DE10221846A1 - Detecting an analyte by enzymatic reaction, useful specifically for measuring glucose in blood, based on reaction with coenzyme and inactive coenzyme-binding protein - Google Patents

Detecting an analyte by enzymatic reaction, useful specifically for measuring glucose in blood, based on reaction with coenzyme and inactive coenzyme-binding protein

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Abstract

Detecting an analyte (I) by enzymatic reaction comprising treating a sample with a detection reagent (DR) that contains a coenzyme (Co) and a catalytically inactive (Co)-binding protein (BP). (Co) is altered by reaction with (I), the altered coenzyme (Co') binds to BP and (I) is detected from (Co')-BP binding, is new. An Independent claim is also included for a reagent system for detecting (I) that comprises (Co) and CBP.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenzsystem zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion, umfassend die Verwendung eines Nachweisreagenz, das ein Coenzym und ein katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein enthält. The invention relates to a method and a reagent system for detection an analyte in a sample by an enzymatic reaction, comprising the use of a detection reagent which is a coenzyme and contains a catalytically inactive coenzyme binding protein.

Der Nachweis von Analyten, beispielsweise Glucose in Blut, durch enzymatische Methoden ist bekannt. Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem Nachweisreagenz, das ein durch eine enzymatische Reaktion nachweisbares, z. B. reduzierbares oder oxidierbares, Coenzym enthält, in Kontakt gebracht. Die bei Reduktion bzw. Oxidation des Coenzyms entstehenden Redoxäquivalente können auf Mediatoren übertragen werden, die dann in einem weiteren Schritt elektrochemisch oder photometrisch erfasst werden. Eine Kalibrierung liefert einen direkten Zusammenhang des Messwerts mit der Konzentration des zu bestimmenden Analyten. The detection of analytes, for example glucose in blood, by enzymatic methods are known. The one to be determined Analyte with a detection reagent, which by an enzymatic Reaction detectable, e.g. B. reducible or oxidizable, coenzyme contains, contacted. The reduction or oxidation of Coenzyme-generated redox equivalents can be applied to mediators which are then electrochemically transferred in a further step or recorded photometrically. A calibration provides a direct one Relationship of the measured value with the concentration of the determining analyte.

Ein beim Nachweis der enzymatischen Reaktion oft auftretendes Problem besteht darin, dass Mediatoren einerseits den Einsatz komplexer Reaktionsgemische erfordern, die zu einer geringen Stabilität und einer hohen Störanfälligkeit der Nachweisreaktion führen, andererseits werden Mediatoren oftmals benötigt, um überhaupt einen Nachweis durchführen zu können oder eine ausreichende Nachweissensitivität zu erreichen. A problem that often occurs when detecting the enzymatic reaction is that mediators use complex on the one hand Reaction mixtures require a low stability and a lead to high susceptibility to failure of the detection reaction, on the other hand Mediators are often required to perform evidence at all can achieve or sufficient detection sensitivity.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, die geschilderten Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise zu vermeiden. Insbesondere sollte ein unempfindliches und sensitives Verfahren zum Nachweis von Analyten bereitgestellt werden, welches auch in Abwesenheit von Mediatoren zu zuverlässigen Messergebnissen führt. The object underlying the present invention was the disadvantages of the prior art described at least partially to avoid. In particular, an insensitive and sensitive Methods for the detection of analytes are provided, which also leads to reliable measurement results in the absence of mediators.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass den übrigen Bestandteilen eines enzymatischen Nachweisreagenz ein katalytisch inaktives Coenzym- bindendes Protein zugesetzt wird. Insbesondere ist das katalytisch inaktive Protein in der Lage, ein durch Reaktion des Analyten verändertes Coenzym zu binden und somit dessen Nachweisbarkeit, insbesondere durch optische Methoden zu verbessern. This problem is solved in that the remaining components of a enzymatic detection reagent a catalytically inactive coenzyme binding protein is added. In particular, this is catalytically inactive Protein is able to produce a coenzyme modified by reaction of the analyte bind and thus its traceability, especially by optical Methods to improve.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion, umfassend die Schritte:

  • a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisreagenz, umfassend ein Coenzym und ein katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein, wobei das Coenzym durch Reaktion mit dem Analyten verändert wird und das veränderte Coenzym an das katalytisch inaktive Protein bindet, und
  • b) Nachweisen einer Reaktion des Analyten durch Veränderung des Coenzyms.
The invention thus relates to a method for the detection of an analyte in a sample by an enzymatic reaction, comprising the steps:
  • a) contacting the sample with a detection reagent comprising a coenzyme and a catalytically inactive coenzyme-binding protein, wherein the coenzyme is changed by reaction with the analyte and the changed coenzyme binds to the catalytically inactive protein, and
  • b) detecting a reaction of the analyte by changing the coenzyme.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzsystem zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend:

  • a) ein Coenzym und
  • b) ein katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein.
Another object of the invention is a reagent system for the detection of an analyte in a sample, comprising:
  • a) a coenzyme and
  • b) a catalytically inactive coenzyme-binding protein.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine einfache qualitative oder quantitative Bestimmung von Analyten durch eine enzymatische Reaktion. Das Verfahren eignet sich zum Nachweis beliebiger Analyten, die durch eine enzymatische Reaktion unter Beteiligung eines Coenzyms nachgewiesen werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich gegenüber bekannten Verfahren dadurch aus, dass dem Nachweisreagenz ein katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein zugesetzt wird, wobei eine verbesserte Nachweissensitivität bewirkt wird. Das Nachweisreagenz enthält das katalytisch inaktive Protein in einer ausreichenden Menge, um entsprechend dem gewünschten Testformat eine verbesserte Sensitivität bei einer qualitativen oder/und quantitativen Bestimmung des Analyten zu ermöglichen. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt ein direkter Nachweis des durch die enzymatische Reaktion veränderten Coenzyms erfolgt, ist eine Anwesenheit von Mediatoren oder anderen Substanzen, die eine Regeneration des Coenzyms bewirken können, in vielen Fällen nicht erforderlich. The present invention enables a simple qualitative or quantitative determination of analytes by an enzymatic reaction. The method is suitable for the detection of any analytes that pass through an enzymatic reaction involving a coenzyme can be demonstrated. The method according to the invention draws differs from known methods in that the Detection reagent is a catalytically inactive coenzyme binding protein is added, whereby an improved detection sensitivity is brought about. The detection reagent contains the catalytically inactive protein in one sufficient amount to match the desired test format an improved sensitivity with a qualitative and / or quantitative To enable determination of the analyte. Since with the invention The method prefers a direct detection of the enzymatic Reaction modified coenzyme takes place, is a presence of Mediators or other substances that cause regeneration of the coenzyme in many cases not necessary.

Das Verfahren und das Nachweissystem erlauben die Verwendung von kleinsten Probenmengen, beispielsweise Probenvolumina ≤ 1 µl, vorzugsweise ≤ 0,1 µl. Gegebenenfalls kann die Probe vor dem Inkontaktbringen mit dem Nachweisreagenz noch verdünnt werden. The method and the detection system allow the use of smallest sample quantities, for example sample volumes ≤ 1 µl, preferably ≤ 0.1 µl. If necessary, the sample can be taken before Contact with the detection reagent can be diluted.

Das erfindungsgemäße Verfahren und Nachweissystem eignet sich zur Bestimmung beliebiger Analyten, beispielsweise Parametern in biologischen Proben, wie etwa Körperflüssigkeiten, wie etwa Blut, Serum, Plasma oder Urin, aber auch in Abwasserproben oder Lebensmitteln. Das Verfahren kann sowohl als Nasstest, z. B. in einer Küvette, oder als Trockentest auf einem entsprechenden Reagenzträger durchgeführt werden. The method and detection system according to the invention is suitable for Determination of any analyte, for example parameters in biological Samples such as body fluids such as blood, serum, plasma or Urine, but also in wastewater samples or food. The procedure can be used both as a wet test, e.g. B. in a cuvette, or as a dry test an appropriate reagent carrier.

Als Analyten können beliebige biologische oder chemische Substanzen ausgewählt werden, die durch eine enzymatische Reaktion bestimmt werden können, wie etwa Enzyme oder Enzymsubstrate, wobei die Reaktion, insbesondere eine Redoxreaktion umfasst. Beispiele für geeignete Analyten sind etwa Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide etc. Any biological or chemical substances can be used as analytes can be selected, which is determined by an enzymatic reaction such as enzymes or enzyme substrates, the Reaction, in particular a redox reaction. Examples of suitable ones Analytes are, for example, glucose, lactic acid, malic acid, glycerin, alcohol, Cholesterol, triglycerides, ascorbic acid, cysteine, glutathione, peptides etc.

Die enzymatische Reaktion ist vorzugsweise eine Redoxreaktion, bei der eine Reduktion oder Oxidation des nachzuweisenden Coenzyms erfolgt. Für eine derartige Reaktion zum Nachweis von Enzymsubstraten wird als Enzym im Nachweisreagenz vorzugsweise eine Oxidoreduktase verwendet. Besonders bevorzugt verwendet man als Enzym eine Dehydrogenase, beispielsweise ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1) oder Aminosäure-Dehydrogenase, z. B. L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). Weitere geeignete Enzyme sind Oxidasen, wie etwa Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4) oder Cholesterinoxidase (E.C.1.1.3.6). The enzymatic reaction is preferably a redox reaction in which the coenzyme to be detected is reduced or oxidized. For such a reaction for the detection of enzyme substrates is called Enzyme in the detection reagent preferably uses an oxidoreductase. A dehydrogenase is particularly preferably used as the enzyme, for example selected from a glucose dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), lactate dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), malate Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), glycerol dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alcohol dehydrogenase (E.C.1.1.1.1) or amino acid dehydrogenase, z. B. L-amino acid dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). More suitable Enzymes are oxidases, such as glucose oxidase (E.C.1.1.3.4) or Cholesterol oxidase (E.C.1.1.3.6).

Wenn als Analyt ein Enzym nachgewiesen werden soll, ist die Anwesenheit eines Enzyms im Nachweisreagenz oftmals nicht erforderlich. In diesem Fall wird eine durch das in der Probe als Analyt vorhandene Enzym bewirkte Veränderung des Coenzyms nachgewiesen. Auch in diesem Falle ist die Nachweisreaktion bevorzugt eine Reduktion oder Oxidation und als Enzym wird eine Oxidoreduktase nachgewiesen. If an enzyme is to be detected as an analyte, the presence is of an enzyme in the detection reagent is often not required. In this case is caused by the enzyme present as an analyte in the sample Change in the coenzyme detected. In this case too Detection reaction prefers a reduction or oxidation and as an enzyme an oxidoreductase is detected.

Coenzyme im Sinne der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise organische Moleküle, die kovalent oder nichtkovalent an ein Enzym gebunden sind und durch die Umsetzung des Analyten verändert, beispielsweise oxidiert oder reduziert werden. Bevorzugte Beispiele für Coenzyme sind Flavin-, Nicotin- und Chinonderivate, beispielsweise Flavinnukleosidderivate, wie etwa FAD, FADH2, FMN, FMNH2, etc., Nicotinnukleosidderivate wie etwa NAD+, NADH/H+, NADP+, NADPH/H+ etc. oder Ubichinone, wie etwa Coenzym Q, PQQ etc. Besonders bevorzugt ist NADH/H+ als Coenzym. Coenzymes in the sense of the present invention are preferably organic molecules which are covalently or non-covalently bound to an enzyme and are changed, for example oxidized or reduced, by the reaction of the analyte. Preferred examples of coenzymes are flavin, nicotin and quinone derivatives, for example flavin nucleoside derivatives such as FAD, FADH 2 , FMN, FMNH 2 , etc., nicotine nucleoside derivatives such as NAD + , NADH / H + , NADP + , NADPH / H + etc or ubiquinones, such as coenzyme Q, PQQ etc. NADH / H + is particularly preferred as coenzyme.

Die Veränderung des Coenzyms durch Reaktion mit dem Analyten kann grundsätzlich auf beliebige Art und Weise nachgewiesen werden. Hier können grundsätzlich alle aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zum Nachweis enzymatischer Reaktionen eingesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch die Veränderung des Coenzyms durch optische Methoden nachgewiesen. Optische Nachweismethoden umfassen beispielsweise die Messung von Absorption, Fluoreszenz, Circulardichroismus (CD), optische Rotationsdispersion (ORD) oder Refraktometrie. Besonders bevorzugt wird die Veränderung des Coenzyms durch Messung der Fluoreszenz nachgewiesen. Die Fluoreszenzmessung ist hochsensitiv und ermöglicht den Nachweis selbst geringer Konzentrationen des Analyten in miniaturisierten Systemen. The change in the coenzyme by reaction with the analyte can can be demonstrated in any way. Here can basically all methods known from the prior art be used to detect enzymatic reactions. Preferably However, the change of the coenzyme by optical methods demonstrated. Optical detection methods include, for example Measurement of absorption, fluorescence, circular dichroism (CD), optical Rotational dispersion (ORD) or refractometry. Is particularly preferred the change in the coenzyme by measuring the fluorescence demonstrated. The fluorescence measurement is highly sensitive and enables the detection of even low concentrations of the analyte in miniaturized systems.

Durch Bindung des Coenzyms an das katalytisch inaktive Protein wird eine Verbesserung der Nachweisbarkeit, insbesondere durch optische Methoden bewirkt. So führt die Bindung des Coenzyms an ein katalytisch inaktives Protein insbesondere zu einer verbesserten Fluoreszenzausbeute des Coenzyms. By binding the coenzyme to the catalytically inactive protein, a Improvement of the detectability, especially through optical methods causes. The binding of the coenzyme to a catalytically inactive one Protein in particular improves the fluorescence yield of the Coenzyme.

Das erfindungsgemäße Verfahren oder Nachweissystem kann einen Flüssigtest umfassen, wobei das Reagenz z. B. in Form einer Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit oder als Pulver oder Lyophilisat vorliegt. Vorzugsweise beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren und Nachweissystem jedoch einen Trockentest, wobei das Reagenz auf einem Träger aufgebracht ist. Der Träger kann beispielsweise einen Teststreifen, umfassend ein saugfähiges oder/und quellbares Material, umfassen, das von der zu untersuchenden Probeflüssigkeit benetzt wird. The method or detection system according to the invention can Include liquid test, the reagent e.g. B. in the form of a solution or Suspension in an aqueous or non-aqueous liquid or as Powder or lyophilisate is present. This preferably includes method and detection system according to the invention, however Dry test, with the reagent applied to a support. The For example, wearer may have a test strip comprising an absorbent and / or swellable material, include that of the material to be examined Sample liquid is wetted.

Das katalytisch inaktive Coenzym-bindende Protein ist in der Lage, das als Produkt der enzymatischen Nachweisreaktion entstehende Coenzym zu binden, wobei durch die Bindung des Coenzyms eine verbesserte Nachweisbarkeit des Coenzym-Reaktionsprodukts bewirkt wird. Das katalytisch inaktive Protein ist vorzugsweise ein inaktiviertes Enzym oder ein Fragment eines inaktivierten Enzyms, welche nicht katalytisch aktiv ist, aber noch eine Coenzym-Bindungsstelle enthält. Vorzugsweise verwendet man eine inaktivierte Oxidoreduktase, z. B. eine inaktivierte Dehydrogenase. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer inaktivierten NADH-bindenden Dehydrogenase, wie etwa Glucose- Dehydrogenase. The catalytically inactive coenzyme-binding protein is able to act as Product of the enzymatic detection reaction to coenzyme bind, with the binding of the coenzyme an improved Detectability of the coenzyme reaction product is effected. The Catalytically inactive protein is preferably an inactivated enzyme or a fragment of an inactivated enzyme which is not catalytically active, but still contains a coenzyme binding site. Preferably used an inactivated oxidoreductase, e.g. B. an inactivated Dehydrogenase. The use of a is particularly preferred inactivated NADH-binding dehydrogenase, such as glucose Dehydrogenase.

Die Inaktivierung von Enzymen kann durch Mutationen in der Aminosäuresequenz, beispielsweise Deletionen, Insertionen oder/und Substitutionen einzelner Aminosäuren oder Abschnitten von mehreren Aminosäuren, bewirkt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Mutation im katalytischen Zentrum des Enzyms. So kann beispielsweise Glucose-Dehydrogenase an dem für die katalytische Aktivität essenziellen Histidinrest an Possition 147 mutagenisiert werden, beispielsweise zu Serin oder Tryptophan. Das Ergebnis ist ein NADH-bindendes Protein ohne substanzielle katalytische Aktivität. Andererseits kann die Inaktivierung des Enzyms auch durch chemische Modifikationen, beispielsweise chemische Modifikationen im katalytischen Zentrum, erfolgen, durch die die katalytische Aktivität zumindest weitgehend beseitigt wird, während die Fähigkeit zur Bindung des Coenzyms erhalten bleibt. The inactivation of enzymes can be caused by mutations in the Amino acid sequence, for example deletions, insertions and / or Substitutions of individual amino acids or sections of several Amino acids. In a particularly preferred There is a mutation in the catalytic center of the embodiment Enzyme. For example, glucose dehydrogenase can be used for the Catalytic activity of essential histidine residue at position 147 mutagenized, for example to serine or tryptophan. The The result is a NADH-binding protein without substantial catalytic Activity. On the other hand, the enzyme can also be inactivated by chemical modifications, for example chemical modifications in catalytic center, through which the catalytic activity is at least largely eliminated while the ability to bind of the coenzyme is retained.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Nachweisreagenz in einer Matrix eingelagert, beispielsweise in einem saugfähigen Material oder in einer Gelmatrix, verwendet. Die Gelmatrix weist vorzugsweise eine Schichtdicke ≤ 50 µm, insbesondere ≤ 5 µm, auf und ist auf einem Träger, beispielsweise einem zumindest teilweise optisch transparenten Träger aufgebracht. Die Gelmatrix ist vorzugsweise ein Polymer, das auf Basis von photopolymerisierbaren Monomeren, wie etwa acrylischen Monomeren, z. B. Acrylamid oder/und Acrylsäureestern, wie Polyethylenglykoldiacrylat, oder vinylaromatischen Monomeren, z. B. 4- Vinylbenzolsulfonsäure, oder Kombinationen davon, aufgebaut ist. Zur Herstellung einer derartigen Gelmatrix kann eine Flüssigkeit, die das Reagenz, umfassend ein Coenzym, ein katalytisch inaktives Protein, ein oder mehrere photopolymerisierbare Monomere sowie gegebenenfalls Enzym, Photoinitiator oder/und nichtreaktive Bestandteile, enthält, auf einen zumindest teilweise optisch transparenten Träger, beispielsweise auf eine Plastikfolie, aufgetragen und z. B. mit UV-Licht von der Rückseite her bestrahlt werden, so dass eine Polymerisation des Monomers oder der Monomere auf dem Träger bis zu einer vorbestimmten Schichtdicke erfolgt. Die Schichtdicke kann durch Zugabe von absorbierenden Substanzen zum Reagenz oder/und durch die Bestrahlungsdauer bzw. -intensität gesteuert werden. Überschüssiges flüssiges Reagenz kann nach der Polymerisation entfernt und erneut eingesetzt werden. In a particularly preferred embodiment, the Detection reagent stored in a matrix, for example in a absorbent material or in a gel matrix. The gel matrix preferably has a layer thickness 50 50 μm, in particular ≤ 5 μm and is on a carrier, for example at least partially optical transparent carrier applied. The gel matrix is preferably a Polymer based on photopolymerizable monomers, such as acrylic monomers, e.g. B. acrylamide and / or acrylic acid esters, such as Polyethylene glycol diacrylate, or vinyl aromatic monomers, e.g. B. 4- Vinylbenzenesulfonic acid, or combinations thereof, is built up. to Preparation of such a gel matrix can be a liquid that the A reagent comprising a coenzyme, a catalytically inactive protein or more photopolymerizable monomers and optionally Enzyme, photoinitiator and / or non-reactive components contains an at least partially optically transparent carrier, for example on a plastic film, applied and z. B. with UV light from the back be irradiated so that polymerization of the monomer or Monomers takes place on the carrier up to a predetermined layer thickness. The layer thickness can be increased by adding absorbent substances Reagent or / and controlled by the radiation duration or intensity become. Excess liquid reagent can be after the polymerization removed and reinserted.

Andererseits kann die Matrix auch durch konventionelle Beschichtungsprozeduren hergestellt werden, wobei das flüssige Reagenz auf einen Träger aufgetragen, dort mit geeigneten Methoden, z. B. mit einem Rakel, auf die gewünschte Dicke gebracht und dann getrocknet oder vollständig polymerisiert wird. On the other hand, the matrix can also be replaced by conventional Coating procedures are made using the liquid reagent applied to a carrier, there using suitable methods, e.g. B. with a squeegee, brought to the desired thickness and then dried or is fully polymerized.

Nach Einpolymerisierung in die Gelmatrix befinden sich das katalytisch inaktive Protein und gegebenenfalls das Enzym in einer geschützten Mikroumgebung. Bei ausreichender Vernetzung der polymeren Gelmatrix liegen die Proteinmoleküle in einer immobilisierten Form vor. Niedermolekulare Substanzen bzw. Glucose oder andere Analyten oder auch Coenzyme können frei durch das Polymernetzwerk diffundieren. After polymerization into the gel matrix, they are catalytic inactive protein and possibly the enzyme in a protected Microenvironment. With sufficient crosslinking of the polymeric gel matrix the protein molecules are in an immobilized form. Low molecular weight substances or glucose or other analytes or Coenzymes can also diffuse freely through the polymer network.

Das katalytisch inaktive Protein und gegebenenfalls das Enzym können zusammen mit dem Coenzym in die Matrix einpolymerisiert werden oder die Matrix kann nach der Polymerisation mit einer Lösung des Coenzym in Kontakt gebracht werden, so dass dieses in die Matrix eindiffundieren kann. Das durch die Reaktion veränderte, z. B. reduzierte oder oxidierte, Coenzym ist durch Bindung an das inaktive Protein und gegebenenfalls zusätzlich durch Einlagerung in die Gelmatrix optimal vor Störeinflüssen geschützt. The catalytically inactive protein and optionally the enzyme can are polymerized into the matrix together with the coenzyme or the After polymerization, the matrix can be dissolved in a solution of the coenzyme Are brought into contact so that they diffuse into the matrix can. The changed by the reaction, e.g. B. reduced or oxidized, Coenzyme is by binding to the inactive protein and optionally in addition, optimal storage against interference due to storage in the gel matrix protected.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch das nachfolgende Beispiel näher erläutert werden. The present invention is further intended to be illustrated by the following example are explained in more detail.

Beispielexample Lactatnachweis über NADH-Fluoreszenz mit inaktivierter Glucose-Dehydrogenase/NAD+/Lactat-Dehydrogenase in einer KüvetteLactate detection via NADH fluorescence with inactivated glucose dehydrogenase / NAD + / lactate dehydrogenase in a cuvette Inaktivierung von Glucose-Dehydroaenase (GlucDH)Inactivation of glucose dehydroaenase (GlucDH)

Das essentielle Histidin der GlucDH an Position 147 wurde nach bekannten Verfahren gegen Serin ausgestauscht. The essential histidine of GlucDH at position 147 has been known Procedures exchanged for serine.

LactatnachweisLactatnachweis

100 mg/ml der inaktivierten GlucDH wurden in Puffer von pH 7 gelöst und mit der entsprechenden Menge NAD+ und einer katalytischen Menge Lactat-Dehydrogenase versetzt. Bei Zugabe von ansteigenden Mengen Lactat ließ sich visuell ein Anstieg der Fluoreszenz unter einer UV-Lampe (Anregungswellenlänge 366 nm) erkennen. Ohne inaktiviertes Enzym war keine vergleichbare Fluoreszenz beobachtbar. 100 mg / ml of the inactivated GlucDH were dissolved in pH 7 buffer and the appropriate amount of NAD + and a catalytic amount of lactate dehydrogenase were added. When increasing amounts of lactate were added, an increase in fluorescence under a UV lamp (excitation wavelength 366 nm) could be seen visually. No comparable fluorescence was observed without the inactivated enzyme.

Claims (28)

1. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion, umfassend die Schritte: a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisreagenz, umfassend ein Coenzym und ein katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein (Bindungsprotein), wobei das Coenzym durch Reaktion mit dem Analyten verändert wird und das veränderte Coenzym an das katalytisch inaktive Protein bindet und b) Nachweisen einer Reaktion des Analyten durch Veränderung des Coenzym-Bindungsprotein-Komplexes. 1. A method for the detection of an analyte in a sample by an enzymatic reaction, comprising the steps: a) contacting the sample with a detection reagent comprising a coenzyme and a catalytically inactive coenzyme-binding protein (binding protein), the coenzyme being changed by reaction with the analyte and the changed coenzyme binding to the catalytically inactive protein and b) Detecting a reaction of the analyte by changing the coenzyme-binding protein complex. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Reaktion eine Redoxreaktion umfasst. 2. The method according to claim 1, characterized, that the enzymatic reaction involves a redox reaction. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisreagenz weiterhin ein Enzym enthält. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that the detection reagent still contains an enzyme. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzym eine Oxidoreduktase verwendet und eine Veränderung des Coenzyms durch Oxidation oder Reduktion nachweist. 4. The method according to claim 3, characterized, that an oxidoreductase is used as the enzyme and one Change in the coenzyme by oxidation or reduction prove. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzym eine Dehydrogenase verwendet, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1) oder Aminosäure-Dehydrogenase, z. B. L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). 5. The method according to claim 4, characterized, selected to use a dehydrogenase as the enzyme from a glucose dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), lactate Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), malate dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), glycerol dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), alcohol Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1) or amino acid dehydrogenase, e.g. B. L-amino acid dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Coenzym ausgewählt aus Flavin-, Nicotin- und Chinonderivaten verwendet. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that one selected a coenzyme from flavin, nicotin and Quinone derivatives used. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Coenzym auswählt aus FAD, FADH2, FMN, FMNH2, Coenzym Q, PQQ, NAD+, NADH/H+, NADP+ und NADPH/H+. 7. The method according to claim 6, characterized in that one selects the coenzyme from FAD, FADH 2 , FMN, FMNH 2 , coenzyme Q, PQQ, NAD + , NADH / H + , NADP + and NADPH / H + . 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein ein inaktiviertes Enzym verwendet. 8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized, that as a catalytically inactive coenzyme binding protein inactivated enzyme used. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man eine inaktivierte Oxidoreduktase verwendet. 9. The method according to claim 8, characterized, that you use an inactivated oxidoreductase. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man eine inaktivierte Dehydrogenase verwendet. 10. The method according to any one of claims 8 or 9, characterized, that you use an inactivated dehydrogenase. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das inaktivierte Enzym eine Mutation in der Aminosäuresequenz aufweist. 11. The method according to any one of claims 8 to 10, characterized, that the inactivated enzyme is a mutation in the amino acid sequence having. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mutation im katalytischen Zentrum vorliegt. 12. The method according to claim 11, characterized, that there is a mutation in the catalytic center. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das inaktivierte Enzym eine chemische Modifikation enthält. 13. The method according to any one of claims 8 to 10, characterized, that the inactivated enzyme contains a chemical modification. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine chemische Modifikation im katalytischen Zentrum vorliegt. 14. The method according to claim 13, characterized, that there is a chemical modification in the catalytic center. 15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man die Veränderung des Coenzyms durch optische Methoden nachweist. 15. The method according to claim 1 to 14, characterized, that you can change the coenzyme by optical methods prove. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Veränderung des Coenzyms durch Messung der Fluoreszenz nachweist. 16. The method according to claim 15, characterized, that you can change the coenzyme by measuring the Detects fluorescence. 17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Analyten in einer Körperflüssigkeit bestimmt. 17. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that you determine an analyte in a body fluid. 18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Analyten, ausgewählt aus Enzymen und Enzymsubstraten, bestimmt. 18. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that you have an analyte selected from enzymes and Enzyme substrates, determined. 19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekenzeichnet, dass man eine Bestimmung von Glucose im Blut durchführt. 19. The method according to claim 17 or 18, characterized by that a determination of glucose in the blood is carried out. 20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nachweisreagenz in einer Gelmatrix eingelagert verwendet. 20. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the detection reagent is stored in a gel matrix used. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelmatrix auf einem zumindest teilweise optisch transparenten Träger aufgebracht wird. 21. The method according to claim 20, characterized, that the gel matrix is at least partially optical transparent carrier is applied. 22. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelmatrix eine Schichtdicke von 50 µm, insbesondere von 5 µm aufweist. 22. The method according to claim 17 or 18, characterized, that the gel matrix has a layer thickness of 50 μm, in particular of 5 µm. 23. Reagenzsystem zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend: a) ein Coenzym und b) ein katalytisch inaktives Coenzym-bindendes Protein. 23. A reagent system for the detection of an analyte in a sample, comprising: a) a coenzyme and b) a catalytically inactive coenzyme-binding protein. 24. Reagenzsystem nach Anspruch 23 weiterhin umfassend ein Enzym. 24. The reagent system of claim 23 further comprising an enzyme. 25. Reagenzsystem nach Anspruch 23 oder 24 weiterhin umfassend einen Träger zur Aufnahme des Nachweisreagenz. 25. The reagent system of claim 23 or 24 further comprising a carrier for receiving the detection reagent. 26. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisreagenz in einer Gelmatrix eingelagert ist. 26. Reagent system according to one of claims 23 to 25, characterized, that the detection reagent is stored in a gel matrix. 27. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zumindest teilweise optisch transparent ist. 27. Reagent system according to one of claims 23 to 26, characterized, that the carrier is at least partially optically transparent. 28. Verwendung eines Reagenzsystems nach einem der Ansprüche 23 bis 27 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22. 28. Use of a reagent system according to one of claims 23 to 27 in a method according to any one of claims 1 to 22.
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