DE10217597A1

DE10217597A1 - Electrochemical immobilization of biomolecules, useful e.g. for medical diagnosis, in layer of conductive polymer derived from coumarins

Info

Publication number: DE10217597A1
Application number: DE2002117597
Authority: DE
Inventors: Nenad Gajovic-Eichelmann
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2002-04-19
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2022-04-20
Also published as: DE10217597B4

Abstract

Electrochemical immobilization of biomolecules (I) on a conductive surface by forming, on the surface, at least one layer of a conductive polymer (II) and incorporating (I) into the polymer layer in aqueous solution. The new feature is that (II) is formed from a coumarin derivative (III). An Independent claim is also included for a device for detecting biomolecules comprising a device with a conductive surface; at least one layer of (II), with incorporated (I) on the surface, and a measuring system.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen. The present invention relates to a method for electrochemical immobilization of biomolecules according to the generic term of claim 1 and a device for detecting Biomolecules.

Die Immobilisierung von Biomolekülen an Oberflächen jeglicher Art spielen eine Schlüsselrolle in der medizinischen Diagnostik, klinischen Chemie, Bioanalytik, Biosensorik und der biochemischen Katalyse unter Verwendung von Enzymen. Verfahren zur kovalenten Kopplung an Oberflächen über reaktive funktionelle Gruppen auf dem Molekül und der Oberfläche (z. B. primäre oder sekundäre Amine, Carboxylat-, Thiol-, Hydroxyl-, Aldehyd- oder Epoxidgruppen) sind längst Stand der Technik (siehe hierzu beispielsweise Hermanson, Greg, T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, New York, 1996) und werden routinemäßig in Forschung und industrieller Produktion eingesetzt. Immobilization of biomolecules on any surface Kind play a key role in medical Diagnostics, clinical chemistry, bioanalytics, biosensors and the biochemical catalysis using enzymes. Procedure for covalent coupling to surfaces via reactive functional Groups on the molecule and the surface (e.g. primary or secondary amines, carboxylate, thiol, hydroxyl, aldehyde or Epoxy groups) have long been state of the art (see here for example Hermanson, Greg, T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, New York, 1996) and will routinely used in research and industrial production.

Allerdings weisen diese Techniken Nachteile und erhebliche Einschränkungen auf. Dazu gehören unspezifische Kopplungen, Niederschläge durch Unlöslichkeiten der Vernetzungsmittel, eine teilweise schwache Kopplungseffizienz in wässrigen Lösungen und vor allem die Unmöglichkeit, gezielt einige Bereiche von Oberflächen spezifisch zu modifizieren. So sind insbesondere für die spezifische Modifizierung leitfähiger Oberflächen, wie beispielsweise Elektroden, kovalente Kopplungsverfahren meist ungeeignet. However, these techniques have disadvantages and are significant Restrictions on. This includes unspecific couplings, Precipitation due to insolubility of the crosslinking agent, a partially poor coupling efficiency in aqueous solutions and especially the impossibility of targeting some areas of Modify surfaces specifically. So are especially for the specific modification of conductive surfaces, such as for example electrodes, covalent coupling methods mostly not suitable.

Leitende Polymere, die auch als Elektropolymere bezeichnet werden können, werden bereits seit den späten 70er Jahren beschrieben. Der Ausdruck "Elektropolymere" bezeichnet eine Gruppe elektroaktiver Polymere, die aus geeigneten Vorläuferlösungen durch Anlegen eines elektrischen Potentials und die dadurch ausgelöste Kettenreaktion (Oxidation der Monomere, Dimerisierung, Strangverlängerung, Ausfällung) an leitfähigen Oberflächen als dünne, hydrophobe, elektrisch leitende Filme abgeschieden werden. Man nennt diese Polymere auch "metallische Polymere". Beispiele dafür sind Polypyrrol-, Polyanilin- und Polyacetylenfilme, die jeweils aus organischen oder organisch/wässrigen Lösungen der Monomere an Elektroden abgeschieden werden. Conductive polymers, also known as electropolymers have been around since the late 1970s described. The term "electropolymer" refers to one Group of electroactive polymers made from suitable Forerunner solutions by applying an electrical potential and thereby triggered chain reaction (oxidation of the monomers, Dimerization, strand extension, precipitation) on conductive Surfaces as thin, hydrophobic, electrically conductive films be deposited. These polymers are also called "metallic Polymers ". Examples of these are polypyrrole, polyaniline and Polyacetylene films, each made from organic or organic / aqueous solutions of the monomers on electrodes be deposited.

Die Tatsache, dass diese Abscheidung ausschließlich an der leitenden Oberfläche, wie an der Elektrode, erfolgt, an die zuvor das benötigte Schwellenpotential angelegt wurde, wurde geeigneterweise zur örtlich begrenzten und selektiven Abscheidung biologischer Makromoleküle, wozu beispielsweise Enzyme, Antikörper, etc. gehören, die zuvor der Vorläuferlösung zugesetzt wurden, ausgenutzt. Beispiele dieser Technik sind, unter anderem für die Herstellung von Biosensoren, von Imisides, M. D. et al. in CHEMTECH, 1996, 26(5), Seiten 19-25; Palmisano, F. et al. Fresenius J. Anal Chem (2000) 366, Seiten 586-601 und Pividori, M. I., et al. Biosensors & Bioelectronics 15 (2000), Seiten 291-303 beschrieben worden. The fact that this deposition is solely on the conductive surface, as on the electrode, to the previously the required threshold potential was created suitably for localized and selective deposition biological macromolecules, for example enzymes, Antibodies, etc. belong to those previously added to the precursor solution have been exploited. Examples of this technique are, among others for the production of biosensors, by Imisides, M.D. et al. in CHEMTECH, 1996, 26 (5), pages 19-25; Palmisano, F. et al. Fresenius J. Anal Chem (2000) 366, pages 586-601 and Pividori, M.I., et al. Biosensors & Bioelectronics 15 (2000), pages 291-303.

Ein entscheidender Nachteil für die industrielle Nutzung aller herkömmlichen Methoden auf der Basis von Elektropolymeren besteht darin, dass die benötigte Vorläuferlösung, in der das Monomer und ein Leitsalz enthalten sind, z. B. 0,1 Mol Pyrrol in Acetonitril mit 0,05 Mol Triethylammoniumtoluol-4-sulfonat als Leitsalz) für empfindliche Biomoleküle meist denaturierend wirkt. Die Gründe dafür sind ein unphysiologischer pH-Wert, ein hoher Gehalt an organischem Lösungsmittel, eine hohe Salz- und Monomerkonzentration und die absolute Notwendigkeit, die Lösung zu desoxidieren, was typischerweise durch Belüften mit Stickstoffgas erfolgen kann. Darüber hinaus wirken das benötigte hohe Schwellenpotential, das in der Regel mehr als 0,7 V vs. Ag/AgCl beträgt und die stark hydrophobe Natur des entstehenden Polymers zusätzlich destabilisierend auf die Biomoleküle, was unweigerlich dazu führt, dass die Ausbeute an biologisch aktiven immobilisierten Biomolekülen sehr gering ist. A crucial disadvantage for the industrial use of everyone conventional methods based on electropolymer is that the required precursor solution in which the Monomer and a conductive salt are included, e.g. B. 0.1 mole of pyrrole in acetonitrile with 0.05 mol of triethylammonium toluene-4-sulfonate as a conductive salt) mostly denaturing for sensitive biomolecules acts. The reasons for this are an unphysiological pH high organic solvent content, high salt and Monomer concentration and the absolute need to find the solution to deoxidize, which is typically done with aeration Nitrogen gas can be done. In addition, the required effects high threshold potential, which is usually more than 0.7 V vs. Ag / AgCl and the strongly hydrophobic nature of the resulting Polymers additionally destabilizing what on the biomolecules inevitably leads to the yield of biological active immobilized biomolecules is very low.

Durch Einsatz von mit Pyrrol modifizierten Oligonukleotiden als Modellbiomoleküle konnten trotz der vorstehend beschriebenen Nachteile funktionierende Bioschichten hergestellt werden. Hierzu wird auf Livache et al., Nucleic Acid Res. 22, 1994, Seiten 2915 bis 2921 verwiesen. Es konnte gezeigt werden, dass komplementäre DNA-Sequenzen mit den in Polypyrrol immobilisierten Oligonukleotiden hybridisiert und diese Anordnung prinzipiell für die Herstellung von DNA-Chips geeignet war. Die Notwendigkeit, jedes einzelne zu immobilisierende Oligonukleotid mit einer Pyrrolgruppe zu versehen, ist allerdings ein erheblicher Nachteil dieses Verfahrens, so dass es für die serienmäßige Herstellung von DNA-Chips viel zu aufwendig ist. By using oligonucleotides modified with pyrrole as Model biomolecules could be used despite those described above Disadvantages functioning organic layers are produced. For this purpose, Livache et al., Nucleic Acid Res. 22, 1994, Pages 2915 to 2921. It could be shown that complementary DNA sequences with those in polypyrrole immobilized oligonucleotides hybridized and this arrangement was principally suitable for the production of DNA chips. The Need to use every single oligonucleotide to be immobilized to be provided with a pyrrole group is, however considerable disadvantage of this method, so that it for the serial production of DNA chips is far too complex.

Darauf aufbauend wurden von vielen Forschungsgruppen optimierte Polypyrrol-Immobilisierungsprotokolle für Enzyme entwickelt. Dabei wurden das anorganische Leitsalz, wie beispielsweise KCl, durch ein polymeres und amphiphiles Polyanion ersetzt, wie beispielsweise ein Polystyrolsulfonat mit einem Molekulargewicht von 70 kDa. Dabei konnten wässrige Vorläuferlösungen hergestellt werden, die für Enzyme nicht denaturierend wirkten und hochwertige Polypyrrolfilme lieferten. Für die technische Nutzung waren allerdings die Vorläuferlösungen aufgrund ihrer hohen Viskosität ungeeignet, was die unumgängliche Desoxidation der Lösung wegen einer Schaumbildung sehr erschwerte. Die Immobilisierungsausbeuten waren wegen der außerordentlichen Hydrophobie der Polypyrrolfilme für eine praktische Nutzung meist zu gering. Building on this, many research groups optimized them Polypyrrole immobilization protocols developed for enzymes. The inorganic conductive salt, such as KCl, replaced by a polymeric and amphiphilic polyanion, such as for example a polystyrene sulfonate with a molecular weight of 70 kDa. This allowed aqueous precursor solutions to be produced which did not have a denaturing effect on enzymes and high quality polypyrrole films. For technical use however, were the forerunners due to their high Unsuitable viscosity, which is the inevitable deoxidation of the Solution very difficult due to foam formation. The Immobilization yields were due to the exceptional hydrophobicity the polypyrrole films mostly for practical use low.

Es sind dann weitere Forschungsarbeiten durchgeführt worden, um die Hydrophobizität des Films herabzusetzen. Dazu wurden neue elektroaktive Monomere auf Pyrrol- oder Hydrochinonbasis synthetisiert, die aus rein wässrigen Vorläuferlösungen und bei niedrigeren Potentialen abgeschieden werden können. Allerdings konnte auch unter diesen Voraussetzungen kein technisch nutzbares Verfahren entwickelt werden. So waren die Vorläuferlösungen des hydrophilen Pyrrolmonomers hochviskos und konnten erst nach vorherigem Auftrocknen elektropolymerisiert werden, während beispielsweise das 2-Mercaptohydrochinon stark denaturierend wirkte und die Kopplungseffizienz extrem niedrig war. Further research has then been carried out to reduce the hydrophobicity of the film. In addition there were new ones electroactive monomers based on pyrrole or hydroquinone synthesized from pure aqueous precursor solutions and lower potentials can be deposited. Indeed could not do any technical under these conditions usable process can be developed. So were the forerunners of the hydrophilic pyrrole monomer highly viscous and could only prior drying are electropolymerized while for example, the 2-mercaptohydroquinone strongly denaturing worked and the coupling efficiency was extremely low.

Aufgrund der vorstehend genannten Einschränkungen und Unzulänglichkeiten wurde bisher keines der genannten Elektropolymerisationsverfahren für die industrielle Produktion von Sensoren, Immunosensoren oder analytischen Mikrosystemen eingesetzt. Trotz intensiver Forschung scheinen bisherige Verfahren der Elektropolymerisation nur für Nischenanwendungen geeignet zu sein. Insbesondere gibt es kein generell einsetzbares, einstufiges Verfahren, mit dem sich im industriellen Maßstab verschiedenartige, empfindliche Biomoleküle mit hoher örtlicher Auflösung an leitfähigen Oberflächen immobilisieren lassen. Due to the above limitations and So far, none of the shortcomings has been identified Electropolymerization process for the industrial production of sensors, Immunosensors or analytical microsystems are used. Despite intensive research, previous methods of Electropolymerization only suitable for niche applications his. In particular, there is no generally applicable one-step process that works on an industrial scale diverse, sensitive biomolecules with high local Allow resolution to be immobilized on conductive surfaces.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen, mit dem praktisch alle Biomoleküle mit hoher örtlicher Auflösung an leitfähigen Oberflächen immobilisiert werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass die Biomoleküle aufgrund von Umgebungsbedingungen während des Verfahrens denaturiert werden. Des Weiteren soll ein Verfahren angegeben werden, das, ggf. auch einstufig, empfindlichste Biopolymere mit hoher örtlicher Auflösung an leitfähigen Oberflächen immobilisiert, wobei die Desoxidation der Vorläuferlösung, die sich üblicherweise nachteilig auf die Immobilisationssausbeuten auswirkt, umgangen wird. It is an object of the present invention to provide a method for electrochemical immobilization of biomolecules for To provide with which practically all biomolecules with high immobilized on conductive surfaces can be without the risk that the Biomolecules due to environmental conditions during the process be denatured. A procedure is also to be specified are, the most sensitive biopolymers with high local resolution on conductive surfaces immobilized, causing the deoxidation of the precursor solution, which usually disadvantageous on the immobilization yields affects, is circumvented.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur elektrischen Immobilisierung von Biomolekülen an einer leitfähigen Oberfläche gemäß Patentanspruch 1 gelöst. The task is accomplished through a method of electrical Immobilization of biomolecules on a conductive surface according to Claim 1 solved.

Die Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. The subclaims define preferred embodiments of the inventive method.

Die Aufgabe wird ebenfalls mit einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 20 gelöst. The task is also accomplished with a device Claim 20 solved.

Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung. The subclaims relate to preferred embodiments of the device according to the invention.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Immobilisierung von Biomolekülen an einer leitfähigen Oberfläche durch Abscheiden mindestens einer Schicht aus einem leitenden Polymer auf der leitfähigen Oberfläche und Einschluss des Biomoleküls in die Polymerschicht in einer wässrigen Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, das als Monomer für die Bildung der Schicht aus dem leitenden Polymer ein Cumarinderivat verwendet wird. The invention relates to a method for electrochemical Immobilization of biomolecules on a conductive surface by depositing at least one layer from a conductive Polymer on the conductive surface and inclusion of the Biomolecule in the polymer layer in an aqueous solution is characterized as the monomer for the formation of the Layer of the conductive polymer uses a coumarin derivative becomes.

Die Figuren dienen zur Erläuterung der Erfindung. The figures serve to explain the invention.

Fig. 1 zeigt die Kontaktwinkelmessung einer Polymerschicht, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurde. Fig. 1 shows the contact angle measurement of a polymer layer, which the method according to the invention was prepared in accordance with a preferred embodiment.

Fig. 2 zeigt die schematische Darstellung einer Interdigitalelektrode aus Beispiel 1 nach erfolgter Hybridisierung. Fig. 2 shows the schematic representation of an interdigital electrode of Example 1 after hybridisation.

Erfindungsgemäß wird die leitfähige Oberfläche von einer dünnen Schicht bzw. einem Film des aus dem Cumarinderivat entstehenden leitenden Polymers vollständig bedeckt, wobei das Biomolekül in der Matrix der entstandenen dünnen Schicht eingebettet vorliegt. Normalerweise liegt die Dicke der auf der leitfähigen Oberfläche ausgebildeten Polymerschicht in einem Bereich von 50 bis 1000 nm, wobei ein Bereich von 200 bis 1000 nm bevorzugt ist. According to the invention, the conductive surface is thin Layer or a film of the resulting from the coumarin derivative conductive polymer completely covered, the biomolecule in embedded in the matrix of the resulting thin layer is present. Usually the thickness is on the conductive Surface formed polymer layer in a range of 50 to 1000 nm, with a range of 200 to 1000 nm preferred is.

Im Zuge der Abscheidung wird das Biomolekül chemisch fest mit der leitfähigen Oberfläche verbunden und damit immobilisiert, so dass es für weitere Reaktionen eingesetzt werden kann oder zum Aufbau komplexer Strukturen genutzt werden kann. Hierzu gehören beispielsweise chemische Modifikationen, Ligand-Rezeptor- Bindungen, DNA-Hybridisierungen, DNA-Ligationen und Biosensorschichten. In the course of the deposition, the biomolecule becomes chemically solid connected to the conductive surface and thus immobilized, so that it can be used for further reactions or can be used to build complex structures. For this include chemical modifications, ligand receptor Binding, DNA Hybridizations, DNA Ligations and Biosensorschichten.

Überraschenderweise konnte erfindungsgemäß festgestellt werden, dass die Cumarinderivate nach chemischer oder elektrochemischer Oxidation wohldefinierte, in wässriger und organischer Lösung stabile elektrisch leitfähige Filme bzw. Schichten mit einheitlicher Dicke von etwa einem µm bilden. Surprisingly, it was found according to the invention that that the coumarin derivatives are chemical or electrochemical Oxidation well-defined, in aqueous and organic solution stable electrically conductive films or layers with form uniform thickness of about one micron.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Monomere in der Vorläuferlösung verwendeten Cumarinderivate können solche sein, die die Strukturformel I aufweisen:

worin R₁ bis R₆ voneinander unabhängig ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aminogruppe oder eine -COOH-Gruppe bedeuten. The coumarin derivatives used as monomers in the precursor solution in the process according to the invention can be those which have the structural formula I:

wherein R ₁ to R ₆ independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group with 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group with 1 to 6 carbon atoms, an amino group or a -COOH group.

Cumarine sind Naturstoffe, die in mehr als sechzig Pflanzenarten gefunden werden und bisher eine technische Verwendung als pharmakologische Wirkstoffe, Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe und als Vorstufen in der chemischen Synthese gefunden haben. Coumarins are natural products found in over sixty Plant species can be found and so far a technical use as pharmacological agents, dyes, fluorescent dyes and found them as precursors in chemical synthesis.

Bevorzugt eingesetzte Cumarinderivate sind solche Verbindungen, in denen mindestens eine der R₁ bis R₆-Gruppen in der Strukturformel I eine Hydroxylgruppe darstellt. Ganz besonders bevorzugt eingesetzte Cumarinderivate sind das Umbelliferon, worin R₁ bis R₄ und R₆ in der Strukturformel I Wasserstoffatome und R₅ eine Hydroxylgruppe bedeuten und das Scopoletin, worin R₁ bis R₃ und R₆ in der Strukturformel I Wasserstoffatome, R₄ eine -OCH3- Gruppe und R₅ eine Hydroxylgruppe bedeuten. Coumarin derivatives used with preference are those compounds in which at least one of the R ₁ to R ₆ groups in structural formula I represents a hydroxyl group. Coumarin derivatives used with very particular preference are the umbelliferone, in which R ₁ to R ₄ and R ₆ in the structural formula I are hydrogen atoms and R _{5 is} a hydroxyl group and the scopoletin in which R ₁ to R ₃ and R ₆ in the structural formula I are hydrogen atoms, R ₄ an -OCH3- group and R _{5 is} a hydroxyl group.

Es hat sich herausgestellt, dass die Cumarinderivate Umbelliferon und Scopoletin, die jeweils mindestens eine Hydroxylgruppe tragen, besonders geeignet für die schonende Immobilisierung von Biomolekülen sind, da durch den Überschuss an Hydroxylgruppen im Polymerfilm eine hydrophile Matrix entsteht, die sich wesentlich von den extrem hydrophoben herkömmlichen Elektropolymeren unterscheidet und eine biokompatible, d. h. nicht denaturierende Umgebung für die Biomoleküle darstellt. It has been found that the coumarin derivatives Umbelliferone and scopoletin, each having at least one hydroxyl group wear, particularly suitable for gentle immobilization of biomolecules are due to the excess Hydroxyl groups in the polymer film a hydrophilic matrix is formed significantly different from the extremely hydrophobic conventional ones Distinguishes electropolymer and a biocompatible, i.e. H. Not represents denaturing environment for the biomolecules.

Die starke Hydrophilizität der Matrix ist anhand der Messung eines Kontaktwinkels zwischen dem Elektropolymerfilm auf der leitfähigen Oberfläche und der Oberfläche eines darauf abgeschiedenen Wassertropfens gemessen worden. Hierzu wird auf Fig. 1 verwiesen. In Fig. 1 wird eine Elektrodenoberfläche 3 gezeigt, die mit einem Scopoletin-Polymerfilm 2 bedeckt ist. Darauf ist ein Wassertropfen 1 abgeschieden worden. Man erkennt aus dem Kontaktwinkel von 10° (+/-1°), dass der Polymerfilm eine stark hydrophile Oberfläche produziert hat. Das Scopoletin (7-Hydroxymethoxycumarin) ist ein als Monomer blaugrün fluoreszierender Naturstoff, der allerdings nicht in polymerisierter Form fluoresziert und je nach Schichtdicke eine Farbe zwischen goldbraun und schwarz aufweist. The strong hydrophilicity of the matrix was measured by measuring a contact angle between the electropolymer film on the conductive surface and the surface of a drop of water deposited thereon. For this purpose, reference is made to FIG. 1. In Fig. 1 an electrode surface 3 is shown, which is covered with a polymer film 2 scopoletin. A drop of water 1 has been deposited on it. It can be seen from the contact angle of 10 ° (+/- 1 °) that the polymer film has produced a highly hydrophilic surface. Scopoletin (7-hydroxymethoxycoumarin) is a blue-green fluorescent natural substance, but it does not fluoresce in polymerized form and, depending on the layer thickness, has a color between golden brown and black.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle Biomoleküle immobilisiert werden, selbst solche, die hochempfindlich sind und schnell degradiert werden können. Eine Auswahl für Biomoleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden können, umfasst Antikörper, Antigene, Peptide, Proteine, Enzyme, Nukleinsäuren, Zellen pflanzlicher, tierischer und humaner Herkunft, Hormone, organische Nanopartikel, anorganische Nanopartikel sowie Teile davon. With the method according to the invention, all biomolecules can immobilized, even those that are highly sensitive and can be degraded quickly. A selection for biomolecules, which are immobilized with the method according to the invention may include antibodies, antigens, peptides, proteins, Enzymes, nucleic acids, cells of plant, animal and human Origin, hormones, organic nanoparticles, inorganic Nanoparticles and parts thereof.

Nanopartikel sind in der Regel synthetische Partikel, die extrem klein sind. Normalerweise liegt ihre Größe in einem Bereich von 20 nm bis 2 µm. Sie können aus organischen oder anorganischen Materialien hergestellt sein. Zu organischen Materialien zählen beispielsweise Polystyrol und zu anorganischen Materialien das Silikat. Die Oberfläche und das Volumen der Nanopartikel können durch bestimmte Verfahren chemisch modifiziert werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise die Volumenmodifikation durch Einlagerung von magnetischen Partikeln oder fluoreszierenden Farbstoffen. Des Weiteren ist es auch möglich, die Oberfläche der Nanopartikel chemisch mit koppelbaren Gruppen, wie beispielsweise Carboxyl- und Aminogruppen, zu modifizieren. Nanopartikel können insbesondere zum Aufbau biochemischer Assays eingesetzt werden. Nanoparticles are usually synthetic particles that are extremely small. Usually their size is one Range from 20 nm to 2 µm. You can choose from organic or be made of inorganic materials. Too organic Materials include, for example, polystyrene and inorganic Materials the silicate. The surface and volume of the Nanoparticles can be chemically modified by certain methods become. These methods include, for example Volume modification by embedding magnetic particles or fluorescent dyes. Furthermore, it is also possible the surface of the nanoparticles can be chemically coupled Groups such as carboxyl and amino groups modify. Nanoparticles can be used especially for building biochemical assays are used.

Die Biomoleküle werden in die Matrix der entstandenen dünnen Polymerschicht eingebettet und damit effektiv immobilisiert und für weitere Reaktionen zugänglich gemacht. The biomolecules are made into the matrix of the thin ones Polymer layer embedded and thus effectively immobilized and made available for further reactions.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich einstufig wie auch mehrstufig durchführen. Im einstufigen Verfahren erfolgt die Immobilisierung durch Abscheidung einer Vorläuferlösung, die das Cumarinderivat-Monomer und das Biomolekül enthält. Somit wird das Biomolekül während der Abscheidung der Schicht aus dem leitenden Polymer in diese eingeschlossen. The method according to the invention can also be carried out in one stage carry out in several stages. The takes place in a one-step process Immobilization by deposition of a precursor solution, the contains the coumarin derivative monomer and the biomolecule. Consequently the biomolecule is deposited during the deposition of the layer conductive polymer enclosed in this.

Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zweistufig durchgeführt werden. In diesem Fall enthält die Vorläuferlösung das Cumarinderivat-Monomer und eine weitere Substanz, die eine Affinität zum Biomolekül aufweist. Aus dieser Vorläuferlösung wird eine Schicht aus dem leitfähigen Cumarinderivat-Polymer mit der Substanz darin hergestellt. Nach der Abscheidung wird das Biomolekül, das ggf. modifiziert ist, um eine Affinität zur vorgenannten Substanz herzustellen, hinzugegeben und in geeigneter Weise mit dem leitfähigen Polymer inkubiert. Als ein geeignetes System kann an dieser Stelle das Affinitätspaar Streptavidin/Biotin genannt werden. Somit erfolgt in diesem zweistufigen Verfahren ein Einschluss des Biomoleküls in die Schicht aus dem leitfähigen Polymer erst nach der Abscheidung der Schicht aus dem leitenden Polymer. Alternatively, the method according to the invention can also have two stages be performed. In this case, the precursor solution contains the coumarin derivative monomer and another substance which is a Has affinity for the biomolecule. From this predecessor solution becomes a layer of the conductive coumarin derivative polymer with the substance made in it. After the deposition the biomolecule, which may be modified to have an affinity for to produce the aforementioned substance, added and in suitably incubated with the conductive polymer. As a A suitable system can be the affinity pair at this point Streptavidin / Biotin can be called. So this takes place in this two-step process an inclusion of the biomolecule in the layer from the conductive polymer only after the deposition of the Layer of the conductive polymer.

Die Konzentrationen des Biomoleküls sowie des Monomers können innerhalb relativ großer Bereiche variieren. Die entsprechende Auswahl des richtigen Konzentrationsbereichs hängt in der Regel davon ab, welches Molekül für welche Anwendung eingesetzt wird. The concentrations of the biomolecule and the monomer can vary within relatively large ranges. The corresponding Choosing the right concentration range usually depends depends on which molecule is used for which application.

Normalerweise liegt die Konzentration des Biomoleküls in einem Bereich von 0,001 ng/ml bis 100 mg/ml. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt zwischen 1 µg/ml bis 1 mg/ml. Usually the concentration of the biomolecule is in one Range from 0.001 ng / ml to 100 mg / ml. A preferred one Concentration range is between 1 µg / ml to 1 mg / ml.

In der Regel wird das Monomer in einer Konzentration eingesetzt, die in einem Bereich von 0,01 bis 100 mMol/l liegt. Bevorzugt ist ein Bereich von 0,1 bis 10 mMol/l, wobei ein 1 mMol/l insbesondere bevorzugt ist. As a rule, the monomer is in a concentration used, which is in a range of 0.01 to 100 mmol / l. A range from 0.1 to 10 mmol / l is preferred, with a 1 mmol / l is particularly preferred.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die leitfähigen Schichten mit hoher Gleichmäßigkeit aus nicht desoxidierten, verdünnten wässrigen Lösungen des Monomers bei annähernd neutralem pH-Wert abgeschieden werden können. In der Praxis hat sich erwiesen, dass die Abscheidung unter Einschluss des Biopolymers bei einem pH- Wert von 6 bis 8 erfolgen kann. Another significant advantage of the invention The method is that the conductive layers with high Uniformity from non-deoxidized, dilute aqueous Solutions of the monomer at approximately neutral pH can be separated. In practice it has been shown that the deposition including the biopolymer at a pH Value from 6 to 8 can be made.

Des weiteren hat sich bei der Auswahl von entsprechenden organischen oder anorganischen Leitsalzen herausgestellt, dass im erfindungsgemäßen Verfahren die Abscheidung mit einfachen anorganischen Salzen durchgeführt werden kann. Beispiele für anorganische Leitsalze sind Salze von Alkali- und Erdalkalimetallen. Spezielle Beispiele für geeignete Leitsalze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid, Toluol-4-sulfonat, Tetraethylammoniumtoluol-4-sulfonat, Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Natriumperchlorat und Poly(Natriumstyrolsulfonat). Bevorzugt wird als Leitsalz Kaliumchlorid eingesetzt. Die Konzentration des Leitsalzes in der Vorläuferlösung liegt in der Regel in einem Bereich von 0,01 mMol/l bis 1000 mMol/l. Ein bevorzugter Bereich liegt zwischen 1,0 und 100 mMol/l. Furthermore, when choosing appropriate organic or inorganic conductive salts pointed out that in the inventive method the deposition with simple inorganic salts can be carried out. examples for inorganic conductive salts are salts of alkali and Alkaline earth metals. Specific examples of suitable conductive salts are Sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, toluene-4-sulfonate, Tetraethylammonium toluene-4-sulfonate, hydrogen phosphate, Dihydrogen phosphate, sodium perchlorate and poly (sodium styrene sulfonate). Potassium chloride is preferably used as the conductive salt. The The concentration of the conductive salt in the precursor solution is in the Usually in a range from 0.01 mmol / l to 1000 mmol / l. On preferred range is between 1.0 and 100 mmol / l.

Die bei der Abscheidung der Schicht verwendete Vorläuferlösung weist somit auch erhebliche Vorteile bezüglich der Umweltbilanz auf. So werden keine organischen Lösungsmittel und keine toxischen Substanzen verwendet. Die Kosten zur Herstellung der Vorläuferlösung sind absolut gering. Des weiteren zeichnet sich die Vorläuferlösung durch eine starke Biokompatibilität, d. h. eine starke Eignung für empfindliche Polymere, aus. Gegenüber den hydrophoben Pyrrolderivaten des Standes der Technik weisen die Cumarinderivat-Vorläuferlösungen eine deutlich geringere Viskosität auf und lassen sich bei niedrigeren Potentialen elektropolymerisieren. The precursor solution used in the deposition of the layer thus also has significant advantages in terms of environmental performance on. So no organic solvents and none toxic substances used. The cost of making the Forerunners are absolutely minimal. Furthermore stands out the precursor solution through strong biocompatibility, d. H. a strong suitability for sensitive polymers. Across from the hydrophobic pyrrole derivatives of the prior art the coumarin derivative precursor solutions a significantly lower one Viscosity and can be at lower potentials electropolymerize.

Die Spannung bei der Elektropolymerisation hängt in der Regel von den verwendeten leitfähigen Oberflächen und deren Anordnung ab. Man kann davon ausgehen, dass Potentiale ab 0,20 V bis 1,0 V vs. Ag/AgCl geeignet sind. Ein typischer Bereich liegt bei 0,5 bis 0,7 V vs. Ag/AgCl. The voltage in electropolymerization usually depends of the conductive surfaces used and their arrangement from. It can be assumed that potentials from 0.20 V to 1.0 V vs. Ag / AgCl are suitable. A typical range is included 0.5 to 0.7 V vs. Ag / AgCl.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich empfindliche Biomoleküle, wie beispielsweise Enzyme, Proteine, Nukleinsäuren, aus gepufferten oder ungepufferten wässrigen Lösungen in einer einstufigen Reaktion an leitfähigen Oberflächen abscheiden. Eine derartige Immobilisierungreaktion lässt sich beispielsweise mit einer Vorläuferlösung vornehmen, die 1 mMol/l Scopoletin, 1 mg/ml Protein und 0,05 Mol/l KCl enthält, bei einem pH-Wert von 7 durchführen. In a preferred embodiment of the invention Process sensitive biomolecules, such as for example enzymes, proteins, nucleic acids, from buffered or unbuffered aqueous solutions in a one-step reaction deposit conductive surfaces. Such Immobilization reaction can, for example, with a Make precursor solution containing 1 mmol / l scopoletin, 1 mg / ml protein and Contains 0.05 mol / l KCl at a pH of 7.

Ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, insbesondere im Hinblick auf die technische Nutzung, die extrem lange Lagerstabilität der gebrauchsfertigen Vorläuferlösungen. So können aktive Bioschichten mit drei Monate alten, bei 4°C gelagerten Starterlösungen bzw. Vorläuferlösungen hergestellt werden. Another decisive advantage of the invention Process is, especially with regard to the technical Use the extremely long shelf life of the ready-to-use Precursor solutions. So active bio-layers with three Months old starter solutions stored at 4 ° C or Precursor solutions are made.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die elektrochemische Immobilisierung von Biomolekülen an Elektroden vorgenommen. Besondere Bedeutung erlangt das Verfahren unter Verwendung makroskopischer oder miniaturisierter Elektroden, die aus Metallen, Halbleitermetallen, Indium-Zinn-Oxid, Kohlenstoff oder leitfähigen Polymeren bestehen. Insbesondere werden diese Elektroden dazu eingesetzt, Biosensoren, Immunsensoren und analytische Mikrosysteme mit Abmessungen von weniger als 1 µm bis zu mehreren Zentimetern herzustellen. An diesen Elektroden kann die erfindungsgemäße wässrige Vorläuferlösung bei einem neutralen pH-Wert unter Bildung einer stark hydrophilen Biomolekülschicht stattfinden. Damit sind erstmals Bedingungen bei der Elektropolymerisation vorgegeben, die zur absolut schonenden Einbettung empfindlicher Biomoleküle geeignet sind. In a further preferred embodiment of the The inventive method is the electrochemical immobilization of Biomolecules made on electrodes. Special meaning obtains the procedure using macroscopic or miniaturized electrodes made of metals, semiconductor metals, Indium tin oxide, carbon or conductive polymers consist. In particular, these electrodes are used to Biosensors, immune sensors and analytical microsystems with Dimensions from less than 1 µm to several centimeters manufacture. The inventive electrode can be attached to these electrodes aqueous precursor solution at a neutral pH with formation a highly hydrophilic biomolecule layer. In order to are conditions for electropolymerization for the first time predefined that are more sensitive for absolutely gentle embedding Biomolecules are suitable.

Je nach Anwendungszweck wird auf der leitfähigen Oberfläche mehr als eine Schicht aufgetragen. So können mindestens zwei Schichten auf der leitfähigen Oberfläche abgeschieden werden. Depending on the application, is on the conductive surface applied more than one layer. So at least two Layers are deposited on the conductive surface.

Es ist möglich und in vielen Fällen auch äußerst praktikabel, in die Vorläuferlösung weitere Additive einzugeben, um auf diese Weise der ausgebildeten Biomolekülschicht weitere Funktionalitäten zu verleihen. Dazu gehört beispielsweise eine Verbesserung des Elektronentransports innerhalb der Schicht. Diese kann beispielsweise durch Zusatz von Redoxmediatoren, wie Osmiumkomplexen, Vitamin K, Chinonderivaten etc. erfolgen. Auch in diesem Fall ist es, wie ausgeführt, möglich, das Additiv gleichzeitig mit der Abscheidung zu verwenden. Alternativ kann es auch erst danach hinzugefügt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das Cumarinderivat mit der Strukturformel I noch vor der Abscheidung entsprechend chemisch zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform lässt sich eine von äußerer Reagenzzufuhr unabhängige Enzymelektrode für einen Biosensor herstellen, wenn in der auf der Elektrode nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgeschiedenen Schicht ein Redoxenzym und ein Redoxmediator enthalten sind. It is possible and in many cases extremely practical, add further additives to the precursor solution in order to this way the developed biomolecule layer further To provide functionalities. This includes, for example Improvement of the electron transport within the layer. This can for example by adding redox mediators, such as Osmium complexes, vitamin K, quinone derivatives etc. take place. Also in In this case, as stated, the additive is possible to be used simultaneously with the deposition. Alternatively, it can only be added afterwards. One more way consists of the coumarin derivative with structural formula I. to be modified chemically before deposition. In a preferred embodiment, one can be from the outside Independent enzyme electrode for a biosensor produce if in the on the electrode after the deposited layer a redox enzyme and a Redox mediator are included.

Das erfindungsgemäße Immobilisationsverfahren stellt ein effizientes und ohne spezielle Optimierung breit einsetzbares Verfahren zur Abscheidung und dauerhaften Immobilisierung von empfindlichen Biomolekülen an leitfähigen Oberflächen zur Verfügung. Die unmittelbar nach der Elektropolymerisation vorhandene elektrische Leitfähigkeit der Polymerschicht geht zwar mit der Zeit und auch durch Umgebungsbedingungen, wie Lagertemperatur, Feuchtigkeit etc., verloren, was allerdings nicht die Funktion der abgeschiedenen Schicht aus Biomolekül/Polymer beeinflusst. The immobilization method according to the invention stops efficient and widely applicable without special optimization Process for the separation and permanent immobilization of sensitive biomolecules on conductive surfaces Available. The one immediately after electropolymerization electrical conductivity of the polymer layer goes with the Time and also due to environmental conditions such as storage temperature, Moisture etc., lost, but this is not the function of the deposited biomolecule / polymer layer.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ohne weiteres insbesondere für die Beschichtung von miniaturisierten Elektrodenstrukturen im Submikrometerbereich geeignet. Es hat sich herausgestellt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Seite einer Interdigitalelektrode mit einer Fingerbreite von 2 µm bei 4 µm Elektrodenabstand ohne Übersprechen mit Streptavidin und einem Cumarinderivatpolymer beschichtet werden konnte. The method according to the invention is particularly simple for coating miniaturized electrode structures suitable in the submicrometer range. It turned out that with the inventive method one side of a Interdigital electrode with a finger width of 2 µm at 4 µm Electrode gap without crosstalk with streptavidin and one Coumarin derivative polymer could be coated.

Des weiteren ist hervorzuheben, dass die für die Elektroimmobilisierung verwendete Vorläuferlösung außerordentlich lagerstabil ist und mindestens zwei Monate aufbewahrt werden kann. Dieses ist ein deutlicher Fortschritt gegenüber den Lösungen, die in den herkömmlichen Elektroimmobilisierungsverfahren angewendet werden, so dass das erfindungsgemäße Verfahren für die Serienproduktion besonders geeignet ist. It should also be emphasized that the for the Electric immobilization used precursor solution extremely is stable in storage and can be stored for at least two months. This is a significant advance over the solutions that in conventional electro-immobilization processes are applied, so that the inventive method for the Series production is particularly suitable.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere dafür einsetzbar, eine Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen. Eine derartige Vorrichtung zum Nachweis von Biomolekülen weist folgende Bestandteile auf:

- eine Einrichtung mit einer leitfähigen Oberfläche;
- mindestens eine auf dieser leitfähigen Oberfläche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgeschiedene Schicht aus dem leitenden Polymer mit dem in der leitenden Schicht eingeschlossenen Biomolekül; und
- eine Messeinrichtung zum Nachweis des Biomoleküls.

The method according to the invention can be used in particular to provide a device for the detection of biomolecules. Such a device for the detection of biomolecules has the following components:

- A device with a conductive surface;
- At least one layer of the conductive polymer with the biomolecule enclosed in the conductive layer deposited on this conductive surface by the method according to the invention; and
- A measuring device for the detection of the biomolecule.

Bezüglich der leitfähigen Oberflächen und der Zusammensetzung der abgeschiedenen Schicht bzw. Schichten wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Regarding the conductive surfaces and the composition the deposited layer or layers is on the referenced previous statements.

Die Messeinrichtung zum Nachweis des Biomoleküls kann beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop, ein Fluoreszenzleser, ein Spektrograph, ein Photometer oder ein Bildscanner sein. Es kann allerdings auch jedes andere elektrische, optische oder magnetische Messgerät für den Nachweis verwendet werden. Voraussetzung ist allerdings, dass die Wechselwirkung des immobilisierten Biomoleküls mit einem dazu affinen Gegenmolekül erkannt und nachgewiesen wird. The measuring device for the detection of the biomolecule can for example a fluorescence microscope, a fluorescence reader Spectrograph, a photometer or an image scanner. It can but also any other electrical, optical or magnetic measuring device can be used for detection. The prerequisite, however, is that the interaction of the immobilized biomolecule with an affine counter molecule recognized and is proven.

Die Vorrichtung ist insbesondere für die Anwendung in der Biochemie, Bioanalytik und Biosensorik, Biotechnologie, in der medizinischen Diagnostik und in der klinischen Chemie einsetzbar. The device is particularly suitable for use in the Biochemistry, Bioanalytics and Biosensors, Biotechnology, in the medical diagnostics and can be used in clinical chemistry.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung. The following examples serve to explain the inventive method or the inventive device.

Examples example 1 Directional immobilization of biotinylated oligonucleotides on streptavidin-modified electrodes to produce a DNA sensor

In einem zweistufigen Prozess wird zunächst eine Elektrode mit einer Schicht aus dem leitenden Scopoletinpolymer und Streptavidin beschichtet; in einem zweiten Schritt werden biotinylierte Oligonukleotide an der Elektrode fixiert. In a two-stage process, an electrode is first used a layer of the conductive scopoletin polymer and Streptavidin coated; in a second step biotinylated oligonucleotides fixed to the electrode.

1. Schritt: Abscheidung von Scopoletinpolymer und Streptavidin an einer miniaturisierten Gold-Interdigitalelektrode (IDE). 1st step: separation of scopoletin polymer and streptavidin on a miniaturized gold interdigital electrode (IDE).

Zur Herstellung der Vorläuferlösung werden in destilliertem Wasser KCl in einer Konzentration von 0,05 Mol gelöst und der pH-Wert auf pH 7 eingestellt. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 1 mMol/l sowie Streptavidin (p. a., Gerbu, Gaiberg) werden darin in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. To prepare the precursor solution are distilled Water KCl dissolved in a concentration of 0.05 mol and the pH adjusted to pH 7. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Switzerland) in a concentration of 1 mmol / l and streptavidin (p. a., Gerbu, Gaiberg) are contained in a concentration of 1 mg / ml dissolved.

Eine ungerührte elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung aus einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, einer Pt- Gegenelektrode und einer miniaturisierten Gold-IDE ("Neurochip" von FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE mit 2 µm Elektrodenabstand und 1 µm Fingerbreite), die von einem handelsüblichen Potentiostaten (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) auf dem konstanten Potential gehalten wird, wird als Elektrolysezelle verwendet. An unmoved electrochemical cell with one Three-electrode arrangement consisting of an Ag / AgCl reference electrode, a Pt Counter electrode and a miniaturized gold IDE ("Neurochip" from FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE with 2 µm electrode spacing and 1 µm finger width), that of a commercially available Potentiostats (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) on the is kept constant potential is called an electrolytic cell used.

Die Abscheidung erfolgt durch Eintauchen der Elektroden in die nicht desoxidierte Vorläuferlösung und Anlegen eines konstanten Potentials von 0,5 V vs./Ag/AgCl für 3 Minuten. Die beschichtete IDE wird mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft für 1 Stunde getrocknet. The deposition takes place by immersing the electrodes in the not deoxidized precursor solution and applying a constant Potentials of 0.5 V vs./Ag/AgCl for 3 minutes. The coated IDE is washed with distilled water and air dried for 1 hour.

2. Schritt: Aufbringen eines biotinylierten Oligonukleotids auf die modifizierte Elektrode. 2nd step: application of a biotinylated oligonucleotide the modified electrode.

Ein 5'-Biotin-markiertes 13-meres Oligomer 1 (Biotez, Berlin) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,4, 50 mMol/l Phosphat) in einer Konzentration von 0,05 mMol/l aufgenommen. 20 µl dieser Lösung werden auf die modifizierte Elektrode gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Elektrode wird 5 Minuten in destilliertes Wasser gelegt, um nicht fest gebundene Oligos abzuwaschen. A 5'-biotin-labeled 13-mer oligomer 1 (Biotez, Berlin) was in phosphate buffer (pH 7.4, 50 mmol / l phosphate) in a Concentration of 0.05 mmol / l added. 20 µl of this solution are placed on the modified electrode and for 30 Incubated for minutes at room temperature. The electrode is 5 minutes placed in distilled water to make non-tightly bound oligos wash away.

3. Schritt: Wie 1., aber nun wird die zweite Hälfte der IDE schichtet. 3rd step: Like 1st, but now the second half of the IDE coated.

4. Schritt: Wie 2., aber die zweite Hälfte der IDE wird mit einem 13-mer Oligonukleotid 2 beschichtet, das sich um genau eine Base vom ersten Oligonukleotid unterscheidet. Step 4: Same as 2nd, but the second half of the IDE is included a 13-mer oligonucleotide 2, which is exactly one Base differs from the first oligonucleotide.

5. Schritt: Hybridisierung mit einem komplementären Fluoreszein-markierten 17-meren Oligonukleotid 3 als Funktionsnachweis. 5th step: hybridization with a complementary Fluorescein-labeled 17-mer oligonucleotide 3 as Functional verification.

Ein zum immobilisierten Oligonukleotid 1 100%-ig komplementäres, am 5'-Ende Fluoreszein-markiertes DNA-Oligonukleotid wird in einer Konzentration von 100 µMol auf die Elektrode gegeben. Nach 30 Minuten Hybridisierungsdauer wird die Elektrode mit destilliertem Wasser gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DMR mit Fluoreszenz-Filtersatz 490 nm/510 nm, Jena) inspiziert. Die mit dem zu 100% komplementären Oligo (full match) beschichtete Seite 1 zeigt eine Helligkeit von 91%, während die mit dem in einer Base abweichenden Oligo beschichtete Elektrode 2 sichtbar dunkler erscheint (Helligkeitswert 45%), siehe Fig. 2. A DNA oligonucleotide which is 100% complementary to the immobilized oligonucleotide 1 and is fluorescein-labeled at the 5 'end is added to the electrode in a concentration of 100 μmol. After a hybridization period of 30 minutes, the electrode is washed with distilled water and inspected under a fluorescence microscope (Leica DMR with fluorescence filter set 490 nm / 510 nm, Jena). The side 1 coated with the 100% complementary oligo (full match) shows a brightness of 91%, while the electrode 2 coated with the oligo differing in a base appears visibly darker (brightness value 45%), see FIG. 2.

Example 2 Immobilization of a redox enzyme on a platinum electrode

In einem einstufigen Prozess wird Pyruvatoxidase als Beispiel eines empfindlichen Enzyms an einer Platinelektrode mittels Scopoletinpolymer immobilisiert. In a one-step process, pyruvate oxidase is used as an example of a sensitive enzyme on a platinum electrode Immobilized scopoletin polymer.

Zur Herstellung einer Vorläuferlösung werden in Phosphatpuffer, pH 7,4 (0,05 Mol/l Phosphat) Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 2 mMol/l, Pyruvatoxidase (6 U/mg, Toyobo Enzymes, Kyoto, Japan) in einer Konzentration von 2 mg/ml sowie Thiaminpyrophosphat (95%, Sigma, USA) in einer Konzentration von 0,2 mMol/l, MgCl₂ in einer Konzentration von 2 mMol/l und Fluorescein-Adenindinukleotid (FAD, > 90%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 10 µMol gelöst. To prepare a precursor solution, in phosphate buffer, pH 7.4 (0.05 mol / l phosphate) scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Switzerland) in a concentration of 2 mmol / l, pyruvate oxidase (6 U / mg, Toyobo Enzymes, Kyoto, Japan) in a concentration of 2 mg / ml and thiamine pyrophosphate (95%, Sigma, USA) in a concentration of 0.2 mmol / l, MgCl ₂ in a concentration of 2 mmol / l and fluorescein adenine dinucleotide ( FAD,> 90%, Fluka, Buchs, Switzerland) in a concentration of 10 µmol.

Eine ungerührte elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung aus einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, einer Pt- Gegenelektrode und einer Pt-Arbeitselektrode (Durchmesser 2 mm), die von einem handelsüblichen Potentiostaten (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) auf dem konstanten Potential gehalten wird, wird als Elektrolysezelle verwendet. An unmoved electrochemical cell with one Three-electrode arrangement consisting of an Ag / AgCl reference electrode, a Pt Counter electrode and a Pt working electrode (diameter 2 mm), from a commercially available potentiostat (CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) at the constant potential is used as an electrolytic cell.

Die Abscheidung erfolgt durch Eintauchen der Elektrode in die nicht desoxidierte Vorläuferlösung und Anlegen eines Potentials von 0,5 V vs./Ag/AgCl für 3 Minuten. Die beschichtete Arbeitselektrode wird mit Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen und vor der Benutzung in diesem Puffer gelagert. The deposition takes place by immersing the electrode in the non-deoxidized precursor solution and application of a potential of 0.5 V vs./Ag/AgCl for 3 minutes. The coated Working electrode is washed with phosphate buffer pH 7.4 and before Use stored in this buffer.

Der Nachweis der funktionalen Immobilisierung des Enzyms erfolgt durch amperometrische Detektion von Pyruvat. Evidence of the functional immobilization of the enzyme is carried out by amperometric detection of pyruvate.

Example 3 Immobilization of streptavidin on a gold IDE as a model for an immunosensor

Als Modellsystem für einen Immunoassay an Mikroelektroden, bei dem ein Antikörper immobilisiert ist, wird Streptavidin in einer leitfähigen Scopoletinpolymerschicht und einer Mikroelektrode abgeschieden und durch ein Fluroszein-markiertes Biotinderivat (als Modell für ein fluoreszenzmarkiertes Antigen) sichtbar gemacht. As a model system for an immunoassay on microelectrodes, at to which an antibody is immobilized, streptavidin in a conductive scopoletin polymer layer and one Microelectrode deposited and marked by a fluroszein Biotin derivative (as a model for a fluorescence-labeled antigen) made visible.

Zur Herstellung einer Vorläuferlösung werden in destilliertem Wasser KCl in einer Konzentration von 0,05 Mol/l gelöst und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Schweiz) in einer Konzentration von 1 mMol/l und Streptavidin (p. a., Gerbu, Gaiberg) in einer Konzentration von 1 mg/ml werden darin gelöst. To prepare a precursor solution are distilled in Water KCl dissolved in a concentration of 0.05 mol / l and the pH adjusted to 7. Scopoletin (> 98%, Fluka, Buchs, Switzerland) in a concentration of 1 mmol / l and streptavidin (p.a., Gerbu, Gaiberg) in a concentration of 1 mg / ml are solved in it.

Eine ungerührte elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung aus einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, einer Pt- Gegenelektrode und einer miniaturisierten Gold-IDE ("Neurochip" von FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE mit 2 µm Elktrodenabstand und 1 µm Fingerbreite), die von einem handelsüblichen Potentiostaten (z. B. CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) auf dem konstanten Potential gehalten wird, wird als Elektrolysezelle verwendet. An unmoved electrochemical cell with one Three-electrode arrangement consisting of an Ag / AgCl reference electrode, a Pt Counter electrode and a miniaturized gold IDE ("Neurochip" from FhG-IBMT, St. Ingbert, IDE with 2 µm electrode spacing and 1 µm finger width), that of a commercially available Potentiostats (e.g. CH Instruments 750 A, Austin, Texas, USA) on the is kept constant potential is called an electrolytic cell used.

Die Abscheidung erfolgt durch Eintauchen der Elektroden in die nicht desoxidierte Vorläuferlösung und Anlegen eines konstanten Potentials von +0,5 V vs./Ag/AgCl für 3 Minuten. Die beschichtete IDE wird mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft für 1 Stunde getrocknet. The deposition takes place by immersing the electrodes in the not deoxidized precursor solution and applying a constant Potentials of +0.5 V vs./Ag/AgCl for 3 minutes. The coated IDE is washed with distilled water and on the Air dried for 1 hour.

2. Schritt: Affine Bindung von Fluoreszein-markiertem Biotin als Modell der Antikörper/Antigen-Bindung. Step 2: Affine binding of fluorescein-labeled biotin as a model of antibody / antigen binding.

Ein Fluorescein-Biotin-Konjugat (synthetisiert am FhG-IBMT, Bergholz-Rehbrücke) wird in Phosphatpuffer (ph 7,4, 50 mMol/l Phosphat) in einer Konzentration von 1 µMol aufgenommen. 20 µl dieser Lösung werden auf die modifizierte Elektrode gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Elektrode wird 5 Minuten in destilliertes Wasser gelegt, um überschüssiges Konjugat abzuwaschen. A fluorescein-biotin conjugate (synthesized on FhG-IBMT, Bergholz-Rehbrücke) is in phosphate buffer (pH 7.4, 50 mmol / l Phosphate) in a concentration of 1 µmol. 20 µl this solution are placed on the modified electrode and incubated for 30 minutes at room temperature. The electrode will Put in distilled water for 5 minutes to remove excess Wash off conjugate.

Die affine Bindung des fluoreszierenden Konjugates exklusiv an der beschichteten Seite der IDE wird durch einen Helligkeitswert von 100% gegenüber einem Helligkeitwert von nur 33% an der unbeschichteten Seite illustriert. The affine binding of the fluorescent conjugate exclusively the coated side of the IDE is replaced by a Brightness value of 100% compared to a brightness value of only 33% on the illustrated uncoated page.

Claims

1. A method for the electrochemical immobilization of biomolecules on a conductive surface by depositing at least one layer of a conductive polymer on the conductive surface and including the biomolecule in the polymer layer in an aqueous solution, characterized in that as a monomer for the formation of the layer from the conductive polymer a coumarin derivative is used.

2. The method according to claim 1, characterized in that the coumarin derivative has the following structural formula I

wherein R ₁ to R ₆ independently of one another represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group with 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group with 1 to 6 carbon atoms, an amino group or a -COOH group.

3. The method according to claim 2, characterized in that at least one of the R ₁ - to R ₆ groups in the structural formula I represents a hydroxyl group.

4. The method according to claim 3, characterized in that in the structural formula IR ₁ to R ₃ and R _{6 are} hydrogen atoms and R _{4 is} an -OCH ₃ group and R _{5 is} a hydroxyl group or R ₁ to R ₄ and R _{6 are} hydrogen atoms and R _{5 represents} a hydroxyl group.

5. The method according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that as biomolecules antibodies, Antigens, peptides, proteins, enzymes, nucleic acids, cells of plant, animal and human origin, hormones, organic nanoparticles, inorganic nanoparticles and parts of which are immobilized.

6. The method according to claim 5, characterized in that the biomolecule out during the deposition of the layer the conductive polymer is included therein.

7. The method according to claim 5, characterized in that the biomolecule after the deposition of the layer from the conductive polymer is included in this.

8. The method according to claim 6 or 7, characterized characterized that the biomolecule at a concentration in a range of 0.001 ng / ml to 100 mg / ml is used.

9. The method according to claim 8, characterized in that the concentration ranges from 1 µg / ml to 1 mg / ml.

10. The method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the monomer in one Concentration is used, which is in the range of 0.01 to 100 mmol / l lies.

11. Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the deposition and the inclusion of the biomolecule at a pH of 6 to 8 is carried out.

12. The method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that in the presence of a organic or inorganic conductive salt in a concentration is deposited from 0.01 to 1000 mmol / l.

13. The method according to claim 12, characterized in that that as the main salt potassium chloride, sodium chloride, Lithium chloride, toluene-4-sulfonate, tetraethylammonium toluene-4-sulfonate, Hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, sodium perchlorate and Poly (sodium styrene sulfonate) is used.

14. Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the conductive Surface is an electrode.

15. The method according to claim 14, characterized in that as an electrode a macroscopic or miniaturized Electrode is used.

16. Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that at least two Layers are deposited on the conductive surface.

17. Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that in the deposited Layer of additives can be added.

18. The method according to claim 17, characterized in that that redox mediators are used as additives.

19. The method according to claim 18, characterized in that to redox mediators osmium complexes, vitamin K and Quinone derivatives count.

20. Device for the detection of biomolecules, which has the components:

- A device with a conductive surface;

- At least one layer of the conductive polymer deposited on the conductive surface according to at least one of claims 1 to 20 with the biomolecule enclosed in the conductive layer; and

- A measuring device for the detection of the biomolecule.

21. The apparatus according to claim 20, characterized characterized in that the device is a biosensor, an immune sensor or is a microsystem.

22. The apparatus of claim 20 or 21, characterized characterized that the measuring device a Fluorescence microscope, a fluorescence reader, a spectrograph, a photometer or is an image scanner.

23. The device according to at least one of claims 20 to 22 for use in biochemistry including Bioanalytics and biosensors, biotechnology, medical Diagnostics and clinical chemistry.