DE10221115B4

DE10221115B4 - Apparatus and method for the determination of chemical or biochemical partners of general receptor-ligand systems contained in samples

Info

Publication number: DE10221115B4
Application number: DE2002121115
Authority: DE
Inventors: Andreas Dipl.-Phys. Katerkamp; Frank Dipl.-Ing. Grawe; Göran Dipl.-Biol. Dr. Key; Silke Dipl.-Ing. Weber; Inka Dipl.-Ing. Wolf; Jochen Dipl.-Ing. Uckelmann
Original assignee: ICB INST fur CHEMO und BIOSEN; Icb Institut fur Chemo- und Biosensorik GmbH
Current assignee: ICB INST fur CHEMO und BIOSEN; Icb Institut fur Chemo- und Biosensorik GmbH
Priority date: 2002-05-07
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2022-05-08
Also published as: DE10221115A1

Abstract

Vorrichtung zur Bestimmung von in flüssigen Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern von Rezeptor-Ligand-Systemen, bei der die flüssige Probe durch einen Kanal (1) strömt, der innerhalb eines in einem Zylinder (6) geführten Kolbens (5) ausgebildet ist und mindestens ein Austritt (2) des Kanals (1) vorhanden ist, der in Bezug zu einer auf einem optischen Element (4) vorhandenen Anströmfläche (3) ausgerichtet ist; wobei
das optische Element (4) einen stirnseitigen Abschluss des Kolbens (5) bildet,
der Austritt (2) des Kanals (1) und die Anströmfläche (3) in einem Abstand zueinander angeordnet sowie in Strömungsrichtung der flüssigen Probe nachfolgend an die Anströmfläche (3) mindestens ein Aufnahmeraum (9) für die flüssige Probe vorhanden ist,
auf der Anströmfläche (3) mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems immobilisiert ist;
Fluoreszenzanregungslicht (10) für einen an einen Partner des Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoff durch das optische Element (4) unter Totalreflexionsbedingungen, zur Ausbildung eines evanescenten Feldes im Bereich des...Device for the determination of chemical or biochemical partners of receptor-ligand systems contained in liquid samples, in which the liquid sample flows through a channel (1) formed inside a piston (5) guided in a cylinder (6) and at least there is an outlet (2) of the duct (1) aligned with respect to an inflow surface (3) present on an optical element (4); in which
the optical element (4) forms an end face of the piston (5),
the outlet (2) of the channel (1) and the inflow surface (3) are arranged at a distance from one another and at least one receiving space (9) for the liquid sample is present downstream of the inflow surface (3) in the flow direction of the liquid sample,
at least one partner of a receptor-ligand system is immobilized on the inflow surface (3);
Fluorescence excitation light (10) for a bound to a partner of the receptor-ligand system marker by the optical element (4) under total reflection conditions, to form an evanescent field in the region of the ...

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von in Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme, wie dies beispielsweise Antikörper und Antigene, aber auch die verschiedensten Proteine, die solche Systeme bilden können, sind. Dabei ist ein solcher Partner, als Analyt in einer flüssigen Probe, beispielsweise einer Körperflüssigkeit, die einem vitalen Organismus entnommen worden ist, enthalten und es soll ein Nachweis für das Vorhandensein eines solchen Analyten, möglichst auch quantitativ durchgeführt werden können. Häufig ist es bei solchen Nachweisen erforderlich, auch die jeweilige Konzentration des entsprechenden Analyten relativ genau und in kurzer Zeit bestimmen zu können.The The invention relates to an apparatus and a method for determination of chemical or biochemical partners contained in samples general receptor-ligand systems, such as antibodies and Antigens, but also the most diverse proteins, such systems can form are. It is such a partner, as an analyte in a liquid sample, for example, a body fluid, which has been taken from a vital organism, and contains it should provide proof of the presence of such an analyte, possibly also be carried out quantitatively can. Frequently it is necessary for such evidence, including the respective concentration determine the corresponding analyte relatively accurately and in a short time to be able to.

Hierzu greift die erfindungsgemäße Lösung an sich bekannte chemische und biochemische Erkenntnisse auf. Dabei wird an einen der Partner eines solchen Rezeptor-Ligand-Systems ein Markierungsstoff gebunden, der bei Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen in einem ganz spezifischen Wellenlängenbereich, der in der Regel relativ eng begrenzt ist, in einen angeregten Zustand übergeht und Fluoreszenzlicht mit einer anderer Wellenlänge emittiert wird.For this attacks the solution according to the invention known chemical and biochemical findings. there becomes one of the partners of such a receptor-ligand system a marker bound by irradiation with electromagnetic Waves in a very specific wavelength range, which is usually is relatively narrow, in an excited state passes and emitting fluorescent light of a different wavelength.

Zur Sicherung einer hohen Selektivität ist es außerdem bekannt, die Fluoreszenz in einem definierten eng begrenzten Bereich anzuregen. Hierzu wird ein evanescentes Feld an einer Grenzfläche, auf der die letztendlich aneinander gebundenen Partner mit dem Markierungsstoff immobilisiert worden sind, ausgebildet. Die hierfür erforderlichen theoretischen und praktischen Voraussetzungen sind u.a. auch in DE 196 28 002 C1 beschrieben. Aus diesem Dokument geht außerdem hervor, dass es an sich vorteilhaft ist, während der Messung der Fluoreszenzintensität, die flüssige Probe durch einen Durchflusskanal unmittelbar über die Grenzfläche, auf der die aneinander gebundenen und markierten Partner immobilisiert sind, fließen zu lassen. Da aber für die Ausbildung eines evanescenten Feldes im Bereich eines solchen Durchflusskanals das Fluoreszenzanregungslicht auf die entsprechende Grenzfläche unter Einhaltung von Totalreflexionsbedingungen gerichtet werden muss, sind insbesondere die optischen Anforderungen an diese Komponenten bei dieser bekannten Vorrichtung entsprechend hoch, so dass die Herstellungskosten, auch wenn die Herstellung im ansonsten kostengünstigen Spritzgußverfahren erfolgt, relativ hoch sind.To ensure a high selectivity, it is also known to excite the fluorescence in a defined narrow range. For this purpose, an evanescent field is formed at an interface on which the finally bound partners have been immobilized with the marker. The necessary theoretical and practical prerequisites are also available in DE 196 28 002 C1 described. It is also evident from this document that it is advantageous, during the measurement of the fluorescence intensity, to allow the liquid sample to flow through a flow-through channel directly over the interface on which the bound and labeled partners are immobilized. Since, however, for the formation of an evanescent field in the region of such a flow channel, the fluorescence excitation light has to be directed to the corresponding interface in compliance with total reflection conditions, in particular the optical requirements of these components in this known device are correspondingly high, so that the production costs, even if the Made in otherwise inexpensive injection molding process, are relatively high.

Außerdem ist es aufwendig, in einer solchen bekannten Vorrichtung mehrere verschiedene Partner, als Analyten gleichzeitig detektieren zu können, da für die entsprechend verschiedenen komplementären Partner ausreichend verschiedene Markierungsstoffe vorhanden sein müssen, wodurch sich der Material- und Geräteaufwand deutlich erhöht.Besides that is it consuming, in such a known device several different Partner to be able to detect simultaneously as an analyte, since for the sufficiently different according to different complementary partners Must be present, whereby the material and equipment costs clearly increased.

Für das Durchströmen der den jeweiligen Analyten enthaltenden Probe durch die Vorrichtung und für die Aufnahme der Probe nach der Durchführung des jeweiligen Testformates, die üblicherweise auch als Assays bezeichnet werden, sind gesonderte zusätzliche Elemente erforderlich.For the flow through the the analyte-containing sample through the device and for the Recording of the sample after carrying out the respective test format, usually too as assays are separate additional Elements required.

Des Weiteren ist in DE 197 47 572 C1 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests beschrieben, bei der ein Lichtwellenleiter in einer in einem Kolben einer Kolben-Zylinder-Einheit ausgebildeten Messkammer aufgenommen ist. Die Messkammer ist über einen im Kolben ausgebildeten Zufluss mit dem Innenraum des Zylinders verbunden.Furthermore, in DE 197 47 572 C1 a device and a method for performing fluorescence immunoassays described in which an optical waveguide is received in a formed in a piston of a piston-cylinder unit measuring chamber. The measuring chamber is connected via an inlet formed in the piston with the interior of the cylinder.

Aus DE 199 16 430 C1 ist eine Vorrichtung zur Durchführung von Rezeptor-Ligand- und Affinitätstests bekannt, bei der ein Hohlkolben aus zumindest teilweise für Licht transparentem Material in einem mit einer temporär verschließbaren Öffnung versehenen Hohlzylinder aufgenommen und geführt ist. Der Hohlzylinder ist aus einem zumindest teilweise für Licht transparentes Material gebildet und mit einer verschließbaren Öffnung versehen. Eine in das Innere des Hohlzylinders weisende Stirnfläche ist aus einer porösen Trennschicht gebildet und im Hohlkolben ist parallel zu dieser porösen Trennschicht eine gas- und flüssigkeitsdichte translatorisch bewegbare Dichtplatte angeordnet.Out DE 199 16 430 C1 a device for performing receptor-ligand and affinity tests is known, in which a hollow piston of at least partially transparent to light material is received and guided in a provided with a temporarily closable opening hollow cylinder. The hollow cylinder is formed from an at least partially transparent to light material and provided with a closable opening. A pointing into the interior of the hollow cylinder end face is formed of a porous separating layer and in the hollow piston is parallel to this porous separating layer, a gas and liquid-tight translationally movable sealing plate arranged.

Eine abklingende Abtastung eines biochemischen Arrays ist in DE 196 15 380 A1 beschrieben. Zur Erfassung einer Zielsubstanz in einem Pixelarray wird Licht einer Lichtquelle zur Anregung der Zielsubstanz eingesetzt. Dabei sollen die Bedingungen einer inneren Totalreflexion eingehalten und ein Lichtdetektor eingesetzt werden.An evanescent scan of a biochemical array is in DE 196 15 380 A1 described. For detecting a target substance in a pixel array, light from a light source is used to excite the target substance. The conditions of a total internal reflection should be met and a light detector should be used.

In DE 34 46 756 C1 ist ein Photometer zum Analysieren flüssiger Medien offenbart, bei der eine Küvette zur Aufnahme des zu untersuchenden Mediums, Mittel zum Zuführen dieses Mediums, Mittel zum Zuführen zuzugebender Reagenzien, Mittel zum Abführen von Reaktionsprodukten, eine monochromatische Lichtquelle und ein photoelektrischer Empfänger vorhanden sind.In DE 34 46 756 C1 there is disclosed a photometer for analyzing liquid media comprising a cuvette for receiving the medium to be assayed, means for supplying this medium, means for supplying reagents to be added, means for removing reaction products, a monochromatic light source and a photoelectric receiver.

Aus US 5,077,012 ist eine Vorrichtung zur Detektion von Markierungsstoffen bekannt, die einen zylindrischen Behälter, der an beiden Enden Öffnungen aufweist, einen quantitativen Testspeicher, der entfernbar an einem Ende des zylindrischen Behältnisses befestigt werden kann, aufweist. Dieser Testspeicher hat ein offenes Ende und eine Zellmembran, die dort befestigt ist. Zudem ist ein zylindrischer Hohlkolben, der eine definierte Kammer bildet, vorhanden. Im Kolben ist eine Öffnung für einen Fluidfluss ausgebildet und ein Probencontainer entfernbar am Kolben befestigt. Am Probencontainer sind eine befestigbare Membraneinheit mit immobilisierten Antikörpern und ein Filtergehäuse befestigt.Out US 5,077,012 For example, there is known a marker detection apparatus comprising a cylindrical container having openings at both ends, a quantitative test reservoir removably attachable to one end of the cylindrical container. This test memory has an open end and a cell membrane attached there. In addition, a cylindrical hollow piston, which forms a defined chamber exists. The piston has an opening for fluid flow and a sample container removably attached to the piston. Attached to the sample container are an attachable membrane unit with immobilized antibodies and a filter housing.

Aus US 4,775,637 ist eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunoassays bekannt, bei der mindestens zwei Wellenleiter vorhanden sind. Außerdem werden eine Küvette und ein lichtleitendes Element, das im Kontakt mit der zu analysierenden Lösung steht, eingesetzt. Es können gleichzeitig zwei unterschiedliche Parameter in der Probenlösung detektiert werden.Out US 4,775,637 a device for performing immunoassays is known in which at least two waveguides are present. In addition, a cuvette and a photoconductive element in contact with the solution to be analyzed are used. Two different parameters can be detected simultaneously in the sample solution.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten zu schaffen, mit der verschiedene Partner allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme, als Analyten kostengünstig, in kurzer Zeit, mit erhöhter Sensitivität und Messgenauigkeit detektiert werden können.It is therefore an object of the invention to create opportunities with the various partners of general receptor ligand systems, as Low cost of analytes in a short time, with increased Sensitivity and Measurement accuracy can be detected.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 sowie mit einem Verfahren gemäß Anspruch 19 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung, können mit den in den untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen erreicht werden.According to the invention this Task with a device having the features of claim 1 as well with a method according to claim 19 solved. Advantageous embodiments and developments of the invention, can achieved with the features indicated in the subordinate claims become.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet einen Kolben und einen Zylinder. Dabei ist innerhalb des im Zylinder geführten Kolbens ein Kanal ausgebildet, durch den, in der Regel mittels einer Relativbewegung von Kolben und Zylinder die flüssige Probe transportiert wird. Dabei gelangt die Probe aus dem Zylinderinneren durch den Kanal und trifft auf eine entsprechend in Bezug zum Austritt des Kanals angeordnete Anströmfläche. Auf dieser Anströmfläche wurde vorab zumindest ein komplementärer Partner des jeweiligen allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systems immobilisiert. Die Anströmfläche ist auf einem optischen Element angeordnet, das wiederum einen stirnseitigen Abschluss des Kolbens und gleichzeitig die optische Grenzfläche für die Ausbildung eines evanescenten Feldes bildet. Der Austritt des Kanals und die Anströmfläche schließen dabei nicht bündig ab, so dass mit einem entsprechenden Abstand die Flüssigkeit vorbeifließen kann.The inventive device uses a piston and a cylinder. It is within the guided in the cylinder Piston a channel formed by, usually by means of a Relative movement of the piston and cylinder the liquid sample is transported. The sample passes from the inside of the cylinder through the channel and encounters a correspondingly arranged with respect to the exit of the channel Inflow area. On this inflow was at least one complementary partner in advance immobilized the respective general receptor-ligand system. The inflow is on arranged an optical element, which in turn a front-side Completion of the piston and at the same time the optical interface for training of an evanescent field. The exit of the canal and the Close the flow area not flush so that with a suitable distance the liquid flow past can.

Gleichzeitig wird auf dieses optisches Element Fluoreszenzanregungslicht gerichtet und unter Einhaltung von Totalreflexionsbedingungen, das gewünschte und vorteilhafte evanescente Feld, innerhalb dem Fluoreszenz angeregt werden kann, ausgebildet. Für einen quantitativen Nachweis eines Partners, als Analyt in der flüssigen Probe kann die Intensität des Fluoreszenzlichtes mit mindestens einem optischen Detektor gemessen werden.simultaneously is directed to this optical element fluorescence excitation light and in compliance with total reflection conditions, the desired and favorable evanescent field, within which fluorescence is excited can be trained. For a quantitative proof of a partner, as an analyte in the liquid sample can the intensity of the fluorescent light with at least one optical detector measured become.

Die flüssige Probe, die auf die Anströmfläche auftrifft, kann dann anschließend in einen Aufnahmeraum geführt und dort innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung sicher aufbewahrt werden, so dass dieser Teil der Vorrichtung gemeinsam mit der flüssigen Probe für die Umwelt gefahrlos entsorgt werden kann. Vorteilhaft ist ein solcher Aufnahmeraum innerhalb des Kolbens im Anschluss an die Anströmfläche ausgebildet.The liquid Sample which impinges on the inflow surface, can then follow led into a recording room and stored there safely within the device according to the invention so that this part of the device is in common with the liquid sample for the Environment can be safely disposed of. An advantage is such Receiving space formed within the piston following the inflow surface.

Der Austritt des Kanals, von dem der Flüssigkeitsstrahl ausgeht und auf die Anströmfläche trifft, kann besonders vorteilhaft in Form einer Düse ausgebildet sein, um neben einer Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit auch eine Fokussierung der Flüssigkeit in Richtung auf die Anströmfläche vornehmen zu können.Of the Outlet of the channel from which the liquid jet emanates and meets the inflow, can be particularly advantageous in the form of a nozzle to be next to an increase the flow velocity also a focusing of the liquid in the direction of the inflow surface to be able to.

Im Gegensatz zu den bekannten Lösungen kann die Anströmfläche deutlich kleiner dimensioniert werden. So kann beispielsweise eine kreisförmige Anströmfläche einen Durchmesser ≤ 10 mm aufweisen. Bei der Wahl z.B. einer quadratischen bzw. rechteckigen Anströmfläche kann diese so dimensioniert sein, dass die Flächendiagonale ebenfalls ≤ 10 mm ist.in the Unlike the known solutions can clear the inflow area be sized smaller. For example, a circular inflow a Diameter ≤ 10 mm have. When choosing e.g. a square or rectangular Inflow area can this dimensioned so that the surface diagonal is also ≤ 10 mm.

Günstig ist es außerdem, wenn die Anströmfläche orthogonal zur Längsachse des Kanals ausgerichtet ist, so dass der aus dem Austritt austretende Flüssigkeitsstrahl direkt auf die Anströmfläche trifft. Zur Vermeidung einer deutlich erhöhten Drosselwirkung sollten möglichst keine Elemente, die das Abfließen der flüssigen Probe von der Anströmfläche in einen Aufnahmeraum behindern können, vorhanden sein und ein Abstand zwischen dem Austritt des Kanals und der Anströmfläche eingehalten sein, der ebenfalls ein nahezu störungsfreies Abfließen der flüssigen Probe sichert. Der Abstand kann daher bis zu 10 mm zwischen Austritt und Anströmfläche betragen.Cheap is it also if the inflow surface orthogonal to the longitudinal axis the channel is aligned so that the liquid jet emerging from the outlet directly hits the inflow surface. to Avoidance of a significantly increased Throttling effect should be as possible no elements that drain the liquid Sample from the inflow surface into one To obstruct reception space, be present and a distance between the exit of the channel and adhered to the inflow area be, which is also a virtually trouble-free flow of the liquid sample guaranteed. The distance can therefore be up to 10 mm between exit and Flow surface amount.

Zur gleichzeitigen Detektion mehrerer unterschiedlicher Analyte ist es vorteilhaft, die Anströmfläche in Segmente zu unterteilen und die einzelnen Segmente, bzw. auch bestimmte Bereiche mit jeweils unterschiedlichen entsprechend komplementären Partnern zu immobilisieren.to simultaneous detection of several different analytes it is advantageous, the inflow area in segments to subdivide and the individual segments, or even certain areas each with different complementary partners to immobilize.

In diesem Fall kann es auch vorteilhaft sein, den Austritt des Kanals mit mehreren Düsen zu gestalten, aus denen Flüssigkeitsstrahlen gezielt auf die jeweiligen Segmente bzw. verschieden immobilisierten Bereiche der Anströmfläche gerichtet werden können.In In this case, it may also be advantageous to the outlet of the channel with several nozzles to shape out of which liquid jets targeted to the respective segments or different immobilized Directed areas of the inflow can be.

Mit der erfindungsgemäßen Lösung besteht die Möglichkeit, ein relativ einfaches, kostengünstiges optisches Element, an dem die Anströmfläche für die Detektion vorhanden ist, einzusetzen, wohingegen an die übrigen Teile, was insbesondere auf den verwendeten Kolben und den Zylinder zutrifft, keine bestimmten Anforderungen, was die optischen Eigenschaften betrifft, gestellt werden.With the solution according to the invention consists of Possibility, a relatively simple, inexpensive optical element on which the inflow surface for the detection is present whereas the rest Parts, especially on the used piston and the cylinder is true, no specific requirements as to the optical properties concerns.

Mit der Erfindung besteht die Möglichkeit, die Anregung der Fluoreszenz innerhalb des ausgebildeten evanescenten Feldes und auch die Detektion des Fluoreszenzlichtes auf unterschiedliche Art und Weise vornehmen zu können.With the invention has the possibility the stimulation of fluorescence within the evanescents formed Field and also the detection of the fluorescent light on different To make way.

So besteht einmal die Möglichkeit, das Anregungslicht für die Fluoreszenz im freien Strahl auf und durch das optische Element zu richten, dabei gleichzeitig an der Grenzfläche, zumindest im Bereich, in der die Anströmfläche angeordnet ist, Totalreflexionsbedingungen einzuhalten, dadurch im Bereich der Anströmfläche ein evanescentes Feld auszubilden und durch entsprechende Anordnung, zumindest eines optischen Detektors die Intensität des Fluoreszenzlichtes im freien Strahl, gegebenenfalls unter Zwischenschaltung von optischen, strahlformenden Elementen zu detektieren.So once there is a possibility the excitation light for the fluorescence in the free beam on and through the optical element at the same time at the interface, at least in the area, arranged in the inflow area is to comply with total reflection conditions, thereby in the range the inflow area evanescentes field and by appropriate arrangement, at least one optical detector, the intensity of the fluorescent light in free beam, optionally with the interposition of optical, to detect beam-shaping elements.

Anstelle einer solchen, auch üblicherweise als Freistrahldetektion bezeichneten Lösung, besteht aber auch die Möglichkeit, das Anregungslicht für Fluoreszenz nicht unter der Bedingung der Totalreflexion auf die Anströmfläche zu richten und das Fluoreszenzlicht, durch das optische Element, das in diesem Fall zumindest bereichsweise als Lichtwellenleiter ausgebildet ist, unter Einhaltung von Totalreflexion durch dieses und von dort auf den zumindest einen optischen Detektor zu richten.Instead of such, usually as Freistrahldetektion designated solution, but there is also the Possibility, the excitation light for fluorescence not to be directed to the inflow area under the condition of total reflection and the fluorescent light, by the optical element, in this Case is at least partially formed as an optical waveguide, in compliance with total reflection through this and from there on to direct the at least one optical detector.

Es besteht aber auch die Möglichkeit, das Licht zur Anregung von Fluoreszenz durch ein solches, zumindest bereichsweise als Lichtwellenleiter ausgebildetes optisches Element zu führen. Dabei innerhalb des Bereiches, der einen Lichtwellenleiter bildet Totalreflexionsbedingungen einzuhalten, dadurch im Bereich der Anströmfläche ein evanescentes Feld auszubilden, innerhalb dessen Fluoreszenz angeregt werden kann und das Fluoreszenzlicht wiederum durch den Lichtwellenleiter oder als Freistrahl auf einen optischen Detektor zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität zu richten.It but it is also possible the light for exciting fluorescence by such, at least partially formed as an optical waveguide optical element respectively. Within the range, which forms an optical waveguide To comply with total reflection conditions, thereby in the area of the inflow form evanescentes field, within which fluorescence is excited can be and the fluorescent light in turn through the optical waveguide or as a free jet on an optical detector for determination the fluorescence intensity to judge.

Mit der erfindungsgemäßen Lösung kann die für einen entsprechenden Nachweis erforderliche Zeit sehr klein gehalten werden, was einen Zeitraum zwischen 30 und 1000 s umfasst.With the solution according to the invention can the for required time is kept very small which covers a period between 30 and 1000 s.

Hierzu kann eine sogenannte zeitaufgelöste Messung durchgeführt werden.For this can be a so-called time-resolved measurement carried out become.

Dabei sollte der Transport der flüssigen Probe durch den Kanal in Richtung auf die Anströmfläche so durchgeführt werden, dass die aus dem Austritt des Kanals austretende flüssige Probe einen nahezu konstanten Volumenstrom innerhalb des jeweiligen für die Messung genutzten Zeitintervalls aufweist und der Stofftransport zur Anströmfläche im Wesentlichen durch Konvektion und nicht durch Diffusion erfolgt. Die flüssige Probe sollte mit einer Strömungsgeschwinigkeit zwischen 0,5 bis 200 μl/s durch den Kanal strömen.there should be the transport of the liquid Sample through the channel in the direction of the inflow area so be carried out that the liquid sample emerging from the exit of the channel a nearly constant volume flow within the respective for the measurement has used time interval and the mass transport to the inflow surface substantially by convection and not by diffusion. The liquid sample should be with a flow rate between 0.5 to 200 μl / s to flow through the canal.

Bei einer solchen zeitaufgelösten Messung kann aus dem Anstieg der gemessen Fluoreszenzintensität auf die Konzentration des in der jeweiligen flüssigen Probe, als Analyt enthaltenen Partners von allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systemen geschlossen werden. Dabei wird ausgenutzt, dass mit dem gleichzeitigen Nach- und Abführen der flüssigen Probe über die Anströmfläche, auf der die jeweiligen entsprechenden komplementären Partner für den jeweiligen Analyten immobilisiert sind, ein entsprechendes kontinuierliches Anbinden von Partnern an die bereits vorab immobilisierten komplementären Partner auf der Anströmfläche erfolgt.at such a time-resolved one Measurement can be made from the increase in fluorescence intensity measured on the Concentration of the in each liquid sample, contained as analyte Partners are closed by general receptor ligand systems. It is exploited that with the simultaneous feeding and discharging the liquid Sample over the inflow, on the respective corresponding complementary partners for each Analytes are immobilized, a corresponding continuous Connecting partners to already pre-immobilized complementary partners the inflow occurs.

In diesem Fall ist es günstig und wünschenswert, den jeweiligen für den Partner komplementären Analyten auf der Anströmfläche im Überschuss zu immobilisieren, so dass in jedem Fall gesichert werden kann, dass jeder in der Probe enthaltene Partner nahe der Oberfläche der Anströmfläche an einen entsprechenden Partner, der vorab auf der Anströmfläche immobilisiert worden ist, anbinden kann.In In this case, it is cheap and desirable, the respective for the partner complementary analytes on the inflow surface in excess immobilize so that in any case can be secured that each partner contained in the sample near the surface of the Flow surface to a corresponding partner, which has been previously immobilized on the inflow area, can connect.

Zumindest unter Einhaltung der letztgenannten Bedingungen kann davon ausgegangen werden, dass die mit dem optischen Detektor gemessene Fluoreszenzintensität, zumindest nahezu linear ansteigt und dementsprechend der Anstieg der gemessenen Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration des jeweiligen Analyten in der flüssigen Probe ist.At least in compliance with the latter conditions can be assumed be that the fluorescence intensity measured by the optical detector, at least increases almost linearly and, accordingly, the increase in the measured fluorescence intensity proportional to the concentration of the respective analyte in the liquid sample is.

Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.following the invention will be explained in more detail by way of example.

Dabei zeigen:there demonstrate:

1 in schematischer Form eine Schnittdarstel lung eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; 1 in schematic form a Schnittdarstel development of an example of a device according to the invention;

2 ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; 2 another example of a device according to the invention;

3 Möglichkeiten zur Aufnahme von flüssigen Proben und das Betreiben von Vorrichtungen gemäß den Beispielen der 1 und 2; 3 Possibilities for receiving liquid samples and the operation of devices according to the examples of 1 and 2 ;

4 in schematischer Form eine Teildarstellung, mit der die Strömungs- und optischen Verhältnisse im Bereich eines Austritts eines Kanals und einer Anströmfläche verdeutlicht worden sind; 4 in schematic form a partial view, with which the flow and optical conditions have been made clear in the region of an exit of a channel and an inflow surface;

5 eine schematische Teildarstellung mit einem in Düsenform ausgebildeten Austritt eines Kanals; 5 a schematic partial view with an outlet formed in a nozzle shape of a channel;

6 in schematischer Form eine Schnittdarstellung eines dritten Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und Möglichkeiten der Führung von Anregungslicht für Fluoreszenz und zu detektierendes Fluoreszenzlicht; 6 in schematic form a sectional view of a third example of a device according to the invention and possibilities of guiding excitation light for fluorescence and to be detected fluorescent light;

7 das Beispiel nach 6 mit veränderter Lichtführung für das Anregungslicht und für das Fluoreszenzlicht; 7 the example after 6 with modified light guide for the excitation light and for the fluorescent light;

8 das dritte Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit wiederum veränderter Lichtführung für Anregungs- und Fluoreszenzlicht; 8th the third example of a device according to the invention with in turn modified light guide for excitation and fluorescent light;

9 in schematischer Form die Anordnung optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Detektion von Fluoreszenzlicht; 9 in schematic form, the arrangement of optical elements for fluorescence excitation and detection of fluorescent light;

10 ein weiteres Beispiel für Möglichkeiten der Anordnung optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Detektion von Fluoreszenzlicht; 10 another example of the possibilities of arranging optical elements for fluorescence excitation and detection of fluorescent light;

11 eine dritte Möglichkeit für Anordnungen verschiedener optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Fluoreszenzlichtdetektion; 11 a third possibility for arrangements of different optical elements for fluorescence excitation and fluorescence light detection;

12 eine weitere Möglichkeit für Anordnungen verschiedener optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Fluoreszenzlichtdetektion; 12 another possibility for arrangements of different optical elements for fluorescence excitation and fluorescence light detection;

13A in schematischer Form Möglichkeiten zur Durchführung eines Sandwich-Assays mit Antikörpern und 13A in schematic form, ways to conduct a sandwich assay with antibodies and

13B in schematischer Form Möglichkeiten zur Durchführung von Sandwich-Assays unter Verwendung von Biotin und zusätzlicher biotinbindender Komplexe. 13B in schematic form, possibilities for performing sandwich assays using biotin and additional biotin-binding complexes.

In 1 ist ein erstes Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch in einer Schnittdarstellung gezeigt. Dabei wird ein Kolben 5 in einem Zylinder 6 geführt. Am Zylinder 6 ist eine Einlassöffnung 7 für die Aufnahme einer flüssigen Probe vorhanden. Diese Einlassöffnung 7 kann zumindest temporär verschlossen werden.In 1 a first example of a device according to the invention is shown schematically in a sectional view. This is a piston 5 in a cylinder 6 guided. At the cylinder 6 is an inlet opening 7 for receiving a liquid sample. This inlet opening 7 can be closed at least temporarily.

Im Kolben 5 ist ein Kanal 1, der bevorzugt parallel zur Bewegungsrichtung des im Zylinder 6 geführten Kolbens 5 ausgerichtet ist, ausgebildet. Durch diesen Kanal 1 kann bei entsprechender Relativbewegung von Kolben 5 und Zylinder 6 die flüssige Probe aus dem Zylinderinnenraum 8 in Richtung auf ein optisches Element 4 strömen und am Austritt 2, als Flüssigkeitsstrahl auf eine am optischen Element 4 vorhandene Anströmfläche 3 gerichtet werden.In the piston 5 is a channel 1 , which is preferably parallel to the direction of movement of the cylinder 6 guided piston 5 is aligned, trained. Through this channel 1 can with appropriate relative movement of the piston 5 and cylinders 6 the liquid sample from the cylinder interior 8th towards an optical element 4 stream and exit 2 , as a liquid jet on an optical element 4 existing inflow area 3 be directed.

Bevorzugt ist vor Aufnahme der flüssigen Probe über die Eintrittsöffnung 7 im Zylinderinnenraum 8 und/oder an entsprechenden Flächen des Kolbens 5, die in diese Richtung weisen, zumindest ein für einen Partner, als Analyt, der in der jeweiligen flüssigen Probe nachgewiesen werden soll, komplementärer Partner, der wiederum mit einem Markierungsstoff gebunden ist, bereits vorhanden. Diese beiden Partner können dann im Zylinderinnenraum 8 innerhalb einer bestimmten Inkubationszeit aneinander binden, und anschließend Kolben 5 und Zylinder 6 relativ zueinander bewegt werden, so dass die flüssige Probe, wie bereits erwähnt, aus dem Zylinderinnenraum 8, durch den Kanal 1, als Flüssigkeit auf die Anströmfläche 3 gerichtet wird.Preference is given to receiving the liquid sample via the inlet opening 7 in the cylinder interior 8th and / or on corresponding surfaces of the piston 5 pointing in this direction, at least one complementary partner already present for a partner, as an analyte to be detected in the respective liquid sample, which in turn is bound with a label. These two partners can then in the cylinder interior 8th bind together within a certain incubation time, and then flasks 5 and cylinders 6 be moved relative to each other, so that the liquid sample, as already mentioned, from the cylinder interior 8th , through the canal 1 , as a liquid on the inflow surface 3 is directed.

Am Kolben 6 bildet das optische Element 4 einen stirnseitigen Abschluss, so dass die als Flüssigkeitsstrahl aus dem Austritt 2 des Kanals 1 austretende flüssige Probe von dort umgelenkt und in einen Aufnahmeraum 9, der ebenfalls im Kolben 5 ausgebildet ist, überführt und dort aufgenommen wird.On the piston 6 forms the optical element 4 a frontal conclusion, so that the liquid jet from the outlet 2 of the canal 1 leaking liquid sample from there deflected and into a receiving space 9 who is also in the butt 5 is trained, convicted and recorded there.

Das optische Element 4 ist zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material gebildet, wobei die optische Transparenz zumindest für die Wellenlän gen für das Anregungslicht 10, mit dem Fluoreszenz angeregt werden kann, und das Fluoreszenzlicht 11 gegegeben sein muss.The optical element 4 is at least partially formed of an optically transparent material, wherein the optical transparency at least for the Wellenlän gene for the excitation light 10 , with which fluorescence can be excited, and the fluorescent light 11 must be given.

Wie deutlich wird, wird das Anregungslicht 10 auf und durch das optische Element 4 so geführt, dass an der Grenzfläche zum Kolbeninneren, auf der die Anströmfläche 3 ausgebildet ist, Totalreflexion auftritt und zumindest in einem definierten Bereich, ausgehend von dieser Grenzfläche, ein evanescentes Feld ausgebildet wird, um in einer definierten Eindringtiefe den einen bzw. auch mehrere Markierungsstoffe in einen angeregten Zustand zu überführen, so dass Fluoreszenzlicht emittiert wird.As it becomes clear, the excitation light 10 on and through the optical element 4 so guided, that at the interface to the piston interior, on which the inflow area 3 is formed, total reflection occurs and at least in a defined area, starting from this interface, an evanescent field is formed in order to convert the one or more markers in an excited penetration into an excited state, so that fluorescent light is emitted.

Dieses Fluoreszenzlicht 11 tritt aus dem optischen Element 4 aus und kann mit einem hier nicht dargestellten optischen Detektor 21 gemessen werden.This fluorescent light 11 exits the optical element 4 from and can with an optical detector, not shown here 21 be measured.

Ebenfalls vor Durchführung, also zur Aufnahme der jeweiligen flüssigen Probe in den Zylinderinnenraum 8 sind auf der Anströmfläche 3 wiederum entsprechende komplementäre Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systems, in der Regel Fängerantikörper immobilisiert worden, an die zumindest der entsprechend andere Partner, als Analyt beim Anströmen der Flüssigkeit anbinden kann, so dass mit steigender Anzahl von zumindest Paaren aneinander gebundener Partner solcher Rezeptor-Ligand-Systeme, die jeweilige messbare Fluoreszenzintensität ansteigt.Also before implementation, so for receiving the respective liquid sample in the cylinder interior 8th are on the inflow area 3 In turn corresponding complementary partners of a general receptor-ligand system, usually capture antibody has been immobilized, to which at least the correspondingly different partners, as an analyte flow on the liquid can bind, so that as the number of at least pairs of linked receptor ligand systems increases, the respective measurable fluorescence intensity increases.

Das in 2 gezeigte zweite Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, unterscheidet sich vom Beispiel nach 1, lediglich durch die Ausbildung des optischen Elementes 4. Dabei ist in beiden Fällen die äußere Mantelfläche des optischen Elementes 4 in einem Winkel konisch geneigt, wobei die Neigung in beiden Fällen jeweils entgegengesetzt ausgerichtet worden ist.This in 2 shown second example of a device according to the invention differs from the example 1 , only by the formation of the optical element 4 , In both cases, the outer surface of the optical element 4 tapered at an angle, wherein the inclination has been aligned opposite in both cases.

Das optische Element 4, kann über den Umfang der äußeren Mantelfläche lediglich einige solcher entsprechend konisch geneigter Bereiche aufweisen.The optical element 4 , may have only a few such corresponding conically inclined areas over the circumference of the outer circumferential surface.

Es besteht aber auch die Möglichkeit, dieses optische Element 4 in Form von Kegel- oder Pyramidenstümpfen auszubilden.But there is also the possibility of this optical element 4 in the form of conical or truncated pyramids.

Mit den 3A und 3B sollen Möglichkeiten zur Aufnahme und Führung flüssiger Proben für die Bestimmung von chemischen oder biochemischen Partnern allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme verdeutlicht werden.With the 3A and 3B to clarify the possibilities of recording and guiding liquid samples for the determination of chemical or biochemical partners of general receptor-ligand systems.

So kann, wie mit 3 angedeutet, die Einlassöffnung 7 des Zylinders 6, mittels einer Membran 13 verschlossen sein. Diese Membran ist gas- und flüssigkeitsdicht, so dass innerhalb des Zylinders 6 vorhandene sowie bereits an der Anströmfläche 3 immobilisierte Partner bzw. auch Markierungsstoffe unbeeinflusst über einen längeren Zeitraum vorgehalten werden können.So can, as with 3 indicated the inlet opening 7 of the cylinder 6 , by means of a membrane 13 to be introverted. This membrane is gas and liquid tight, so that inside the cylinder 6 existing as well as already at the inflow area 3 immobilized partners or markers can be kept unaffected over a longer period of time.

Die Membran 13 kann mit einer Kanüle 12 durchstoßen werden, so dass über die Kanüle 12 bei entsprechender Relativbewegung von Kolben 5 und Zylinder 6 der Zylinderinnenraum 8 vergrößert und in diesen die flüssige Probe aufgenommen werden kann.The membrane 13 can with a cannula 12 be pierced, so over the cannula 12 with corresponding relative movement of the piston 5 and cylinders 6 the cylinder interior 8th enlarged and in this the liquid sample can be recorded.

Nach der bereits erwähnten Inkubationszeit, kann dann wie in 3B verfahren werden, nämlich die Relativbewegung zwischen Kolben 5 und Zylinder 6 in die entgegengesetzte Richtung durchgeführt werden. Dabei ist vorab die Kanüle 12 abgezogen und entfernt worden, wobei sich vorteilhaft die Membran 13 wieder vollständig verschließt und den Flüssigkeitsaustritt aus der Einlassöffnung 7 verhindert.After the incubation period already mentioned, then as in 3B be moved, namely the relative movement between the piston 5 and cylinders 6 be done in the opposite direction. Here is the cannula in advance 12 withdrawn and removed, wherein advantageously the membrane 13 completely closes again and the liquid outlet from the inlet opening 7 prevented.

Anstelle einer solchen Membran 13 kann aber auch ein Ventil 13 oder ein anderer auf die Einlassöffnung 7 auf setzbarer Verschluss eingesetzt werden.Instead of such a membrane 13 but it can also be a valve 13 or another on the inlet opening 7 be used on settable closure.

Bei entsprechend verschlossener Einlassöffnung 7 und gleichzeitiger Relativbewegung von Kolben 5 und Zylinder 6 wird die flüssige Probe durch den Kanal 1 in Richtung auf das optische Element 4 gefördert und tritt am Austritt 2 des Kanals 1, als Flüssigkeitsstrahl aus, der auf die Anströmfläche 3 auftrifft und von dort die flüssige Probe in den ebenfalls im Kolben ausgebildeten Aufnahmeraum 9, gelangen und dort aufbewahrt werden kann.With appropriately closed inlet opening 7 and simultaneous relative movement of pistons 5 and cylinders 6 the liquid sample is passed through the channel 1 towards the optical element 4 promoted and occurs at the exit 2 of the canal 1 , acting as a liquid jet, on the inflow surface 3 impinges and from there the liquid sample in the likewise formed in the piston receiving space 9 , get there and can be stored there.

Es ist insbesondere vorteilhaft den Kolben 5 zumindest in der Phase, die mit 3B verdeutlicht worden ist, fixiert gehalten wird und die Relativbewegung ausschließlich über eine entsprechende Bewegung des Zylinders 6 realisiert wird.It is particularly advantageous the piston 5 at least in the phase that with 3B has been clarified, is held fixed and the relative movement exclusively via a corresponding movement of the cylinder 6 is realized.

Mit den 4 und 5 sollen schematisch die Strömungsverhältnisse, der als Flüssigkeitsstrahl aus dem Kanal 1 austretenden flüssigen Probe, sowie Möglichkeiten zur Lichtführung für Fluoreszenzanregungslicht 10 und Fluoreszenzlicht 11 innerhalb eines optischen Elementes 4 angedeutet werden. Dabei unterscheidet sich die Darstellung nach 5 von der nach 4 im Wesentlichen dadurch, dass hier ein Austritt 2 des Kanals 1, der in Düsenform ausgebildet ist, und zusätzliches aus dem Bereich der Anströmfläche 3 emittiertes Fluoreszenzlicht 11 ortsaufgelöst in schematischer Form dargestellt worden sind.With the 4 and 5 are intended schematically the flow conditions, as a liquid jet from the channel 1 emerging liquid sample, as well as possibilities for guiding light for fluorescence excitation light 10 and fluorescent light 11 within an optical element 4 be indicated. The presentation differs according to 5 from the after 4 essentially by the fact that here an exit 2 of the canal 1 , which is formed in a nozzle shape, and additional from the region of the inflow surface 3 emitted fluorescent light 11 Spatially resolved in schematic form.

Mit den 4 und 5 soll verdeutlicht werden, wie die Flüssigkeitsströmung, ausgehend aus dem Kanal 1 auf die Anströmfläche 3 mit relativ kleiner Fläche gerichtet und von dort umgelenkt und in den Aufnahmeraum 9 strömen kann.With the 4 and 5 should be clarified how the liquid flow, starting from the channel 1 on the inflow surface 3 directed with a relatively small area and deflected from there and into the receiving space 9 can flow.

Des weiteren wird angedeutet, dass für die Einhaltung von Totalreflexionsbedingungen bestimmte Brechzahlverhältnisse zwischen dem optischen Element 4 mit n1 und jenseits der Grenzfläche des optischen Elementes 4, also hier im Inneren des Kolbens 5 mit n2, sowie bestimmte Winkelverhältnisse für das Fluoreszenzanregungslicht 10 eingehalten werden sollten, um ein definiertes evanescentes Feld, zumindest mit bekannter ausreichender Eindringtiefe im Bereich der Anströmfläche 3 auszubilden. Dabei müssen die Bedingungen n₁ > n₂ und α ≥ arcsin (n₂/n₁) eingehalten werden.Furthermore, it is indicated that for the maintenance of total reflection conditions certain refractive index ratios between the optical element 4 with n1 and beyond the interface of the optical element 4 So here in the interior of the piston 5 with n2, as well as certain angular relationships for the fluorescent excitation light 10 should be kept to a defined evanescentes field, at least with known sufficient penetration depth in the area of the inflow 3 train. The conditions n ₁ > n ₂ and α ≥ arcsin (n ₂ / n ₁ ) must be observed.

Das in den 6 gezeigte dritte Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, unterscheidet sich wiederum von den vorab bereits beschriebenen Beispielen durch die Ausbildung des optischen Elementes 4 und dabei wiederum durch unterschiedliche Möglichkeiten der Lichtführung für die Fluoreszenzanregung und die Fluoreszenzlichtdetektion.That in the 6 shown third example of a device according to the invention, in turn, differs from the previously described examples by the formation of the optical element 4 and in turn by different possibilities of light guidance for fluorescence excitation and fluorescence light detection.

In diesem Fall ist das optische Element 4 so ausgebildet, dass zumindest ein Bereich, als Lichtwellenleiter ausgebildet worden ist.In this case, the optical element 4 designed such that at least one area has been formed as an optical waveguide.

Im übrigen unterscheidet sich das dritte Beispiel von den vorab bereits beschriebenen Beispielen nicht.Otherwise different the third example of the previously described examples Not.

In 6 erfolgt die Lichtführung für Anregungslicht 10, ausgehend von einer hier nicht dargestell ten Lichtquelle, das in das optische Element 4 eingekoppelt wird und innerhalb des optischen Elementes 4 mehrfach total reflektiert, so dass die Ausbildung des gewünschten evanescenten Feldes dadurch erreicht werden kann. Das Fluoreszenzlicht 11 tritt hier in divergenter Form, als Freistrahl aus dem optischen Element 4 aus und kann, wie nachfolgend weiterhin beispielhaft noch erläutert werden soll, über zusätzliche optische Elemente auf mindestens einen optischen Detektor, hier ebenfalls nicht dargestellt, gerichtet werden.In 6 the light guide for excitation light 10 , Starting from a not dargestell th light source, which in the optical element 4 is coupled and within the optical element 4 several times totally reflected, so that the formation of the desired evanescent field can be achieved. The fluorescent light 11 occurs here in divergent form, as a free jet from the optical element 4 and can, as will be further explained below by way of example, be addressed via additional optical elements on at least one optical detector, also not shown here.

Mit 7 soll verdeutlicht werden, dass die Möglichkeit besteht, das Anregungslicht 10 für die Fluoreszenz direkt durch das optische Element 4, als Freistrahlen zu richten und Bereiche des optischen Elementes 4, als Lichtwellenleiter für nach mehrfacher Totalreflexion aus dem optischen Element 4 austretendes Fluoreszenzlicht 11 zu nutzen.With 7 should be clarified that the possibility exists, the excitation light 10 for the fluorescence directly through the optical element 4 to judge as free-radiating and areas of the optical element 4 , as an optical waveguide for after multiple total reflection from the optical element 4 leaking fluorescent light 11 to use.

Mit 8 soll verdeutlicht werden, dass auch die Möglichkeit besteht, sowohl das Fluoreszenzanregungslicht 10, wie auch das Fluoreszenzlicht 11 nach mehrfacher Totalreflexion innerhalb des optischen Elementes 4 in das optische Element ein- und auch wieder auszukoppeln.With 8th should be clarified that there is also the possibility of both the fluorescence excitation light 10 as well as the fluorescent light 11 after multiple total reflection within the optical element 4 in the optical element on and also decouple again.

In der 9 ist eine Anordnung von optischen Elementen für die Fluroeszenzanregung und die Detektion von Fluoreszenzlicht 11 gezeigt. Dargestellt ist das Fluoreszenzanregungslicht 10 als paralleler nahezu monochromatischer Lichtstrahl. Dieses kann entweder durch ein optisches Filter und eine entsprechende Lichtstrahlführung bei bekannten Lichtquellen, z.B. einem thermischen Strahler, wie Halogenlampen oder auch Entladungslampen, z.B. Xe-Blitzlampen erreicht werden oder es können entsprechende Laserlichtquellen, wie z.B. Halbleiterlaser oder Gaslaser eingesetzt werden.In the 9 is an array of optical elements for fluorescence excitation and the detection of fluorescent light 11 shown. Shown is the fluorescence excitation light 10 as a parallel almost monochromatic light beam. This can be achieved either by an optical filter and a corresponding light beam guidance in known light sources, such as a thermal radiator, such as halogen lamps or discharge lamps, eg Xe flash lamps or appropriate laser light sources, such as semiconductor lasers or gas lasers can be used.

Das Fluoreszenzanregungslicht 10 der Lichtquelle 15 gelangt auf und durch das optische Element 4, woraufhin innerhalb des evanescenten Feldes von dort gebundenen Partnern mit dem Markierungsstoff Fluoreszenzlicht 11 emittiert wird. Dieses gelangt, wie hier gezeigt, als divergenter Freistrahl über die optischen Linsen 19 und 20 zur Strahlformung in fokussierter Form auf einen optischen Detektor 21, mit dem die jeweilige Intensität des Fluoreszenzlichtes 11 bestimmt werden kann.The fluorescence excitation light 10 the light source 15 gets on and through the optical element 4 , whereupon within the evanescent field of bound there partners with the marker fluorescent light 11 is emitted. This passes, as shown here, as a divergent free jet over the optical lenses 19 and 20 for beam shaping in focused form onto an optical detector 21 , with which the respective intensity of the fluorescent light 11 can be determined.

Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes 11, hier unmittelbar vor dem optischen Detektor 21, ist eine optische Blende 30 angeordnet. Die optische Blende 30 kann als Strich- bzw. auch als Punktblende ausgebildet sein.In the beam path of the fluorescent light 11 , right here in front of the optical detector 21 , is an optical aperture 30 arranged. The optical aperture 30 can be designed as a dash or as a dot aperture.

Durch die optische Blende 30 gelangt dementsprechend nur ein Teil des Fluoreszenzlichtes 11, aus einem bestimmten Detektionsbereich, von der Anströmfläche 3 auf den optischen Detektor 21. Durch entsprechende Bewegung der optischen Blende 30 können unterschiedliche Flächenbereiche auf der Anströmfläche 3, ohne störende Einflüsse von Fluoreszenzlicht 11, das von anderen Bereichen der Anströmfläche 3 ausgehend emittiert worden ist, detektiert werden.Through the optical aperture 30 Accordingly, only a part of the fluorescent light 11 , from a certain detection area, from the inflow area 3 on the optical detector 21 , By appropriate movement of the optical aperture 30 can different surface areas on the Anströmfläche 3 , without disturbing influences of fluorescent light 11 that of other areas of the inflow area 3 has been emitted starting to be detected.

Durch Variation des Abstandes der optischen Blende 30 zum optischen Detektor 21 kann die Ortsauflösung vergrößert bzw. verkleinert werden, so dass die jeweils detektierte Fläche ebenfalls veränderbar ist.By varying the distance of the optical aperture 30 to the optical detector 21 the spatial resolution can be increased or decreased, so that the respectively detected surface is also changeable.

Mit einem solchen Beispiel einer Anordnung optischer Elemente für die Detektion von Fluoreszenzlicht 11 kann eine ortsaufgelöste Detektion relativ einfach und kostengünstig mit lediglich einem einzigen optischen Detektor 21 durchgeführt werden.With such an example of an arrangement of optical elements for the detection of fluorescent light 11 For example, spatially resolved detection is relatively easy and inexpensive with only a single optical detector 21 be performed.

Es besteht aber auch die Möglichkeit, optische Blende 30 und den optischen Detektor 21 für eine ortsaufgelöste Messung gemeinsam zu bewegen.But there is also the possibility of optical aperture 30 and the optical detector 21 to move together for a spatially resolved measurement.

Mit einer Anordnung unterschiedlicher optischer Elemente, wie sie 10 entnommen werden kann, ist eine ortsaufgelöste Messung möglich.With an array of different optical elements, like them 10 can be removed, a spatially resolved measurement is possible.

Prinzipiell ist wieder ein ähnlicher Aufbau und eine ähnliche Anordnung der optischen Elemente verwendet worden.in principle is a similar again Construction and a similar Arrangement of the optical elements has been used.

Mit dem Doppelpfeil wird angedeutet, dass sämtliche optischen Elemente, die für die eigentliche Fluoreszenzlichtanregung und -detektion genutzt werden, in Bezug zur Anströmfläche 3 am optischen Element 4 bewegt werden können, so dass eine entsprechende ortsaufgelöste Messung über den Flächenbereich der Anströmfläche 3 erreicht werden kann.The double arrow indicates that all optical elements that are used for the actual fluorescence light excitation and detection, in relation to the inflow surface 3 on the optical element 4 can be moved, so that a corresponding spatially resolved measurement over the surface area of the inflow surface 3 can be achieved.

Das Beispiel nach 11 entspricht wiederum im Wesentlichen dem Aufbau, wie er in 9 gezeigt ist.The example after 11 in turn, corresponds essentially to the structure as it is in 9 is shown.

Der optische Detektor 21 besteht hier aus mehreren einzelnen optischen Detektoren, die in Form eines Arrays oder in einer Reihenanordnung vorhanden sind. Diese Anordnung ermöglicht ebenfalls eine ortsaufgelöste Messung.The optical detector 21 here consists of several individual optical detectors, which are in the form of an array or in a series arrangement. This arrangement also allows a spatially resolved measurement.

Die 12 zeigt die mögliche Anordnung von unter schiedlichen optischen Elementen für die Fluoreszenzanregung und die Detektion des Fluoreszenzlichtes 11 bei zwei Wellenlängen.The 12 shows the possible arrangement of different optical elements for the Fluorescence excitation and the detection of the fluorescent light 11 at two wavelengths.

Bei dem hier gezeigten Beispiel werden zwei verschiedene Lichtquellen 15 und 16 eingesetzt, die Licht 10 unterschiedlicher Wellenlänge emittieren. Diese Wellenlängen sind so ausgewählt, dass sie Fluoreszenz an unterschiedlichen Markierungsstoffen anregen können, die jeweils mit unterschiedlicher Wellenlänge Fluoreszenzlicht 11 emittieren.In the example shown here are two different light sources 15 and 16 used the light 10 emit different wavelengths. These wavelengths are selected so that they can excite fluorescence on different markers, each with different wavelength fluorescent light 11 emit.

Dabei gelangt das divergent aus dem optischen Element 4, vom Bereich der Anströmfläche 3 ausgehende Fluoreszenzlicht 11 über die optischen Linsen 19 und 20 infolge entsprechender Strahlformung in fokussierter Form auf den optischen Detektor 21, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes 11 gemessen werden kann.The divergent comes out of the optical element 4 , from the area of the inflow area 3 outgoing fluorescent light 11 over the optical lenses 19 and 20 due to appropriate beam shaping in focused form on the optical detector 21 , with which the intensity of the fluorescent light 11 can be measured.

Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes 11 ist jeweils ein optisches Filter 17 oder 18, beim hier gezeigten Beispiel zwischen den optischen Linsen 19 und 20 angeordnet. Die optischen Filter 17 und 18 sind so ausgewählt, dass sie für das jeweilige Fluoreszenzlicht 11 durchlässig sind. Dementsprechend kann mittels von der Lichtquelle 15 angeregtes Fluoreszenzlicht 11 das optische Filter 17 passieren und mit dem optischen Detektor 21 detektiert werden.In the beam path of the fluorescent light 11 is each an optical filter 17 or 18 in the example shown here between the optical lenses 19 and 20 arranged. The optical filters 17 and 18 are chosen so that they are suitable for the respective fluorescent light 11 are permeable. Accordingly, by means of the light source 15 excited fluorescent light 11 the optical filter 17 happen and with the optical detector 21 be detected.

Gleichzeitig kann in der hier dargestellten Form das Anregungslicht 10, das von der zweiten Lichtquelle 16 emittiert wird, mit dem optischen Filter 18 gesperrt werden, so dass für diese Wellenlänge keine Fluoreszenzanregung erfolgen kann und demzufolge auch kein entsprechender Fluoreszenzfremdlichteinfluss am opti schen Detektor 21 auftritt.At the same time, in the form shown here, the excitation light 10 that from the second light source 16 is emitted with the optical filter 18 be blocked, so that no fluorescence excitation can take place for this wavelength and therefore also no corresponding influence of fluorescent light at the opti's detector 21 occurs.

Vorteilhaft sind die optischen Filter 17 oder 18 entweder miteinander verbunden oder auf einem gemeinsamen Träger angeordnet, so dass sie gemeinsam entsprechend bewegt oder so verdreht werden können, dass sie die jeweiligen gewünschten Positionen für den Durchlass von Fluoreszenzlicht 11 bzw. das Sperren von Anregungslicht 10 einer der Lichtquellen 15 oder 16 sperren.The optical filters are advantageous 17 or 18 either connected together or arranged on a common carrier so that they can be moved together in accordance with or rotated so that they are the respective desired positions for the passage of fluorescent light 11 or the blocking of excitation light 10 one of the light sources 15 or 16 lock.

In nicht dargestellter Form besteht natürlich auch die Möglichkeit, die Anzahl der verschiedenen Lichtquellen für die Fluoreszenzanregung und die entsprechenden optischen Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht zu erhöhen.In Unillustrated form is of course also the possibility the number of different light sources for fluorescence excitation and the corresponding optical filters for the respective fluorescent light to increase.

In dieser gezeigten Form besteht die Möglichkeit der sequentiellen Messung unterschiedlicher Partner, als Analyte, ohne dass die Lichtquellen 15 und 16 in gesteuerter Form und getaktet ein- und ausgeschaltet werden müssen, also kontinuierlich betrieben werden können und es lediglich erforderlich ist, die optischen Filter 17 und 18 entsprechend zu positionieren.In this shown form, there is the possibility of sequentially measuring different partners, as analytes, without the light sources 15 and 16 must be switched on and off in a controlled manner and clocked, so can be operated continuously and it is only necessary, the optical filter 17 and 18 position accordingly.

In der 13 sind in schematischer Form unterschiedliche sogenannte Assayformate dargestellt. In beiden Fällen handelt es sich dabei um unterschiedliche Möglichkeiten für sogenannte Sandwich-Assays.In the 13 are shown in schematic form different so-called assay formats. In both cases these are different possibilities for so-called sandwich assays.

In der Darstellung nach 13A ist ein Markierungsstoff 23 (Fluorophor) an einen Detektorantikörper 24, als einen Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems gebunden und bilden einen Komplex. Dieser Komplex bindet wiederum an den jeweiligen Analyten 25. Diese Bindungen erfolgen bei der Vorinkubation innerhalb des Zylinders 7 nach dem Aufnehmen der flüssigen Probe.In the illustration after 13A is a marker 23 (Fluorophore) to a detector antibody 24 , bound as a partner of a receptor-ligand system and form a complex. This complex in turn binds to the respective analyte 25 , These bonds occur during preincubation within the cylinder 7 after picking up the liquid sample.

Die so vorbereitete flüssige Probe gelangt dann, wie bereits beschrieben, durch den Kanal auf die Anströmfläche 3. Auf dieser Anströmfläche 3 wurden vorab Detektorantikörper 26, als komplementäre Partner auf der Oberfläche 27 immobilisiert. Beim Anströmen der flüssigen Probe binden die aus Markierungsstoff 23, Detektorantikörper 24 und Analyt 25 gebildeten Komplexe an immobilisierte Fängerantikörper 26 an.The liquid sample thus prepared then passes, as already described, through the channel onto the inflow surface 3 , On this inflow area 3 were in advance detector antibodies 26 , as a complementary partner on the surface 27 immobilized. When flowing the liquid sample bind from the marker 23 , Detector antibody 24 and analyte 25 formed complexes of immobilized capture antibodies 26 at.

Da in diesem Bereich ein evanescentes Feld ausgebildet worden ist, kann mittels des mit an die Fängerantikörper 26 gebundenen Markierungsstoffes 23 Fluoreszenz angeregt und entsprechend die Intensität des Fluoreszenzlichtes, die im Verhältnis der an die Fängerantikörper 26, die auf der Oberfläche 27 der Anströmfläche 3 angebunden sind, entsprechend ansteigt, gemessen werden.Since an evanescent field has been formed in this area, can by means of the with the capture antibody 26 bound marker 23 Fluorescence excited and correspondingly the intensity of the fluorescent light, in proportion to the capture antibodies 26 on the surface 27 the inflow area 3 are attached, increases accordingly, be measured.

Das in 13B schematisch angedeutete Assayformat unterscheidet sich von dem in 13A angedeuteten Assayformat dadurch, dass auf der Oberfläche 27 keine Fängerantikörper 26, sondern ein biotinbindender Komplex 28, wie beispielsweise Neutravidin, Avidin oder Streptavidin immobilisiert worden ist und außerdem bei der Vorinkubation zusätzlich an die gebildeten Komplexe, bestehend aus Detektorantikörper 24, Markierungsstoff 23, Analyt 25 der Fängerantikörper 26, markiert mit Biotin 29, gebunden worden ist. Die Bindung dieser Komplexe erfolgt dann auf der Anströmfläche 3, oberhalb der Oberfläche 27 während des Anströmens der flüssigen Probe aus dem Kanal 1 durch die Bindung zwischen dem Biotin 29 und dem auf die der Oberfläche 27 immobilisierten biotinbindenden Komplex 28.This in 13B schematically indicated assay format differs from that in 13A indicated assay format characterized in that on the surface 27 no capture antibodies 26 but a biotin-binding complex 28 in which, for example, neutravidin, avidin or streptavidin has been immobilized and also in the pre-incubation in addition to the complexes formed, consisting of detector antibody 24 , Marker 23 , Analyte 25 the capture antibody 26 , labeled with biotin 29 , has been bonded. The binding of these complexes then takes place on the inflow surface 3 , above the surface 27 during the flow of the liquid sample from the channel 1 through the bond between the biotin 29 and that on the surface 27 immobilized biotin-binding complex 28 ,

Die Messung der jeweiligen Fluoreszenzintensität innerhalb des oberhalb der Oberfläche 27 ausgebildeten evanescenten Feldes kann dann in den beschriebenen Formen erfolgen.The measurement of the respective fluorescence intensity within the above the surface 27 trained evanescent field can then take place in the forms described.

Claims

Device for the determination of chemical or biochemical substances contained in liquid samples partner of receptor-ligand systems, in which the liquid sample is passed through a channel ( 1 ) flowing within a cylinder ( 6 ) guided piston ( 5 ) is formed and at least one outlet ( 2 ) of the channel ( 1 ) which is in relation to one on an optical element ( 4 ) existing inflow area ( 3 ) is aligned; the optical element ( 4 ) an end face of the piston ( 5 ), the exit ( 2 ) of the channel ( 1 ) and the inflow surface ( 3 ) arranged at a distance to one another and in the direction of flow of the liquid sample following the inflow surface ( 3 ) at least one recording room ( 9 ) for the liquid sample is present on the inflow surface ( 3 ) at least one partner of a receptor-ligand system is immobilized; Fluorescence excitation light ( 10 ) for a label bound to a partner of the receptor-ligand system by the optical element ( 4 ) under total reflection conditions, for the formation of an evanescent field in the region of the inflow surface ( 3 ) immobilized Part ners of the receptor-ligand system and for the detection of fluorescent light ( 11 ) at least one optical detector ( 21 ) is available.

Device according to claim 1, characterized in that the outlet ( 2 ) is formed in the form of at least one nozzle.

Apparatus according to claim 1 or 2, characterized in that the inflow surface ( 3 ) has a diameter or a length of a surface diagonal ≤ 10 mm.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the inflow surface ( 3 ) orthogonal to the longitudinal axis of the channel ( 1 ) is aligned.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the outlet ( 2 ) of the channel ( 1 ) at a distance ≤ 10 mm from the inflow surface ( 3 ) is arranged.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that at least one receiving space ( 9 ) for the liquid sample following the inflow surface ( 3 ) within the piston ( 5 ) is trained.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that on the cylinder ( 6 ) a closable opening ( 7 ) for receiving the sample in the cylinder ( 6 ) is available.

Device according to claim 7, characterized in that the opening ( 7 ) with a membrane ( 13 ), a valve or a closure element is closed.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that on different areas / segments of the inflow surface ( 3 ) various partners of receptor-ligand systems are immobilized.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that inside the cylinder ( 6 ) at least one partner of a receptor-ligand system is included.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the outer circumferential surface of the optical element ( 4 ) at least in regions at an angle conical with respect to the longitudinal axis of the channel ( 1 ) is inclined.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the optical element ( 4 ) is designed as a conical or truncated pyramid.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the optical element ( 4 ) at least in the area of the inflow surface ( 3 ) is designed as an optical waveguide.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that between optical element ( 4 ) and optical detector ( 21 ) at least one optical filter ( 17 . 18 ) or at least one optical filter ( 17 . 18 ) and an optical aperture is / are arranged.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the position of the optical aperture ( 30 ) in relation to the inflow surface ( 3 ) is variable for a spatially resolved measurement.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the position of at least one light source ( 15 . 16 ), an optical filter ( 17 . 18 ) and an optical detector ( 21 ) in relation to the inflow surface ( 3 ) is variable for a spatially resolved measurement.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that a plurality of optical filters ( 17 . 18 ) or arranged on a common carrier and with respect to the optical detector ( 21 ) and light sources ( 15 . 16 ) can be positioned for a wavelength-selective measurement.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the optical detector ( 21 ) is formed as a series or array arrangement of individual optical detectors.

Method for the determination of chemical or biochemical partners of receptor-ligand systems contained in liquid samples, in which the liquid sample is passed through an opening ( 7 ) in a cylinder ( 6 ), the opening ( 7 ) and then due to a relative movement of a piston ( 5 ) and the cylinder ( 6 ) by one in the piston ( 5 ) trained channel ( 1 ) and after leaving at least one exit ( 2 ) of the channel ( 1 ) to one on an optical element ( 4 ), which has a front end of the piston ( 5 ), arranged inflow surface ( 3 ), on which at least one partner of a receptor-ligand system is immobilized, is directed, whereby fluorescence excitation light ( 10 ) for the formation of an evanescent field in an area of the inflow surface ( 3 ) immobilized partner of the receptor-ligand system under total reflection conditions by the optical element ( 4 ) and excited fluorescent light of at least one label bound to one of the partners of the receptor-ligand system with an optical detector ( 21 ) is detected.

A method according to claim 19, characterized in that after receiving the liquid sample in the cylinder ( 6 ) an incubation with at least one partner of the respective receptor-ligand system is performed.

Method according to claim 20, characterized in that that incubation with at least one partner of a receptor-ligand system, to the Labeling substance is bound.

A method according to claim 19 or 21, characterized in that the liquid sample from the inflow surface ( 3 ) in at least one within the piston ( 5 ) trained receiving space ( 9 ) is recorded.

Method according to one of claims 19 or 22, characterized in that the sample at the outlet ( 2 ) of the channel ( 1 ) is divided into at least two partial beams of different flow direction.

Method according to one of claims 19 to 23, characterized in that on different areas / segments of the inflow surface ( 3 ) different partners of receptor-ligand systems have been immobilized.

Method according to one of claims 19 to 24, characterized in that for different partners different markers and for the respective marking substances specific light sources ( 15 . 16 ) are used for fluorescence excitation.

Method according to one of claims 19 to 25, characterized in that the concentration of a partner of a receptor-ligand system, as an analyte of a sample, by means of time-resolved intensity measurement of the fluorescent light ( 11 ) is determined.

A method according to claim 26, characterized in that the concentration of an analyte by determining the increase of the with the optical detector ( 21 ) measured intensity of the fluorescent light ( 11 ) is determined within predefinable time intervals.

Method according to one of claims 19 to 27, characterized in that the determination on the inflow surface ( 3 ) is carried out with spatial resolution.

Method according to claim 28, characterized in that the light source ( 15 ) or ( 16 ) for the fluorescent light ( 11 ) is moved selectively, so that the inflow surface ( 3 ) is illuminated successively point by point.

Method according to claim 27 or 29, characterized in that the optical detector ( 21 ) and an optical aperture ( 30 ) in relation to the position of the inflow surface ( 3 ) are moved.

A method according to claim 19 to 30, characterized in that when using a plurality of specific light sources ( 15 . 16 ) corresponding wavelength-selective optical filters ( 17 . 18 ) sequentially into the beam path of the fluorescent light ( 11 ) between inflow surface ( 3 ) and optical detector ( 21 ) are moved.

Method according to claim 31, characterized in that the movement of the optical filters ( 17 . 18 ) is performed so that a respective different optical filter ( 17 . 18 ) simultaneously the fluorescence excitation light ( 10 ) of the other light source ( 15 . 16 ) in the direction of the optical element ( 4 ) locks.

Method according to one of claims 19 to 32, characterized in that the liquid sample by relative movement of the piston ( 5 ) and cylinders ( 6 ) through a closable opening ( 7 ) in the cylinder ( 6 ), at least one partner of a receptor-ligand system, binds as analyte to another partner, which is present with or without marker substance, following this incubation, the liquid sample with closed opening ( 7 ) by relative movement of pistons ( 5 ) and cylinders ( 6 ) out of the cylinder ( 6 ) through the channel ( 1 ) on the inflow surface ( 3 ) and thereby the intensity of the fluorescent light ( 11 ) with the optical detector ( 21 ) is measured.

A method according to claim 33, characterized in that at least one partner of a receptor-ligand system additionally biotin ( 29 ) which is bound to one on the surface ( 27 ) of the inflow surface ( 3 ) immobilized biotin-binding complex ( 28 ) is bound.

A method according to claim 32 or 34, characterized in that the temporal increase in the intensity of the fluorescent light ( 11 ) is determined.