DE10221970A1 - Optischer Detektor mit Auflösung im Nanometerbereich - Google Patents

Abstract

Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung von Proben 1, die zumindest teilweise für elektromagnetische Strahlung, insbesondere Licht der Wellenlängen zwischen 10 nm und 10000 nm, lichtdurchlässig sind, wobei eine Probe 1 mit der Strahlung 3 bestrahlt und das Bild der Probe 1 untersucht wird, wobei die Probe 1 auf einen Lichtwandler 2 abgebildet wird, der das Bild in ein Signalmuster 7 wandelt, wobei das Signalmuster 7 mit einem Rastersondenverfahren (Scanning Probe Microscopy) untersucht wird.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung von Proben, die zumindest teilweise für elektromagnetische Strahlung, insbesondere für Licht der Wellenlängen zwischen 10 nm und 10000 nm, lichtdurchlässig sind, wobei eine Probe mit der Strahlung bestrahlt und das Bild der Probe untersucht wird. Die Erfindung betrifft zudem ein System zur Umsetzung des Verfahrens.
• In der Lichtmikroskopie ist eine hohe örtliche Auflösung erstrebenswert. Dabei ist die Auflösung bei den klassischen Mikroskopen auf ungefähr die verwendete Wellenfänge begrenzt (Abbe-Limit) und beträgt im sichtbaren Bereich etwa 1 Mikrometer. Es werden große Anstrengungen unternommen, um die von Abbe formulierte Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu überwinden. Insbesondere wird ein Auflösungsvermögen unter 100 Nanometern angestrebt, was zum Teil mit den Methoden der konfokalen Lichtmikroskopie erreicht wird. Lichtmikroskope sind gerade für die biologisch-medizinische Forschung von großem Interesse, da damit im Gegensatz zu einem Elektronen- oder einem Kraftmikroskop auch lebende Systeme untersucht werden können. Durchlichtverfahren erlauben die Untersuchung der in den Proben ablaufenden Prozesse, z. B. die Dynamik lebender Zellen. Ein besseres Auflösungsvermögen bei solchen Lichtmikroskopen ist somit von grundsätzlicher Bedeutung.
• Bei der Erforschung des Lebens auf sub-zellulärer Ebene spielen die dreidimensionalen lichtmikroskopischen Untersuchungsmethoden, wie etwa die Multiphoton-Fluoreszenz-Mikroskopie eine wichtige Rolle. Mit der 4-π-konfokalen Mikroskopie können dreidimensionale Zellstrukturen viermal deutlicher abgebildet werden, als es mit der "high-end" konfokalen Mikroskopie bislang möglich war. Mit Hilfe zusätzlicher Bildbearbeitungstechniken wird eine dreidimensionale Auflösung in der Größenordnung von 100 nm, also deutlich unterhalb der Wellenlänge des sichtbaren Lichts von 400 nm bis 700 nm erreicht.
• Auch mit der Kontaktmikroskopie läßt sich eine gute räumliche Auflösung erzielen. In der Regel werden dabei biologische Objekte untersucht, die auf Photolack direkt aufgebracht und dann mit weicher Röntgenstrahlung belichtet werden. Anschließend werden die Proben in einem naßchemischen Verfahren entwickelt und die so erhaltenen Strukturen mit einem Rasterkraftmikroskop nachgewiesen. Dieses Verfahren erreicht eine hohe laterale Auflösung von etwa 50 nm. Als nachteilig erweist sich allerdings der große Aufwand, der von der Bereitstellung der notwendigen Lichtquelle bis hin zum umständlichen Nachweisverfahren mit Entwicklung und anschließender Abbildung mit dem Rasterkraftmikroskop reicht. Zeitaufgelöste Messungen sind auch mit diesem Verfahren nicht möglich, da die Prozedur langwierig ist und da das Röntgenlicht die Objekte, z. B. lebende Organismen, zerstört. Die Kontaktmikroskopie wird daher selten eingesetzt.
• Für höchstauflösende optische Abbildungen dient das Rasternahfeldmikroskop ("scanning near-field optical microscope"; SNOM). Dabei wird mit einer feinen Glasfaserspitze als Lichtquelle oder Sensor das zu untersuchende Objekt abgetastet und direkt das Lichtmuster im Nahfeld abgebildet. Die laterale Auflösung beim SNOM ist durch den Durchmesser der Faserspitze bedingt. Eine kleine Öffnung verringert jedoch die Transmission und verschlechtert das Signal- zu-Rausch-Verhältnis. Mit speziellen Ätzverfahren können Spitzen mit stabilen Öffnungsgrößen hergestellt werden. Zudem werden Spitzen mit möglichst großem Öffnungswinkel zur Verbesserung der Transmission erprobt. Mit diesem Verfahren lassen sich Strukturen mit bis zu 100 nm Auflösung abbilden.
• Mitunter reichen diese Auflösungen bei Forschungsvorhaben in der Chemie, Biologie und Molekularbiologie an bewegten oder lebenden Objekten, die bei Untersuchungen mit einem Elektronen- oder einem Rastersondenmikroskop ("scanning-probe-microscope", SPM) zerstört würden, nicht aus. Für derartige Vorhaben wäre ein optischer Detektor mit einer räumlichen Auslösung im Bereich von wenigen Nanometern wünschenswert. Ein solcher Detektor ist derzeit nicht verfügbar.
• Aufgabe der Erfindung ist es nunmehr, ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich bei geringem Aufwand insbesondere auch lebende Systeme mit einer lateralen Auflösung von wenigen Nanometern auch zeitaufgelöst untersuchen lassen. Zudem ist es Aufgabe der Erfindung, ein System zur Umsetzung des Verfahrens zu schaffen.
• Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruch 1 und ein System nach Anspruch 10 gelöst.
• Der erfindungswesentliche Grundgedanke liegt darin, die hohe Auflösung eines Rastersondenmikroskops ("scanning-probe-microscope", SPM) zu nutzen, um bildgebend optische Signale zu detektieren. Dazu wird ein Wandler genutzt, der das Lichtmuster der Probe in ein mit dem SPM zu untersuchendes Signal mit hoher räumlicher Selektivität transformiert. Der Wandler muß daher so beschaffen sein, daß eine dem Lichtmuster der Probe entsprechende Eigenschaftsänderung auftritt, die mit einem SPM ausgelesen werden kann. Dazu wird die Probe insbesondere im Nahfeld auf den Lichtwandler abgebildet, der das Bild in ein Signalmuster wandelt. Dieses Muster wird dann erfindungsgemäß mit einem bekannten Rastersondenverfahren mittels einer Sonde untersucht, wobei das so aufgenommene Bild vorteilhafter Weise digital weiterverarbeitet wird.
• Das Signalmuster kann sich auf unterschiedliche Art manifestieren. So können je nach Art des Wandlers Lichtmuster in Verteilungen freier oder gebundener Ladungen, in Topographiemuster, in magnetische Muster, in Polarisationsmuster, in Elastizitätsmuster oder in Austrittsarbeitsmuster transformiert werden, wobei die jeweiligen Muster über SPM ausgelesen werden.
• Die benötigten Rastersondenmikroskope sind an sich bekannt und seit ihrer ersten Realisierung im Jahre 1981 durch Binnig und Rohrer ein Standardverfahren zur Abbildung beliebiger Oberflächen mit höchster räumlicher Auflösung. So lassen sich mit solchen SPM zusätzlich zur Topographie auch Oberflächeneigenschaften wie die Verteilung gebundener und freier Ladungen auf atomarer Skala abbilden. Ebenso ist die Detektion von Einzelladungen, magnetischen Domänen, Polarisationszuständen oder auch mechanischer Eigenschaften, wie Elastizität oder Reibung, auf atomarer Skala möglich. Die Erfindung basiert somit auf dem Konzept, das Lichtsignal mit einem geeigneten Wandler in eine dem SPM zugängliche Eigenschaft zu transformieren ohne dabei die räumliche Auflösung zu verlieren.
• Optische Detektoren (Wandler) mit hoher räumlicher Auflösung, wie sie in dieser Erfindung beschrieben werden, lassen sich z. B. basierend auf der Photoleitung realisieren. Die erste Beobachtung dieses Effektes datiert auf das Jahr 1873 und wurde beim Experimentieren mit Selen gemacht. Für die Entwicklung von Solarzellen oder auch im Bereich der Opto-Elektronik wurde die Photoleitung inzwischen eingehend untersucht. Mit geeigneter Dotierung läßt sich sowohl die spektrale Empfindlichkeit als auch die Quanteneffizienz kontrolliert einstellen. Die rasante Entwicklung der Halbleitertechnologie hat die Verfahren zur Herstellung von photoleitenden Materialien in unterschiedlichsten Formen ermöglicht. Heute lassen sich freitragende Membranen mit wenigen Nanometern Dicke aus unterschiedlichen Materialien beispielsweise aus dotiertem Silizium fertigen. Außerdem stehen seit kurzem auch photoleitende organische Moleküle zur Verfügung, deren Eigenschaften sich über die chemische Zusammensetzung steuern lassen. Mit Hilfe der etablierten Langmuir-Blodgett-Technik können auch freitragende Filme von wenigen Molekülschichten Dicke hergestellt werden.
• Ein anderes Konzept zur Realisierung von optischen Detektoren mit hoher räumlicher Auflösung, wie sie in dieser Erfindung beschrieben werden, basiert auf der Verwendung von Materialien, die eine kanalartige supramolekulare Struktur haben (Nanoröhrenmatrix). In die Nanokanäle können spezifische Gastmoleküle eingebracht werden, die bei Belichtung ihren Polarisationszustand ändern. Generell lassen sich auch aus mehreren Wandlern zusammengesetzte Detektoren einsetzen, wobei diese vorteilhafter Weise eine regelmäßige Anordnung einzelner Elemente aufweisen.
• Generell sind Verfahren der Transmissions- und der Reflexionsmikroskopie denkbar. Bei der Transmissionsmikroskopie wird die eine Seite des Wandlers beleuchtet und die andere Seite mit dem SPM abgetastet. Das zu untersuchende Objekt wird, ähnlich wie bei der Kontaktmikroskopie, unmittelbar auf den Wandler aufgebracht und als Schattenwurf auf dessen Oberfläche abgebildet. Bei der "Reflexionsmikroskopie" wird die auf den Wandler abgebildete Probe entfernt und dessen mit dem Schattenwurf beleuchtete Oberfläche abgetastet.
• Wie beschrieben können zwei verschiedene Arten von Wandlern eingesetzt werden: Bei der ersten Methode wird vorteilhafter Weise ein wenige Nanometer dicker Wandlerfilm, beispielsweise aus dotiertem Silizium, eingesetzt, in dem das die Probe beleuchtende Licht freie elektrische Ladungen erzeugt. Der Film ist dabei so dünn, daß das Ladungsmuster beim Transport durch den Wandler erhalten bleibt. Bei der zweiten Methode wird ein Wandlerkristall eingesetzt: Ein solcher Kristall weist, wie beschrieben, eine Matrix von Nanokanälen auf, in die sich kontrolliert optisch nichtlineare Moleküle einlagern, wobei diese ihre Polarisationsrichtung bei Lichteinfall ändern. Bei diesen Wandlerkristallen transportieren die Moleküle das Signal durch das Material hindurch. Die Ausrichtung der Moleküle führt dann zu einer an der Oberfläche mit dem SPM meßbaren Änderung der elektrischen Polarisierung.
• Die Erfindung beruht somit darauf, daß am Ort der Belichtung in dem Wandler lokal eine Änderung der Eigenschaft, beispielsweise der Ladungsdichte oder des Polarisationszustandes, hervorgerufen wird. Im Fall einer räumlich inhomogenen Beleuchtung wird das Lichtmuster somit beispielsweise in ein Ladungsmuster oder ein Polarisationsmuster transformiert. Mit dem Rasterkraftmikroskop lassen sich diese Eigenschaften mit hoher lateraler Auflösung abbilden. Der Vorteil der Erfindung liegt darin, daß sich mit vergleichsweise geringem Aufwand auch lebende Proben mit einer Auflösung von bis zu einem Nanometer zerstörungsfrei untersuchen lassen.
• Zur Untersuchung eines Objektes kann dieses direkt auf den Wandler aufgebracht und homogen beleuchtet werden. Dadurch nutzt der Wandler die Abbildung im Nahfeld und vermeidet eine Verschmierung der Abbildung durch Beugung. Licht, das vom Objekt selber abgestrahlt wird, kann in gleicher Weise mit hoher räumlicher Auflösung abgebildet werden. Je nach Bedarf kann es vorteilhaft sein, zur Beleuchtung des Objektes UV-Licht, sichtbares Licht oder infrarotes Licht zu verwenden. Bei besonders dicken Proben ist sogar die Verwendung von insbesondere weicher Röntgenstrahlung denkbar. Wegen seiner definierten Eigenschaften kann für die Beleuchtung der Probe Laserlicht vorteilhaft sein. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, die Probe mit polarisierter Strahlung zu beleuchten.
• Um Verschmierungen der Bilder durch zeitliche Veränderungen in der lebenden Probe zu vermeiden, ist es vorteilhaft, diese mit gepulstem Licht (Blitzlicht) zu beleuchten.
• Die Erfindung wird nachfolgend anhand der in den Fig. 1 bis 4 beschriebenen Ausführungsbeispiele näher beschrieben. Es zeigen:
• Fig. 1 einen Detektor mit einer auf den Wandler aufgebrachten lichtabsorbierenden Probe,
• Fig. 2 einen Detektor mit selbststrahlender Probe,
• Fig. 3 einen Detektor mit ultradünner Wandlermembran und
• Fig. 4 einen Detektor mit Nanoröhrenmatrix.
• Fig. 1 zeigt das Prinzip des Detektors für ein lichtabsorbierendes Objekt. Das Objekt 1, hier eine Zelle mit Zellkern 1a, wird unmittelbar auf einen dünnen Wandlerfilm 2 aufgebracht, wobei die Dicke des Wandlerfilmes mit wenigen Nanometern kleiner als die Wellenlänge der beleuchtenden Strahlung 3 ist. Dann wird das Objekt 1 mit der homogenen Strahlung 3 von der Objektseite aus belichtet. In dem Wandlerfilm 2 erzeugt der Schattenwurf 7 des Objektes 1 eine Verschiebung (durch unterschiedliche Grautöne dargestellt) der vormals homogenen Eigenschaften des Wandlerfilmes. Auf der gegenüberliegenden Seite des Wandlers wird dieses Signalmuster 7 mit einer in Richtung des Pfeiles verschiebbaren SPM-Spitze 4 detektiert.
• In Fig. 2 ist das Prinzip eines Detektors gezeigt, bei dem ein lichtemittierendes Objekt 5, beispielsweise eine Zelle mit einer Zellstruktur 5a, die mit einem Fluoreszenz-Marker versehen ist, direkt auf einen Wandler 2 aufgebracht wird. Auf der gegenüberliegenden Seite wird das Signal mit einer SPM-Spitze 4 detektiert.
• Fig. 3 zeigt eine andere Art des Wandlers. Dabei wird als Wandlermedium ein selbsttragender photosensitiver Film 6 benutzt, der eine Dicke von wenigen Nanometern hat. Das zu untersuchende Objekt 1 wird direkt auf den Wandlerfilm 6 aufgebracht. Bei homogener Belichtung 3 von der Objektseite aus entsteht im Wandlerfilm ein der transmittierten Lichtintensität entsprechendes Ladungsmuster (bezeichnet durch die unterschiedlich starken + Symbole), wobei die Struktur des Objekts abgebildet wird. Der optische Detektor wird wiederum mit einem SPM 4 ausgelesen. Durch das Abtasten der Oberfläche mit dem Rastersondenmikroskop entsteht eine zweidimensionale Darstellung der Ladungsverteilung, die der ursächlichen Lichtverteilung entspricht. Bei dieser Realisierung des Wandlers wird die hohe räumliche Auflösung dadurch gewährleistet, daß der Wandlerfilm extrem dünn ist. Somit wird die Ladungsverteilung während des Transports durch den Wandlerfilm nicht verschmiert.
• Statt als Wandler einen solchen ultradünnen photoleitenden Film zu verwenden, ist es, wie Fig. 4 zeigt, auch möglich einen Kristall mit parallel orientierter Kanalstruktur einzusetzen. Ein geeignetes Material ist Perhydrotriphenylen (PHTP), das eine bienenwabenförmige, supramolekulare Struktur hat. Die ungestört durch den Kristall laufenden Kanäle haben bei PHTP einen Abstand von nur etwa 1 Nanometer. Die Kristalle können mit einer Größe von wenigen Millimetern hergestellt werden. Die Kanäle werden dann mit photosensitiven Gastmolekülen gefüllt. Aufgrund des kleinen Durchmessers der Kanäle werden die Gastmoleküle in Richtung der Kanalachse ausgerichtet. Die photosensitiven Moleküle ändern bei Beleuchtung ihre Polarisation und geben diese als elektrisches Signal an die Nachbarmoleküle weiter. Wird also das eine Ende des Kanals beleuchtet, entsteht am gegenüberliegenden Ende des Kristalls eine Änderung der Polarisation. Das Füllmaterial kann anwendungsspezifisch ausgewählt werden.
• Fig. 4 zeigt einen solchen Wandler mit orientierter Kanalstruktur. Das zu untersuchende Objekt 1 wird direkt auf die Nanokanal-Matrix, den photosensitiven Wandlerfilm 7 aufgebracht. Bei homogener Belichtung 3 von der Objektseite entsteht im Wandlerfilm ein zur transmittierten Lichtintensität proportionales Polarisierungsmuster, wobei die Struktur des Objekts abgebildet wird. Der optische Detektor wird mit einem SPM 4 ausgelesen. Durch Abtasten der Oberfläche mit dem Rasterkraftmikroskop entsteht ein zweidimensionales Bild der Polarisierung, die der ursächlichen Lichtverteilung entspricht.
• Bei dieser Realisierung des Wandlers wird die hohe räumliche Auflösung dadurch gewährleistet, daß das Signal im Wandler durch die Kanäle geleitet wird und sich nicht isotrop ausbreiten kann. Da zwischen den Kanälen kein Übersprechen möglich ist, wird die Polarisierungsverteilung während des Transports nicht verschmiert.

Claims (10)

1. Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung von Proben (1), die zumindest teilweise für elektromagnetische Strahlung, insbesondere Licht der Wellenlängen zwischen 10 nm und 10000 nm, lichtdurchlässig sind, wobei eine Probe (1) mit der Strahlung (3) bestrahlt und das Bild der Probe (1) untersucht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe(1) auf einen Lichtwandler (2) abgebildet wird, der das Bild in ein Signalmuster (7) wandelt, wobei das Signalmuster (7) mit einem Rastersondenverfahren (Scanning Probe Microscopy) untersucht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalmuster(7)auf der Oberfläche des Lichtwandlers (2) entsteht und dort untersucht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtwandler (2) eine Struktur aus photosensitivem Material verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktur ein Film ist, der dünner als die Wellenlänge der beleuchtenden Strahlung (3) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtwandler(2)ein supramolekularer Kristall mit einer makroskopischen Kanalstruktur verwendet wird, wobei die Kanäle mit polaren Molekülen gefüllt sind und wobei das Bild auf eine Oberfläche des Kristalls abgebildet wird, in die die Öffnungen der Kanäle münden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Kristall dicker ist, als die Wellenlänge der beleuchtenden Strahlung (3).

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (1)unmittelbar auf der Oberfläche des Lichtwandlers (2) aufgebracht wird, die der Strahlung (3) ausgesetzt ist.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (1) mit einem oder mehreren Lichtpulsen (Blitzlicht) beleuchtet wird.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Belichtung die der Strahlung (3) abgewandte Oberfläche des Lichtwandlers (2) mit der Sonde (4) im Rastersondenverfahren untersucht wird.

10. System zur Umsetzung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch,

- eine Lichtquelle zur Beleuchtung einer Probe (1),

- einen Probenhalter aufweisend einen zum direkten Aufbringen der Probe geeigneten Lichtwandler (2), der einen Schattenwurf der Probe (1) in ein Signalmuster (7) auf seiner Oberfläche wandelt,

- ein Rastersondenmikroskop mit einer feinen Spitze (4) zur Abtastung und Untersuchung des auf dem Lichtwandler entstandenen Signalmusters (7) und

- eine Auswerteelektronik zur Generierung eines Bildes aus dem abgetasteten Signalmuster.