DE10213184A1

DE10213184A1 - Preparation of optically active beta-aminocarboxylic acids for, e.g. preparation of medicaments, involves enantioselective hydrolysis of racemic N-acylated beta-aminocarboxylic acid in presence of hydrolase by way of biocatalyst

Info

Publication number: DE10213184A1
Application number: DE2002113184
Authority: DE
Inventors: Harald Groeger; Harald Trauthwein; Karlheinz Drauz; Stefan Buchholz; Christiane Sacherer; Helge Werner
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-03-23
Filing date: 2002-03-23
Publication date: 2003-10-02

Abstract

Optically active beta-aminocarboxylic acids are prepared from racemic N-acylated beta-aminocarboxylic acids by enantioselective hydrolysis of the N-acylated beta-aminocarboxylic acid in the presence of a hydrolase by way of biocatalyst. Preparation of optically active beta-aminocarboxylic acids from racemic N-acylated beta-aminocarboxylic acids comprises enantioselective hydrolysis of the N-acylated beta-aminocarboxylic acid in the presence of a hydrolase by way of biocatalyst. The N-acyl substituent of the N-acylated beta-aminocarboxylic acid exhibits structure (I), (IIA), (IIB), (III), or their corresponding salts. R1, R2 = H, halo, alkyl residues, OH, alkoxy residues, or aryloxy residues; and R3 = halo, alkoxy residues, or aryloxy residues.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven β-Aminocarbonsäuren. The invention relates to a method of manufacture of optically active β-aminocarboxylic acids.

Optisch aktive β-Aminocarbonsäuren treten in Naturstoffen wie Alkaloiden und Antibiotika auf und deren Isolierung gewinnt zunehmend an Interesse, nicht zuletzt wegen deren steigender Bedeutung als essentielle Zwischenprodukte bei der Herstellung von Arzneimitteln (siehe u. a.: E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004). Sowohl die freie Form optisch aktiver β-Aminocarbonsäuren als auch deren Derivate zeigen interessante pharmakologische Effekte und können auch bei der Synthese modifizierter Peptide eingesetzt werden. Optically active β-aminocarboxylic acids occur in natural products like alkaloids and antibiotics and their isolation is gaining increasing interest, not least because of it increasing importance as essential intermediates the manufacture of medicinal products (see, inter alia: E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004). Either the free form of optically active β-aminocarboxylic acids as well their derivatives show interesting pharmacological effects and can also be used in the synthesis of modified peptides be used.

Als Herstellungsmethoden für β-Aminocarbonsäuren haben sich bislang die klassische Racematspaltung über diastereomere Salze (vorgeschlagene Route in: H. Boesch et al., Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27) und insbesondere die diastereoselektive Addition von Lithium-Phenylethylamid (A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970) etabliert. Letztere Methode gilt als intensiv erforscht und wird trotz zahlreicher dabei auftretender Nachteile bevorzugt angewandt. Zum einen werden stöchiometrische Mengen eines chiralen Reagenzes benötigt, was im Vergleich zu katalytischen asymmetrischen Methoden einen großen Nachteil darstellt. Außerdem werden teure und zudem gefährliche Hilfsstoffe wie beispielsweise n- Butyllithium zur Aktivierung des stöchiometrischen Reagenz durch Deprotonierung benötigt. Für eine genügende Stereoselektivität ist zudem die Durchführung der Reaktion bei niedrigen Temperaturen von ca. -70°C wichtig, was einen hohen Anspruch an das Reaktormaterial, zusätzliche Kosten und einen hohen Energieverbrauch bedeutet. As production methods for β-aminocarboxylic acids so far the classic resolution of racemates via diastereoisomers Salts (suggested route in: H. Boesch et al., Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27) and in particular the diastereoselective addition of lithium phenylethylamide (A. F. Abdel-Magid, J.H. Cohen, C.A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970). The latter method is considered is intensively researched and is being used despite numerous disadvantages occurring preferably applied. For one thing stoichiometric amounts of a chiral reagent are required, what compared to catalytic asymmetric methods is a big disadvantage. They also become expensive and dangerous auxiliary substances such as n- Butyllithium to activate the stoichiometric reagent required by deprotonation. For a sufficient Stereoselectivity is also the implementation of the reaction at low temperatures of approx. -70 ° C important, which one high demands on the reactor material, additional costs and means high energy consumption.

Die Herstellung von optisch aktiven β-Aminocarbonsäuren auf biokatalytischem Wege spielt zwar gegenwärtig nur eine untergeordnete Rolle, ist aber insbesondere aufgrund der ökonomischen und ökologischen Vorteile biokatalytischer Reaktionen wünschenswert. Es entfällt der Einsatz stöchiometrischer Mengen eines chiralen Reagenzes und stattdessen werden geringe, katalytische Mengen von Enzymen eingesetzt, die natürliche und umweltfreundliche Katalysatoren darstellen. Diese im wässrigen Medium effizient eingesetzten Biokatalysatoren weisen neben ihren katalytischen Eigenschaften und ihrer hohen Wirksamkeit zudem, im Gegensatz zu einer Vielzahl von synthetischen metallhaltigen Katalysatoren, den Vorteil auf, dass auf die Verwendung metallhaltiger, insbesondere schwermetallhaltiger und somit toxischer Einsatzstoffe verzichtet werden kann. The production of optically active β-aminocarboxylic acids only one currently plays a biocatalytic path secondary role, but is particularly due to the economic and ecological advantages of biocatalytic Reactions desirable. There is no use stoichiometric amounts of a chiral reagent and instead, small, catalytic amounts of enzymes used the natural and environmentally friendly Represent catalysts. This in an aqueous medium efficiently used biocatalysts have in addition to their catalytic properties and their high effectiveness moreover, in contrast to a large number of synthetic metal-containing catalysts, the advantage of that on the Use of metal containing, especially heavy metal and thus toxic feedstocks can be dispensed with.

Im Stand der Technik wurde z. B. bereits mehrfach über die enantioselektive N-Acylierung von β-Aminocarbonsäuren berichtet. In the prior art, e.g. B. already several times over the enantioselective N-acylation of β-aminocarboxylic acids reported.

So beschreiben L. T. Kanerva et al. in Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 7, No. 6, S. 1707-1716, 1996 die enantioselektive N-Acylierung von Ethylestern verschiedener alicylischer β-Aminocarbonsäuren mit 2,2,2- Trifluorethylester in organischen Lösungsmitteln und Lipase SP 526 aus Candida antarctica oder Lipase PS aus Pseudomonas cepacia als Biokatalysator. For example, L. T. Kanerva et al. in Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 7, No. 6, pp. 1707-1716, 1996 the enantioselective N-acylation of different ethyl esters alicyclic β-aminocarboxylic acids with 2,2,2- Trifluoroethyl ester in organic solvents and lipase SP 526 from Candida antarctica or Lipase PS from Pseudomonas cepacia as a biocatalyst.

V. M. Sánchez et al. untersuchten die biokatalytische Racematspaltung von (±)-Ethyl-3-aminobutyrat (Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 8, No. 1, S. 37-40, 1997) mit Lipase aus Candida antarctica über die Herstellung des N-acetylierten β-Aminocarbonsäureesters. V. M. Sánchez et al. examined the biocatalytic Racemate resolution of (±) -ethyl-3-aminobutyrate (tetrahedron: Asymmetry, Vol. 8, No. 1, pp. 37-40, 1997) with lipase Candida antarctica on the preparation of the N-acetylated β-amino carboxylic ester.

In EP-A-8 890 649 ist eain Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Aminosäureestern aus racemischen Aminosäureestern durch enantioselektive Acylierung mit einem Carbonsäureester in Gegenwart einer Hydrolase, ausgewählt aus der Gruppe Amidase, Protease, Esterase und Lipase, und nachfolgende Isolierung des nicht umgesetzten Enantiomers des Aminosäureesters offenbart. EP-A-8 890 649 describes a process for the preparation of optically active amino acid esters from racemic Amino acid esters by enantioselective acylation with a Carboxylic acid esters in the presence of a hydrolase from the group amidase, protease, esterase and lipase, and subsequent isolation of the unreacted enantiomer of the amino acid ester disclosed.

WO-A-98/50575 betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer chiralen β-Aminocarbonsäure oder ihrer entsprechenden Ester durch Inberührungbringen einer racemischen β- Aminocarbonsäure, eines Acyldonors und Penicilin G Acylase unter Bedingungen, um ein Enantiomer der racemischen β- Aminocarbonsäure stereoselektiv zu acylieren, wobei das andere Enantiomer im wesentlichen nicht umgesetzt wird, und man so eine chirale β-Aminocarbonsäure erhält. WO-A-98/50575 relates to a method for obtaining a chiral β-aminocarboxylic acid or its corresponding ester by contacting a racemic β- Aminocarboxylic acid, an acyl donor and penicilin G acylase under conditions to form an enantiomer of the racemic β- To acylate aminocarboxylic acid, the other enantiomer is essentially unreacted, and a chiral β-aminocarboxylic acid is thus obtained.

Wünschenswert wäre insbesondere die Übertragung einer bei den α-Aminocarbonsäuren industriell bereits praktizierten Biokatalyse-Technologie auf β-Aminocarbonsäuren. Von Interesse ist vor allem die Racematspaltung von racemischen N-Acetyl-α-aminocarbonsäuren oder entsprechenden an der N- Acetylgruppe substituierten Derivaten über enzymatische Deacetylierung unter Einsatz von Hydrolasen, insbesondere Acylasen. Die racemischen Ausgangsverbindungen sind leicht mit Hilfe von Essigsäurederivaten herstellbar und deren Synthese gelingt zudem in situ, so dass die N-acetylierten Produkte ohne zusätzlichen Isolierungsschritt direkt in der biokatalytischen Reaktion eingesetzt werden können. Die Ausbeuten von Acetylierungsreaktionen liegen im quantitativen Bereich, und die Ausgangsverbindungnen, so z. B. Chloressigsäure, Methoxyessigsäure oder Acetanhydrid, sind preiswerte und in großen Mengen verfügbare Chemikalien. Ein weiterer Vorteil solcher Acetylderivate im Vergleich zu anderen Acylderivaten ist die leichte Abtrennbarkeit der IV- Acetylaminocarbonsäure von der Essigsäure (bzw. deren substituierten Derivate) nach der Reaktion. In particular, it would be desirable to transfer one to the α-aminocarboxylic acids already practiced industrially Biocatalysis technology on β-aminocarboxylic acids. Of Of particular interest is the resolution of racemic racemates N-acetyl-α-aminocarboxylic acids or corresponding at the N- Acetyl group-substituted derivatives via enzymatic Deacetylation using hydrolases, in particular Acylases. The racemic starting compounds are light producible with the help of acetic acid derivatives and their Synthesis also succeeds in situ, so that the N-acetylated Products without additional insulation step directly in the biocatalytic reaction can be used. The Yields of acetylation reactions are in the quantitative range, and the starting compounds, see above z. B. chloroacetic acid, methoxyacetic acid or acetic anhydride, are inexpensive chemicals that are available in large quantities. Another advantage of such acetyl derivatives compared to other acyl derivatives is the easy separability of the IV Acetylaminocarboxylic acid from acetic acid (or its substituted derivatives) after the reaction.

Die Anwendung dieses Konzepts scheiterte allerdings bislang für β-Aminocarbonsäure. Leider stellte sich heraus, dass sich Hydrolasen, insbesondere Acylasen, für derartige Reaktionen nicht zu eignen scheinen. H. K. Chenault, J. Dahmer, G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6354-6364 stellten fest, dass sich weder acyclische noch cyclische N-Acyl-β-aminocarbonsäuren als Substrate eignen. Bezüglich der acylischen Verbindung wurde eine N- Acetylverbindung untersucht. Dieses Ergebnis wurde durch eigene Versuche der Erfinder mit anderen Hydrolasen, insbesondere Acylasen, bestätigt. The application of this concept has so far failed for β-aminocarboxylic acid. Unfortunately, it turned out that hydrolases, especially acylases, for such Reactions don't seem to be appropriate. H.K. Chenault, J. Dahmer, G.M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6354-6364 found that neither acyclic nor Cyclic N-acyl-β-aminocarboxylic acids are suitable as substrates. Regarding the acylic compound, an N- Acetyl compound examined. This result was achieved by the inventors' own experiments with other hydrolases, especially acylases.

Lediglich über die enantioselektiven Hydrolyse von racemischen N-Phenylacetyl-β-aminocarbonsäuren mit Penicillin Acylase wurde bislang berichtet (V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Soloüenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341; 7. Soloshonok,, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, T. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 1119-1126; V. Soloshonok,. N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1601-1610; G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161): Nachteilig bei diesem Verfahren ist die schwierige Aufarbeitung des Produktgemisches nach der enantioselektiven Hydrolyse. Nach Abtrennung der freien β-Aminocarbonsäure erhält man ein Gemisch aus Phenylessigsäure und N-Phenyläcetyl-β- Aminocarbonsäure, das schwierig aufzutrennen ist. Only through the enantioselective hydrolysis of with racemic N-phenylacetyl-β-aminocarboxylic acids Penicillin acylase has been reported to date (V.A. Soloshonok, V.K. Svedas, V.P. Kukhar, A.G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Soloüenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341; 7. Soloshonok ,, A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, T. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E.V. Kozlova, Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 1119-1126; V. Soloshonok ,. N.A. Fokina, A.V. Rybakova, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, A.E. Sochorinsky, V.P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1601-1610; G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161): disadvantageous with this The procedure is the difficult reappraisal of the Product mixture after the enantioselective hydrolysis. To Separation of the free β-aminocarboxylic acid is obtained Mixture of phenylacetic acid and N-phenylacetyl-β- Aminocarboxylic acid, which is difficult to separate.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine neues einfach und wirtschaftlich durchführbares Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven β- Aminocarbonsäuren zur Verfügung zu stellen. The present invention is based on the object a new simple and economical to implement Process for the production of optically active β- To provide aminocarboxylic acids.

Die Aufgabe wird überraschenderweise gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven β- Aminocarbonsäuren aus racemischen N-acylierten β- Aminocarbonsäuren durch enantioselektive Hydrolyse der N- acylierten β-Aminocarbonsäure in Gegenwart einer Hydrolase als Biokatalysator, wobei der N-Acylsubstituent der N- acylierten β-Aminocarbonsäure. (I) Struktur I

worin R¹, R² jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H; Halogen, vorzugsweise Chlor, Brom und Fluor; Alkylresten mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl und tert.- Butyl; OH; Alkoxyresten mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere Methoxy und Ethoxy, und Aryloxyresten mit vorzugsweise 6 bis 14 C-Atomen, insbesondere Phenoxy; und
R³ ausgewählt ist aus Halogen, vorzugsweise Chlor, Alkoxyresten mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere Methoxy, und Aryloxyresten mit vorzugsweise 6 bis 14 C-Atomen, insbesondere Phenoxy; (II) Struktur IIA oder IIB

oder die Struktur der entsprechenden Salze oder (III) Struktur III

oder die Struktur des entsprechenden Salzes aufweist. The object is surprisingly achieved by a process for the preparation of optically active β-aminocarboxylic acids from racemic N-acylated β-aminocarboxylic acids by enantioselective hydrolysis of the N-acylated β-aminocarboxylic acid in the presence of a hydrolase as a biocatalyst, the N-acyl substituent being the N-acylated one β-aminocarboxylic acid. (I) Structure I

wherein R ¹ , R ^{2 are} each independently selected from H; Halogen, preferably chlorine, bromine and fluorine; Alkyl radicals with preferably 1 to 10 carbon atoms, in particular methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and tert-butyl; OH; Alkoxy radicals with preferably 1 to 10 carbon atoms, in particular methoxy and ethoxy, and aryloxy radicals with preferably 6 to 14 carbon atoms, in particular phenoxy; and
R ^{3 is} selected from halogen, preferably chlorine, alkoxy radicals with preferably 1 to 10 C atoms, in particular methoxy, and aryloxy radicals with preferably 6 to 14 C atoms, in particular phenoxy; (II) Structure IIA or IIB

or the structure of the corresponding salts or (III) structure III

or has the structure of the corresponding salt.

Entgegen bisherigen Erkenntnissen aus der Literatur und eigenen Forschungsergebnissen der Erfinder findet völlig unerwartet eine Reaktion der speziellen N-acylierten β- Aminocarbonsäuren mit einer Hydrolase statt. Contrary to previous knowledge from literature and own inventions of the inventor finds completely a reaction of the special N-acylated β- Aminocarboxylic acids with a hydrolase instead.

Besonders effektiv verläuft die enantioselektive Hydrolyse mit einem N-Acylsubstituent der Struktur I, wenn R³ Chlor ist, gegebenenfalls auch R¹ oder R² Chlor ist, oder wenn R³ Methoxy ist oder wenn R¹, R² und R³ jeweils Fluor sind. Beispielhafte N-Acylsubstituenten sind N-Chloracetyl, N- Dichloracetyl, N-Methoxyacetyl und N-Trifluoracetyl. Ein weiterer Vorteil dieser N-Acylsubstituenten ist, dass die bei der Hydrolyse daraus entstehenden Essigsäurederivate wegen ihres relativ geringen Molekulargewichts leicht vom Produktgemisch abgetrennt werden können. Enantioselective hydrolysis with an N-acyl substituent of structure I is particularly effective if R ^{3 is} chlorine, optionally also R ¹ or R ^{2 is} chlorine, or if R ^{3 is} methoxy or if R ¹ , R ² and R ^{3 are} each fluorine , Exemplary N-acyl substituents are N-chloroacetyl, N-dichloroacetyl, N-methoxyacetyl and N-trifluoroacetyl. Another advantage of these N-acyl substituents is that the acetic acid derivatives resulting from them during hydrolysis can easily be separated from the product mixture because of their relatively low molecular weight.

Insbesondere ist das Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven aromatischen β-Aminocarbonsäuren durch Umsetzung einer N-acylierten β-Aminocarbonsäure der nachfolgenden Struktur IV geeignet,

worin der N-Acylsubstituent wie zuvor definiert ist; R⁴ ausgewählt ist aus H; Alkylresten mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl; OH, Alkoxyresten mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methoxy und Ethoxy; und Halogen, und X für ein Heteroatom, vorzugsweise N, oder CH steht, Besonders vorteilhaft ist es, wenn der N-Acylsubstituent die Struktur I aus Anspruch 1 aufweist, worin R¹ und R² jeweils H sind und R³ Chlor ist, und R⁴ gleich H ist und X gleich CH ist. The process is particularly suitable for the production of optically active aromatic β-aminocarboxylic acids by reacting an N-acylated β-aminocarboxylic acid of the structure IV below,

wherein the N-acyl substituent is as previously defined; R ^{4 is} selected from H; Alkyl radicals with preferably 1 to 10 carbon atoms, in particular methyl, ethyl, propyl and butyl; OH, alkoxy radicals with preferably 1 to 4 carbon atoms, in particular methoxy and ethoxy; and halogen, and X represents a heteroatom, preferably N, or CH. It is particularly advantageous if the N-acyl substituent has the structure I from claim 1, in which R ¹ and R ^{2 are} each H and R ^{3 is} chlorine, and R ⁴ is H and X is CH.

Insbesondere geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver 3-Amino-3-phenylpropionsäure (β-Amino-β-phenylpropionsäure) aus der entsprechenden racemischen N-acylierten 3-Amino-3-phenylpropionsäure. The method according to the invention is particularly suitable for Production of optically active 3-amino-3-phenylpropionic acid (β-amino-β-phenylpropionic acid) from the corresponding racemic N-acylated 3-amino-3-phenylpropionic acid.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch vorteilhaft zur Herstellung von optisch aktiven aliphatischen β- Aminocarbonsäuren durch Umsetzung einer N-acylierten β- Aminocarbonsäure der nachfolgenden Struktur V,

worin R⁵ für eine Alkylcrruppe, insbesondere eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl- oder tert.- Butylgruppe, oder eine aubstituierte Alkylgruppe, insbesondere eine substituierte Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl- oder tert.-Butylgruppe steht. Die Substituenten sind vorzugsweise ausgewählt aus Halogenen, Benzyl und N-, O- und S-haltigen Substituenten. The process according to the invention is also advantageous for the production of optically active aliphatic β-aminocarboxylic acids by reacting an N-acylated β-aminocarboxylic acid of the following structure V

wherein R ^{5 is} an alkyl group, especially a methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl or tert-butyl group, or a substituted alkyl group, especially a substituted methyl, ethyl, n Propyl, iso-propyl, n-butyl or tert-butyl group. The substituents are preferably selected from halogens, benzyl and N-, O- and S-containing substituents.

Die als Ausgangsverbindungen eingesetzten racemischen N- acylierten β-Aminocarbonsäuren gewinnt man allgemein aus der racemischen β-Aminocarbonsäure durch Umsetzung mit geeigneten Säurechloriden oder -anhydriden. Es ist auch die Herstellung der racemischen N-acylierten β-Aminocarbonsäuren in situ und der direkte Einsatz in die biokatalytische Reaktion möglich. The racemic N- used as starting compounds Acylated β-aminocarboxylic acids are generally obtained from the racemic β-aminocarboxylic acid by reaction with suitable acid chlorides or anhydrides. It is also that Preparation of the racemic N-acylated β-aminocarboxylic acids in situ and direct use in biocatalytic Reaction possible.

Als Hydrolasen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl von Enzymen eingesetzt werden; geeignete Hydrolasen sind beispielsweise Acylasen, Proteasen, Lipasen oder Esterasen, vorzugsweise Acylasen. Als besonders geeignet hat sich dabei der Einsatz von Schweinenierenacylase vom Typ I erwiesen. Die Reaktion gelingt aber auch unter Einsatz einer Protease, vorzugsweise aus Aspergillus, und bevorzugter aus Aspergillus oryzae. As hydrolases in the process according to the invention a variety of enzymes are used; suitable Hydrolases are, for example, acylases, proteases, lipases or esterases, preferably acylases. As special the use of Type I pig kidney acylase. The reaction but also succeeds using a protease, preferably from Aspergillus, and more preferably from Aspergillus oryzae.

Das verwendete Enzym kann in nativer oder immobilisierter Form eingesetzt werden. Es ist auch die Verwendung von gentechnisch veränderten Enzymen möglich. The enzyme used can be in native or immobilized Form are used. It is also the use of genetically modified enzymes possible.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in wässriger Lösung durchcreführt. Der pH-Wert liegt dabei üblicherweise zwischen 6 und 10, vorzugsweise zwischen 7 und 9. The inventive method is preferably in carried out aqueous solution. The pH is there usually between 6 and 10, preferably between 7 and 9th

In wässriger Lösung beträgt die Konzentration der N- acylierten β-Aminocarbonsäure bevorzugt 2 bis 40 Gew.-%, bevorzugter 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge im Reaktionsgemisch. In aqueous solution the concentration of the N- acylated β-aminocarboxylic acid, preferably 2 to 40% by weight, more preferably 5 to 20 wt .-%, based on the total amount in Reaction mixture.

Außer in wässriger Lösung kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise wassermischbaren Lösungsmitteln wie etwa Methanol und Ethanol, sowie in entsprechenden Mischungen von organischen Lösungsmitteln mit Wasser durchgeführt werden. Except in aqueous solution, the invention Process also in organic solvents, preferably water-miscible solvents such as methanol and Ethanol, as well as in corresponding mixtures of organic Solvents are carried out with water.

Die zuzusetzende Menge an Enzym hängt von der Art der Hydrolase und der Aktivität der Enzympräparation ab. Die für die Reaktion optimale Enzymmenge kann vom Fachmann leicht durch einfache Vorversuche ermittelt werden. The amount of enzyme to be added depends on the type of Hydrolase and the activity of the enzyme preparation. The for the reaction optimal enzyme amount can easily by the expert can be determined by simple preliminary tests.

Die Hydrolyse der N-acylierten β-Aminocarbonsäure unter Enzymkatalyse wird üblicherweise bei Temperaturen zwischen 10 und 60°C, insbesondere zwischen 20 und 40°C durchgeführt. The hydrolysis of the N-acylated β-aminocarboxylic acid Enzyme catalysis is usually carried out at temperatures between 10 and 60 ° C, especially between 20 and 40 ° C.

Der Reaktionsverlauf lässt sich leicht mit üblichen Methoden, beispielsweise mittels HPLC verfolgen. Man beendet die Racematspaltung sinnvollerweise bei einem Umsatz von 50% der racemischen N-acylierten β-Aminocarbonsäure. Dies geschieht in der Regel durch Entfernen des Enzyms aus dem Reaktionsraum, beispielsweise durch Filtration, vorzugsweise Ultrafiltration. The course of the reaction can easily be done with usual Follow methods, for example using HPLC. You quit the resolution of racemates makes sense with a turnover of 50% the racemic N-acylated β-aminocarboxylic acid. This usually happens by removing the enzyme from the Reaction space, for example by filtration, preferably Ultrafiltration.

Durch die enantioselektive Hydrolyse der racemischen Nacylierten β-Aminocarbonsäure entsteht aus dem einen Enantiomer die entsprechende β-Aminocarbonsäure, während das andere Enantiomer im wesentlichen nicht umgesetzt wird. Das nun vorliegende Gemisch aus N-acylierter β-Aminocarbonsäure und β-Aminocarbonsäure lässt sich leicht mit üblichen Methoden trennen. Gut geeignet zur Trennung des Gemisches sind beispielsweise Extraktions- und/oder Filtrationsverfahren bei geeigneten pH-Werten. Through the enantioselective hydrolysis of the racemic Nacylated β-aminocarboxylic acid arises from one Enantiomeric the corresponding β-aminocarboxylic acid, while the other enantiomer is essentially unreacted. The now present mixture of N-acylated β-aminocarboxylic acid and β-aminocarboxylic acid can be easily with conventional Separate methods. Well suited for separating the mixture are, for example, extraction and / or Filtration process at suitable pH values.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich noch ökonomischer gestalten, wenn man nach Abtrennung des gewünschten Enantiomers das verbliebene, nicht gewünschte Enantiomer nach im Stand der Technik bekannten Methoden racemisiert und erneut in das Verfahren einführt. The method according to the invention can be even more economical design if after separating the desired Enantiomer the remaining, undesired enantiomer racemized by methods known in the art and reintroduced into the process.

Durch diese Rückführung wird es möglich, insgesamt mehr als 50% des gewünschten Enantiomers aus der racemischen N- acylierten β-Aminocarbonsäure zu gewinnen. This return makes it possible to total more than 50% of the desired enantiomer from the racemic N- to win acylated β-aminocarboxylic acid.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur zur Herstellung von optisch aktiven β-Aminocarbonsäuren, sondern kann auch Teil komplizierter Mehrstufensynthesen, beispielsweise bei der Herstellung von Arzneimitteln oder Pflanzenschutzmitteln sein. The method according to the invention is not only suitable for Production of optically active β-aminocarboxylic acids, but can also be part of complicated multi-step syntheses, for example in the manufacture of pharmaceuticals or Pesticides.

Die Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht werden. The invention will now be illustrated by the following examples are illustrated.

Example 1 (comparative example)

In einem Reaktionsgefäß werden eine Lösung, bestehend aus 900 µl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers mit pH = 8,0, 100 µl einer 0,1 M wässrigen Lösung von rac-N-Acetyl-3- amino-3-phenylpropionsäure und 5 mg Schweinenierenacylase vom Typ I (Hersteller: Sigma) bei 30°C für 24 h gerührt und anschließend mittels HPLC (Säule: Nautilus; Eluent: H₂O und Acetonitril im Volumenverhältnis 80 : 20 mit 0,1 Vol-% Trifluoressigsäure, 220 nm, 1 ml/min. Injektion: 900 µl Eluent + 100 µl Reaktionsmischung) die Umsatzrate bestimmt. Die Umsatzrate liegt bei <1%. In a reaction vessel, a solution consisting of 900 ul of a 50 mM sodium phosphate buffer with pH = 8.0, 100 ul of a 0.1 M aqueous solution of rac-N-acetyl-3-amino-3-phenylpropionic acid and 5 mg of pig kidney acylase from Type I (manufacturer: Sigma) stirred at 30 ° C for 24 h and then by means of HPLC (column: Nautilus; eluent: H ₂ O and acetonitrile in a volume ratio of 80:20 with 0.1% by volume of trifluoroacetic acid, 220 nm, 1 ml / min injection: 900 µl eluent + 100 µl reaction mixture) determines the conversion rate. The turnover rate is <1%.

Example 2

In einem Reaktionsgefäß werden eine Lösung, bestehend aus 950 µl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers mit pH = 8,0, 50 µl einer 10%-igen (w/vol.%) Lösung von rac-N-Chloracetyl- 3-amino-3-phenylpropionsäure in Aceton und 5 mg Schweinenierenacylase vom Typ I (Hersteller: Sigma) bei 30°C für 24 h gerührt und anschließend mittels HPLC (Säule: Nautilus; Eluent: H₂O und Acetonitril im Volumenverhältnis 80 : 20 mit 0,1 Vol-% Trifluoressigsäure, 220 nm, 1 ml/min. Injektion: 900 µl Eluent + 100 µl Reaktionsmischung) die Umsatzrate bestimmt. Die Umsatzrate liegt bei 14%. In a reaction vessel, a solution consisting of 950 μl of a 50 mM sodium phosphate buffer with pH = 8.0, 50 μl of a 10% (w / vol.%) Solution of rac-N-chloroacetyl-3-amino-3- phenylpropionic acid in acetone and 5 mg type I kidney acylase (manufacturer: Sigma) at 30 ° C for 24 h and then by HPLC (column: Nautilus; eluent: H ₂ O and acetonitrile in a volume ratio of 80:20 with 0.1 vol. % Trifluoroacetic acid, 220 nm, 1 ml / min, injection: 900 µl eluent + 100 µl reaction mixture) determines the conversion rate. The turnover rate is 14%.

Example 3

In einem Reaktionsgefäß werden 50 ml einer wässrigen Lösung, bestehend aus einem Kaliumphosphatpuffer mit pH = 7,0 sowie von 127 mg rac-N-Chloracetyl-3-amino-3-phenylpropionsäure (0,5 mmol) vorgelegt. Anschließend gibt man 120 mg der Schweinenierenacylase vom Typ I (Hersteller: Sigma) hinzu und lässt das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (ca. 25°C) reagieren. Der Umsatz liegt nach 5 Tagen bei 9% und nach 19 Tagen bei 46% (gemäß HPLC der Reaktionsprobe). 50 ml of an aqueous solution, consisting of a potassium phosphate buffer with pH = 7.0 as well of 127 mg rac-N-chloroacetyl-3-amino-3-phenylpropionic acid (0.5 mmol) submitted. Then you give 120 mg of Type I pig kidney acylase (manufacturer: Sigma) and leaves the reaction mixture at room temperature (approx. 25 ° C) react. The turnover is 9% after 5 days and after 19 Days at 46% (according to HPLC of the reaction sample).

Example 4

In einem Reaktionsgefäß werden 50 ml einer wässrigen Lösung von 127 mg rac-N-Chloracetyl-3-anino-3-phenylpropionsäure (0,5 mmol), die mittels NaOH auf pH = 8,2 eingestellt wurde, vorgelegt und auf eine Temperatur von 30°C gebracht. Anschließend gibt man 120 mg der Schweinenierenacylase vom Typ I (Hersteller: Sigma) hinzu und lässt das Reaktionsgemisch bei einer Reaktionstemperatur von 30°C reagieren. Nach 5 Tagen liegt der Umsatz bei 24% (gemäß HPLC der Reaktionsprobe). Nach einem Zeitraum von 13 Tagen wird das Reaktionsgemisch zunächst durch Ultrafiltration von der Enzymkomponente abgetrennt. Es wird ein klares Filtrat erhalten, aus dem dann die Umsatzrate sowie die Enantioselektivität in Bezug auf die gebildete optisch aktive 3-Amino-3-phenylpropionsäure bestimmt werden. Die Umsatzrate liegt dabei bei 35% und für die Enantioselektivität wurden >98% ee ermittelt. 50 ml of an aqueous solution are placed in a reaction vessel of 127 mg of rac-N-chloroacetyl-3-anino-3-phenylpropionic acid (0.5 mmol), which was adjusted to pH = 8.2 using NaOH, submitted and brought to a temperature of 30 ° C. Then give 120 mg of the pig kidney acylase from Type I (manufacturer: Sigma) and leaves that Reaction mixture at a reaction temperature of 30 ° C react. After 5 days, the conversion is 24% (according to HPLC the reaction sample). After a period of 13 days the reaction mixture first by ultrafiltration from the Enzyme component separated. It becomes a clear filtrate get, from which then the turnover rate as well as the Enantioselectivity with respect to the formed optically active 3-amino-3-phenylpropionic acid can be determined. The Sales rate is 35% and for that Enantioselectivity was determined> 98% ee.

Example 5

In einem Reaktionsgefäß werden eine Lösung, bestehend aus 950 µl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers mit pH = 7,5, 50 µl einer 10%-igen (w/vol.%) Lösung von rac-N-Chloracetyl-3- amirio-3-phenylpropionsäure in Aceton, und 5 mg Protease aus Aspergillus oryzae (Hersteller: Sigma: Protease XXIII) bei 30°C für 4 Tage gerührt und anschließend mittels HPLC wie in Beispiel 2 die Umsatzrate bestimmt. Die Umsatzrate liegt bei 6%. In a reaction vessel, a solution consisting of 950 µl of a 50 mM sodium phosphate buffer with pH = 7.5, 50 µl of a 10% (w / vol.%) solution of rac-N-chloroacetyl-3- amirio-3-phenylpropionic acid in acetone, and 5 mg protease Aspergillus oryzae (manufacturer: Sigma: Protease XXIII) at Stirred at 30 ° C for 4 days and then by HPLC as in Example 2 determines the turnover rate. The turnover rate is 6%.

Claims

1. Process for the preparation of optically active β-aminocarboxylic acids from racemic N-acylated β-aminocarboxylic acids by enantioselective hydrolysis of the nacylated β-aminocarboxylic acid in the presence of a hydrolase as a biocatalyst, the N-acyl substituent being the nacylated β-aminocarboxylic acid

(I) Structure I

wherein R1, R2 are each independently selected from H, halogen, alkyl radicals, OH, alkoxy radicals and aryloxy radicals,
R ^{3 is} selected from halogen, alkoxy radicals and aryloxy radicals,

(II) Structure IIA or IIB

or the structure of the corresponding salts or

(III) Structure III

or has the structure of the corresponding salt.

2. The method according to claim 1, characterized in that the N-acyl substituent of the N-acylated β-aminocarboxylic acid has structure T, wherein R ¹ , R ^{2 are} each independently selected from H, chlorine, bromine, fluorine, methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, tert-butyl, methoxy and ethoxy and R3 is selected from chlorine and methoxy.

3. The method according to claim 2, characterized, that R1 and R2 are each H and R3 is chlorine.

4. The method according to claim 2, characterized, that R1 is H and R2 and R3 are both chlorine.

5. The method according to claim 2, characterized, that R1 and R2 are each H and R3 is methoxy.

6. The method according to claim 1, characterized, that R1, R2 and R3 are each fluorine.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the N-acylated β-aminocarboxylic acid is an aromatic N-acylated β-aminocarboxylic acid of structure IV

wherein the N-acyl substituent is as defined in claim 1; R ^{4 is} selected from H, alkyl radicals, OH, alkoxy radicals, and halogen, and X represents a hetero atom, preferably N, or CH.

8. The method according to claim 7, characterized in that the N-acyl substituent has the structure I from claim 1 wherein R ¹ and R ^{2 are} each H and R ^{3 is} chlorine, and R ⁴ is H and X is CH.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized, that the hydrolase is an acylase, protease, lipase or Is esterase.

10. The method according to claim 9, characterized, that the acylase is type I pig kidney acylase.

11. The method according to claim 9, characterized, that the hydrolase is a protease from Aspergillus.

12. The method according to claim 11, characterized, that the protease is from Aspergillus oryzae.