DE10217597B4 - Method and device for the electrochemical immobilization of biomolecules - Google Patents

Method and device for the electrochemical immobilization of biomolecules Download PDF

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Abstract

Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen an einer leitfähigen Oberfläche durch Abscheiden mindestens einer Schicht aus einem leitenden Polymer auf der leitfähigen Oberfläche und Einschluss des Biomoleküls in die Polymerschicht in einer wässrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass als Monomer für die Bildung der Schicht aus dem leitenden Polymer ein Cumarinderivat verwendet wird, wobei das Cumarinderivat folgende Strukturformel I aufweist

Figure 00000002
worin R1 bis R6 voneinander unabhängig ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aminogruppe oder eine -COOH-Gruppe bedeuten und wobei mindestens eine der R1- bis R6-Gruppen eine Hydroxylgruppe darstellt.A method of electrochemically immobilizing biomolecules on a conductive surface by depositing at least one layer of a conductive polymer on the conductive surface and entrapping the biomolecule in the polymer layer in an aqueous solution, characterized by using as a monomer the conductive polymer layer a coumarin derivative is used, wherein the coumarin derivative has the following structural formula I.
Figure 00000002
wherein R 1 to R 6 independently of one another represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group or a -COOH group and at least one of R 1 - to R 6 groups represents a hydroxyl group.

Figure 00000001
Figure 00000001

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen.The The present invention relates to a method for electrochemical Immobilization of biomolecules according to the generic term of claim 1 and a device for the detection of biomolecules.

Die Immobilisierung von Biomolekülen an Oberflächen jeglicher Art spielt eine Schlüsselrolle in der medizinischen Diagnostik, klinischen Chemie, Bioanalytik, Biosensorik und der biochemischen Katalyse unter Verwendung von Enzymen. Verfahren zur kovalenten Kopplung an Oberflächen über reaktive funktionelle Gruppen auf dem Molekül und der Oberfläche (z. B. primäre oder sekundäre Amine, Carboxylat-, Thiol-, Hydroxyl-, Aldehyd- oder Epoxidgruppen) sind längst Stand der Technik (siehe hierzu beispielsweise Hermanson, Greg, T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, New York, 1996) und werden routinemäßig in Forschung und industrieller Produktion eingesetzt.The Immobilization of biomolecules on surfaces of any kind plays a key role in medical diagnostics, clinical chemistry, bioanalytics, Biosensing and biochemical catalysis using Enzymes. Process for covalent coupling to surfaces via reactive functional Groups on the molecule and the surface (eg primary or secondary Amines, carboxylate, thiol, hydroxyl, aldehyde or epoxide groups) are long ago State of the art (see, for example, Hermanson, Greg, T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, New York, 1996) and are routinely used in research and industrial Production used.

Allerdings weisen diese Techniken Nachteile und erhebliche Einschränkungen auf. Dazu gehören unspezifische Kopplungen, Niederschläge durch Unlöslichkeiten der Vernetzungsmittel, eine teilweise schwache Kopplungseffizienz in wässrigen Lösungen und vor allem die Unmöglichkeit, gezielt einige Bereiche von Oberflächen spezifisch zu modifizieren. So sind insbesondere für die spezifische Modifizierung leitfähiger Oberflächen, wie beispielsweise Elektroden, kovalente Kopplungsverfahren meist ungeeignet.Indeed These techniques have disadvantages and significant limitations on. These include non-specific Couplings, rainfall through insolubilities the crosslinking agent, a partially weak coupling efficiency in aqueous solutions and above all the impossibility specifically to modify some areas of surfaces specifically. So are in particular for the specific modification of conductive surfaces, such as For example, electrodes, covalent coupling methods usually unsuitable.

Leitende Polymere, die auch als Elektropolymere bezeichnet. werden können, werden bereits seit den späten 70er Jahren be schrieben. Der Ausdruck "Elektropolymere" bezeichnet eine Gruppe elektroaktiver Polymere, die aus geeigneten Vorläuferlösungen durch Anlegen eines elektrischen Potentials und die dadurch ausgelöste Kettenreaktion (Oxidation der Monomere, Dimerisierung, Strangverlängerung, Ausfällung) an leitfähigen Oberflächen als dünne, hydrophobe, elektrisch leitende Filme abgeschieden werden. Man nennt diese Polymere auch "metallische Polymere". Beispiele dafür sind Polypyrrol-, Polyanilin- und Polyacetylenfilme, die jeweils aus organischen oder organisch/wässrigen Lösungen der Monomere an Elektroden abgeschieden werden.senior Polymers, also referred to as electropolymers. can become already since the late 70s. The term "electropolymers" refers to a group of electroactive agents Polymers prepared from suitable precursor solutions by applying a electrical potential and the resulting chain reaction (oxidation the monomers, dimerization, strand extension, precipitation) conductive surfaces as a thin, hydrophobic, electrically conductive films are deposited. Is called these polymers also "metallic Polymers ". Examples for that are Polypyrrole, polyaniline and polyacetylene films, respectively organic or organic / aqueous solutions the monomers are deposited on electrodes.

Die Tatsache, dass diese Abscheidung ausschließlich an der leitenden Oberfläche, wie an der Elektrode, erfolgt, an die zuvor das benötigte Schwellenpotential angelegt wurde, wurde geeigneterweise zur örtlich begrenzten und selektiven Abscheidung biologischer Makromoleküle, wozu beispielsweise Enzyme, Antikörper, etc. gehören, die zuvor der Vorläuferlösung zugesetzt wurden, ausgenutzt. Beispiele dieser Technik sind, unter anderem für die Herstellung von Biosensoren, von Imisides, M. D. et al. in CHEMTECH, 1996, 26(5), Seiten 19–25; Palmisano, F. et al, Fresenius J. Anal Chem (2000) 366, Seiten 586–601 und Pividori, M. I., et al, Biosensors & Bioelectronics 15 (2000), Seiten 291–303 beschrieben worden.The Fact that this deposition is only at the conductive surface, such as at the electrode, takes place to the previously applied the required threshold potential became suitably localized and selective Separation of biological macromolecules, including, for example, enzymes, Antibody, etc., previously added to the precursor solution were exploited. Examples of this technique are, among others for the Preparation of Biosensors, by Imisides, M.D. et al. in CHEMTECH, 1996, 26 (5), pages 19-25; Palmisano, F. et al, Fresenius J. Anal. Chem. (2000) 366, pages 586-601 and Pividori, M.I., et al, Biosensors & Bioelectronics 15 (2000), pages 291-303 been described.

Ein entscheidender Nachteil für die industrielle Nutzung aller herkömmlichen Methoden auf der Basis von Elektropolymeren besteht darin, dass die benötigte Vorläuferlösung, in der das Monomer und ein Leitsalz enthalten sind, z. B. 0,1 mol Pyrrol in Acetonitril mit 0,05 mol Triethylammoniumtoluol-4-sulfonat als Leitsalz für empfindliche Biomoleküle meist denaturierend wirkt. Die Gründe dafür sind ein unphysiologischer pH-Wert, ein hoher Gehalt an organischem Lösungsmittel, eine hohe Salz- und Monomerkonzentration und die absolute Notwendigkeit, die Lösung zu desoxidieren, was typischerweise durch Belüften mit Stick stoffgas erfolgen kann. Darüber hinaus wirken das benötigte hohe Schwellenpotential, das in der Regel mehr als 0,7 V vs. Ag/AgCl beträgt und die stark hydrophobe Natur des entstehenden Polymers zusätzlich destabilisierend auf die Biomoleküle, was unweigerlich dazu führt, dass die Ausbeute an biologisch aktiven immobilisierten Biomolekülen sehr gering ist.One decisive disadvantage for based on the industrial use of all conventional methods of electropolymerics is that the required precursor solution in which the monomer and a Conducting salt are included, for. B. 0.1 mol of pyrrole in acetonitrile with 0.05 mol of triethylammonium toluene-4-sulfonate as conductive salt for sensitive biomolecules usually denaturing acts. The reasons are an unphysiological one pH, a high content of organic solvents, a high salt content and monomer concentration and the absolute need to solve the problem deoxidize, which typically take place by venting with nitrogen gas can. About that In addition, the required effect high threshold potential, which is usually more than 0.7V vs. Ag / AgCl is and the strongly hydrophobic nature of the resulting polymer additionally destabilizing on the biomolecules, which inevitably leads that the yield of biologically active immobilized biomolecules is very high is low.

Durch Einsatz von mit Pyrrol modifizierten Oligonukleotiden als Modellbiomoleküle konnten trotz der vorstehend beschriebenen Nachteile funktionierende Bioschichten hergestellt werden. Hierzu wird auf Livache et al., Nucleic Acid Res. 22, 1994, Seiten 2915 bis 2921 verwiesen. Es konnte gezeigt werden, dass komplementäre DNA-Sequenzen mit den in Polypyrrol immobilisierten Oligonukleotiden hybridisieren und diese Anordnung prinzipiell für die Herstellung von DNA-Chips geeignet war. Die Notwendigkeit, jedes einzelne zu immobilisierende Oligonukleotid mit einer Pyrrolgruppe zu versehen, ist allerdings ein erheblicher Nachteil dieses Verfahrens, so dass es für die serienmäßige Herstellung von DNA-Chips viel zu aufwendig ist.By Use of pyrrole-modified oligonucleotides as model biomolecules could despite the above-described disadvantages functioning biolayers getting produced. See Livache et al., Nucleic Acid Res. 22, 1994, pages 2915-2921. It could be shown, that complementary Hybridize DNA sequences with the immobilized in polypyrrole oligonucleotides and this arrangement in principle for the production of DNA chips was suitable. The need to immobilize each one However, to provide oligonucleotide with a pyrrole group is a significant disadvantage of this method, making it for mass production of DNA chips is far too expensive.

Darauf aufbauend wurden von vielen Forschungsgruppen optimierte Polypyrrol-Immobilisierungsprotokolle für Enzyme entwickelt. Dabei wurden das anorganische Leitsalz, wie beispielsweise KCl, durch ein polymeres und amphiphiles Polyanion ersetzt, wie beispielsweise ein Polystyrolsulfonat mit einem Molekulargewicht von 70 kDa. Dabei konnten wässrige Vorläuferlösungen hergestellt werden, die für Enzyme nicht denaturierend wirkten und hochwertige Polypyrrolfilme lieferten. Für die technische Nutzung waren allerdings die Vorläuferlösungen aufgrund ihrer hohen Viskosität ungeeignet, was die unumgängliche Desoxidation der Lösung wegen einer Schaumbildung sehr erschwerte. Die Immobilisierungsausbeuten waren wegen der außerordentlichen Hydrophobie der Polypyrrolfilme für eine praktische Nutzung meist zu gering.Based on this, polypyrrole immobilization protocols optimized for enzymes have been developed by many research groups. In this case, the inorganic conductive salt, such as KCl, was replaced by a polymeric and amphiphilic polyanion, such as a polystyrene sulfonate having a molecular weight of 70 kDa. It was possible to prepare aqueous precursor solutions which did not denature enzymes and provided high-quality polypyrrole films. However, because of their high viscosity, the precursor solutions were unsuitable for industrial use, which made the unavoidable deoxidation of the solution very difficult because of foaming. The immobilization yields were because of the extraordinary Hydrophobicity of polypyrrole films usually too low for practical use.

Es sind dann weitere Forschungsarbeiten durchgeführt worden, um die Hydrophobizität des Films herabzusetzen. Dazu wurden neue elektroaktive Monomere auf Pyrrol- oder Hydrochinonbasis synthetisiert, die aus rein wässrigen Vorläuferlösungen und bei niedrigeren Potentialen abgeschieden werden können. Allerdings konnte auch unter diesen Voraussetzungen kein technisch nutzbares Verfahren entwickelt werden. So waren die Vorläuferlösungen des hydrophilen Pyrrolmonomers hochviskos und konnten erst nach vorherigem Auftrocknen elektropolymerisiert werden, während beispielsweise das 2-Mercaptohydrochinon stark denaturierend wirkte und die Kopplungseffizienz extrem niedrig war.It Then further research has been done to determine the hydrophobicity of the film decrease. For this purpose, new electroactive monomers on pyrrole or hydroquinone base synthesized from pure aqueous Precursor solutions and can be deposited at lower potentials. Indeed could not be technically usable even under these conditions Procedures are developed. Such were the precursor solutions of the hydrophilic pyrrole monomer highly viscous and could only be electropolymerized after previous drying be while for example, the 2-mercaptohydroquinone strongly denaturing and acted the coupling efficiency was extremely low.

Aufgrund der vorstehend genannten Einschränkungen und Unzulänglichkeiten wurde bisher keines der genannten Elektropolymerisationsverfahren für die industrielle Produktion von Sensoren, Immunosensoren oder analytischen Mikrosystemen eingesetzt. Trotz intensiver Forschung scheinen bisherige Verfahren der Elektropolymerisation nur für Nischenanwendungen geeignet zu sein. Insbesondere gibt es kein generell einsetzbares, einstufiges Verfahren, mit dem sich im industriellen Maßstab verschiedenartige, empfindliche Biomoleküle mit hoher örtlicher Auflösung an leitfähigen Oberflächen immobilisieren lassen.by virtue of the above restrictions and inadequacies has not been one of the mentioned electropolymerization process for the industrial production of sensors, immunosensors or analytical Microsystems used. Despite intensive research, previous ones seem Electropolymerization process suitable only for niche applications to be. In particular, there is no generally applicable, single-stage A process that is used on the industrial scale various, sensitive biomolecules with high local resolution on conductive surfaces immobilize.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen, mit dem praktisch alle Biomoleküle mit hoher örtlicher Auflösung an leitfähigen Oberflächen immobilisiert werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass die Biomoleküle aufgrund von Umgebungsbedingungen während des Verfahrens denaturiert werden. Des Weiteren soll ein Verfahren angegeben werden, das, ggf. auch einstufig, empfindlichste Biopolymere mit hoher örtlicher Auflösung an leitfähigen Oberflächen immobilisiert, wobei die Desoxidation der Vorläuferlösung, die sich üblicherweise nachteilig auf die Immobilisationssausbeuten auswirkt, umgangen wird.It Object of the present invention, a method for electrochemical Immobilization of biomolecules to disposal to provide virtually all biomolecules with high locality resolution on conductive surfaces can be immobilized without the risk that the biomolecules due to environmental conditions during the Denatured procedure. Furthermore, a method is given be, if necessary, even one-stage, most sensitive biopolymers with high local resolution on conductive Surfaces immobilized, wherein the deoxidation of the precursor solution, the usually has a detrimental effect on immobilization yields becomes.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur elektrischen Immobilisierung von Biomolekülen an einer leitfähigen Oberfläche gemäß Patentanspruch 1 gelöst.The Task is by a method for electrical immobilization of biomolecules on a conductive surface according to claim 1 solved.

Die Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.The under claims define preferred embodiments the method according to the invention.

Die Aufgabe wird ebenfalls mit einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 18 gelöst.The The object is also achieved with a device according to claim 18.

Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.The under claims relate to preferred embodiments the device according to the invention.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen an einer leitfähigen Oberfläche durch Abscheiden mindestens einer Schicht aus einem leitenden Polymer auf der leitfähigen Oberfläche und Einschluss des Biomoleküls in die Polymerschicht in einer wässrigen Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, das als Monomer für die Bildung der Schicht aus dem leitenden Polymer ein Cumarinderivat verwendet wird.The The invention relates to a method for electrochemical immobilization of biomolecules on a conductive surface by depositing at least one layer of a conductive polymer the conductive one surface and inclusion of the biomolecule in the polymer layer in an aqueous solution, the characterized in that as a monomer for the formation of the layer a coumarin derivative is used in the conductive polymer.

Cumarine sind Naturstoffe, die in mehr als sechzig Pflanzenarten gefunden werden und bisher eine technische Verwendung als pharmakologische Wirkstoffe, Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe und als Vorstufen in der chemischen Synthese gefunden haben.coumarins are natural products found in more than sixty plant species and hitherto a technical use as pharmacologically active substances, Dyes, fluorescent dyes and as precursors in the chemical Found synthesis.

Im Stand der Technik offenbart WO 92/16838 A1 einen Sensor, der auf einem Elektrodenmaterial einen Hilfsstoff wie Cumarin aufweist. Der Hilfsstoff kann in oligomerer oder polymerer Form auf dem Elektrodenmaterial vorliegen. Eine elektrochemische Polymerisation von Cumarin auf einer Elektrode wie in der vorliegenden Erfindung wird in dieser Druckschrift jedoch nicht gelehrt. US 5,964,994 A beschreibt eine mehrschichtige Ionensensitive Elektrode, wobei eine Membran auf einem Träger aufge bracht ist, die eine polymere Matrix mit einem Ionophor und einem 7-Amino-cumarin-Derivat als Fluorophor umfasst. Das Cumarinderivat wird jedoch nicht polymerisiert, sondern einem Polymer wie Polyvinylchlorid zugesetzt.Disclosed in the prior art WO 92/16838 A1 a sensor having on an electrode material an adjuvant such as coumarin. The adjuvant may be in oligomeric or polymeric form on the electrode material. However, electrochemical polymerization of coumarin on an electrode as in the present invention is not taught in this reference. US 5,964,994 A describes a multilayered ion-sensitive electrode wherein a membrane is supported on a support comprising a polymeric matrix with an ionophore and a 7-amino-coumarin derivative as the fluorophore. However, the coumarin derivative is not polymerized but added to a polymer such as polyvinyl chloride.

Die Figuren dienen zur Erläuterung der Erfindung.The Figures are for explanation the invention.

1 zeigt die Kontaktwinkelmessung einer Polymerschicht, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurde. 1 shows the contact angle measurement of a polymer layer which has been prepared according to a preferred embodiment of the method according to the invention.

2 zeigt die schematische Darstellung einer Interdigitalelektrode aus Beispiel 1 nach erfolgter Hybridisierung. 2 shows the schematic representation of an interdigital electrode of Example 1 after hybridization.

Erfindungsgemäß wird die leitfähige Oberfläche von einer dünnen Schicht bzw. einem Film des aus dem Cumarinderivat entstehenden leitenden Polymers vollständig bedeckt, wobei das Biomolekül in der Matrix der entstandenen dünnen Schicht eingebettet vorliegt. Normalerweise liegt die Dicke der auf der leitfähigen Oberfläche ausgebildeten Polymerschicht in einem Bereich von 50 bis 1000 nm, wobei ein Bereich von 200 bis 1000 nm bevorzugt ist.According to the invention conductive surface from a thin one Layer or a film of the resulting from the coumarin derivative conductive polymer completely covered, with the biomolecule in the matrix of the resulting thin Layer embedded present. Usually the thickness is the on the conductive surface formed polymer layer in a range of 50 to 1000 nm, a range of 200 to 1000 nm is preferred.

Im Zuge der Abscheidung wird das Biomolekül chemisch fest mit der leitfähigen Oberfläche verbunden und damit immobilisiert, so dass es für weitere Reaktionen eingesetzt werden kann oder zum Aufbau komplexer Strukturen genutzt werden kann. Hierzu gehören beispielsweise chemische Modifikationen, Ligand-Rezeptor-Bindungen, DNA-Hybridisierungen, DNA-Ligationen und Biosensorschichten.In the course of deposition, the biomolecule becomes chemically solid with the conductive surface ver bound and thus immobilized, so that it can be used for further reactions or can be used to construct complex structures. These include, for example, chemical modifications, ligand-receptor binding, DNA hybridization, DNA ligation and biosensor layers.

Überraschenderweise konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäß verwendeten Cumarinderivate nach chemischer oder elektrochemischer Oxidation wohldefinierte, in wässriger und organischer Lösung stabile elektrisch leitfähige Filme bzw. Schichten mit einheitlicher Dicke von etwa einem μm bilden.Surprisingly could be found that the invention used Coumarin derivatives after chemical or electrochemical oxidation well-defined, in aqueous and organic solution stable electrically conductive Form films or layers with a uniform thickness of about one micron.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Monomere in der Vorläuferlösung verwendeten Cumarinderivate sind solche, die die Strukturformel I aufweisen:

Figure 00070001
worin R1 bis R6 voneinander unabhängig ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aminogruppe oder eine -COOH-Gruppe bedeuten und in denen mindestens eine der R1 bis R6-Gruppen in der Strukturformel I eine Hydroxylgruppe darstellt. Ganz besonders bevorzugt eingesetzte Cumarinderivate sind das Umbelliferon, worin R1 bis R4 und R6 in der Strukturformel I Wasserstoffatome und R5 eine Hydroxylgruppe bedeuten und das Scopoletin, worin R1 bis R3 und R6 in der Strukturformel I Wasserstoffatome, R4 eine -OCH3-Gruppe und R5 eine Hydroxylgruppe bedeuten.The coumarin derivatives used as monomers in the precursor solution in the process according to the invention are those which have the structural formula I:
Figure 00070001
wherein R 1 to R 6 independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group or a -COOH group and in which at least one of R 1 to R 6 groups in the structural formula I represents a hydroxyl group. Very particularly preferably used coumarin derivatives are the umbelliferone, wherein R 1 to R 4 and R 6 in the structural formula I are hydrogen atoms and R 5 is a hydroxyl group and the scopoletin, wherein R 1 to R 3 and R 6 in the structural formula I hydrogen atoms, R 4 a -OCH 3 group and R 5 represents a hydroxyl group.

Es hat sich herausgestellt, dass die Cumarinderivate Umbelliferon und Scopoletin, die jeweils mindestens eine Hydroxylgruppe tragen, besonders geeignet für die schonende Immobilisierung von Biomolekülen sind, da durch den Überschuss an Hydroxylgruppen im Polymerfilm eine hydrophile Matrix entsteht, die sich wesentlich von den extrem hydrophoben herkömmlichen Elektropolymeren unterscheidet und eine biokompatible, d. h. nicht denaturierende Umgebung für die Biomoleküle darstellt.It It has been found that the coumarin derivatives umbelliferone and Scopoletin, each carrying at least one hydroxyl group, particularly suitable for the gentle immobilization of biomolecules are because of the excess hydroxyl groups in the polymer film form a hydrophilic matrix, which is significantly different from the extremely hydrophobic conventional ones Electropolymer distinguishes and a biocompatible, d. H. Not denaturing environment for the biomolecules represents.

Die starke Hydrophilizität der Matrix ist anhand der Messung eines Kontaktwinkels zwischen dem Elektropolymerfilm auf der leitfähigen Oberfläche und der Oberfläche eines darauf abgeschiedenen Wassertropfens gemessen worden. Hierzu wird auf 1 verwiesen. In 1 wird eine Elektrodenoberfläche 3 gezeigt, die mit einem Scopoletin-Polymerfilm 2 bedeckt ist. Darauf ist ein Wassertropfen 1 abgeschieden worden. Man erkennt aus dem Kontaktwinkel von 10° (+/–1°), dass der Polymerfilm eine stark hydrophile Oberfläche produziert hat. Das Scopoletin (7-Hydroxymethoxycumarin) ist ein als Monomer blaugrün fluoreszierender Naturstoff, der allerdings nicht in polymerisierter Form fluoresziert und je nach Schichtdicke eine Farbe zwischen goldbraun und schwarz aufweist.The strong hydrophilicity of the matrix has been measured by measuring a contact angle between the electropolymer film on the conductive surface and the surface of a water droplet deposited thereon. This is on 1 directed. In 1 becomes an electrode surface 3 shown with a scopoletin polymer film 2 is covered. On it is a drop of water 1 been separated. It can be seen from the contact angle of 10 ° (+/- 1 °) that the polymer film has produced a strongly hydrophilic surface. The scopoletin (7-hydroxymethoxycoumarin) is a natural blue-green fluorescent natural substance, but does not fluoresce in polymerized form and depending on the layer thickness has a color between golden brown and black.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle Biomoleküle immobilisiert werden, selbst solche, die hochempfindlich sind und schnell degradiert werden können. Eine Auswahl für Biomoleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden können, umfasst Antikörper, Antigene, Peptide, Proteine, Enzyme, Nukleinsäuren, Zellen pflanzlicher, tierischer und humaner Herkunft, ausgenommen humane Keimzellen, Hormone, organische Nanopartikel, anorganische Nanopartikel sowie Teile davon.With the method according to the invention can all biomolecules be immobilized, even those that are highly sensitive and can be demoted quickly. A selection for biomolecules with the method according to the invention can be immobilized includes antibodies, Antigens, peptides, proteins, enzymes, nucleic acids, plant cells, of animal and human origin, excluding human germ cells, Hormones, organic nanoparticles, inorganic nanoparticles as well Parts of it.

Nanopartikel sind in der Regel synthetische Partikel, die extrem klein sind. Normalerweise liegt ihre Größe in einem Bereich von 20 nm bis 2 μm. Sie können aus organischen oder anorganischen Materialien hergestellt sein. Zu organischen Materialien zählen beispielsweise Polystyrol und zu anorganischen Materialien das Silikat. Die Oberfläche und das Volumen der Nanopartikel können durch bestimmte. Verfahren chemisch modifiziert werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise die Volumenmodifikation durch Einlagerung von magnetischen Partikeln oder fluoreszierenden Farbstoffen. Des Weiteren ist es auch möglich, die Oberfläche der Nanopartikel chemisch mit koppelbaren Gruppen, wie beispielsweise Carboxyl- und Aminogruppen, zu modifi zieren. Nanopartikel können insbesondere zum Aufbau biochemischer Assays eingesetzt werden.nanoparticles are usually synthetic particles that are extremely small. Usually their size is in one Range from 20 nm to 2 μm. You can be made of organic or inorganic materials. To count organic materials For example, polystyrene and inorganic materials to the silicate. The surface and the volume of nanoparticles can be determined by certain. method be chemically modified. These methods include, for example the volume modification by incorporation of magnetic particles or fluorescent dyes. Furthermore, it is also possible, the surface the nanoparticles chemically coupled with groups, such as Carboxyl and amino groups, to be modified. In particular, nanoparticles can be used to build biochemical assays.

Die Biomoleküle werden in die Matrix der entstandenen dünnen Polymerschicht eingebettet und damit effektiv immobilisiert und für weitere Reaktionen zugänglich gemacht.The biomolecules are embedded in the matrix of the resulting thin polymer layer and thus effectively immobilized and made available for further reactions.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich einstufig wie auch mehrstufig durchführen. Im einstufigen Verfahren erfolgt die Immobilisierung durch Abscheidung einer Vorläuferlösung, die das Cumarinderivat-Monomer und das Biomolekül enthält. Somit wird das Biomolekül während der Abscheidung der Schicht aus dem leitenden Polymer in diese eingeschlossen.The inventive method can be single-stage as well as perform multi-level. In the one-step process, the immobilization is carried out by deposition a precursor solution that contains the coumarin derivative monomer and the biomolecule. Thus, the biomolecule becomes during the Deposition of the layer of conductive polymer included in this.

Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zweistufig durchgeführt werden. In diesem Fall enthält die Vorläuferlösung das Cumarinderivat-Monomer und eine weitere Substanz, die eine Affinität zum Biomolekül aufweist. Aus dieser Vorläuferlösung wird eine Schicht aus dem leitfähigen Cumarinderivat-Polymer mit der Substanz darin hergestellt. Nach der Abscheidung wird das Biomolekül, das ggf. modifiziert ist, um eine Affinität zur vorgenannten Substanz herzustellen, hinzugegeben und in geeigneter Weise mit dem leitfähigen Polymer inkubiert. Als ein geeignetes System kann an dieser Stelle das Affinitätspaar Streptavidin/Biotin genannt werden. Somit erfolgt in diesem zweistufigen Verfahren ein Einschluss des Biomoleküls in die Schicht aus dem leitfähigen Polymer erst nach der Abscheidung der Schicht aus dem leitenden Polymer.Alternatively, the method according to the invention can also be carried out in two stages. In this case, the precursor solution contains the coumarin derivative monomer and another substance that has an affinity for the biomolecule. From this Vorläu fer solution, a layer of the conductive coumarin derivative polymer is prepared with the substance therein. After deposition, the biomolecule, optionally modified to produce affinity for the aforementioned substance, is added and suitably incubated with the conductive polymer. As a suitable system, the affinity pair streptavidin / biotin can be mentioned at this point. Thus, in this two-step process, entrapment of the biomolecule into the conductive polymer layer occurs only after deposition of the conductive polymer layer.

Die Konzentrationen des Biomoleküls sowie des Monomers können innerhalb relativ großer Bereiche variieren. Die entsprechende Auswahl des richtigen Konzentrationsbereichs hängt in der Regel davon ab, welches Molekül für welche Anwendung eingesetzt wird.The Concentrations of the biomolecule and the monomer can within relatively large Ranges vary. The appropriate selection of the correct concentration range hangs in usually depends on which molecule is used for which application becomes.

Normalerweise liegt die Konzentration des Biomoleküls in einem Bereich von 0,001 ng/ml bis 100 mg/ml. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt zwischen 1 μg/ml bis 1 mg/ml.Usually the concentration of the biomolecule is in the range of 0.001 ng / ml to 100 mg / ml. A preferred concentration range is between 1 μg / ml to 1 mg / ml.

In der Regel wird das Monomer in einer Konzentration eingesetzt, die in einem Bereich von 0,01 bis 100 mmol/l liegt. Bevorzugt ist ein Bereich von 0,1 bis 10 mmol/l, wobei ein 1 mmol/l insbesondere bevorzugt ist.In usually the monomer is used in a concentration that in a range of 0.01 to 100 mmol / l. Preferred is a Range of 0.1 to 10 mmol / l, with 1 mmol / l being particularly preferred is.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die leitfähigen Schichten mit hoher Gleichmäßigkeit aus nicht desoxidierten, verdünnten wässrigen Lösungen des Monomers bei annähernd neutralem pH-Wert abgeschieden werden können. In der Praxis hat sich erwiesen, dass die Abscheidung unter Einschluss des Biopolymers bei einem pH-Wert von 6 bis 8 erfolgen kann.One Another essential advantage of the method according to the invention is that the conductive Layers with high uniformity from not deoxidized, diluted aqueous Solutions of the Monomers at approximate neutral pH can be deposited. In practice it has been proven that the deposition including the biopolymer in a pH from 6 to 8 can take place.

Des weiteren hat sich bei der Auswahl von entsprechenden organischen oder anorganischen Leitsalzen herausgestellt, dass im erfindungsgemäßen Verfahren die Abscheidung mit einfachen norganischen Salzen durchgeführt werden kann. Beispiele für anorganische Leitsalze sind Salze von Alkali- und Erdalkalimetallen. Spezielle Beispiele für geeignete Leitsalze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid, Toluol-4-sulfonat, Tetraethylammoniumtoluol-4-sulfonat, Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Natriumperchlorat und Poly(Natriumstyrolsulfonat). Bevorzugt wird als Leitsalz Kaliumchlorid eingesetzt. Die Konzentration des Leitsalzes in der Vorläuferlösung liegt in der Regel, in einem Bereich von 0,01 mmol/l bis 1000 mmol/l. Ein bevorzugter Bereich liegt zwischen 1,0 und 100 mmol/l.Of Another has to be in the selection of appropriate organic or inorganic conductive salts, that in the process according to the invention the deposition can be carried out with simple inorganic salts can. examples for inorganic conductive salts are salts of alkali and alkaline earth metals. Special examples for suitable conductive salts are sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, Toluene-4-sulphonate, tetraethylammoniumtoluene-4-sulphonate, hydrogenphosphate, Dihydrogen phosphate, sodium perchlorate and poly (sodium styrenesulfonate). Preference is given to using potassium chloride as the conductive salt. The concentration of the conductive salt is in the precursor solution usually, in a range of 0.01 mmol / l to 1000 mmol / l. A preferred range is between 1.0 and 100 mmol / l.

Die bei der Abscheidung der Schicht verwendete Vorläuferlösung weist somit auch erhebliche Vorteile bezüglich der Umweltbilanz auf. So werden keine organischen Lösungsmittel und keine toxischen Substanzen verwendet. Die Kosten zur Herstellung der Vor läuferlösung sind absolut gering. Des weiteren zeichnet sich die Vorläuferlösung durch eine starke Biokompatibilität, d. h. eine starke Eignung für empfindliche Polymere, aus. Gegenüber den hydrophoben Pyrrolderivaten des Standes der Technik weisen die Cumarinderivat-Vorläuferlösungen eine deutlich geringere Viskosität auf und lassen sich bei niedrigeren Potentialen elektropolymerisieren.The The precursor solution used in the deposition of the layer thus also has considerable advantages in terms of the environmental audit. So no organic solvents and no toxic substances used. The cost of production are the runner solution absolutely low. Furthermore, the precursor solution is characterized a strong biocompatibility, d. H. a strong suitability for sensitive Polymers, off. Across from The hydrophobic pyrrole derivatives of the prior art have the Cumarin derivative precursor solutions clearly lower viscosity and can be electropolymerized at lower potentials.

Die Spannung bei der Elektropolymerisation hängt in der Regel von den verwendeten leitfähigen Oberflächen und deren Anordnung ab. Man kann davon ausgehen, dass Potentiale ab 0,20 V bis 1,0 V vs. Ag/AgCl geeignet sind. Ein typischer Bereich liegt bei 0,5 bis 0,7 V vs. Ag/AgCl.The Voltage in the electropolymerization generally depends on the one used conductive surfaces and their arrangement from. You can assume that potentials off 0.20V to 1.0V vs. Ag / AgCl are suitable. A typical area is 0.5 to 0.7 V vs. Ag / AgCl.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich empfindliche Biomoleküle, wie beispielsweise Enzyme, Proteine, Nukleinsäuren, aus gepufferten oder ungepufferten wässrigen Lösungen in einer einstufigen Reaktion an leitfähigen Oberflächen abscheiden. Eine derartige Immobilisierungreaktion lässt sich beispielsweise mit einer Vorläuferlösung vornehmen, die 1 mmol/l Scopoletin, 1 mg/ml Protein und 0,05 mol/l KCl enthält, bei einem pH-Wert von 7 durchführen.In a preferred embodiment the method according to the invention can be sensitive biomolecules, such as enzymes, Proteins, nucleic acids, from buffered or unbuffered aqueous solutions in a single stage Reaction to conductive surfaces deposit. Such immobilization reaction can be for example, with a precursor solution, containing 1 mmol / l scopoletin, 1 mg / ml protein and 0.05 mol / l KCl to a pH of 7.

Ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, insbesondere im Hinblick auf die technische Nutzung, die extrem lange Lagerstabilität der gebrauchsfertigen Vorläuferlösungen. So können aktive Bioschichten mit drei Monate alten, bei 4°C gelagerten Starterlösungen bzw. Vorläuferlösungen hergestellt werden.One Another decisive advantage of the method according to the invention is, especially with regard to the technical use, the extreme long shelf life ready-to-use precursor solutions. So can active biolayer with three-month-old, at 4 ° C stored starter solutions or Precursor solutions prepared become.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die elektrochemische Immobilisierung von Biomolekülen an Elektroden vorgenommen. Besondere Bedeutung erlangt das Verfahren unter Verwendung makroskopischer oder miniaturisierter Elektroden, die aus Metallen, Halbleitermetallen, Indium-Zinn-Oxid, Kohlenstoff oder leitfähigen Polymeren bestehen. Insbesondere werden diese Elektroden dazu eingesetzt, Biosensoren, Immunsensoren und analytische Mikrosysteme mit Abmessungen von weniger als 1 μm bis zu mehreren Zentimetern herzustellen. An diesen Elektroden kann die erfindungsgemäße wässrige Vorläuferlösung bei einem neutralen pH-Wert unter Bildung einer stark hydrophilen Biomolekülschicht stattfinden. Damit sind erstmals Bedingungen bei der Elektropolymerisation vorgegeben, die zur absolut schonenden Einbettung empfindlicher Biomoleküle geeignet sind.In a further preferred embodiment the method according to the invention is the electrochemical immobilization of biomolecules to electrodes performed. Of particular importance is the method using macroscopic or miniaturized electrodes made of metals, Semiconducting metals, indium tin oxide, carbon or conductive polymers consist. In particular, these electrodes are used to Biosensors, immunosensors and analytical microsystems with dimensions less than 1 μm to produce up to several centimeters. At these electrodes can the aqueous precursor solution according to the invention take place at a neutral pH to form a highly hydrophilic biomolecule layer. For the first time, conditions for electropolymerization are given, suitable for absolutely gentle embedding sensitive biomolecules are.

Je nach Anwendungszweck wird auf der leitfähigen Oberfläche mehr als eine Schicht aufgetragen. So können mindestens zwei Schichten auf der leitfähigen Oberfläche abgeschieden werden.Depending on the application, more than one layer is applied to the conductive surface Thus, at least two layers can be deposited on the conductive surface.

Es ist möglich und in vielen Fällen auch äußerst praktikabel, in die Vorläuferlösung weitere Additive einzugeben, um auf diese Weise der ausgebildeten Biomolekülschicht weitere Funktionalitäten zu verleihen. Dazu gehört beispielsweise eine Verbesserung des Elektronentransports innerhalb der Schicht. Diese kann beispielsweise durch Zusatz von Redoxmediatoren, wie Osmiumkomplexen, Vitamin K, Chinonderivaten etc. erfolgen. Auch in diesem Fall ist es, wie ausgeführt, möglich, das Additiv gleichzeitig mit der Abscheidung zu verwenden. Alternativ kann es auch erst danach hinzugefügt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das Cumarinderivat mit der Strukturformel I noch vor der Abscheidung entsprechend chemisch zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform lässt sich eine von äußerer Reagenzzufuhr unabhängige Enzymelektrode für einen Biosensor herstellen, wenn in der auf der Elektrode nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgeschiedenen Schicht ein Redoxenzym und ein Redoxmediator enthalten sind.It is possible and in many cases also very practical, in the precursor solution more Add additives to the thus formed biomolecule layer additional functionalities to rent. This includes for example, an improvement in the electron transport within the layer. This can be achieved, for example, by adding redox mediators, like osmium complexes, vitamin K, quinone derivatives, etc. Also in this case, as stated, it is possible to add the additive at the same time to use with the deposition. Alternatively, it may only be after that added become. One more way consists of the coumarin derivative with the structural formula I yet chemically modify before deposition. In a preferred embodiment let yourself one from outside reagent supply independent Enzyme electrode for one Produce biosensor when in the on the electrode according to the inventive method deposited layer containing a redox enzyme and a redox mediator are.

Das erfindungsgemäße Immobilisationsverfahren stellt ein effizientes und ohne spezielle Optimierung breit einsetzbares Ver fahren zur Abscheidung und dauerhaften Immobilisierung von empfindlichen Biomolekülen an leitfähigen Oberflächen zur Verfügung. Die unmittelbar nach der Elektropolymerisation vorhandene elektrische Leitfähigkeit der Polymerschicht geht zwar mit der Zeit und auch durch Umgebungsbedingungen, wie Lagertemperatur, Feuchtigkeit etc., verloren, was allerdings nicht die Funktion der abgeschiedenen Schicht aus Biomolekül/Polymer beeinflusst.The Immobilization process according to the invention provides an efficient and widely deployable without special optimization Ver drive for the separation and permanent immobilization of sensitive biomolecules on conductive surfaces to disposal. The existing immediately after the electropolymerization electrical conductivity the polymer layer does move with time and also through environmental conditions, such as storage temperature, humidity, etc., lost, but what not the function of the deposited biomolecule / polymer layer affected.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ohne weiteres insbesondere für die Beschichtung von miniaturisierten Elektrodenstrukturen im Submikrometerbereich geeignet. Es hat sich herausgestellt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Seite einer Interdigitalelektrode mit einer Fingerbreite von 2 μm bei 4 μm Elektrodenabstand ohne Übersprechen mit Streptavidin und einem Cumarinderivatpolymer beschichtet werden konnte.The inventive method is readily available in particular for the coating of miniaturized electrode structures in the sub-micron range suitable. It has been found that with the method according to the invention one side of an interdigital electrode with a finger width of 2 μm at 4 μm electrode gap without crosstalk with Streptavidin and a coumarin derivative polymer are coated could.

Des weiteren ist hervorzuheben, dass die für die Elektroimmobilisierung verwendete Vorläuferlösung außerordentlich lagerstabil ist und mindestens zwei Monate aufbewahrt werden kann. Dieses ist ein deutlicher Fortschritt gegenüber den Lösungen, die in den herkömmlichen Elektroimmobilisierungsverfahren angewendet werden, so dass das erfindungsgemäße Verfahren für die Serienproduktion besonders geeignet ist.Of Further, it should be emphasized that those for the electrical immobilization used precursor solution greatly is stable on storage and can be stored for at least two months. This is a significant advance over the solutions used in the conventional Electric immobilization procedures are applied so that the inventive method for the Series production is particularly suitable.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere dafür einsetzbar, eine Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen. Eine derartige Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen weist folgende Bestandteile auf:

  • – eine Einrichtung mit einer leitfähigen Oberfläche;
  • – mindestens eine auf dieser leitfähigen Oberfläche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgeschiedene Schicht aus dem leitenden Polymer mit dem in der leitenden Schicht eingeschlossenen Biomolekül; und
  • – eine Messeinrichtung zum Nachweis des Biomoleküls.
The method according to the invention can be used in particular for providing a device for detecting biomolecules. Such a device for the detection of biomolecules has the following components:
  • A device with a conductive surface;
  • At least one layer of the conductive polymer deposited on this conductive surface according to the method of the invention with the biomolecule enclosed in the conductive layer; and
  • - A measuring device for the detection of the biomolecule.

Bezüglich der leitfähigen Oberflächen und der Zusammensetzung der abgeschiedenen Schicht bzw. Schichten wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.Regarding the conductive surfaces and the composition of the deposited layer or layers Reference is made to the preceding remarks.

Die Messeinrichtung zum Nachweis des Biomoleküls kann beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop, ein Fluoreszenzleser, ein Spektrograph, ein Photometer oder ein Bildscanner sein. Es kann allerdings auch jedes andere elektrische, optische oder magnetische Messgerät für den Nachweis verwendet werden. Voraussetzung ist allerdings, dass die Wechselwirkung des immobilisierten Biomoleküls mit einem dazu affinen Gegenmolekül erkannt und nachgewiesen wird.The Measuring device for detecting the biomolecule, for example, a Fluorescence microscope, a fluorescence reader, a spectrograph, a photometer or a picture scanner. However, it can be any other electrical, optical or magnetic measuring device can be used for the detection. However, a prerequisite is that the interaction of the immobilized biomolecule detected and detected with an affinity counterpart molecule becomes.

Die Vorrichtung ist insbesondere für die Anwendung in der Biochemie, Bioanalytik und Biosensorik, Biotechnologie, in der medizinischen Diagnostik und in der klinischen Chemie einsetzbar.The Device is especially for application in biochemistry, bioanalytics and biosensing, biotechnology, can be used in medical diagnostics and in clinical chemistry.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung.The The following examples serve to illustrate the process according to the invention or the device according to the invention.

BeispieleExamples

Beispiel 1example 1

Gerichtete Immobilisierung von biotinylierten Oligonukleotiden an Streptavidin-modifizierten Elektroden zur Herstellung eines DNA-Sensorsdirected Immobilization of biotinylated oligonucleotides to streptavidin-modified Electrodes for the production of a DNA sensor

In einem zweistufigen Prozess wird zunächst eine Elektrode mit einer Schicht aus dem leitenden Scopoletinpolymer und Streptavidin beschichtet; in einem zweiten Schritt werden biotinylierte Oligonukleotide an der Elektrode fixiert.

  • 1. Schritt: Abscheidung von Scopoletinpolymer und Streptavidin an einer miniaturisierten Gold-Interdigitalelektrode (IDE).
In a two-step process, an electrode is first coated with a layer of the conductive scopoletin polymer and streptavidin; in a second step, biotinylated oligonucleotides are fixed to the electrode.
  • 1st step: Deposition of scopoletin polymer and streptavidin on a miniaturized gold interdigital electrode (IDE).

Zur Herstellung der Vorläuferlösung werden in destilliertem Wasser KCl in einer Konzentration von 0,05 mol gelöst und der pH-Wert auf pH 7 eingestellt. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 1 mmol/l sowie Streptavidin (p. a., Gerbu, Gaiberg) werden darin in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst.To prepare the precursor solution, KCl is dissolved in distilled water in a concentration of 0.05 mol and the pH is adjusted to pH 7. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Switzerland) at a concentration of 1 mmol / l and streptavidin (pa, Gerbu, Gaiberg) are dissolved therein at a concentration of 1 mg / ml.

Eine ungerührte elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung aus einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, einer Pt-Gegenelektrode und einer miniaturisierten Gold-IDE ("Neurochip" von FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE mit 2 μm Elektrodenabstand und 1 μm Fingerbreite), die von einem handelsüblichen Potentiostaten (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) auf dem konstanten Potential gehalten wird, wird als Elektrolysezelle verwendet.A unstirred Electrochemical cell with a three-electrode arrangement of a Ag / AgCl reference electrode, a Pt counter electrode and a miniaturized Gold IDE ("Neurochip" by FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE with 2 μm Electrode distance and 1 μm Finger width), which were measured by a commercially available potentiostat (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) at the constant potential is used as an electrolysis cell is used.

Die Abscheidung erfolgt durch Eintauchen der Elektroden in die nicht desoxidierte Vorläuferlösung und Anlegen eines konstanten Potentials von 0,5 V vs./Ag/AgCl für 3 Minuten. Die beschichtete IDE wird mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft für 1 Stunde getrocknet.

  • 2. Schritt: Aufbringen eines biotinylierten Oligonukleotids auf die modifizierte Elektrode.
Deposition occurs by immersing the electrodes in the non-deoxygenated precursor solution and applying a constant potential of 0.5 V vs. / Ag / AgCl for 3 minutes. The coated IDE is washed with distilled water and dried in air for 1 hour.
  • 2nd step: Applying a biotinylated oligonucleotide to the modified electrode.

Ein 5'-Biotin-markiertes 13-meres Oligomer 1 (Biotez, Berlin) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,4, 50 mmol/l Phosphat) in einer Konzentration von 0,05 mmol/l aufgenommen. 20 μl dieser Lösung werden auf die modifizierte Elektrode gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Elektrode wird 5 Minuten in destilliertes Wasser gelegt, um nicht fest gebundene Oligos abzuwaschen.

  • 3. Schritt: Wie 1., aber nun wird die zweite Hälfte der IDE beschichtet.
  • 4. Schritt: Wie 2., aber die zweite Hälfte der IDE wird mit einem 13-mer Oligonukleotid 2 beschichtet, das sich um genau eine Base vom ersten Oligonukleotid unterscheidet.
  • 5. Schritt: Hybridisierung mit einem komplementären Fluoreszein-markierten 17-meren Oligonukleotid 3 als Funktionsnachweis.
A 5'-biotin-labeled 13-mer oligomer 1 (Biotez, Berlin) was taken up in phosphate buffer (pH 7.4, 50 mmol / l phosphate) in a concentration of 0.05 mmol / l. 20 μl of this solution are added to the modified electrode and incubated for 30 minutes at room temperature. The electrode is placed in distilled water for 5 minutes to wash off unbound oligos.
  • 3rd step: Same as 1st, but now the second half of the IDE will be coated.
  • 4th step: As 2nd, but the second half of the IDE is coated with a 13-mer oligonucleotide 2 that differs by exactly one base from the first oligonucleotide.
  • 5th step: hybridization with a complementary fluorescein-labeled 17-mer oligonucleotide 3 as a function detection.

Ein zum immobilisierten Oligonukleotid 1 100%-ig komplementäres, am 5'-Ende Fluoreszein-markiertes DNA-Oligonukleotid wird in einer Konzentration von 100 μmol auf die Elektrode gegeben. Nach 30 Minuten Hybridisierungsdauer wird die Elektrode mit destilliertem Wasser gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DMR mit Fluoreszenz-Filtersatz 490 nm/510 nm, Jena) inspiziert. Die mit dem zu 100% komplementären Oligo (full match) beschichtete Seite 1 zeigt eine Helligkeit von 91%, während die mit dem in einer Base abweichenden Oligo beschichtete Elektrode 2 sichtbar dunkler erscheint (Helligkeitswert 45%), siehe 2.A to the immobilized oligonucleotide 1 100% complementary, at the 5 'end fluorescein-labeled DNA oligonucleotide is added to the electrode in a concentration of 100 .mu.mol. After 30 minutes of hybridization, the electrode is washed with distilled water and inspected under a fluorescence microscope (Leica DMR with fluorescence filter set 490 nm / 510 nm, Jena). The side 1 coated with the 100% complementary oligo (full match) shows a brightness of 91%, while the one with the base deviating oligo coated electrode 2 appears visibly darker (brightness value 45%), see 2 ,

Beispiel 2Example 2

Immobilisierung eines Redoxenzyms an einer PlatinelektrodeImmobilization of a redox enzyme on a platinum electrode

In einem einstufigen Prozess wird Pyruvatoxidase als Beispiel eines empfindlichen Enzyms an einer Platinelektrode mittels Scopoletinpolymer immobilisiert.In In a one - step process, pyruvate oxidase is used as an example sensitive enzyme on a platinum electrode using scopoletin polymer immobilized.

Zur Herstellung einer Vorläuferlösung werden in Phosphatpuffer, pH 7,4 (0,05 mol/l Phosphat) Scopoletin (> 98%, Fiuka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 2 mmol/l, Pyruvatoxidase (6 U/mg, Toyobo Enzymes, Kyoto, Japan) in einer Konzentration von 2 mg/ml sowie Thiaminpyrophosphat (95%, Sigma, USA) in einer Konzentration von 0,2 mmol/l, MgCl2 in einer Konzentration von 2 mmol/l und Fluorescein-Adenindinukleotid (FAD, > 90%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 10 μmol gelöst. To prepare a precursor solution, in phosphate buffer, pH 7.4 (0.05 mol / l phosphate), scopoletin (> 98%, Fiuka, Buchs, Switzerland) in a concentration of 2 mmol / l, pyruvate oxidase (6 U / mg, Toyobo Enzyme, Kyoto, Japan) at a concentration of 2 mg / ml and thiamine pyrophosphate (95%, Sigma, USA) at a concentration of 0.2 mmol / l, MgCl 2 at a concentration of 2 mmol / l and fluorescein adenine dinucleotide ( FAD,> 90%, Fluka, Buchs, Switzerland) dissolved in a concentration of 10 .mu.mol.

Eine ungerührte elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung aus einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, einer Pt-Gegenelektrode und einer Pt-Arbeitselektrode (Durchmesser 2 mm), die von einem handelsüblichen Potentiostaten (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) auf dem konstanten Potential gehalten wird, wird als Elektrolysezelle verwendet.A unstirred Electrochemical cell with a three-electrode arrangement of a Ag / AgCl reference electrode, a Pt counter electrode and a Pt working electrode (Diameter 2 mm), which by a commercially available potentiostat (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) at the constant potential is used as an electrolysis cell is used.

Die Abscheidung erfolgt durch Eintauchen der Elektrode in die nicht desoxidierte Vorläuferlösung und Anlegen eines Potentials von 0,5 V vs./Ag/AgCl für 3 Minuten. Die beschichtete Arbeitselektrode wird mit Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen und vor der Benutzung in diesem Puffer gelagert.The Deposition takes place by immersing the electrode in the non deoxidized precursor solution and Apply a potential of 0.5 V vs. / Ag / AgCl for 3 minutes. The coated one Working electrode is washed with phosphate buffer pH 7.4 and before stored in this buffer for use.

Der Nachweis der funktionalen Immobilisierung des Enzyms erfolgt durch amperometrische Detektion von Pyruvat.Of the Detection of the functional immobilization of the enzyme is carried out by amperometric detection of pyruvate.

Beispiel 3Example 3

Immobilisierung von Streptavidin an einer Gold-IDE als Modell für einen ImmunosensorImmobilization of streptavidin on a Gold IDE as a model for an immunosensor

Als Modellsystem für einen Immunoassay an Mikroelektroden, bei dem ein Antikörper immobilisiert ist, wird Streptavidin in einer leitfähigen Scopoletinpolymerschicht und einer Mikroelektrode abgeschieden und durch ein Fluoreszein-markiertes Biotinderivat (als Modell für ein fluoreszenzmarkiertes Antigen) sichtbar gemacht.

  • 1. Schritt: Abscheidung von Scopoletinpolymer und Streptavidin an einer miniaturisierten Gold-Interdigitalelektrode (IDE).
As a model system for an immunoassay on microelectrodes in which an antibody is immobilized, streptavidin is deposited in a conductive scopoletin polymer layer and a microelectrode and visualized by a fluorescein-labeled biotin derivative (as a model for a fluorescently labeled antigen).
  • 1st step: Deposition of scopoletin polymer and streptavidin on a miniaturized gold interdigital electrode (IDE).

Zur Herstellung einer Vorläuferlösung werden in destilliertem Wasser KCl in einer Konzentration von 0,05 mol/l gelöst und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 1 mmol/l und Streptavidin (p. a., Gerbu, Gaiberg) in einer Konzentration von 1 mg/ml werden darin gelöst.to Preparation of a precursor solution in distilled water KCl in a concentration of 0.05 mol / l solved and the pH is adjusted to 7. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Switzerland) in one Concentration of 1 mmol / l and streptavidin (P.a., Gerbu, Gaiberg) in a concentration of 1 mg / ml are dissolved therein.

Eine ungerührte elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung aus einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, einer Pt-Gegenelektrode und einer miniaturisierten Gold-IDE ("Neurochip" von FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE mit 2 μm Elktrodenabstand und 1 μm Fingerbreite), die von einem handelsüblichen Potentiostaten (z. B. CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) auf dem konstanten Potential gehalten wird, wird als Elektrolysezelle verwendet.A unstirred Electrochemical cell with a three-electrode arrangement of a Ag / AgCl reference electrode, a Pt counter electrode and a miniaturized Gold IDE ("Neurochip" by FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE with 2 μm Electrode distance and 1 μm Finger width), which by a commercial potentiostat (z. CH Instruments 750A, Austin, Texas, USA) at the constant Potential is maintained, is used as an electrolytic cell.

Die Abscheidung erfolgt durch Eintauchen der Elektroden in die nicht desoxidierte Vorläuferlösung und Anlegen eines konstanten Potentials von +0,5 V vs./Ag/AgCl für 3 Minuten. Die beschichtete IDE wird mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft für 1 Stunde getrocknet.

  • 2. Schritt: Affine Bindung von Fluoreszein-markiertem Biotin als Modell der Antikörper/Antigen-Bindung.
Deposition occurs by immersing the electrodes in the non-deoxygenated precursor solution and applying a constant potential of +0.5 V vs. / Ag / AgCl for 3 minutes. The coated IDE is washed with distilled water and dried in air for 1 hour.
  • 2nd step: Affine binding of fluorescein-labeled biotin as a model of antibody / antigen binding.

Ein Fluorescein-Biotin-Konjugat (synthetisiert am FhG-IBMT, Bergholz-Rehbrücke) wird in Phosphatpuffer (ph 7,4, 50 mmol/l Phosphat) in einer Konzentration von 1 μmol aufgenommen. 20 μl dieser Lösung werden auf die modifizierte Elektrode gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Elektrode wird 5 Minuten in destilliertes Wasser gelegt, um überschüssiges Konjugat abzuwaschen.One Fluorescein-biotin conjugate (synthesized at FhG-IBMT, Bergholz-Rehbrücke) in phosphate buffer (pH 7.4, 50 mmol / l phosphate) in one concentration of 1 μmol added. 20 μl this solution are placed on the modified electrode and for 30 minutes incubated at room temperature. The electrode is placed in distilled water for 5 minutes placed to excess conjugate wash away.

Die affine Bindung des fluoreszierenden Konjugates exklusiv an der beschichteten Seite der IDE wird durch einen Helligkeitswert von 100% gegenüber einem Helligkeitwert von nur 33% an der unbeschichteten Seite illustriert.The affine binding of the fluorescent conjugate exclusively to the coated Side of the IDE is characterized by a brightness value of 100% over one Brightness value of only 33% illustrated on the uncoated side.

Claims (21)

Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen an einer leitfähigen Oberfläche durch Abscheiden mindestens einer Schicht aus einem leitenden Polymer auf der leitfähigen Oberfläche und Einschluss des Biomoleküls in die Polymerschicht in einer wässrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass als Monomer für die Bildung der Schicht aus dem leitenden Polymer ein Cumarinderivat verwendet wird, wobei das Cumarinderivat folgende Strukturformel I aufweist
Figure 00190001
worin R1 bis R6 voneinander unabhängig ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aminogruppe oder eine -COOH-Gruppe bedeuten und wobei mindestens eine der R1- bis R6-Gruppen eine Hydroxylgruppe darstellt.A method of electrochemically immobilizing biomolecules on a conductive surface by depositing at least one layer of a conductive polymer on the conductive surface and entrapping the biomolecule in the polymer layer in an aqueous solution, characterized by using as a monomer the conductive polymer layer a coumarin derivative is used, wherein the coumarin derivative has the following structural formula I.
Figure 00190001
wherein R 1 to R 6 independently of one another represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group or a -COOH group and at least one of R 1 - to R 6 groups represents a hydroxyl group. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Strukturformel I R1 bis R3 und R6 Wasserstoffatome und R4 eine -OCH3-Gruppe und R5 eine Hydroxylgruppe bzw. R1 bis R4 und R6 Wasserstoffatome und R5 eine Hydroxylgruppe bedeuten.A method according to claim 1, characterized in that in the structural formula IR 1 to R 3 and R 6 are hydrogen atoms and R 4 is an -OCH 3 group and R 5 is a hydroxyl group or R 1 to R 4 and R 6 is hydrogen and R 5 is a Hydroxyl group mean. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Biomoleküle Antikörper, Antigene, Peptide, Proteine, Enzyme, Nukleinsäuren, Zellen pflanzlicher, tierischer und humaner Herkunft, ausgenommen humane Keimzellen, Hormone, organische Nanopartikel, anorganische Nanopartikel sowie Teile davon immobilisiert werden.Method according to at least one of claims 1 to 2, characterized in that as biomolecules antibodies, antigens, peptides, proteins, enzymes, nucleic acids, Cells of plant, animal and human origin, except human germ cells, hormones, organic nanoparticles, inorganic Nanoparticles and parts thereof are immobilized. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül während der Abscheidung der Schicht aus dem leitenden Polymer in diese eingeschlossen wird.Method according to claim 3, characterized that the biomolecule while the deposition of the layer of conductive polymer included in this becomes. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül nach der Abscheidung der Schicht aus dem leitenden Polymer in diese eingeschlossen wird.Method according to claim 3, characterized that the biomolecule after deposition of the layer of conductive polymer included therein becomes. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül in einer Konzentration in einem Bereich von 0,001 ng/ml bis 100 mg/ml eingesetzt wird.Method according to claim 4 or 5, characterized that the biomolecule in a concentration ranging from 0.001 ng / ml to 100 mg / ml is used. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration in einem Bereich von 1 μg/ml bis 1 mg/ml liegt.Method according to Claim 6, characterized the concentration is in a range of 1 μg / ml to 1 mg / ml. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomer in einer Konzentration eingesetzt wird, die im Bereich von 0,01 bis 100 mmol/l liegt.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the monomer in a concentration is used, which is in the range of 0.01 to 100 mmol / l. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abscheidung und der Einschluss des Biomoleküls bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durchgeführt wird.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the deposition and the inclusion of the biomolecule is carried out at a pH of 6 to 8. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Gegenwart eines organischen oder anorganischen Leitsalzes in einer Konzentration von 0,01 bis 1000 mmol/l abgeschieden wird.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that in the presence of an organic or inorganic conductive salt in a concentration of 0.01 to 1000 mmol / l is deposited. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Leitsalz Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Lithiumchlorid, Toluol-4-sulfonat, Tetraethylammoniumtoluol-4-sulfonat, Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Natriumperchlorat und Poly(Natriumstyrolsulfonat) verwendet wird.Process according to Claim 10, characterized in that the conductive salt used is potassium chloride, sodium chloride, lithium chloride, toluene-4-sulphonate, tetraethylammonium toluene-4-sulphonate, hydrogenphosphate, Dihydrogen phosphate, sodium perchlorate and poly (sodium styrenesulfonate) is used. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die leitfähige Oberfläche eine Elektrode ist.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the conductive surface is an electrode. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Elektrode eine makroskopische oder miniaturisierte Elektrode verwendet wird.Method according to claim 12, characterized in that that as electrode a macroscopic or miniaturized electrode is used. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Schichten auf der leitfähigen Oberfläche abgeschieden werden.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that at least two layers are deposited on the conductive surface become. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in die abgeschiedene Schicht Additive hinzugegeben werden.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that in the deposited layer additives be added. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Additive Redoxmediatoren eingesetzt werden.Method according to claim 15, characterized in that that are used as additives redox mediators. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zu Redoxmediatoren Osmiumkomplexe, Vitamin K und Chinonderivate zählen.Method according to claim 16, characterized in that that to redox mediators osmium complexes, vitamin K and quinone derivatives counting. Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen, die die Bestandteile aufweist: – eine Einrichtung mit einer leitfähigen Oberfläche; – mindestens eine auf der leitfähigen Oberfläche nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 abgeschiedene Schicht aus dem leitenden Polymer mit dem in der leitenden Schicht eingeschlossenen Biomolekül; und – eine Messeinrichtung zum Nachweis des Biomoleküls.Device for the detection of biomolecules, the the ingredients have: - a facility with a conductive Surface; - at least one on the conductive one Surface after at least one of the claims 1 to 17 deposited layer of the conductive polymer with the biomolecule trapped in the conducting layer; and - a measuring device for the detection of the biomolecule. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Biosensor, ein Immunsensor oder ein Mikrosystem ist.Device according to claim 18, characterized in that that the device is a biosensor, an immune sensor or a microsystem is. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Messeinrichtung ein Fluoreszenzmikroskop, ein Fluoreszenzleser, ein Spektrograph, ein Photometer oder ein Bildscanner ist.Device according to claim 18 or 19, characterized that the measuring device is a fluorescence microscope, a fluorescence reader, a spectrograph, a photometer or an image scanner. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 20 für die Anwendung in der Biochemie einschließlich Bioanalytik und Biosensorik, Biotechnologie, medizinischen Diagnostik und klinischen Chemie.Device according to at least one of claims 18 to 20 for the application in biochemistry including bioanalytics and biosensors, Biotechnology, medical diagnostics and clinical chemistry.
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