a molecular weight of 1500 and mixtures of polyethylene glycols with higher and lower molecular weight), to use locally as ointments. It can also be in water-in-oil or oil-in-water emulsions and lotions are incorporated. Another use case is in form given by nasal drops, lozenges and suppositories. For veterinary use Bougies, capsules, tablets, mastitis ointments, oil suspensions are particularly suitable etc.
Infolge seiner ausgesprochenen antibakteriellen Wirksamkeit, der geringen Giftigkeit und den hohen erreichbaren Blutspiegeln eignet sich das Antibiotikum 101 a und dessen Derivate zur Behandlung der verschiedensten Krankheiten. So kann es infolge seiner ungewöhnlich hohen Wirksamkeit gegen M. tuberculosis H 37 Rv zur Behandlung der Tuberkulose verwendet werden. Dabei werden vorteilhafte Ergebnisse erzielt, wenn man 101 a mit anderen Tuberkuloseheilmitteln, wie Isonikotinsäurehydrazid, Streptomycin und; oder Dihydrostreptomycin, p-Aminosalicylsäure und deren Salze, Ir-4-Amino-3-isooxyzolidon (Cvcloserin), Kombinationen von Isonikotinsäurehydrazid und p Aminosalicylsäure und deren Salzen, Kombinationen von Streptomycin, Isonikotinsäurehydrazid und p-Aminosalicylsäure und deren Salzen usw., kombiniert.As a result of its pronounced antibacterial effectiveness, the low Toxicity and the high achievable blood levels, the antibiotic is suitable 101 a and its derivatives for the treatment of various diseases. So can because of its unusually high effectiveness against M. tuberculosis H 37 Rv Treatment of tuberculosis can be used. Doing so will produce beneficial results obtained when one 101 a with other tuberculosis remedies, such as isonicotinic acid hydrazide, Streptomycin and; or dihydrostreptomycin, p-aminosalicylic acid and its salts, Ir-4-Amino-3-isooxyzolidone (Cvcloserin), combinations of isonicotinic hydrazide and p aminosalicylic acid and its salts, combinations of streptomycin, isonicotinic acid hydrazide and p-aminosalicylic acid and its salts, etc. are combined.
Das erfindungsgemäß erhältliche antibiotische Produkt kann auch als Tuberkulosedesinfektionsmittel in Spitälern und in der Milchwirtschaft verwendet werden. Zu diesem Zwecke wird es den üblichen Trägern, wie Aerosolen oder Reinigungsmittellösungen, zugesetzt. Dies kann für sich allein oder in Kombination mit Sulfonamiden, wie Sulfadiazin, Sulfamerazin und Sulfamethazin (im Verhältnis von etwa 1 Teil des Antibiotikums auf insgesamt 2 Teile Sulfonamid) oder mit anderen Antibiotika, wie Tetracyclin, Oxvtetracyclin, Chlortetracyclin, Neomycin, Polymycin, Chloramphenicol, Penicillin G, 0 und V, Novobiocin, Bacitracin, Streptothricin, Circulin und Erythromycin, geschehen. Das Antibiotikum oder dessen Kombinationen mit den vorgenannten Therapeutika eignen sich auch zur Behandlung von durch Staphylokokken und Pneumokokken hervorgerufenen Infektionen der Lunge und der Luftwege. Die Verabreichung kann örtlich, oral oder parenteral erfolgen. Das Antibiotikum läßt sich auch zusammen mit Vitaminen, wie Thiamin, Riboflavin, Ascorbinsäure, Niacinamid, Pyridoxin, Pantothensäure, Vitamin B12 und Folsäure, verabreichen. Ferner kann man es mit anderen therapeutisch wertvollen Stoffen kombinieren. In Kombination mit verschiedenen Corticoiden wird die therapeutische Wirkung von 101 a und seinen Komponenten bei der Behandlung der atopischen und Kontaktdermatitis, Neurodermatitis, Pruritis usw. stark verbessert. Geeignete Corticoide sind Cortison, Hydrocortison und deren Ester; A 1-Cortison und @11 1-Hydrocortison und deren Ester in 21-Stellung, wie die Acetate, Cyclopentylpropionate und Succinat sowie die wasserlöslichen Salze derselben, äthylsubstituierte Cortisone und Hydrocortisone und 6-Methylhy drocortison einschließlich deren Ester.The antibiotic product obtainable according to the invention can also be used as Tuberculosis disinfectant used in hospitals and in the dairy industry will. For this purpose, it is the usual carriers, such as aerosols or detergent solutions, added. This can be used alone or in combination with sulfonamides, such as sulfadiazine, Sulfamerazine and sulfamethazine (in a ratio of about 1 part of the antibiotic to a total of 2 parts sulfonamide) or with other antibiotics, such as tetracycline, Oxvtetracycline, Chlortetracycline, Neomycin, polymycin, chloramphenicol, Penicillin G, 0 and V, novobiocin, bacitracin, streptothricin, circulin and erythromycin, happen. The antibiotic or its combinations with the aforementioned therapeutic agents are also suitable for the treatment of staphylococci and pneumococci Infections of the lungs and airways. Administration can be topical, oral or done parenterally. The antibiotic can also be used along with vitamins, such as Thiamine, riboflavin, ascorbic acid, niacinamide, pyridoxine, pantothenic acid, vitamin B12 and folic acid. It can also be therapeutically valuable with others Combine fabrics. In combination with various corticoids it becomes therapeutic Effect of 101 a and its components in the treatment of atopic and contact dermatitis, Neurodermatitis, pruritis, etc. greatly improved. Suitable corticoids are cortisone, Hydrocortisone and its esters; A 1-cortisone and @ 11 1-hydrocortisone and their esters in the 21-position, such as the acetates, cyclopentylpropionates and succinate as well as the water-soluble ones Salts thereof, ethyl-substituted cortisones and hydrocortisones and 6-methylhy drocortisone including its esters.
Das erfindungsgemäß erhältliche Antibiotikum kann mit gleicher Wirkung wie beim Menschen auch bei Tieren, wie Geflügel und Kühen, Verwendung finden. Es kann den Tierfuttermischungen, z. B. dem Geflügelfutter, in Mengen von mindestens 0,10./, beigemischt werden.The antibiotic obtainable according to the invention can also be used in animals, such as poultry and cows, with the same effect as in humans. It can be the animal feed mixes, e.g. B. the poultry feed, in amounts of at least 0.10. /, Are added.
Verabreicht man das Antibiotikum beispielsweise parenteral, so eignet es sich auch zur Behandlung von Tieren, die von Pasteurella multocida, den Erreger der haemorragischen Blutvergiftung, eine fiebrige, beim Transport von Vieh auftretende Infektion, befallen sind. Man kann das Antibiotikum auch für sich allein oder in Kombination mit anderen Antibiotika oder Therapeutika als Nahrungsergänzung zur Begünstigung des Wachstums von Tieren oder Geflügel verwenden. Infolge seiner hohen Wirksamkeit gegen S. pullorum ist es auch wertvoll zur Bekämpfung des durch diesen Mikroorganismus verursachten weißen Durchfalls von Kühen.If the antibiotic is administered parenterally, for example, it is suitable It is also used to treat animals affected by Pasteurella multocida, the pathogen haemorrhagic blood poisoning, a feverish one that occurs when transporting cattle Infection. One can also use the antibiotic on its own or in Combination with other antibiotics or therapeutic agents as a dietary supplement Use to favor the growth of animals or poultry. As a result of its high Efficacy against S. pullorum, it is also valuable for combating through this Microorganism caused white diarrhea in cows.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Herstellung, Gewinnung, Konzentrierung, Reinigung und Identifizierung des Antibiotikums 101 a und seiner Komponenten und Derivate. Beispiel 1 Herstellung von Antibiotikum 101a A. Saatgut Streptomyces sp. 101 wird auf einer Maltose-Trypton-Agar-Schrägkultur (Zusammensetzung in g/1 destilliertes Wasser; Maltose 10, Trypton 5, K,HP04, 0,5; Fe S 04 - 7 H,0, 0,1; Agar 15) 7 Tage bei 28°C kultiviert und die so erhaltene Kultur als Impfgut für eine Saatkultur verwendet.The following examples illustrate the production, extraction, concentration, Purification and identification of the antibiotic 101 a and its components and Derivatives. Example 1 Production of Antibiotic 101a A. Seeds Streptomyces sp. 101 is distilled on a maltose tryptone agar slant culture (composition in g / 1 Water; Maltose 10, tryptone 5, K, HP04, 0.5; Fe S 04-7 H, 0, 0.1; Agar 15) 7 days cultivated at 28 ° C and the culture thus obtained as inoculum for a seed culture used.
B. Saatkultur 50 ml eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung:
C. Fermentierung Die nach der Vorschrift B hergestellte Saatkultur
wurde in einer Menge von 1 Volumprozent 100 ml eines Fermentiermediums folgender
Zusammensetzung zugesetzt:
Beispiel 2 Herstellung und Isolierung von 101a A. Vorsaatkultur 100
ml eines sterilen Vorsaatmediums, das folgende Bestandteile enthält:
D. Isolierung Nach 42 Stunden wird das Ganze beim Ernte-pR 7,4 filtriert.
Das Filtrat plus Waschflüssigkeit des Mycels (Gesamtvolumen 6001) wird mit Äthylacetat
gesättigt und mit dem 0,2fachen Volumen Äthylacetat extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt
(1211) wird auf 960 ml konzentriert und im Vakuum zur Trockne verdampft.
1Ian erhält 34 g eines roten glasigen festen Produktes (570;'0 Ausbeute). Man reinigt
das Material in Portionen mittels eines Gegenstrom-Verteilungsverfahrens (Aceton-Äthylacetat-Wasser,
1:1:1). Nach Umfällen des gereinigten Materials aus Äthvlacetat mit technischem
n-Hexan erhält man 101 a in kristalliner Form. Das Produkt besitzt bei der Mr.-101
a-Prüfung eine Stärke von 1000 mcg/mg. E. Prüfungen Die Mr.-101a-Prüfung wird wie
folgt durchgeführt: Mycobacterium ranae Upjohn Kultursammlung No. 161 wird auf einer
Lowenstein-Jensen -Schrägkultur (K. A. Jensen, »Towards Standardisation of Labotatory
Methods«, International Union against Tuberculosis, Vol. 24, S. 102 und 103, 1954)
kultiviert. Eine kleine Menge der Kultur wird in einen 250-ml-Kolben oder 50 ml
des folgenden sterilen Mediums
Unbekannte feste Präparate werden im Verhältnis von 1 mg/ml in Aceton gelöst und mittels n!10-Phosphatpuffer bei pA 6 geeignete Verdünnungen hergestellt. Fermentationsflüssigkeit und andere Proben von aus der Verarbeitung stammenden Lösungen werden ebenfalls mit Pufferlösungen in geeigneter Weise verdünnt. Die Prüfung erfolgt mittels der Standard-12,7-mm-Filterpapierscheiben, denen man 0,08 ml Standard- oder Prüflösung einverleibt. Die Grundlösung eines kristallinen Standardpräparates enthält 1 mg/ml in Aceton. Mit n/10-Phosphatpuffer stellt man bei pft 6,0 Verdünnungen von 5, 10, 20, 40 und 80 mcg/ml her. Die Scheiben werden über Nacht bei 37'C bebrütet und die Durchmesser der inhibierten Zonen gemessen. Die Standardkurve wird auf halblogarithmisches Papier aufgetragen, und zwar die Konzentration in Ftg ml als Abszisse und der Zonendurchmesser als Ordinate. Der Umrechnungsfaktor ist 4 lig pro biologische Einheit. Eine biologische Einheit ist die Menge Antibiotikum, die eine Inhibitionszone von 20 mm bei der Prüfung gegen einen empfindlichen Organismus, wie M. ranae (:4b.-101 a-Test), S. aureus oder B. subtilis, bei Verwendung einer 12,7 mm Durchmesser aufweisenden Papierscheibe ergibt.Unknown solid preparations are in the ratio of 1 mg / ml in acetone dissolved and prepared using n! 10 phosphate buffer at pA 6 suitable dilutions. Fermentation liquor and other samples of processing solutions are also appropriately diluted with buffer solutions. The test takes place using the standard 12.7 mm filter paper discs to which 0.08 ml standard or Test solution incorporated. Contains the basic solution of a crystalline standard preparation 1 mg / ml in acetone. With n / 10 phosphate buffer, dilutions of 6.0 are made at pft 5, 10, 20, 40 and 80 mcg / ml. The disks are incubated at 37 ° C. overnight and the diameter of the inhibited zones was measured. The standard curve is on a semi-logarithmic basis Plotted on paper, namely the concentration in ftg ml as the abscissa and the zone diameter as the ordinate. The conversion factor is 4 lig per biological unit. A biological one Unit is the amount of antibiotic that has an inhibition zone of 20 mm during the test against a sensitive organism such as M. ranae (: 4b.-101 a-Test), S. aureus or B. subtilis using a 12.7 mm diameter paper disc results.
Beispiel 3 Herstellung und Isolierung von 101a A. Vorsaatkultur Fünf
500-ml-Erlenmeyerkolben, die je 100 ml des folgenden Vorsaatmediums enthalten
D. Isolierung Nach der 4tägigen Fermentierung wird das Ganze filtriert (beim natürlichen p" 7,1) und das Filtrat (54971) mit 1060 1 (0,2 Volumen) Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck auf 4200 ml konzentriert, mit 4200 ml technischem n-Hexan versetzt und filtriert. Den so erhaltenen Niederschlag löst man in 3920 ml Methylenchlorid, versetzt mit 3920 ml technischem n-Hexan und entfernt den harzigen roten Niederschlag (Präparation 3A) durch Filtration. Das Filtrat wird mit dem 3fachen Volumen technischem n-Hexan versetzt und der gelbe kristalline Niederschlag im Vakuum getrocknet. Man erhält so 104 g 101a (Präparation 3B) mit einer Stärke von etwa 920 mcg/mg.D. Isolation After 4 days of fermentation, the whole is filtered (at natural p "7.1) and the filtrate (54971) extracted with 1060 l (0.2 volume) of ethyl acetate. The extract is concentrated to 4200 ml under reduced pressure with 4200 ml of technical grade n-hexane are added and the precipitate obtained is dissolved in 3920 ml of methylene chloride, 3920 ml of technical grade n-hexane are added and the resinous red precipitate (preparation 3A) is removed by filtration n-hexane is added and the yellow crystalline precipitate is dried in vacuo, giving 104 g of 101a (preparation 3B) with a strength of about 920 mcg / mg.
Gibt man zu 10 ml einer wäßrigen Äthanollösung, die 0,5 g der Präparation 3B enthält, 30 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Methylorange und hält die Mischung 30 Minuten bei 50'C, so erhält man das Helianthatsalz des 101 a als braune Kristalle. Das kristalline Material wird durch Filtration entfernt und getrocknet.The 0.5 g of the preparation is added to 10 ml of an aqueous ethanol solution 3B contains 30 ml of a saturated aqueous solution of methyl orange and holds the Mixture for 30 minutes at 50.degree. C., the helianthat salt of 101 a is obtained as a brown one Crystals. The crystalline material is removed by filtration and dried.
Der harzige rote Niederschlag (Präparation 3A) wird in 600 ml Aceton unter mäßigem Erwärmen und Rühren gelöst, dann abkühlen und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach 13 Tagen hat sich das Volumen auf etwa 500 ml vermindert. Der sich bildende gelbe Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton und technischem n-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält so 71 g 101 a (Präparation 3 C) mit einem Wirkungsgrad von mehr als 2000 mcg/mg.The resinous red precipitate (preparation 3A) is dissolved in 600 ml of acetone dissolved with moderate heating and stirring, then cool and at room temperature ditched. After 13 days the volume has decreased to about 500 ml. Of the The yellow precipitate that forms is filtered off with acetone and technical grade n-hexane washed and dried in vacuo. This gives 71 g of 101 a (preparation 3 C) with an efficiency of more than 2000 mcg / mg.
Beim Chromatographieren des Produktes (Präparation 3 C) in einem Phosphatpuffersystem
vom pH 7,0 und einem Lösungsmittelsystem wurde festgestellt, daß die Komponenten
101a-1, 101a-2 und 101a-3 vorhanden waren. Beispiel 4 Herstellung und Isolierung
von 101a Man arbeitete wie in den Beispielen 3, A, B und C, jedoch in einem Tankraum
von 56 800 1 Inhalt und einem Medium, das pro Liter folgende Zusammensetzung aufwies
Beispiel 5 Herstellung und Isolierung von 101a A. Die fermentierte
Flüssigkeit von zwei weiteren 56 800-1-Tanks, hergestellt nach Beispiel 4, wurde
filtriert und mit 18 1681 Methvlenchlorid extrahiert. Das verwendete Medium hatte
folgende Zusammensetzung pro Liter:
B. Die Flüssigkeit aus zwei weiteren 56 800-1-Tanks, die wie im Beispiel 4 erhalten wurde, wobei aber bei 32°C während 114 Stunden kultiviert wurde, wurde filtriert und mit 181681 Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde filtriert und wie im Beispiel 5, A weiterbehandelt; man erhielt 29,036 g 101 a, das im Milligramm 62,1 #tg 101 a-1, 62,6 #tg 101 a-2, 147,6 p.g 101 a-3 und 105,1 #Lg 101 a-5 enthielt (Präparation 5 B). Beispiel 6 Herstellung und Isolierung von 101a Das Fermentationsmedium aus weiteren 56800-1-Tanks, erhalten wie im Beispie14, wurde filtriert und bei pH 4 bis 5 mit 181681 Methylenchlorid extrahiert. Der Extralot wurde auf eine Konzentration mit dem Siedepunkt 60°C (eine Atmosphäre) mit dem spezifischen Gewicht 0,99 eingeengt. Es ergab sich, daß das C H2 Cl, durch Butylacetat verunreinigt war. Die Konzentrierung wurde beendigt, wenn der Siedepunkt im Vakuum 70'C betrug. Das Konzentrat wurde mit dem 7,5fachen Volumen technischem n-Hexan vermischt. Der so erhaltene Niederschlag wog 4,093 kg und enthielt im Milligramm 725 #tg Wirksubstanz, die sich wie folgt zusammensetzte: 32,5 mcg 101a-1, 27,5 mcg 101a-2 104,1 mcg 101 a-3 und etwas 101 a-4 undloder 101 a-5. Beispiel 7 Herstellung von 101a Die Kulturlösung von weiteren 56800-1-Tanks, hergestellt wie im Beispiel 4, jedoch bei 32'C und 136 Stunden Kulturzeit, wurde filtriert und bei pii 4 bis 5 mit 18 1681 Methylenchlorid extrahiert. Nach Konzentrierung des Extraktes wurde eine sich abscheidende wäßrige Schicht entfernt. Die organische Phase wurde weiter auf 37,851 konzentriert. Das Konzentrat wurde in das 5fache Volumen technisches n-Hexan gegossen und der Niederschlag gesammelt und getrocknet. Er wog 17,325 kg und enthielt 174 mcg/mg. Die Zusammensetzung ergab sich bei der quantitativen papierchromatographischen Analyse zu 31 mcg/mg 101 a-1, 40 mcgimg 101 a-2 und 142 mcg/mg 101 a-3.B. The liquid from two other 56 800-1 tanks, which are as in the example 4 was obtained, but cultivation was carried out at 32 ° C. for 114 hours filtered and extracted with methylene chloride 181681. The extract was filtered and treated further as in Example 5, A; 29.036 g of 101 a were obtained, that in the milligram 62.1 #tg 101 a-1, 62.6 #tg 101 a-2, 147.6 p.g 101 a-3 and 105.1 #Lg 101 a-5 (Preparation 5 B). Example 6 Preparation and Isolation of 101a The Fermentation Medium from further 56800-1 tanks, obtained as in Example 14, was filtered and kept at pH 4 to 5 extracted with 181681 methylene chloride. The extra lot was on one concentration with a boiling point of 60 ° C (one atmosphere) with a specific gravity of 0.99. It was found that the C H2 Cl, was contaminated with butyl acetate. The concentration was terminated when the boiling point in vacuo was 70'C. The concentrate was mixed with 7.5 times the volume of technical grade n-hexane. The precipitate thus obtained weighed 4.093 kg and contained 725 milligrams of active substance, which was as follows composed: 32.5 mcg 101a-1, 27.5 mcg 101a-2, 104.1 mcg 101 a-3 and some 101 a-4 and / or 101 a-5. Example 7 Preparation of 101a The culture solution of others 56800-1 tanks, produced as in example 4, but at 32'C and 136 hours of culture time, was filtered and extracted at pii 4 to 5 with 18 1681 methylene chloride. To Concentration of the extract, a separating aqueous layer was removed. The organic phase was further concentrated to 37.851. The concentrate was Poured into 5 times the volume of technical grade n-hexane and collected the precipitate and dried. It weighed 17.325 kg and contained 174 mcg / mg. The composition revealed quantitative paper chromatographic analysis results in 31 mcg / mg 101 a-1, 40 mcgimg 101 a-2 and 142 mcg / mg 101 a-3.
Beispiel 8 Herstellung von 101a-2 Man löste die obenerwähnte Präparation 3 C in einer heißen Mischung von Dioxan und Benzol (3:1) und erhielt beim Abkühlen ein faseriges kristallines Material, das mit einer Mischung aus Dioxan und Benzol (3:1) gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Das Produkt war orangegelb, vom Schmp. 194 bis 200°C, optische Drehung [a]24 = + 378- (0,25 °/ o in Methanol), und zeigt im Ultraviolett-Absorptionsspektrum eine Spitze bei 435 m#t, Ei°z, -- 115. Das so erhaltene Produkt (Präparation 8A) hatte eine Stärke von 3080 mcglmg.Example 8 Preparation of 101a-2 The above preparation was dissolved 3 C in a hot mixture of dioxane and benzene (3: 1) and obtained on cooling a fibrous crystalline material made with a mixture of dioxane and benzene (3: 1) was washed and dried in vacuo. The product was orange-yellow, dated Mp. 194 to 200 ° C, optical rotation [a] 24 = + 378- (0.25 ° / o in methanol), and shows a peak in the ultraviolet absorption spectrum at 435 m # t, Ei ° z, - 115. The product thus obtained (preparation 8A) had a strength of 3080 mcglmg.
Die chromatographische Untersuchung des Produktes in einem Phosphatpuffersystem vom p,, 7,0 ergab, daß 101 a-2 vorherrschte.The chromatographic analysis of the product in a phosphate buffer system of p ,, 7.0 showed that 101 a-2 predominated.
Beim Verreiben mit Benzol wurden die orangegelben Kristalle (Präparation 8 A) in eine andere Kristallform umgewandelt, deren Verhältnis von Länge zu Breite etwa 5 bis 10:1 beträgt. Unter polarisiertem Licht zeigt sie eine Chartreusefarbe und schmilzt zwischen 195 und 200`C. Beim Trocknen nahm dieses Material wieder das Aussehen der ursprünglichen gelben Kristalle an. Beispiel 9 Kristallisation von 101a-2 Man stellte eine Lösung von 11,31,g eines nach den Beispielen 3, A, B, C und D erhaltenen Produktes in 1131 1,4-Dioxan her. Nach Zusatz von einem gleichen Volumen technischem Hexan erhielt man 724 g rohe Kristalle von 101a-2, die aus Dioxan und Benzol umkristallisiert wurden. Die Kristalle wurden in 7,251 Dioxan gelöst und durch Zusatz des gleichen Volumens Benzol ausgefällt. Die erste Kristallisation ergab 362 g (Präparation 9A). Die Mutterlaugen wurden auf 21 eingeengt, und man erhielt «eitere 283 g (Präparation 9 B) durch Zusatz des 5fachen Volumens von technischem n-llexal?.When triturated with benzene, the orange-yellow crystals (Preparation 8 A) were converted into another crystal form, the ratio of length to width is about 5 to 10: 1. Under polarized light it shows a chartreuse color and melts between 195 and 200`C. Upon drying, this material reverted to the appearance of the original yellow crystals. Example 9 Crystallization of 101a-2 A solution of 11.31 g of a product obtained according to Examples 3, A, B, C and D in 1131 1,4-dioxane was prepared. After adding an equal volume of technical grade hexane, 724 g of crude crystals of 101a-2 were obtained, which were recrystallized from dioxane and benzene. The crystals were dissolved in 7,251 dioxane and precipitated by adding an equal volume of benzene. The first crystallization gave 362 g (Preparation 9A). The mother liquors were concentrated to 21, and "purulent 283 g (preparation 9 B) were obtained by adding 5 times the volume of technical n-llexal".
Die erstenMutterlaugen (Dioxan-technisches n-Hexan) wurden auf 1-151 abdestilliert. 191 dieser Lösung verwendete man zur Herstellung einer an 101a-2 nahezu freien Lösung, indem man die Gesamtmenge dieser Komponente mit dem 10fachen Volumen technischem n-Hexan ausfällte (Präparation 9C). Die restlichen 1241 wurden mit dem 5fachen Volumen technischem Hexan versetzt, wobei 7,860 kg festes Produkt mit einem Gehalt von 167 mcg; mg ausfiel, das wie folgt zusammengesetzt war (papierchromatographische Analyse) : 335 mcg/'mg 101a-1, 60 mcg.mg 101a-2 und 380 mcg'mg 101a-3 (Präparation 9D).The first mother liquors (technical dioxane n-hexane) were distilled off to 1-151. 191 of this solution was used to prepare a solution almost free of 101a-2 by precipitating the total amount of this component with 10 times the volume of technical grade n-hexane (preparation 9C). The remaining 1241 were mixed with 5 times the volume of technical grade hexane, with 7.860 kg of solid product with a content of 167 mcg; mg precipitated, which was composed as follows (paper chromatographic analysis): 335 mcg / 'mg 101a-1, 60 mcg.mg 101a-2 and 380 mcg'mg 101a-3 (preparation 9D).
Umkristallisierung von 101a=2 Präparation 9A (362 g) wurde aus Benzol
(201) umkristallisiert, wobei vier Fraktionen wie folgt erhalten wurden
Eigenschaften Nach dem Trockner. im Vakuum verloren die langen faserigen
Kristalle ihre Form, und man erhielt Massen, die unter den gekreuzten Nicolschen
Prismen aufleuchten. Suspendiert man in Benzol oder kristallisiert man daraus um,
so bilden sich kürzer;, und dickere Nadeln. Beim Umkristallisieren aus Butylacetat
erhält man Nadelbüschel. 101 a-2 ist löslich in Ühloroform,-%lethanol, Dioxan, etwas
löslich in Benzol, Aceton und Nasser und unlöslich in Petroläthern. Es nimmt in
C C14 kein Brom auf, beim Erhitzen wird die Lösung kirschrot.
Die nahe Verwandtschaft der Komponenten von 101 a ergibt sich aus
folgenden Beispielen Beispiel 10 Umwandlung von 101 ä-2 durch Acetylierung 1 g 101
a-2 (Präparation 9F) werden in 20 ml Pyridin gelöst und 4 Stunden mit 3,3 ml Essigsäureanhydrid
am Rückfluß gekocht. Die Reaktionsmischung wird über Nacht im Kühlschrank gehalten
und in 200 ml kaltes Wasser gegeben. 1 g des so erhaltenen gelben Niederschlags
wird umkristallisiert, wobei man 564 mg hellgelbes Produkt (Präparation 10A) mit
folgenden Eigenschaften erhält
Die Papierchromatogramme der so erhaltenen Produkte zeigen nur die Anwesenheit der Komponente 101 a.The paper chromatograms of the products thus obtained show only the Presence of component 101 a.
Die Präparationen wurden zusammengegeben und einer Gegenstromverteilung unterworfen, die mit 230 Rohren und gleichen Teilen Cyclohexan, Wasser, Äthylacetat und 95°,!oigem Äthanol arbeitet. Man erhält eine einzige Spitze, die beim Papierchromatogramm nur 101 a-1 anzeigt. Daraus ergibt sich, daß die Umwandlung von 101 a-2 in 101 a-1 vollzogen war. Beispiel 12 Umwandlung von 101 a-2 durch Ammoniak 0,5 g 101 a-2 (Präparation 9F) werden in 2 ml 95°;'oigem Äthanol gelöst und 25 Minuten mit 10 ml konzentriertem Ammoniumhvdroxyd gerührt. Dann wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf pII1,5 gestellt. Beim Abkühlen auf Zimmertemperatur scheidet sich aus der gelben wäßrigen Phase ein dunkelbraunes Öl aus. Das Öl wird in 80 ml Aceton gelöst, wobei sich etwa 500 mg eines gründlichweißen Salzes ausscheiden, von dem abfiltriert wird. Zum Filtrat gibt man 210 ml Wasser und unterwirft die Lösung der Gefriertrocknung. Das Papierchromatogramm zeigt die Anwesenheit aller sieben Komponenten von 101 a im getrockneten Produkt.The preparations were combined and a countercurrent distribution subjected to that with 230 tubes and equal parts of cyclohexane, water, ethyl acetate and 95 °, oigem ethanol works. A single peak is obtained, that of the paper chromatogram only shows 101 a-1. It follows that the conversion of 101 a-2 to 101 a-1 was completed. Example 12 Conversion of 101 a-2 by ammonia 0.5 g of 101 a-2 (preparation 9F) are dissolved in 2 ml of 95 °; 'oigem ethanol and 25 minutes with 10 ml of concentrated Ammonium hydroxide stirred. Then with concentrated sulfuric acid to pII1.5 posed. On cooling to room temperature, the yellow aqueous separates out Phase out a dark brown oil. The oil is dissolved in 80 ml of acetone, whereby about Excrete 500 mg of a thoroughly white salt, which is filtered off. To the filtrate 210 ml of water are added and the solution is subjected to freeze-drying. The paper chromatogram shows the presence of all seven components of 101 a in the dried product.
Beispiel 13 Chromatographische Trennung von 101a Für 41 der Mischung:
Die Säule wird wie folgt vorbereitet: 250 g Infusorienerde werden 1 Stunde mit 500 ml 6n-Salzsäure verrührt, auf dem Filter gesammelt und mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das pII des Waschwassers 5,5 ist. Dann wäscht man mit Methanol und trocknet an der Luft. 180 g dieser mit Säure gewaschenen Infusorienerde werden mit 90 ml der unteren Phase des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems innig vermischt und in ein Rohr von 25,4 mm lichter Weite aus Pyrexglas unter Stopfen etwa 90 cm hoch eingefüllt.The column is prepared as follows: 250 g of infusor soil are used Stirred for 1 hour with 500 ml of 6N hydrochloric acid, collected on the filter and mixed with distilled Washed water until the pII of the wash water is 5.5. Then it is washed with methanol and air dry. 180 g of this acid-washed infusor earth will be intimately mixed with 90 ml of the lower phase of the solvent system described above and into a tube of 25.4 mm internal width made of Pyrex glass with a stopper about 90 cm highly filled.
Die fraktionierte Probe war 1,0 g 101 a aus Beispiel 6. Diese wurde in 10 ml der oberen Phase des beschriebenen Systems gelöst, mit 20 g der mit Säure gewaschenen Infusorienerde vermischt und die Mischung oben auf die Säule gepackt.The fractionated sample was 1.0 g of 101 a from Example 6. This was dissolved in 10 ml of the upper phase of the system described, with 20 g of that with acid washed infusion soil mixed and the mixture packed on top of the column.
Die Säule wurde dann mit der oberen Phase eluiert und in Abständen von 20 Minuten Fraktionen (20 bis 25 ml) abgetrennt.The column was then eluted with the upper phase and at intervals separated fractions (20 to 25 ml) from 20 minutes.
Fraktionen 1 bis 25 enthielten 101 a-4 und 101 a-5, Fraktionen 76 bis 126 enthielten 101 a-3, Fraktionen 148 bis 193 enthielten 101 a-1.Fractions 1 to 25 contained 101 a-4 and 101 a-5, fractions 76 to 126 contained 101 a-3, fractions 148 to 193 contained 101 a-1.
Das in der Säule verbleibende Band wurde herausgeschaufelt und das 101 a-2 mit 300 ml Chloroform aus der Infusorienerde eluiert. Nach dem Eindampfen zur Trockne erhält man 121 mg 101 a-2 (Präparation 13 A).The tape remaining in the column was shoveled out and the 101 a-2 eluted from the infusor earth with 300 ml of chloroform. After evaporation 121 mg of 101 a-2 (preparation 13 A) are obtained when dry.
Die Fraktionen 1 bis 25 werden vereinigt und zur Trockne verdampft, wobei man etwa 1105 mg einer Mischung von 101 a-4 und 101 a-5 erhältj(Präparation 13B).Fractions 1 to 25 are combined and evaporated to dryness, about 1105 mg of a mixture of 101 a-4 and 101 a-5 are obtained (preparation 13B).
Die Fraktionen 76 bis 126 werden vereinigt und eingedampft, wobei man 385 mg festes 101 a-3 erhält (Präparation 13C).Fractions 76 to 126 are combined and evaporated, whereby 385 mg of solid 101 a-3 are obtained (preparation 13C).
Die Fraktionen 148 bis 193 werden vereinigt und eingedampft und ergeben 275 mg festes 101 a-1 (Präparation 13D).Fractions 148 to 193 are combined and evaporated to give 275 mg of solid 101 a-1 (Preparation 13D).
Beispiel 14 Trennung der Komponenten 101 a--1 und 101 a-5 durch Gegenstromverteilung A. Eine nach Beispiel 13 (Präparation 13B) erhaltene Mischung von 101 a-4 und 101 a-5 wird nach der Gegenstromverteilungsmethode von Craig zerlegt. Das verwendete System war 95""', Äthanol-Äthylacetat-Cyclohexan-Wasser (1 : 1 : 1 : 1 Volumen). Eine Probe von 5 g der Mischung wurde in 160 ml des Lösungsmittelsystems gelöst, und nach 195 Durchgängen ergaben sich zwei gefärbte Bänder. Das erste (K = 5,73) paßte nicht zur theoretischen Kurve, die mindestens zwei Stoffe anzeigt. Diese Spitze enthielt 101 a-5 und eine schwarz bernsteinfarbige Verunreinigung. Die zweite (K = 2,04) entsprach der theoretischen Kurve, und zwar im wesentlichen reines 101 a-4 (Präparation 14A). B. Man wiederholt den vorstehenden Versuch mit einer zweiten Probe von 5 g für 197 Durchgänge und dampft zu einer wäBrigen Paste ein. Diese extrahiert man mit Methylenchlorid und verdampft das Methylenchlorid zur Trockne. Man erhält so 1,61 g biologisch reines 101 a-4 (Präpaxation 14B).Example 14 Separation of components 101 a-1 and 101 a-5 by countercurrent distribution A. A mixture of 101 a-4 and 101 obtained according to Example 13 (Preparation 13B) a-5 is broken down using the Craig countercurrent distribution method. That used System was 95 "" ', ethanol-ethyl acetate-cyclohexane-water (1: 1: 1: 1 by volume). A 5 g sample of the mixture was dissolved in 160 ml of the solvent system, and after 195 passes there were two colored bands. The first (K = 5.73) did not match the theoretical curve, which shows at least two substances. This tip contained 101 a-5 and a black amber impurity. The second (K = 2.04) corresponded to the theoretical curve, essentially pure 101 a-4 (Preparation 14A). B. Repeat the above experiment with a second sample of 5 g for 197 passes and evaporated to an aqueous paste a. This is extracted with methylene chloride and the methylene chloride is evaporated to dryness. This gives 1.61 g of biologically pure 101 a-4 (preparation 14B).
C. Die 101 a-5- und 101 a-6-Fraktionen aus A und B werden vereinigt und die 101 a-5 und die Verunreinigung enthaltende Mischung zur Trockne verdampft, wiederum in 140 ml des oben genannten Lösungsmittelsystems gelöst und nochmals im Apparat von Craig verteilt. Unter Anwendung der Rückführungstechnik werden 466 Durchgänge ausgeführt, und es wurden wiederum zwei Farbbänder sichtbar. Das Band, das 101 a-5 enthielt (K = 5,66), wurde zu einer wäBrigen Paste eingedampft und mit Methylenchlorid extrahiert. Man setzte 10 Volumen technisches n-Hexan zu und filtrierte. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, wobei man 1,22 g biologisch reines 101 a-5 erhielt (Präparation 14C).C. The 101 a-5 and 101 a-6 fractions from A and B are combined and the mixture containing 101 a-5 and the impurity is evaporated to dryness, again dissolved in 140 ml of the above-mentioned solvent system and again in Apparatus distributed by Craig. Using the return technique, there are 466 passes and again two colored bands became visible. The tape that 101 a-5 (K = 5.66), was evaporated to an aqueous paste and treated with methylene chloride extracted. 10 volumes of technical grade n-hexane were added and the mixture was filtered. The filtrate was evaporated to dryness to give 1.22 g of biologically pure 101 a-5 (Preparation 14C).
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