DE10214395A1

DE10214395A1 - Verfahren zur Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen

Info

Publication number: DE10214395A1
Application number: DE2002114395
Authority: DE
Inventors: Dmitri Tcherkassov
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-03-30
Filing date: 2002-03-30
Publication date: 2003-10-23

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Reaktionsoberfläche zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen, insbesondere zur Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen und Mutationen. Diese Verfahren basieren auf der Sequenzierung einzelner, auf den erfindungsgemäßen Reaktionsoberflächen fixierter Nukleinsäureketten. Die Sequenzierungsreaktion erfolgt durch den sequentiellen Aufbau eines zu einzelnen auf der Oberfläche gebundenen einzelsträngigen Nukleinsäureketten komplementären Stranges. Aus der Reihenfolge der eingebauten Nukleotide wird die Sequenz für die gebundenen Nukleinsäureketten bestimmt.

Description

Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Reaktionsoberfläche zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen, insbesondere zur Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen und Mutationen. Diese Verfahren basieren auf der Sequenzierung einzelner, auf den erfindungsgemäßen Reaktionsoberflächen fixierter Nukleinsäureketten. Die Sequenzierungsreaktion erfolgt durch den sequentiellen Aufbau eines zu einzelnen auf der Oberfläche gebundenen einzelsträngigen Nukleinsäureketten komplementären Stranges. Aus der Reihenfolge der eingebauten Nukleotide wird die Sequenz für die gebundenen Nukleinsäureketten bestimmt. 1. Abkürzungen und Begriffserläuterungen DPuMA - Deutsches Patent- und Markenamt
DNA - Desoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge: (genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
dNTP - 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate, Substrate für die Einbaureaktion von DNA- Polymerasen und Reverse-Transkriptasen
Einzelnukleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) - sind Veränderungen in den Sequenzen, die als Substitution (Transition oder Transversion) oder als Deletion oder Insertion einzelner NT auftreten können.
Erkennungssequenz - Teil der Zielsequenz, der für die Zuordnung dieser Zielsequenz in der Gesamtsequenz verwendet wird.
Gesamtsequenz - die in die Sequenzierungsreaktion eingesetzte Sequenz, meistens in NSKFs überführt. Sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder Äquivalente einer anderen Sequenz oder Sequenz- Populationen darstellen (z. B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit einem klonierten Abschnitt, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen. Die Gesamtsequenz stellt in den meisten Fällen eine Population von vielen gleich aufgebauten NSK-Molekülen dar.
NSK - Nukleinsäurekette. DNA oder RNA in ihrer ursprünglichen Länge
NSKF - Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs - Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein Äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.
NT - natürliches Nukleotid, meist dNTP, wenn nicht ausdrücklich anders gekennzeichnet. Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z. B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate. Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide.
NT* - modifiziertes Nukleotid, meist dNTP, wenn nicht ausdrücklich anders gekennzeichnet. NTs* bedeutet: modifizierte Nukleotide
Plane Oberfläche - Oberfläche, die vorzugsweise folgende Merkmale aufweist: 1) Sie erlaubt, mehrere einzelne Moleküle, vorzugsweise mehr als 100, noch besser mehr als 1000, mit dem jeweiligen gegebenen Objektiv-Oberflächen-Abstand bei einer Objektivposition gleichzeitig zu detektieren. 2) Die immobilisierten bzw. gebundenen einzelnen Moleküle befinden sich in derselben Fokusebene, die reproduzierbar eingestellt werden kann.
Polymerasen - Enzyme, die komplementäre Nukleotide in einen wachsenden DNA- oder RNA-Strang einbauen können (z. B. DNA-Polymerasen, Reverse-Transkriptasen, RNA- Polymerasen)
Primer - spezifischer, ein sequenzspezifischer Primer-Oligonukleotid, das an eine spezifische, ausgewählte Stelle in der Gesamtsequenz komplementär bindet und als Primer für die Sequenzierungsreaktion dient. Zur Verdeutlichung des erfinderischen Gedankens werden im Text folgende Begriffe unterschieden:

a) Im Text wird allgemein unter einem "Primer" eine Population von Primermolekülen mit einheitlicher Struktur verstanden.
b) "mehrere Primer" o. ä. werden im Text als mehrere Populationen von Primermolekülen verstanden, die unterschiedliche Struktur besitzen.
c) Ein "Primer-Molekül" bedeutet ein einziges Oligonukleotid-Molekül.
d) "Mehrere Primer-Moleküle" bedeuten mehrere einzelne Oligonukleotid-Moleküle, sie können einheitliche oder unterschiedliche Struktur aufweisen.

2. Stand der Technik

Die Nukleinsäurenketten-Sequenzanalyse ist in vielen Bereichen der Wissenschaft, Medizin und Industrie zu einem wichtigen Werkzeug geworden. Zur Analyse wurden mehrere Verfahren entwickelt.

Die bekanntesten Verfahren sind die Ketten-Terminations-Sequenzierung nach Sanger (F. Sanger et al. PNAS 1977 v. 74 s. 5463), die auf dem Einbau von Kettenterminatoren basiert, und die Maxam-Gilbert-Methode, die auf Basen-spezifischer Modifikation und Spaltung von Nukleinsäureketten beruht (A. M. Maxam and W. Gilbert PNAS 1977, v. 74 S. 560). Beide Methoden liefern eine Anzahl von Nukleinsäurekettenfragmenten verschiedener Längen. Diese Fragmente werden der Länge nach in einem Gel aufgetrennt. Dabei müssen alle Nachteile der Elektrophorese (wie z. B. lange Laufzeit, relativ kurze Strecken von Sequenzen, die in einem Ansatz bestimmt werden können, begrenzte Anzahl der parallelen Ansätze sowie relativ große Mengen an DNA) in Kauf genommen werden. Diese Methoden sind sehr arbeitsintensiv und langsam.

Ein weiteres Verfahren zur Sequenzierung basiert auf der Hybridisierung von Nukleinsäureketten mit kurzen Oligonukleotiden. Dabei wird mit mathematischen Methoden berechnet, wie viele Oligonukleotide einer bestimmten Länge vorhanden sein müssen, um eine komplette Sequenz zu ermitteln (Z. T. Strezoska et al. PNAS 1991 v. 88 S. 10089, R. S. Drmanac et al. Science 1993 v. 260 S. 1649). Auch dieses Verfahren ist mit Problemen behaftet: Es kann nur eine Sequenz in einem Ansatz bestimmt werden.

In WO 00/56925 ist ein Verfahren beschrieben, das parallel viele SNPs detektieren kann. Einer der größten Nachteile dieses und ähnlichen Verfahren ist die Materialmenge, die man für die Identifizierung von SNPs benötigt. Ein anderer Nachteil ist die Notwendigkeit, bestimmte Primer an bestimmte Partikel oder Positionen auf einer Oberfläche zu fixieren (räumliche oder andere Kodierung von Oligonukleotiden), um Aussagen über SNPs treffen zu können. Ein weiterer Nachteil sind die großen Kosten, die dabei entstehen.

In Anmeldung Tcherkassov et al. (Aktenzeichen 101 20 797.2-41 DPuMA) wurden SBS- Verfahren (Sequencing by Synthesis) zur parallelen Sequenzierung von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen beschrieben.

Die Erfindung stellt eine Fortentwicklung der SBS-Verfahren mit Einzelmolekülen dar.

Der erste Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, das viele relevante Einzelnukleotid- Polymorphismen (SNPs) schnell und gleichzeitig identifiziert, keine vorbestimmte Kodierung von Oligonukleotiden (z. B. durch eine definierte Positionierung von Oligonukleotiden auf einer Oberfläche oder eine definierte Farbkodierung von Kügelchen mit definierten Oligonukleotiden) voraussetzt und wenig Material benötigt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Sequenzabschnitten (Zielsequenzen) einer Gesamtsequenz mit sequenzspezifischen Primern.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Oberfläche mit immobilisierten Nukleinsäureketten, NSKFs.

3. Allgemeine Beschreibung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Reaktionsoberfläche zur Analyse von NSK- sequenzen, insbesondere zur Analyse von Sequenzabschnitten einer Gesamtsequenz mit Einzelnukleotidpolymorphismen und Mutationen.

Dieses Verfahren basiert auf der Sequenzierung einzelner, auf der Reaktionsoberfläche fixierter NSK- bzw. NSKF-Moleküle (SMPS-Verfahren). Während der Sequenzierungsreaktion werden markierte NT*s in den wachsenden Strang durch eine Polymerase eingebaut und die Signale von einzelnen eingebauten NT*-Molekülen detektiert Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 20 797.2-41 DPuMA. Nach dem Einbau und der Detektion des Signals wird das Signal entfernt und ein nächstes komplementäres NT* durch eine Polymerase eingebaut. Aus der Reihenfolge der eingebauten Nukleotide wird die Sequenz für die gebundenen Nukleinsäureketten bestimmt.

Zur Anschaulichkeit, nicht zur Einschränkung wird ein Verfahren zur Analyse von SNPs detailliert beschrieben.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur SNP-Analyse werden mehrere potentielle SNP-Positionen in der Referenzsequenz ausgewählt, die in einer zu analysierenden NSK untersucht werden. Zu diesen Positionen werden entsprechend unterschiedliche, sequenzspezifische Primer bereitgestellt. Diese Primer können einen standardisierten Primersatz zur SNP-Analyse bei einer bestimmten Fragestellung bilden und einheitlich als Kit für die betreffende Analysen eingesetzt werden.

Die Vorbereitung des zu analysierenden Materials (auf SNP zu untersuchende einzel- und doppelsträngige Nukleinsäureketten) hängt von der Aufgabenstellung ab und hat erfindungsgemäß das Ziel, aus einer oder mehreren langen Nukleinsäureketten (Gesamtsequenz) eine Population an relativ kleinen, zwischen 30 und 2000 NT langen, einzelsträngigen Nukleinsäurekettenfragmenten (NSKFs) zu bilden.

Diese NSKF-Moleküle werden zufällig auf einer planen Oberfläche mit einer Dichte zwischen 10 und 1.000.000 pro 100 µm² immobilisiert. An die auf der Oberfläche gebundenen NSKFs werden Primer hybridisiert, so dass die Dichte der extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexe ca. 10-1000 pro 100 µm² beträgt.

Nach der Hybridisierung werden nicht gebundene Primer entfernt und die Sequenzierungsreaktion gestartet. Als Grundlage der Sequenzierung dient die Synthese des komplementären Stranges zu jedem einzelnen gebundenen NSKF-Molekül. Dabei werden in den neu synthetisierten Strang markierte NTs* eingebaut. Die Polymerase baut nur ein einziges markiertes NT* in die wachsende Kette ein. Dies kann beispielsweise durch die reversible Ankopplung einer zur Termination führenden Gruppe an die NTs* erreicht werden. Der Einbau eines weiteren markierten NT* wird dadurch zunächst unmöglich gemacht.

Die Sequenzierungsreaktion verläuft vorzugsweise in mehreren Zyklen. Ein Zyklus umfasst beispielsweise folgende Schritte:

a) Zugabe einer Lösung mit markierten Nukleotiden (NTs*) und Polymerase zu den NSKF-Primer-Komplexen,
b) Inkubation der NSKF-Primer-Komplexe mit dieser Lösung unter Bedingungen, die zur Verlängerung der komplementären Stränge um ein NT geeignet sind,
c) Waschen,
d) Detektion der Signale der einzelnen eingebauten NT*-Molekülen,
e) Entfernung der Markierung und der zur Termination führenden Gruppe von den eingebauten NT*,
f) Waschen.

Gegebenenfalls erfolgt eine mehrfache Wiederholung des Zyklus (a-f).

Die Reaktionsbedingungen des Schrittes (b) in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKF- Primer-Komplexe in einem Zyklus ein markiertes NT* einbauen können, vorzugsweise an mehr als 95%.

Die Anzahl der durchzuführenden Zyklen hängt von der jeweiligen Aufgabenstellung ab, ist theoretisch nicht beschränkt und liegt zwischen 2 und 5000, vorzugsweise zwischen 4 und 500.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren und die Oberfläche ergeben sich mehrere Vorteile:

1. Durch eine große Parallelität der Sequenzierung (theoretisch unbegrenzte Anzahl, praktisch bis zu 10.000.000 der zu analysierenden NSKFs) kann man viele SNPs, bzw. Zielsequenzen gleichzeitig analysieren. Die Redundanz der Daten erlaubt die Verifikation der Sequenzen und die Korrektur von Fehlbestimmungen sowie die Ermittlung des homo- und heterozygoten Zustandes der SNPs im jeweiligen Träger.
2. Es ist nicht notwendig, NSKF-Moleküle in einer definierten Anordnung auf der Oberfläche zu fixieren, da das Signal von einzelnen Molekülen ausgeht und nicht von einer räumlich definierten Population von Primern.
3. Durch eine Auswahl der Zielsequenzen und der sequenzspezifischen Primer werden nur die relevanten Abschnitte der Gesamtsequenz untersucht, was die Menge nicht relevanter Informationen verringert und die Analysezeit verkürzt.
4. Durch eine hohe Konzentrationen der sequenzspezifischen Primer in der Hybridisierungslösung wird die Hybridisierungszeit der Primer an die NSKFs deutlich verkürzt.
5. Die Zahl der Vorbereitungsschritte des Materials für die Sequenz-Analyse ist minimal.

Die folgenden Anmeldungen werden hier in vollem Umfang zitiert:
Patentanmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 49 786.5 beim DPuMA
Patentanmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 48 868.8 beim DPuMA
Patentanmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 20 797.2-41 beim DPuMA
Patentanmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 20 798.0-41 beim DPuMA
Patentanmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 42 256.3 beim DPuMA

4. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Dem erfindungsgemäßen Verfahren zur SNP-Analyse liegen folgende Prinzipien zugrunde:
Es werden Stellen in einer Referenzsequenz ausgewählt, die in den zu untersuchenden NSKs (Gesamtsequenz) auf Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) überprüft werden sollen

1. Zur Analyse jeder ausgewählten SNP-Stelle werden spezifische Primer bereitgestellt, so dass jede zu untersuchende SNP-Stelle entweder die nächste Position 3'-wärts vom Primer einnimmt oder innerhalb von 2 bis 100, vorzugsweise 2 bis 50, idealerweise 2 bis 20 Positionen 3'-wärts vom Primer liegt. Die SNP- Stelle liegt somit innerhalb der Zielsequenz, die während der Sequenzierungsreaktion bestimmt wird. Es werden vorzugsweise mehrere SNP- Stellen gleichzeitig analysiert, so dass mehrere spezifische Primer verwendet werden müssen. Die Primer werden vorzugsweise so ausgewählt, dass sie möglichst einheitliche Annealing-Temperaturen haben.
2. Von der Gesamtsequenz werden kurze Nukleinsäurekettenfragmente (NSKFs) abgeleitet, wobei diese Fragmente einzelsträngig sind und eine Länge von 20 bis 2000 NT, vorzugsweise 30 bis 500 NT besitzen.
3. NSKF-Moleküle werden in einer zufälligen Anordnung auf der Oberfläche immobilisiert.
4. Nach der Hybridisierung (Annealing) von sequenzspezifischen Primern an die auf der Oberfläche immobilisierten NSKFs wird eine zyklische Sequenzierungsreaktion durchgeführt, wobei für jedes an der Reaktion beteiligte NSKF-Molekül eine Zielsequenz ermittelt wird. Die Sequenzierungsreaktion läuft an vielen Molekülen gleichzeitig ab.
5. Die ermittelten Zielsequezen enthalten Information über die Zugehörigkeit zu einem bestimmten Abschnitt in der Gesamtsequenz und über den SNP in diesem Abschnitt bei der zu untersuchenden Probe. Die Länge der Zielsequenzen und somit die Zahl der Zyklen ist so zu wählen, dass eine Identifizierung der Sequenzen gewährleistet werden kann.

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden die ermittelten Zielsequenzen mit der Referenzsequenz verglichen und durch Sequenzübereinstimmung zugeordnet. Bei einer genügend langen ermittelten Zielsequenz kann man sie mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer bestimmten Position in der Referenzsequenz zuordnen. Beispielsweise kann eine Sequenz aus 10 NTs mehr als 10⁶ verschiedene Kombinationen bilden und somit mit einer großen Wahrscheinlichkeit in einer NSK von nur 100.000 NT eindeutig identifiziert werden. Nach der Zuordnung der ermittelten Zielsequenz zur bestimmten Position innerhalb der Referenzsequenz werden Unterschiede in den Sequenzen, die SNPs, sichtbar.

Zur Identifizierung der Zielsequenzen wird in einer anderen vorteilhaften Ausführungsform sowohl die bereits bekannte Anzahl der Primer, ihre Zusammensetzung und ein bereits bekannter, an die Primerbindungsstelle anschließender Sequenzabschnitt der Referenzsequenz verwendet. Dabei werden die ermittelten Zielsequenzen nach ihrer Zugehörigkeit zu den Primern analysiert, wobei nur die nah an der Primerbindungsstelle liegenden Sequenzen berücksichtigt werden müssen. Wenn beispielsweise nur 1000 Primer verwendet werden, reichen weniger als 10 NTs der ermittelten Zielsequenzen, um eine Zuordnung zu den entsprechenden Primern zu ermöglichen.

Materialauswahl

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode ist es möglich, sowohl vorselektionierte DNA- Sequenzen (z. B. in YAC-, PAC-, oder BAC-Vektoren klonierte Abschnitte eines Genoms (R. Anand et al. NAR 1989 v. 17 S. 3425, H. Shizuya et al. PNAS 1992 v. 89 S. 8794, "Construction of bacterial artificial chromosome libraries using the modified PAC system" in "Current Protocols in Human genetics" 1996 John Wiley & Sons Inc)) als auch nicht vorselektionierte DNA (z. B. genomische DNA, cDNA- oder mRNA-Gemische oder deren Äquivalente) zu analysieren. Durch eine sorgfältige Primerselektion ist es möglich, in einer großen Menge genetischer Information gezielt nach bestimmten SNP-Stellen zu suchen.

Die zu analysierende Probe enthält meistens mehrere identische Gesamtsequenzmoleküle, z. B. mehrere Kopien von genomischer DNA aus Zellen eines Gewebes oder mehrere identische mRNA-Populationen aus Zellen eines Gewebes.

Materialvorbereitung

Ziel der Materialvorbereitung ist es, einzelsträngige NSKFs mit einer Länge zwischen 30 und 2000 NTs, vorzugsweise 30-500 NTs und einer einzelnen Primerbindungsstelle zu erhalten. Zur Verbesserung der Anschaulichkeit folgen nun einige Beispiele, wobei die angeführten Methoden einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können.

Erzeugung kurzer Nukleinsäurekettenfragmente (50-1000 NTs)

Die Fragmentierung ist notwendig, damit nur ein Primer pro NSKFs binden kann. Erfindungsgemäß kann die Erzeugung der Nukleinsäurekettenfragmente (NSKFs) durch mehrere Methoden erfolgen, z. B. durch die Fragmentierung des Ausgangsmaterials mit Ultraschall oder durch Endonukleasen ("Molecular cloning" 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press), wie z. B. durch unspezifische Endonukleasegemische. Die Ultraschall-Fragmentierung wird bevorzugt. Man kann die Bedingungen so einstellen, dass Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von einigen Hundert NTs entstehen.

Außerdem können aus einer langen NSK oder mehreren langen NSKs unter Verwendung randomisierter Primer komplementäre noch kürzere NSKFs synthetisiert werden. Besonders bevorzugt wird diese Methode bei der Analyse von SNPs in mRNA- oder cDNA-Populationen. Dabei werden an der mRNA einzelsträngige DNA-Fragmente mit randomisierten Primern und einer reversen Transkriptase gebildet (Zhang-J et al. Biochem. J. 1999 v. 337 S. 231, Ledbetter et al. J. Biol. Chem. 1994 v. 269 S. 31544, Kolls et al. Anal. Biochem. 1993 v. 208 S. 264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v. 27 S. 962).

Einzelstrang-Vorbereitung

Für die Sequenzierungsreaktion werden einzelsträngige NSKFs benötigt. Falls das Ausgangsmaterial in doppelsträngiger Form vorliegt, gibt es mehrere Möglichkeiten, aus doppelsträngiger DNA eine einzelsträngige Form zu erzeugen (z. B. Hitze-Denaturierung oder Alkali-Denaturierung) ("Molecular cloning" 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press).

SNP-Stellenwahl

Mit der erfindungsgemäßen Methode kann man sowohl bekannte SNP-Stellen analysieren als auch neue SNP-Stellen ermitteln. Als potentielle SNP-Stelle kann jede Position in der NSK auftreten. Die Auswahl richtet sich nach der Fragestellung, z. B. SNP-Analyse in Genen, deren Produkte mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, oder SNP-Analyse in konservierten, kodierenden Abschnitten der Gene, die für Membranrezeptoren kodieren, oder Überprüfung bekannter SNP-Stellen in regulatorischen Sequenzen von Genen, die für die Zellteilung wichtig sind.

Eine zu analysierende SNP-Stelle liegt innerhalb einer Zielsequenz, die während der Sequenzierungsreaktion bestimmt wird. Man kann mehrere SNP-Stellen innerhalb einer Zielsequenz ermitteln. Man kann andererseits auch mehrere Zielsequenzen z. B. innerhalb eines Gens wählen. Wichtig dabei ist, dass die Zielsequenzen in genügendem Abstand voneinander in der Gesamtsequenz liegen. Dieser Abstand ist notwendig, damit nur ein sequenzspezifischer Primer pro NSKF hybridisiert, und er ist von der durchschnittlichen NSKF-Länge abhängig: je kürzer die NSKFs, desto näher aneinander können Zielsequenzen liegen. Die SNP-Stellen können bei angemessener Primer-Wahl an beiden Strängen einer doppelsträngigen Nukleinsäurekette analysiert werden.

Das Verfahren bietet auch die Möglichkeit, beispielsweise mehrere SNP-Stellen aus vielen Individuen (als Stichprobe einer Population) gleichzeitig zu kontrollieren. Dadurch kann z. B. das SNP-Profil einer Population untersucht werden.

Primer für die Sequenzierungsreaktion

Sequenzierungsreaktion an einem einzelnen NSKF-Molekül wird durch ein Primer- Molekül ermöglicht. Ein sequenzspezifischer Primer ist erfindungsgemäß notwendig, um die Sequenzierungsreaktion jeweils an einer bestimmten/spezifischen Zielsequenz innerhalb der Gesamtsequenz durchführen zu können. Der für die Analyse einer SNP- Stelle, bzw. einer Zielsequenz einzusetzende sequenzspezifische Primer stellt eine Population von Primer-Molekülen mit identischer Struktur dar. Für die Analyse mehrerer, unterschiedlicher Zielsequenzen sind mehrere unterschiedliche Primer-Populationen notwendig.

Durch die Verwendung sequenzspezifischer Primer werden nur die relevanten Sequenzabschnitte, die Zielsequenzen, analysiert. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu sequenzierende Länge der Sequenzen möglichst niedrig gehalten, damit die Geschwindigkeit der Analyse steigt.

Ein sequenzspezifischer Primer bindet an eine für ihn spezifische Primerbindungsstelle in der zu analysierenden Sequenz, PBS. Die Zusammensetzung und die Länge der Primer werden für jede potentielle SNP-Stelle, bzw. Zielsequenz optimiert. Beispiele für Optimierungsschritte sind in Rychlik et al. NAR 1990 v. 18 S. 6409 dargestellt. Bei der Primerwahl bzw. bei der Wahl der PBS (Primerbindungsstelle) sind folgende Aspekte besonders zu berücksichtigen:

1. Die zu analysierende SNP-Stelle sollte entweder gleich nach dem 3'-Ende des Primers oder innerhalb der nächsten 2 bis 50 NTs, vorzugsweise 2 bis 20 NTs liegen.
2. Die Positionierung (die Wahl der Sequenzlänge und der Zusammensetzung) der PBS zu SNP-Stelle sollte so erfolgen, dass die verschiedenen PBS-Sequenzen und die korrespondierenden Primer-Sequenzen möglichst ähnliche "Annealing-temperaturen" besitzen, um bei möglichst einheitlichen Hybridisierungsbedingungen zu binden. Das kann beispielsweise durch Veränderung der PBS-Position im Bezug auf die jeweilige, zu analysierende SNP-Stelle oder durch die Veränderung der Primersequenzlänge erfolgen (Rychlik et al. NAR 1990 v. 18 S. 6409).
3. Der minimale Abstand zwischen Primern, die an denselben Strang in der Gesamtsequenz binden, sollte die durchschnittliche NSKF-Länge nicht unterschreiten.

Es können Primer für beide Stränge einer Doppelstrang-NSK verwendet werden. Damit lassen sich beispielsweise nah aneinander liegende SNP-Stellen erfassen, oder man kann eine Kontrolle einer SNP-Stelle in beiden Strängen vornehmen.

Vorzugsweise beträgt die Länge des Primers zwischen 6 und 100 NTs, optimalerweise zwischen 10-30 oder 30-40 oder 40-50. Für verschiedene SNP-Stellen, bzw. Zielsequenzen können Primer mit unterschiedlicher Länge eingesetzt werden.

Die Synthese eines solchen Primers kann z. B. mit dem DNA-Synthesizer 380 A von Applied Biosystems ausgeführt werden oder aber als Auftragssynthese bei einem kommerziellen Anbieter, z. B. MWG-Biotech GmbH, Germany erstellt werden.

Für die SNP-Analyse mit sequenzspezifischen Primern werden Primer erfindungsgemäß in einer Hybridisierungslösung an die auf der Reaktionsoberfläche immobilisierten NSKFs hybridisiert (Annealing-Reaktion).

Immobilisierung von NSKFs

Die bereitgestellten NSKF-Moleküle werden an die plane Oberfläche in zufälliger Anordnung gebunden.

Als plane Oberfläche dient die Oberfläche einer festen Phase eines Materials, das vorzugsweise enzymatischen Reaktionen gegenüber inert ist und keine Störungen der Detektion verursacht. Silicon, Glas, Keramik, Kunststoff (z. B. Polycarbonate oder Polystyrole) oder beliebiges anderes Material, das diesen funktionalen Anforderungen genügt, kann verwendet werden. Vorzugsweise ist die Oberfläche nicht verformbar, da sonst mit einer Verzerrung der Signale bei der wiederholten Detektion zu rechnen ist.

Falls eine gelartige feste Phase verwendet wird, so kann dieses Gel z. B. ein Agarose- oder Polyacrylamidgel sein. Das Gel ist vorzugsweise für Moleküle mit einer Molekularmasse unter 5000 Da frei passierbar (beispielsweise kann ein 1 bis 2% Agarose-Gel oder 10 bis 15% Polyacrylamid Gel verwendet werden). Eine solche Geloberfläche hat anderen festen Oberflächen gegenüber den Vorteil, dass die markierten NSKFs im Gegensatz zu freien NTs* auf der Oberfläche festgehalten werden. Durch die Fixierung der NSKFs auf der Oberfläche ist die Detektion der Fluoreszenzsignale von eingebauten NTs* möglich. Die Signale von freien NTs* werden nicht detektiert, weil sie nicht an das Material des Gels binden und somit nicht immobilisiert werden. Das Gel ist vorzugsweise auf einer festen Unterlage befestigt. Die Dicke des Gels beträgt vorzugsweise nicht mehr als 0,1 mm. Die Geldicke muß jedoch größer als die Tiefenschärfe des Objektivs sein, damit unspezifisch an die feste Unterlage gebundene NTs* nicht in die Fokusebene gelangen und damit detektiert werden. Wenn die Tiefenschärfe z. B. 0,3 µm beträgt, so soll die Geldicke vorzugsweise zwischen 1 µm und 100 µm liegen. Die Reaktionsoberfläche muß groß genug sein, um die notwendige Anzahl der NSKFs bei entsprechender Dichte fixieren zu können. Die Reaktionsoberfläche sollte vorzugsweise nicht größer als 20 cm² sein. Detailliert ist eine bevorzugte Oberfläche, eine Geloberfläche, in der Anmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 49 786.5 beim DPuMA beschrieben.

Die Immobilisierung der NSKFs erfolgt vorzugsweise an einem der beiden Ketten-Enden. Dies kann durch entsprechende kovalente (z. B. Tcherkassov et al. (Aktenzeichen 101 49 786.5 beim DPuMA), affine (z. B. Biotin-Streptavidin) oder andere Bindungen erreicht werden. Es sind viele Beispiele der Immobilisierung von Nukleinsäuren bekannt (McGall et al. US Patent 5412087, Nikiforov et al. US Patent 5610287, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M. Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v. 198, S. 138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v. 73, S. 2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v. 71, S. 279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v. 72, S. 3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v. 24 S. 3142, Ghosh et. al. NAR 1987 v. 15 S. 5353, Gingeras et al. NAR 1987 v. 15 S. 5373, Maskos et al. NAR 1992 v. 20 S. 1679). Die Immobilisierung kann auch durch eine unspezifische Bindung, wie z. B. die Austrocknung der NSKFs enthaltende Probe auf der planen Oberfläche erreicht werden. Die Dichte der Immobilisation kann zwischen 10 und 1.000.000 NSKFs pro 100 µm² liegen.

Die verschiedenen Zyklusschritte erfordern einen Austausch der unterschiedlichen Reaktionslösungen über der Oberfläche. Die Reaktionsoberfläche ist vorzugsweise Bestandteil eines Reaktionsgefäßes. Das Reaktionsgefäß ist wiederum vorzugsweise Bestandteil einer Reaktionsapparatur mit Durchflußvorrichtung. Die Durchflußvorrichtung ermöglicht einen Austausch der Lösungen im Reaktionsgefäß. Der Austausch kann mit einer durch einen Computer gesteuerten Pumpvorrichtung oder manuell erfolgen. Wichtig dabei ist, dass die Oberfläche nicht austrocknet. Vorzugsweise beträgt das Volumen des Reaktionsgefäßes weniger als 50 µl. Idealerweise beträgt sein Volumen weniger als 1 µl. Ein Beispiel für eine Durchflussvorrichtung ist in der Patentanmeldung Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 48 868.8 beim DPMA beschrieben.

Hybridisierung

Die immobilisierten NSKFs und die Primer werden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die eine möglichst selektive Anbindung (Annealing) der Primer an die entsprechenden Primerbindungsstellen der NSKFs erlauben. Optimale Hybridisierungsbedingungen hängen von der genauen Struktur der Primerbindungsstellen und der jeweiligen Primerstrukturen ab und lassen sich beispielsweise nach Rychlik et al. NAR 1990 v. 18 S. 6409 berechnen.

Die Primer stellen vorzugsweise ein Primergemisch dar. Die Konzentrationen einzelner sequenzspezifischer Primer (Einzelkonzentrationen von Primerpopulationen) liegen vorzugsweise zwischen 10 pmol/l und 100 µmol/l. Die Gesamtkonzentration von Primern im Primergemisch liegt vorzugsweise zwischen 1 nmol/l und 10 mmol/l. Das Verhältnis zwischen einzelnen Primer-Populationen kann variieren. Primer können in deutlichem Überschuss über die immobilisierten NSKFs zugegeben werden, so dass die Hybridisierungszeit gering ist.

Die für die SMPS notwendige Dichte von extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexen beträgt ca. 10 bis 1000 pro 100 µm². Sie kann vor, während oder nach der Hybridisierung der Primer erreicht werden.

Bei einer bekannten NSKF-Konzentration können in einer Ausführungsform die Immobilisierungsbedingungen so gewählt werden, dass die NSKFs in einer Dichte von ca. 10 bis 1000 Moleküle pro 100 µm² gebunden werden. NSKFs bestimmen somit die Dichte der NSKF-Primer-Komplexe.

In einer anderen Ausführungsform kann die Dichte der immobilisierten NSKFs wesentlich höher als 1000 NSKFs pro 100 µm² liegen, z. B. 1000.000 pro 100 µm². Die für die optische Detektion notwendige Dichte der NSKF-Primer-Komplexe wird während der Primer- Hybridisierung erreicht. Dabei sind die Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Zeit, Puffer) so zu wählen, dass die Primer nur an einen Teil der immobilisierten NSKFs binden.

Bei unbekannter NSKF-Konzentration und entsprechend unbekannter Immobilisationsdichte kann die Hybridisierung (Annealing) von Primern an die NSKFs zu einer höheren als optimale Dichte von NSKF-Primer-Komplexen führen.

Aus diesem Grund wird in einer vorteilhaften Ausführungsform ein Teil der NSKFs enthaltenden Probe für die Ermittlung der optimalen Dichte verwendet. Dieser Teil wird auf einer Reaktionsoberfläche immobilisiert, die Primer werden an die NSKFs hybridisiert und die entstandenen NSKF-Primer-Komplexe werden durch den Einbau von Fluoreszenzfarbstoff tragenden NT*s (z. B. Cy3-dCTP, Amersham Pharmacia Biotech) markiert. Aus der ermittelten Dichte lässt sich einerseits die eventuell notwendige Verdünnung oder Konzentrierung der ursprünglichen Probe für den endgültigen Sequenzierungsansatz errechnen (Die Hybridisierungsbedingungen werden beibehalten). Andererseits können daraus notwendige Veränderungen in den Hybridisierungsbedingungen errechnet werden, beispielsweise eine Verkürzung der Hybridisierungszeit, wobei die NSKF-Immobilisierungsdichte konstant bleibt.

Eine andere Möglichkeit zur Einstellung der optimalen Dichte von extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexen besteht in der kontrollierten Entfernung von überschüssigen NSKF-Primer-Komplexen.

Dabei wird nach der Hybridisierung von Primern an die fixierten NSKFs eine Markierungsreaktion durchgeführt, bei der alle extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexe markiert werden. Die Primer sollten möglichst gleiche Schmelztemperatur (Tm) besitzen. Beispiel einer solchen Markierung kann der Einbau von Reversiblen Terminatoren (Tcherkassov et al Aktenzeichen 101 20 797.2-41 beim DPuMA) darstellen. Nach der Markierung wird die Oberfläche gewaschen und die nicht eingebauten NT* entfernt. Die anfängliche Dichte der NSKF-Primer-Komplexe wird mit der Detektionsapparatur analysiert und falls sie zu hoch ist, wird sie kontrolliert reduziert.

Dabei wird die Temperatur der Lösung über der Oberfläche kontinuierlich oder schrittweise erhöht und gleichzeitig die Dichte der Signale von in die NSKF-Primer-Komplexe eingebauten NT*s kontrolliert. Beides kann beispielsweise in einem Sequenzierautomaten nach Tcherkassov et al Aktenzeichen 101 48 868.8 beim DPuMA erfolgen. Bei steigender Temperatur zerfallen die NSKF-Primer-Komplexe, so dass die Primer mit eingebauten NT*s in die über der Oberfläche befindliche Lösung übergehen. Nach dem Erreichen der optimalen Dichte wird die Temperatur gesenkt und die Markierung entfernt.

Vorzugsweise werden alle 4 NT*s mit einer einheitlichen Markierung versehen. Die Kontrolle der Lösungstemperatur kann unterschiedlich erfolgen, beispielsweise durch ein direktes Erhitzen des Reaktionsgefäßes, unter anderem der Reaktionsoberfläche, oder durch eine direkte Zufuhr der Lösung, die außerhalb des Reaktionsgefäßes erwärmt wird.

Das Mengen-Verhältnis zwischen Primerpopulationen kann unterschiedlich oder gleich groß sein. Durch eine höhere Primerkonzentrationen können gewisse, beispielsweise seltenere Sequenzen mit größerer Wahrscheinlichkeit in einem bestimmten Zeitraum gebunden werden.

Der große Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahrensanordnung gegenüber einer Verfahrensanordnung mit auf einer Oberfläche immobilisierten sequenzspezifischen Primern und einer anschließenden Hybridisierung von Proben an diese Primer ist die deutliche Verkürzung der Zeit für die Hybridisierung zwischen den sequenzspezifischen Primern und den zu analysierenden Proben auf der Reaktionsoberfläche.

Detektion

Beispiel für die Prinzipien der Detektion der Signale von eingebauten NT* und dazu erforderliche Apparatur sind in den Patentanmeldungen beim DPuMA Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 48 868.8 beschrieben.

Konkretisierung der Detektionsbedingungen

Der Einbau der markierten Nukleotide wird vorzugsweise mit optischen Mitteln wie z. B. Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop mit einer Epifluoreszenz- oder einer Total-Intern- Reflexions-Beleuchtung (Total-internal-reflection-excitation), oder einem Laser-Scanning- Mikroskop ("Confocal Laser Scanning Microscopy" 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, "New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy" 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., "Fluorescence microscopy" 1998 2. ed. Herman BIOS Scientific Publishers, "Handbook of biological confocal microscopy" 1995 J. Pawley Plenum Press), einem Sequenzierautomaten (Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 48 868.8 beim DPuMA) oder einer ähnlichen optischen Detektionsvorrichtung mit Weitfeld-Optik und einer Auflösung von ca. 200-300 nm detektiert. Der Einsatz eines Sequenzierautomaten oder eines Gerätes mit ähnlichen optischen Eigenschaften ist gegenüber dem Einsatz von Nahfeld-Mikroskopie oder einer anderen hoch auflösenden Technik (mit einer Auflösung von wenigen Nanometern) besonders vorteilhaft, weil eine wesentlich größere Oberfläche (vorzugsweise größer als 20 µm × 20 µm) mit einer großen Anzahl relevanter Signale in einer kurzen Zeit analysiert werden kann. In der vorliegenden Erfindung wird Gebrauch von dieser Weitfeld-Optik-Detektionstechnik gemacht.

Einbaureaktion

Beispiele einer zyklischen Sequenzierungsreaktion, die NT*-Strukturen und die Polymerasen sind ausführlich in den Patentanmeldungen Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 20 797.2-41, 101 20 798.0-41, 101 42 256.3 beim DPuMA beschrieben. Es können sowohl vier markierte NT*s in der Reaktion verwendet werden, als auch zwei markierte NT*s und zwei unmarkierte NT.

5. Beispiele Gel-Vorbereitung

Die Vorbereitung der Oberfläche ist in Anmeldung Tcherkassov et al. (Aktenzeichen 101 49 786.5 beim DPuMA) detailliert beschrieben.

Das Polyacrylamid-Gel für die Analyse von Reaktionen mit einzelnen Molekülen wird nach allgemeinen Regeln der Gel-Vorbereitung für elektrophoretische Auftrennung erstellt ("Electrophoresis" A. T. Andrews, Oxford science publications 1995).

Die Polymerisationsreaktion kann z. B. durch UV-Licht oder durch Radikalbildner durchgeführt werden. In diesem Beispiel wird Ammoniumpersulfat (APS) und TEMED (Tetramethyethylendiamin) zur Radikalreaktion verwendet, z. B. TEMED 0.01% v/v und APS 0.04% w/v. Die Komponentenzusammensetzung kann breit variieren, die Konzentrationen einzelner Komponenten liegen in folgenden Bereichen (errechnet für die gebrauchsfertige wässrige AA-bisAA-Lösung):
Acrylamid-monomer (AA) von 3 bis 30%, idealerweise zwischen 10 und 20%
Bis-Acrylamid (bis-AA) im Verhältnis zum Acrylamid-Monomer 1 : 10 bis 1 : 50, vorzugsweise 1 : 20.

Zur Herstellung werden 2 saubere Glasplatten verwendet (mit Aceton und danach Wasser gewaschen). Eine Glasplatte (P1) wird vorzugsweise mit einem wasserabweisenden Reagenz vorbehandelt, z. B. Repel-silan, Dimethyldichlorsilane-Lösung, Amersham Pharmacia- Biotech. P2 dient als fester Träger für das Gel und kann mit gelbindenden Reagenzien z. B. Bind-silan, Methacryloxypropyltrimethoxysilane, Amersham Pharmacia-Biotech, vorbehandelt werden, so dass es zu einer kovalenten Bindung zwischen dem Gel und der Glasoberfläche kommt. Die P2-Vorbehandlung mit gelbindenden Reagentien ist dann sinnvoll, wenn mehrere Reaktionen mit immobilisierten Molekülen durchgeführt werden müssen. Bei einer geringeren Anzahl an Reaktionen ist eine solche Vorbehandlung nicht notwendig. In diesen Fällen reicht, für P2 eine saubere Glas-Oberfläche aus, so dass das Gel allein durch adhäsive Kräfte an der Glasoberfläche haften bleibt.

Die fertige Polymerisationslösung (AA/bisAA-Lösung mit Radikalbildnern) wird zwischen P1 und P2 gegossen, so dass eine Schicht von ca. 5 bis 30 µm resultiert. Die Dicke des Gels kann z. B. durch Abstandhalter kontrolliert werden. Nach Erhärtung wird P1 entfernt. Das Gel bleibt auf P2 haften. Es wird mit entionisiertem Wasser gewaschen.

Das Gel kann direkt weiter verwendet werden oder in verschiedenen Fertigungsstadien getrocknet und gelagert werden. Vor einer Reaktion mit markierten Molekülen wird das Gel normalerweise einige Minuten in der Reaktions-Pufferlösung aufgequollen und erst dann für die Reaktion eingesetzt.

Auf eine so vorbereiteten Gel-Oberfläche werden NSKFs durch das Austrocknen immobilisiert.

Beispielsweise wurde eine Lösung (ca. 1 µl) einer Plasmid-DNA (mit Hind III linearisierte, durch Hitze in einzelsträngige Form überführte pMOS-Blue-Plasmid-DNA ca. 3400 NT lang, Konzentration 0.1 µg/µl) auf ca. 10 mm² der Gel-Oberfläche aufgetropft und bei 90°C zum Trocknen gebracht. Die errechnete Dichte der immobilisierten Plasmid-Moleküle betrug ca. 1000 pro 1 µm².

Als Primer wurde das Oligonukleotid 5'-AGTGAATTCGAGCTCGGTAC-3' verwendet. Die Primerbindungsstelle (nachfolgend fettgedruckt) mit der für die Analyse relevanten Verlängerung hat folgende Sequenz:

Eine Flow-Cell (Mikroflüssigkeitskanal, MFK nach Tcherkassov et al. Aktenzeichen 101 48 868.8 beim DPuMA) wurde mit der Reaktionsoberfläche zusammengebaut. Ein solcher MFK erlaubt einen schnellen Flüssigkeitsaustausch über der Geloberfläche.

Als Vorversuch wurde der Primer (errechnete Tm 45,3°C, 0.1 µmol/l in 50 mmol/l Tris-HCl pH 8,7) bei 45°C für 10 Minuten mit der Plasmid-DNA auf der Oberfläche hybridisiert (Annealing). Nach einem Waschschritt wurde die Dichte der Plasmid-Primer-Komplexe kontrolliert. Die Kontrolle erfolgte durch den Einbau von dCTP-Cy3 (Amersham Pharmacia Biotech) unter Verwendung von Klenow-Fragment (2Units pro 50 µl in 20 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, mit 5 mmol/l MgCl₂, 15 Minuten bei 30°C). Dabei wird nur ein einzelnes dCMP-Cy3 in den wachsenden Strang eingebaut.

Als Detektionsapparatur diente Axioplan 2e (Zeiss) mit der CCD-Kamera AxioCam (Zeiss). Die Detektionsapparatur und die Auswertung der Signale sind in der Anmeldung (Tcherkassov et al Aktenzeichen 101 20 797.2-41 beim DPuMA) beschrieben.

Die Signaldichte der einzelnen, eingebauten dCMP-Cy3-Moleküle entspricht der Dichte der extensionsfähigen Plasmid-Primer-Komplexe. Unter den genannten Bedingungen betrug die Dichte der Plasmid-Primer-Komplexe durchschnittlich ca. 15 pro 100 µm² und lag damit in der gewünschten Größenordnung.

Auf einer zweiten, in gleicher Weise vorbereiteten Oberfläche (mit Hind III linearisierte, durch Hitze in einzelsträngige Form überführte pMOS-Blue-Plasmid-DNA ca. 3400 NT lang, Konzentration 0.1 µg/µl mit hybridisierten Primern) wird eine zyklische Sequenzierungsreaktion durchgeführt. Dabei werden dUTP-SS-R-Cy3 (Fig. 1) und dCTP-SS-R-Cy3 (Fig. 2) als reversible Terminatoren verwendet (Tcherkassov et al Aktenzeichen 101 20 797.2-41 beim DPuMA). Die Detektionsapparatur ist dieselbe wie im Vorversuch.

Die für die zyklische Sequenzierungsreaktion verwendeten Lösungen setzen sich wie folgt zusammen:

a) Reaktionslösung für die Einbaureaktion: 20 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 8.5, 5 mmol/l MgCl₂, 10% Glycerin, Klenow-Fragment (Amersham Pharmacia-Biotech) 2 U pro 50 µl (dialysiert gegen 20 mmol/l Tris-HCl, pH 8.5), dUTP-SS-R-Cy3 bzw. dCTP-SS-R-Cy3, oder dATP und dGTP je 10 µmol/l.
b) Waschlösung: 20 mmol/l Tris-HCl pH 8.5, 0.01% Na-Azid
c) Reaktionslösung für die Abspaltungsreaktion: 20 mmol/l Tris-HCl, pH 8.5, 50 mmol/l Merkaptoethanol.

Die Einbaureaktionen mit markierten NT*s wurden bei 30°C 15 Minuten durchgeführt. Im ersten Zyklus der Sequenzierungsreaktion wurde eine Reaktionslösung mit dCTP-SS-R- Cy3 zugegeben. Nach einem Waschschritt wurde ein Detektionsschritt durchgeführt, wobei Einzelmolekül-Signale mit den zugeordneten x,y-Koordinaten auf der Oberfläche registriert wurden (ca. 11.200 Signale). Danach wurde die Markierung von den eingebauten NT*s abgespalten (Raumtemperatur, 10 Minuten) und die Oberfläche gewaschen.

Im zweiten Zyklus wurde eine Reaktionslösung mit dUTP-SS-R-Cy3 zugegeben und 15 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Nach einem anschließenden Waschschritt wurden die Einzelmolekül-Signalen auf der Oberfläche detektiert (ca. 200 Signale). Dies entspricht dem Hintergrundsignal, das durch eine unspezifische Bindung der NT*s an die Oberfläche entsteht. Die Markierung von den NT*s wurde abgespalten (Raumtemperatur, 10 Minuten) und die Oberfläche mit der Waschlösung gewaschen.

Im dritten Zyklus wurde eine Reaktionslösung mit dATP und dGTP zugegeben und 15 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde die Oberfläche gewaschen.

Die Zyklen 1 bis 3 wurden drei mal wiederholt, wobei insgesamt ca. 9900 CCU- Zielsequenzen ermittelt wurden. Diese Zielsequenzen können eindeutig zum Primer zugeordnet werden.

Legende für Fig. 1 und 2

Dargestellt sind Nukleotidanaloga, die zu einer reversiblen Termination führen. Dabei wirkt der über einen Linker an die Base gekoppelte Farbstoff (Cy3) als eine zur Termination führende Gruppe (Tcherkassov et al Aktenzeichen 101 20 797.2-41 beim DPuMA). Nach dem Einbau der NT* in den komplementären Strang und der Detektion der Signale wird diese Gruppe durch die Spaltung der Disulfidbindung entfernt, so dass ein anderes NT* eingebaut werden kann.

Claims

1. Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Sequenzabschnitten einer Gesamtsequenz mit sequenzspezifischen Primern, das folgende Schritte einschließt:

1. 1.1. Bereitstellung von einzelsträngigen NSKFs mit einer Länge von etwa 30 bis 1000 Nukleotiden, die überlappenden Teilsequenzen der Gesamtsequenz entsprechen

2. 1.2. Immobilisierung von NSKF-Molekülen an einer planen Oberfläche in einer zufälligen Anordnung

3. 1.3. Hybridisierung (Annealing) von einer oder mehreren sequenzspezifischen Primerpopulationen an die immobilisierten NSKFs, wobei die Dichte der einzelnen extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexe zwischen 10 und 1000 pro 100 µm² liegt.

4. 1.4. Durchführung einer zyklischen Aufbaureaktion der zu NSKFs komplementären Stränge, die folgende Schritte einschließt:

a) Zugabe einer Lösung zu den gebundenen NSKFs, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nukleotide (NTs*) enthält, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei NTs* jeweils an den NTs* befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, daß sich die verwendeten NTs* durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, und die NTs* strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen NT* in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres NT* in denselben Strang einzubauen, wobei die zur Termination führende Gruppe mit dem Fluoreszenzfarbstoff abspaltbar ist.

b) Inkubation der in Stufe a) erhaltenen stationären Phase unter Bedingungen, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein NT* verlängert werden.

c) Waschen der in Stufe b) erhaltenen stationären Phase unter Bedingungen, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter NTs* geeignet sind.

d) Detektion der einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten NT*-Moleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt.

e) Abspaltung der zur Termination führenden Gruppen mit den Fluoreszenzfarbstoffen von den am komplementären Strang angefügten NTs* zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs

f) Waschen der in Stufe e) erhaltenen stationären Phase unter Bedingungen, die zur Entfernung der zu Termination führenden Gruppen mit den Fluoreszenzfarbstoffen geeignet sind

Wiederholung der Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach, wobei man die relative Position einzelner NSKFs auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den NTs bestimmt.

2. Oberfläche zur Immobilisierung von einzelsträngigen NSKFs nach Anspruch 1 charakterisiert dadurch, dass die NSKFs in einer zufälligen Anordnung auf der Oberfläche immobilisiert werden können, wobei die Dichte der immobilisierten NSKF-Moleküle zwischen 10 und 1.000.000 pro 100 µm² liegt.

3. Plane Oberfläche nach Anspruch 1, die aus Glas, Kunststoff, Gel oder Keramik besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem im Detektionsschritt (d) folgende Detektionsarten eingesetzt werden: Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie, Laser-Scanning- Fluoreszenzmikroskopie, TIRF-Mikroskopie.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Konzentration einzelner sequenzspezifischer Primer während der Hybridisierung (Annealing) zwischen 10 pmol/l und 100 µmol/l liegt.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 1 charakterisiert dadurch, dass es zur SNP-Analyse eingesetzt wird und ein sequenzspezifischer Primer zur Identifizierung jeder SNP-Stelle in der Gesamtsequenz verwendet wird.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 6 charakterisiert dadurch, dass die Zahl der parallel zu analysierenden SNP-Stellen mehr als 2 ist und für jede SNP-Stelle ein sequenzspezifischer Primer verwendet wird.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 1 charakterisiert dadurch, dass die Gesamtsequenz folgende NSK-Arten einschließt: genomische DNA und deren Abkömmlinge, mRNA-Populationen oder davon abgeleitete cDNA-Populationen.

9. Primer nach oben genannten Ansprüchen, wobei Primer eine oder mehrere Primerpopulationen darstellen, eine Primerpopulation zu einem Abschnitt in der Gesamtsequenz komplementär sequenzspezifisch ist und die Primermoleküle in einer Primerpopulation identische Sequenz-Zusammensetzung haben.

10. Primer nach Anspruch 9, deren Länge zwischen 10 und 100 NT liegt.