DE10211545A1

DE10211545A1 - Use of polypeptides of human origin for the treatment of microbial infectious diseases

Info

Publication number: DE10211545A1
Application number: DE10211545A
Authority: DE
Inventors: Christiane Kirchhoff; Hans Henning Von Horsten; Petra Derr
Original assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Current assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-10-02
Also published as: WO2003077938A1; AU2003219059A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs mit der in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von biologisch aktiven Fragmenten oder Varianten derselben zur Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen.The invention relates to the use of polypeptides of human origin having the amino acid sequence given in SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 or of biologically active fragments or variants thereof for the treatment of microbial infectious diseases.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs mit der in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von biologisch aktiven Fragmenten derselben zur Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen. The present invention relates to the use of Polypeptides of human origin having the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 indicated amino acid sequence or of biologically active Fragments thereof for the treatment of microbial Infectious diseases.

Weltweit leiden über 2 Billionen Menschen an den ernsthaften Folgen von Infektionskrankheiten. In vielen Ländern Asiens, Afrikas sowie Mittel- und Südamerikas bilden diese Erkrankungen die häufigste Todesursache. Nicht zuletzt durch den Einsatz von Antibiotika konnte die Mortalität in den Industrienationen auf etwa 2-4% gesenkt werden. Das verstärkte Auftreten von gegen Antibiotika resistenten Stämmen pathogener Bakterien droht jedoch, diese Erfolge in Frage zu stellen. So wurde beispielsweise in den Jahren von 1989 bis 1993 eine 20-fache Zunahme von Infektionen mit Vankomycin-resistenten Enterokokken beobachtet. Als Reaktion auf die dramatische Zunahme und Verbreitung von Resistenzen bei klinisch relevanten Mikroorganismen fordert die Weltgesundheitsorganisation (WHO) seit mehreren Jahren nachdrücklich die Entwicklung neuer antibiotisch wirksamer Leitstrukturen. Worldwide over 2 trillion people suffer from the serious Consequences of infectious diseases. In many countries of Asia, Africa and Central and South America form these diseases the most common cause of death. Not least through the use of Antibiotics could put on mortality in industrialized nations about 2-4% are lowered. The increased occurrence of against Antibiotic-resistant strains of pathogenic bacteria threatens however, to question these successes. So for example in the years 1989 to 1993 a 20-fold increase of Infections with vancomycin-resistant enterococci were observed. As Reaction to the dramatic increase and spread of Resistance in clinically relevant microorganisms calls the World Health Organization (WHO) for several years strongly encouraging the development of new antibiotic agents Lead structures.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung neuer Mittel mit antimikrobieller Wirksamkeit. The object of the present invention is therefore the provision new agent with antimicrobial activity.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Verwendung von Polypeptiden humanen Ursprungs mit der in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder von Fragmenten derselben mit gleicher antimikrobieller Wirksamkeit zur Herstellung von Pharmazeutika für die Behandlung von mikrobiellen Infektionserkrankungen gelöst. According to the invention, the object is achieved by the use of Polypeptides of human origin with the in SEQ ID NO. 5 or SEQ ID No. 6 amino acid sequence or fragments thereof with the same antimicrobial effectiveness for the production of Pharmaceuticals for the treatment of microbial Infectious diseases solved.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide leiten sich von den im Stand der Technik bereits bekannten Epididymis-spezifischen, humanen Polypeptiden HE2α1 und HE2α2 gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 her. Deren Identifizierung erfolgte anhand von cDNA-Klonierung und -Analyse. Diese erstmals in der DE 40 02 981 beschriebenen Polypeptide wurden für die Verwendung bei der Diagnose und der Behandlung der männlichen Infertilität vorgeschlagen. The polypeptides of the invention are derived from those in the state the art already known epididymis-specific, human Polypeptides HE2α1 and HE2α2 according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ago. Their identification was by cDNA cloning and analysis. This first described in DE 40 02 981 Polypeptides have been approved for use in diagnosis and the Treatment of male infertility is suggested.

Es hat sich inzwischen gezeigt, dass die ursprünglich identifizierten HE2α1- und HE2α2-cDNA-Klone Mitglieder einer Familie Epididymis-spezifischer Varianten sind, die aus dem differentiellen Spleißen der entsprechenden mRNA hervorgehen (Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253; vgl. Fig. 1). Die aus den verschiedenen Spleißvarianten hervorgehenden Polypeptide (nachfolgend als HE2-Polypeptide bezeichnet) sind schematisch in Fig. 2 gezeigt. In the meantime, it has been shown that the originally identified HE2α1 and HE2α2 cDNA clones are members of a family of epididymis-specific variants resulting from the differential splicing of the corresponding mRNA (Hamil et al (2000), Endocrinology, 141, 1245) -1253, see Fig. 1). The polypeptides resulting from the various splice variants (hereafter referred to as HE2 polypeptides) are shown schematically in FIG .

Bei den HE2-Polypeptiden handelt es sich um kationische Polypeptide, die eine für Sekret-Polypeptide typische Signalsequenz von 25 Aminosäuren besitzen, welche beim Export aus der Zelle abgespalten wird. The HE2 polypeptides are cationic Polypeptides which have a signal sequence typical of secretion polypeptides Have 25 amino acids, which when exported from the cell is split off.

Unterschiedliche Expressionsmuster verschiedener HE2-Varianten innerhalb des menschlichen Epididymis sowie die Bindung spezifischer HE2-Polypeptidvarianten an bestimmte Regionen menschlicher Spermatozoen (Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525; Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253) lassen spezielle Funktionen der einzelnen Polypeptide bei der posttesticularen Spermareifung im proximalen Epididymis sowie bei der Befruchtung vermuten. Experimentelle Daten verweisen darüber hinaus auf eine Androgen-abhängige Regulation auf post-transkriptionaler Ebene (Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253). Different expression patterns of different HE2 variants within the human epididymis as well as the binding specific HE2 polypeptide variants to specific regions of human Spermatozoa (Osterhoff et al., 1994), Biol. Repro., 50, 516-525; Hamil et al. (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253) special functions of the individual polypeptides in the Posttesticular sperm maturation in the proximal epididymis as well as in of fertilization. Experimental data refer to it to an androgen-dependent regulation post-transcriptional level (Hamil et al (2000), Endocrinology, 141, 1245-1253).

Kürzlich wurde auch im Epididymis der Ratte ein Epididymis-spezifisches Polypeptid (Bin1b) isoliert (Li et al. (2001), Science, 291, 1783-1785). Die Analyse der Aminosäure-Sequenz zeigte das Vorhandensein eines für die Familie der β-Defensine - einer Gruppe antimikrobiell wirksamer Polypeptide - typischen Strukturmotivs aus 6 Cystein-Resten, die 3 Disulfidbrücken mit charakteristischem Verbrückungsmuster bilden (vgl. Fig. 3) auch bei Bin1b. Die Autoren konnten in Untersuchungen mit E. coli zeigen, daß Bin1b ebenfalls die den β-Defensinen eigene antimikrobielle Wirksamkeit entfaltet. Li et al. weisen darüberhinaus auf die strukturelle Verwandtschaft von Bin1b mit der humanen Epididymis-spezifischen HE2-Variante HE2β1 hin, welche ebenfalls das für β-Defensine typische Strukturmotiv umfaßt. Recently, an epididymis-specific polypeptide (Bin1b) has also been isolated in rat epididymis (Li et al., (2001) Science 291, 1783-1785). Analysis of the amino acid sequence revealed the presence of a structural motif of 6 cysteine residues typical of the family of β-defensins, a group of antimicrobially active polypeptides, which form 3 disulfide bridges with characteristic bridging patterns (see Figure 3) also in Bin1b. The authors were able to show in studies with E. coli that Bin1b also unfolds its own anti-microbial activity to the β-defensins. Li et al. moreover indicate the structural relationship of Bin1b with the human epididymis-specific HE2 variant HE2β1, which also includes the structural motif typical of β-defensins.

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

Fig. 1 revidierte Struktur des humanen HE2-Genlocus, der zwei zusätzliche Exons und zwei Promotoren aufweist (vgl. Jia et al. (2001), Gene, 263, 211-218). Offene Leserahmen sind gepunktet dargestellt, β-Defensindomänen schwarz. Fig. 1 revised structure of human HE2 gene locus having two additional exons and two promoters (see Jia et al., (2001), Gene, 263, 211-218). Open reading frames are dotted, β-defensin domains are black.

Fig. 2 schematische Darstellung der neuen HE2-Polypeptid-Isoformen, die sich anhand von klonierten cDNAs vorhersagen lassen, sowie Lokalisation von Polypeptidfragmenten für die Antipolypeptid-Antikörperherstellung. HE2α1 and HE2α2 unterscheiden sich lediglich durch drei Aminosäuren; die drei gepunkteten Linien markieren die Aminosäureaustausche. Signalpeptide = Rechtecke mit weißem Hintergrund; Signalpeptidase- und Proproteinkonvertase-Schnittstellen (↓); reife Polypeptide = hellgraue Rechtecke; Lokalisation der Polypeptidfragmente für die Antikörperherstellung, P1-P5 = dunkelgraue Rechtecke, Zahlen verweisen auf entsprechende Aminosäurereste innerhalb der HE2-Polypeptide; β-Defensin-ähnliche Module = Rechtecke mit schwarzem Hintergrund. Fig. 2 Schematic representation of the novel HE2 polypeptide isoforms which can be predicted from cloned cDNAs, as well as localization of polypeptide fragments for antipolypeptide antibody production. HE2α1 and HE2α2 differ only by three amino acids; the three dotted lines mark the amino acid changes. Signal peptides = rectangles with white background; Signal Peptidase and Proprotein Convertase Interfaces (↓); mature polypeptides = light gray rectangles; Localization of polypeptide fragments for antibody production, P1-P5 = dark gray rectangles, numbers refer to corresponding amino acid residues within HE2 polypeptides; β-defensin-like modules = rectangles with a black background.

Fig. 3 Aminosäuresequenzen von HE2β1 und HE2C in einem Aminosäuresequenz-Alignment mit humanen β-Defensinen (hBD1-4) sowie β-Defensinkonsensus-Sequenz. Bindestriche wurden eingefügt, um das Alignment zu verbessern. Fig. 3 amino acid sequences of HE2β1 and HE2C in an amino acid sequence alignment with human β-defensins (hBD1-4) and β-defensin consensus sequence. Hyphens have been added to improve the alignment.

Fig. 4 proteolytische Spaltung von rekombinant exprimierten HE2-Polypeptiden in-vitro. Furin-Peptidase-Spaltung von in E. coli exprimierten MBP-proHE2α1 Protein und nachfolgende Western-Blot Analyse mit P3-Antiserum (1 : 500). Bahn 1: Faktor Xa/Furin-Doppelverdau von 50 µg MBP-proHE2α1; Bahn 2: Furinverdau von 50 µg MBP- HE2α1. Die Furinspaltung von HE2α1 war im Rahmen des Doppelverdaus effizienter. Fig. 4 proteolytic cleavage of recombinantly expressed HE2 polypeptides in vitro. Furin-peptidase cleavage of MBP-proHE2α1 protein expressed in E. coli and subsequent Western blot analysis with P3 antiserum (1: 500). Lane 1: factor Xa / furin double digest of 50 μg MBP-proHE2α1; Lane 2: furin digestion of 50 μg MBP-HE2α1. The furin cleavage of HE2α1 was more efficient as part of the double digestion.

Fig. 5 antibakterielle Aktivität synthetischer C-terminaler HE2α-Polypeptidfragmente. a) Kontinuierliche Essigsäure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Coomassiefärbung der Polypeptidfragmente mit und ohne intramolekularer Disulfidbrücke. M = Markerproteine; Bahn 1 = etwa 50 µg des partiell cyklisierten HE2α2- Fragments; Bahn 2 = 10 µg lineares HE2α2-Fragment; Bahn 3 = Positivkontrolle (Kristallviolett). b) Gel- Overlay eines parallelen Essigsäure-Harnstoff-Gels. Fig. 5 Antibacterial activity of synthetic C-terminal HE2α polypeptide fragments. a) Continuous acetic acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis and Coomassie staining of polypeptide fragments with and without intramolecular disulfide bridge. M = marker proteins; Lane 1 = about 50 μg of the partially cyclized HE2α2 fragment; Lane 2 = 10 μg of linear HE2α2 fragment; Lane 3 = positive control (crystal violet). b) Gel overlay of a parallel acetic acid-urea gel.

Die antimikrobielle Aktivität wird durch klare Zonen ohne bakterielles Wachstum sichtbar. The antimicrobial activity is through clear zones visible without bacterial growth.

Fig. 6 Quantifizierung der antibakteriellen Aktivität durch CFU-Assay des linearen HE2α2-Fragments (▴) und des partiell cyklischen HE2α2-Fragments (▪) gegen E. coli DHSα. FIG. 6 Quantification of antibacterial activity by CFU assay of the linear HE2α2 fragment (▴) and the partially cyclic HE2α2 fragment (▪) against E. coli DH5α.

Fig. 7 schematische Darstellung epididymaler HE2-Polypeptid- Isoformen. Prozessierung, Aminosäuresequenz und Struktur reifer in vivo HE2α-Isoformen im Vergleich mit den synthetischen HE2α-Polypeptidfragmenten, die im Rahmen der antibakteriellen Assays verwendet wurden. Signalpeptid = Rechteck mit weißem Hintergrund; gespaltene Pro-Domäne = Hellgraues Rechteck; prozessierte Polypeptide = Rechtecke mit schwarzem Hintergrund. Die Ziffern beziehen sich auf die Numerierung der Aminosäuren beginnend mit Methionin 1 (1-25: Signalpeptid; 26-60: verlängertes Pro-Polypeptid; 61-103: reifes HE2α; 74-103: synthetisches Polypeptid). Fig. 7 Schematic representation of epididymal HE2 polypeptide isoforms. Processing, amino acid sequence and structure of mature in vivo HE2α isoforms in comparison with the synthetic HE2α polypeptide fragments used in the antibacterial assays. Signal peptide = rectangle with white background; split pro domain = light gray rectangle; processed polypeptides = rectangles with black background. The numbers refer to the numbering of the amino acids starting with methionine 1 (1-25: signal peptide; 26-60: extended pro-polypeptide; 61-103: mature HE2α; 74-103: synthetic polypeptide).

Fig. 8 Gel-Retardations-Assay des linearen HE2α2-Polypeptidfragments. In den Bahnen 1-9 wurden jeweils 300 ng eines 500 bp-PCR-Amplifikats verwendet, welches nicht mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden verwandt ist. Bahn O enthält 800 ng des Amplifikats. Bahn M enthält einen 1 kb-DNA-Längenstandard. Die Bahnen 1-9 enthalten ferner steigende Polypeptid-Konzentrationen (Bahn 1: 0 µg; Bahn 2: 0,6 µg; Bahn 3: 1,2 µg; Bahn 4: 1,8 µg; Bahn 5: 2,4 µg; Bahn 6: 3,0 µg; Bahn 7: 6,0 µg; Bahn 8: 18,0 µg; Bahn 9: 30,0 µg). Während bei der Negativkontrolle (linkes Gel) ein synthetisches Polypeptid mit einer aus HE2-Propeptid-Domäne abgeleiteten Aminosäuresequenz verwendet wurde (vgl. SEQ ID Nr. 9), enthielten die als "HE2α" gekennzeichneten Proben (rechtes Gel) das erfindungsgemäße HE2α2-Polypeptidfragment. Die schwarzen Dreiecke markieren die PCR-Amplifikatbande. Fig. 8 Gel retardation assay of the linear HE2α2 polypeptide fragment. Lanes 1-9 each used 300 ng of a 500 bp PCR amplificate which is not related to the polypeptides of the invention. Lane O contains 800 ng of the amplificate. Lane M contains a 1 kb DNA length standard. Lanes 1-9 also contain increasing polypeptide concentrations (lane 1: 0 μg; lane 2: 0.6 μg; lane 3: 1.2 μg; lane 4: 1.8 μg; lane 5: 2.4 μg; Lane 6: 3.0 μg; Lane 7: 6.0 μg; Lane 8: 18.0 μg; Lane 9: 30.0 μg). While the negative control (left gel) used a synthetic polypeptide having an HE2-propeptide domain-derived amino acid sequence (see SEQ ID NO: 9), the samples labeled as "HE2α" (right gel) contained the HE2α2 polypeptide fragment of the present invention , The black triangles mark the PCR amplification band.

Fig. 9 a) Gelelektrophoretische Trennung von Superose 12- FPLC-Fraktionen des gespaltenen MBP-proHE2α1-Fusionsproteins nach Faktor Xa-Verdau. Fraktion 16 enthält das proHE2α1-Polypeptid, welches vom Maltose-Binde- Protein (MBP) abgespalten wurde. b) Untersuchung pro- HE2α1-Polypeptid haltiger Fraktionen aus der Gelfiltration auf antimikrobiellen Aktivität gegen E. coli DH5α im Radial-Diffusions-Assay. In die linke Agarvertiefung (-) wurden etwa 20 µg proHE2α1-Polypeptid pipettiert. In die rechte Vertiefung (+) wurden zum Vergleich ebenfalls etwa 20 µg des synthetischen, linearen HE2α1-Fragments (SEQ ID Nr. 7) gegeben. Figure 9 a) Gel electrophoretic separation of Superose 12 FPLC fractions of the cleaved MBP-proHE2α1 fusion protein after Factor Xa digestion. Fraction 16 contains the proHE2α1 polypeptide which has been cleaved from the maltose-binding protein (MBP). b) Examination of pro-HE2α1 polypeptide-containing fractions from gel filtration for antimicrobial activity against E. coli DH5α in the radial diffusion assay. Approximately 20 μg of proHE2α1 polypeptide were pipetted into the left agar well (-). In the right well (+), about 20 μg of the synthetic, linear HE2α1 fragment (SEQ ID NO: 7) was also added for comparison.

Die HE2-Varianten HE2α1- und HE2α2 mit den SEQ ID Nrn. 1 und 2 umfassen das β-Defensin-typische Strukturmotiv nicht. Umso überraschender war daher die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Erkenntnis, daß die erfindungsgemäß vorgeschlagenen, die Aminosäuren 61 bis 103 der SEQ Nrn. 1 oder 2 umfassenden Polypeptide gemäß SEQ. ID Nrn. 5 oder 6 oder Fragmente derselben ausgeprägte antimikrobielle Wirksamkeit entfalten. Erfindungsgemäß wird somit eine neue Klasse antimikrobiell wirksamer Polypeptide zur Verfügung gestellt, deren Ursprung im männlichen Genitaltrakt liegt und die keiner bekannten Klasse antimikrobiell wirksamer Polypeptide zuzuordnen sind. The HE2 variants HE2α1- and HE2α2 with SEQ ID Nos. 1 and 2 do not include the β-defensin-typical structural motif. more Therefore, it was more surprising that the basis of the present invention underlying finding that the inventively proposed comprising amino acids 61 to 103 of SEQ ID NOS: 1 or 2 Polypeptides according to SEQ. ID Nos. 5 or 6 or fragments thereof develop pronounced antimicrobial activity. Thus, according to the invention, a new class becomes more antimicrobially effective Polypeptides provided whose origin in the male Genital tract lies and no known class antimicrobially active polypeptides are assigned.

Wie ein Vergleich der in SEQ ID Nrn. 1 und 2 bzw. 5 und 6 angegebenen Sequenzen zeigt, unterscheiden sich die Varianten HE2α1 und HE2α2 lediglich hinsichtlich dreier Aminosäuren in den Positionen 77, 85 und 89 (bezogen auf SEQ ID Nrn. 1 und 2), d. h. es handelt sich bei dem Polypeptid HE2α2 um eine allelische Variante des ersten von Kirchhoff et al. beschriebenen humanen Epididymis-spezifischen Polypeptids HE2α1 (vgl. DE 40 02 981). As a comparison of the in SEQ ID Nos. 1 and 2 or 5 and 6 shows different sequences, the variants HE2α1 differ and HE2α2 only in terms of three amino acids in the Positions 77, 85 and 89 (based on SEQ ID NOs: 1 and 2), d. H. it the polypeptide HE2α2 is an allelic Variant of the first by Kirchhoff et al. described human Epididymis-specific polypeptide HE2α1 (see DE 40 02 981).

Die Epididymis-spezifischen Polypeptide HE2α1 und HE2α2 werden im humanen Nebenhoden als Prä-Pro-Polypeptide synthetisiert. Sie enthalten eine typische N-terminale Signalsequenz (Aminosäuren 1 bis 25, vgl. Fig. 2), die beim Transport aus der Zelle abgetrennt wird. Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß es sich bei dem nach Abspaltung der Signalsequenz erhaltenen Polypeptid gemäß den SEQ. ID. Nrn. 3 und 4 um ein antimikrobiell nicht aktives Pro-Polypeptid handelt (vgl. Fig. 2, Fig. 9), aus dem erst nach erneuter Spaltung an einer konservierten Schnittstelle zwischen den Aminosäuren 60 und 61 (bezogen auf SEQ ID Nrn. 1 und 2) das reife, antimikrobiell aktive Polypeptid hervorgeht (vgl. SEQ. ID. Nrn. 5 und 6). The epididymis-specific polypeptides HE2α1 and HE2α2 are synthesized in the human epididymis as pre-pro polypeptides. They contain a typical N-terminal signal sequence (amino acids 1 to 25, see Fig. 2), which is separated during transport from the cell. According to the invention, it has been found that the polypeptide obtained after cleavage of the signal sequence according to SEQ. ID. Nos. 3 and 4 is an antimicrobially inactive pro-polypeptide (see Fig. 2, Fig. 9), from which only after renewed cleavage at a conserved interface between the amino acids 60 and 61 (based on SEQ ID Nos. 1 and 2) the mature, antimicrobially active polypeptide is evident (see SEQ ID NOS: 5 and 6).

Erfindungsgemäß hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß das reife Polypeptid gemäß den SEQ. ID. Nrn. 5 und 6 sowie Fragmente desselben ausgeprägte antimikrobielle Wirksamkeit aufweisen. According to the invention, it has surprisingly been found that the mature polypeptide according to SEQ. ID. Nos. 5 and 6 and fragments have the same pronounced antimicrobial activity.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der die 30 C-terminalen Aminosäuren 74 bis 103 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 oder 2) umfassenden Fragmente gemäß den SEQ. ID. Nrn. 7 und 8 als antimikrobielle Mittel. A particularly preferred embodiment of the invention relates the use of the 30 C-terminal amino acids 74 to 103 (based on SEQ ID NOs: 1 or 2) comprising fragments according to the SEQ. ID. Nos. 7 and 8 as antimicrobial agents.

Erfindungsgemäß einbezogen sind ferner antimikrobiell wirksame Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, die sich von den in den SEQ. ID. Nrn. 5, 6, 7 und 8, angegebenen Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden, wobei Polypeptide, welche das β-Defensin-Motiv aufweisen, nicht als Varianten im erfindungsgemäßen Sinne gelten. Also included according to the invention are antimicrobially active Variants of the polypeptides of the invention, which differ from the in the SEQ. ID. Nos. 5, 6, 7 and 8, indicated sequences Exchange, insertion or deletion of one or more Differentiate amino acids, wherein polypeptides containing the β-defensin motif, not as variants in the invention Meaning.

Ferner können die erfindungsgemäßen Polypeptide am N-terminalen Ende eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren aufweisen, soweit die antimikrobielle Wirksamkeit erhalten bleibt. So können die in den SEQ. ID. Nrn. 7 und 8 angegebenen Polypeptide zusätzliche Aminosäuren an ihrem N-Terminus, vorzugsweise 1 bis 13, aufweisen, ohne daß ihre antimikrobielle Aktivität negativ beeinflußt wird. Furthermore, the polypeptides of the invention at the N-terminal End have one or more additional amino acids, as far as the antimicrobial effectiveness is maintained. So can the in the SEQ. ID. Nos. 7 and 8 polypeptides additional Amino acids at their N-terminus, preferably 1 to 13, without adversely affecting their antimicrobial activity becomes.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide HE2α1 und HE2α2 werden im humanen Nebenhoden als Prä-Pro-Polypeptide exprimiert, die gegenüber den in SEQ. ID. Nrn. 5 und 6 angegebenen Sequenzen zusätzliche Aminosäuren am N-terminalen Ende sowie eine interne proteolytische Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 60 und 61 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 und 2) aufweisen. The polypeptides HE2α1 and HE2α2 according to the invention are described in US Pat human epididymis expressed as pre-pro polypeptides, the compared to the in SEQ. ID. Nos. 5 and 6 indicated sequences additional amino acids at the N-terminal end as well as an internal one proteolytic cleavage site between amino acids 60 and 61 (based on SEQ ID NOS: 1 and 2).

Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß die reifen HE2α1 und HE2α2-Polypeptide gemäß den SEQ. ID. Nrn. 5 und 6 durch die 35 Aminosäure lange am N-terminalen Ende vorgeschaltete Sequenz (Aminosäuren 1-35 bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 3 und 4) in einem antimikrobiell inaktiven Zustand gehalten werden (vgl. Beispiel 4 und Beispiel 5). Erst nach proteolytischer Abspaltung dieser N-terminalen Domäne an der internen proteolytischen Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 60 und 61 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 und 2) wird die antimikrobielle Wirksamkeit erhalten. According to the invention it has been shown that the mature HE2α1 and HE2α2 polypeptides according to SEQ. ID. Nos. 5 and 6 through the 35th Amino acid long at the N-terminal end upstream sequence (Amino acids 1-35 based on SEQ ID NOS: 3 and 4) in held in an antimicrobial inactive state (see. Example 4 and Example 5). Only after proteolytic cleavage this N-terminal domain at the internal proteolytic Cleavage site between amino acids 60 and 61 (based on the SEQ. ID. Nos. 1 and 2), the antimicrobial efficacy receive.

Dementsprechend betrifft die Erfindung auch Polypeptide, bei denen die zuvor definierten antimikrobiell wirksamen Polypeptide am N-terminalen Ende eine zusätzliche Aminosäuresequenz aufweisen, welche die Polypeptide bezüglich ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit inaktiviert, und bei denen die inaktivierende Aminosäuresequenz über eine proteolytische Spaltstelle mit den antimikrobiell wirksamen Polypeptiden verknüpft ist. Erfindungsgemäß handelt es sich um eine Spaltstelle, die von einem Enzym erkannt wird, welches für den oder die Erreger der jeweils zu behandelnden Infektionskrankheit spezifisch ist. Eine solche interne proteolytische Spaltstelle eröffnet die Möglichkeit, einen lokal aktivierbaren antimikrobiellen Wirkstoff auf der Basis der erfindungsgemäßen HE2α-Polypeptide herzustellen, der seine Aktivität erst entfaltet, wenn er mit bestimmten bakteriellen Pathogenitätsfaktoren (wie beispielsweise Proteasen) in Kontakt kommt. Eine solche antibiotische Substanz liegt auch bei systemischer Verabreichung nur am Ort der Infektion in aktiver Form vor. Die natürliche Körperflora des Patienten sowie gesunde Körperzellen und Gewebe werden auf diese Weise weitgehend geschont. Die lokale Aktivierung des jeweiligen Antibiotikums mittels der erfindungsgemäßen Spaltstelle trägt ferner dazu bei, den bakteriellen Selektionsprozess von Resistenzen gegen den betreffenden antimikrobiellen Wirkstoff zu minimieren. Accordingly, the invention also relates to polypeptides, in those the previously defined antimicrobially active polypeptides an additional amino acid sequence at the N-terminal end which contain the polypeptides with respect to their antimicrobial Inactivated efficacy, and in which the inactivating Amino acid sequence via a proteolytic cleavage site with the antimicrobially active polypeptides is linked. According to the invention is a cleavage site of a Enzyme is detected, which is responsible for the pathogen (s) of each specific to the infectious disease to be treated. Such internal proteolytic cleavage site opens the possibility a locally activated antimicrobial agent on the Base of the HE2α polypeptides of the invention, the his activity unfolds only when he is with certain bacterial pathogenicity factors (such as proteases) comes into contact. Such an antibiotic substance is also with systemic administration only at the site of infection in active form. The natural body flora of the patient as well Healthy body cells and tissues become that way largely spared. Local activation of each Antibiotic by means of the cleavage site according to the invention further contributes In addition, the bacterial selection process of resistance against the antimicrobial agent concerned.

Als N-terminale Sequenz, welche die erfindungsgemäßen HE2α1- und HE2α2-Polypeptide in inaktiven Zustand hält, kommen grundsätzlich beliebige Aminosäuresequenzen in Betracht, die eine geeignete Spaltstelle umfassen. Die Aminosäuresequenzen können hinsichtlich ihrer Länge variieren, wobei die Aminosäuresequenz 1 bis 35 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 3 und 4) besonders bevorzugt sind. As N-terminal sequence which the HE2α1- and HE2α2 polypeptides in inactive state keeps coming basically any amino acid sequences into consideration, the one include suitable cleavage site. The amino acid sequences can vary in length, the amino acid sequence being 1 to 35 (referring to SEQ ID NOs: 3 and 4) particularly are preferred.

Bei der Spaltstelle, die eine Abspaltung der inaktivierenden Sequenz von dem antimikrobiell aktiven HE2α-Polypeptidanteil ermöglicht, kann es sich um jede Aminosäuresequenz handeln, die von einem Enzym des Erregers mit hinreichender Spezifität erkannt und zur Spaltung genutzt wird. Besonders vorteilhaft ist es, wenn es sich um ein für den Erreger spezifisches Enzym handelt, das weder von humanen oder tierischen Gewebezellen noch von Bakterien der natürlichen Körperflora synthetisiert wird. At the cleavage site, a cleavage of the inactivating Sequence of the antimicrobially active HE2α polypeptide moiety This may be any amino acid sequence that of an enzyme of the pathogen with sufficient specificity recognized and used for splitting. Is particularly advantageous it, if it is a specific for the pathogen enzyme that does not affect human or animal tissue cells either is synthesized by bacteria of the natural body flora.

Ein solches Enzym mit hoher Sequenzspezifität ist die im Stand der Technik beschriebene IgA1-Protease Typ2, die u. a. bei Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis) nachgewiesen wurde (Wood and Burton (1991), Infection and Immunity, 59(5), 1818-1822; Pohlner et al., (1992), Biotechnology 10, 799-804. Ihre Synthese und Sekretion ist beispielsweise bei der Gattung Neisseria streng an die Virulenz der betreffenden Spezies gekoppelt. Such an enzyme with high sequence specificity is in the state the art described IgA1 protease type 2, the u. a. at Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis) (Wood and Burton (1991) Infection and Immunity, 59 (5), 1818-1822; Pohlner et al., (1992), Biotechnology 10, 799-804. Your synthesis and For example, secretion is severe in the genus Neisseria coupled the virulence of the species concerned.

Die IgA1-Protease Typ2 erkennt beispielsweise die kurze Aminosäuresequenz:
TPAPRPP ↓ TP
und spaltet proteolytisch an der mit Hilfe des Pfeils oben dargestellten Position. Die IgA1-Protease Typ2 eignet sich demgemäß besonders zur proteolytischen Aktivierung von rekombinanten Fusionspolypeptiden. Die Erkennungssequenz kann durch Austausch, Insertion oder Deletion einzelner Aminosäuren variieren. For example, the IgA1 protease type 2 recognizes the short amino acid sequence:
TPAPRPP ↓ TP
and cleaves proteolytically at the position shown by the arrow above. Accordingly, the IgA1 protease type 2 is particularly suitable for the proteolytic activation of recombinant fusion polypeptides. The recognition sequence can vary by replacement, insertion or deletion of individual amino acids.

Eine weitere geeignete spezifische Protease ist die Metalloprotease ZapA (Fernandez et al., (2000), Braz J Med Biol Res, 33(7), 765-770), welche beispielsweise die Aminosäuresequenz
AFR ↓ SAAQ
erkennt und an der mit Hilfe des Pfeils dargestellten Position spaltet. Die Protease wird von dem humanpathogenen Bakterium Proteus mirabilis als Virulenzfaktor synthetisiert und in das umgebende Medium sekretiert. Auch diese Spaltstelle kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzt werden, wobei einzelne Aminosäurerste der Erkennnungssequenz ausgetauscht werden können, sofern dies die Erkennung durch ZapA nicht behindert. Another suitable specific protease is the metalloprotease ZapA (Fernandez et al., (2000), Braz J Med Biol Res, 33 (7), 765-770), which for example, the amino acid sequence
AFR ↓ SAAQ
detects and splits at the position shown with the help of the arrow. The protease is synthesized by the human pathogenic bacterium Proteus mirabilis as a virulence factor and secreted into the surrounding medium. This cleavage site can also be used in the context of the present invention, wherein individual amino acid residues of the recognition sequence can be exchanged, provided this does not hinder the recognition by ZapA.

Je nach Erregerart sind weitere Enzyme als aktivierende Faktoren denkbar. So kommen beispielsweise bei Protozoneninfektionen wie z. B. der durch Entamoeba histolytica verursachten Amöbiasis spezifische Cysteinproteasen als aktivierende Enzyme in Betracht. Auch Protozoen wie Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, Cryptosporidiurn parvum und Toxoplasma gondii synthetisieren extrazelluäre Cysteinproteasen, die in die Pathogenitätsmechanismen des jeweiligen Organismus involviert sind. Als Virulenzfaktoren fungierende Cysteinproteasen konnten auch bei einigen Helminthen und Bakterien nachgewiesen werden. Depending on the type of pathogen, other enzymes are activating factors conceivable. For example, in proto-zonal infections such as z. The amoebiasis caused by Entamoeba histolytica specific cysteine proteases as activating enzymes in Consideration. Also protozoans like Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, Cryptosporidium parvum and Toxoplasma gondii synthesize extracellular cysteine proteases that are in the Pathogenicity mechanisms of the respective organism are involved. As Virulenzfaktoren acting cysteine proteases were also in some helminths and bacteria are detected.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann sowohl mittels rekombinanter Verfahren als auch auf chemosynthetischem Wege erfolgen. Rekombinante Expressionssysteme, bei denen die für Polypeptide oder Peptide kodierende DNA in einen Vektor oder ein Phagemid kloniert wird, und die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die heterologe Expression der kodierenden DNA konstitutiv oder nach Zugabe eines Induktors erlauben, sind im Stand der Technik vielfach beschrieben und umfassen u. a. das Baculovirus-Expressionssytem, das 6His-Expressionssystem und das MBP-Fusionsprotein-Expressionssystem. The preparation of the polypeptides according to the invention can both by recombinant methods as well as chemosynthetic Paths take place. Recombinant expression systems in which the for polypeptides or peptides encoding DNA into a vector or a phagemid is cloned, and after being introduced into a phagemid suitable host cell heterologous expression of the coding DNA constitutively or after adding an inductor are allowed in the State of the art often described and include u. a. the Baculovirus expression system, the 6His expression system and the MBP fusion protein expression system.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Polypeptidfragmentes nach einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem man

a) eine DNA, die für ein Polypeptid mit einer der in SEQ ID Nr. 5 bis SQ ID Nr. 8 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert oder Fragmente oder Varianten derselben, in einen Vektor oder ein Phagemid kloniert;
b) den Vektor oder das Phagemid der Stufe (a) in eine Zelle einbringt; und
c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression der DNA ermöglichen.

The invention thus also relates to a process for the preparation of a polypeptide or polypeptide fragment according to any one of the preceding claims, wherein

a) a DNA which codes for a polypeptide having one of the amino acid sequences given in SEQ ID No. 5 to SQ ID No. 8 or clones fragments or variants thereof, into a vector or a phagemid;
b) introducing the vector or phagemid of step (a) into a cell; and
c) culturing the cell under conditions which allow expression of the DNA.

Die Klonierung kann beispielsweise ausgehend von epididymaler mRNA durch reverse Transkription und nachfolgender PCR-Amplifikation der entstandenen cDNA mit Hilfe der bei Fröhlich et al. (2000), J Androl., 21, 421-30, beschriebenen Oligonukleotidprimer erfolgen. Alternativ kann, wie in DE 40 02 981 beschrieben, eine epididymale cDNA-Bibliothek als Ausgangspunkt für eine PCR dienen. Das gewünschte Fragment läßt sich mittels PCR ohne weiteres generieren (vgl. Beispiel 2). The cloning can be carried out, for example, starting from epididymal mRNA by reverse transcription and subsequent PCR amplification of the resulting cDNA using the in Fröhlich et al. (2000), J Androl., 21, 421-30 Oligonucleotide primer done. Alternatively, as described in DE 40 02 981, an epididymal cDNA library as a starting point for a PCR serve. The desired fragment can be determined by PCR without Generate more (see example 2).

Als Wirtszellen zur Anwendung in diesen Verfahren kommen eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Zellen von Trichoplusia ni ("high five"-Zellen; Parrington et al. (1997), Virus Genes, 14, 63-72) oder CHO-Zellen, sowie prokaryotische Zellen in Betracht, wobei E. coli besonders bevorzugt ist. As host cells for use in this process come eukaryotic cells, such as cells of Trichoplusia ni ("high five" cells; Parrington et al. (1997), Virus Genes, 14, 63-72) or CHO cells, as well as prokaryotic cells, E. coli being particularly preferred.

Die cDNA kann darüber hinaus anhand der bekannten Sequenzen auch synthetisch hergestellt werden. The cDNA may also be based on the known sequences also be prepared synthetically.

Die chemische Synthese der erfindungsgemäßen Polypeptide kann nach im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, beispielsweise mit Hite automatisierter Peptid-Synthesizer erfolgen (Barany und Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis", in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 2, Ch. 1, 3-284; Steward und Young (1984), "Solid-Phase Peptides Synthesis, 2nd Ed.", Pierce Chemical Company, Rockford, III; Atherton und Sheppard (1989), "Solid-Phase Synthesis - A Practical Approach", Oxford University Press, Oxford). The chemical synthesis of the polypeptides of the invention can according to methods described in the prior art, for example, with Hite automated peptide synthesizer done (Barany and Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis", in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2, Ch. 1, 3-284; Steward and Young (1984), Solid-Phase Peptides Synthesis, 2nd Ed. ", Pierce Chemical Company, Rockford, III, Atherton and Sheppard (1989), Solid Phase Synthesis - A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford).

Die Polypeptide können nach der Synthese gemäß bekannten Verfahren modifiziert werden, beispielsweise durch die Einführung einer intramolekularen Disulfid-Brücke. Die Bildung einer intramolekularen Disulfid-Brücke zwischen zwei Cystein-Resten kann dabei durch Entfernung der Cystein-Schutzgruppe und nachfolgende Oxidation durch Luftsauerstoff erfolgen. The polypeptides may be synthesized according to known art Be modified method, for example by the introduction an intramolecular disulfide bridge. The formation of a intramolecular disulfide bridge between two cysteine residues can thereby removing the cysteine protecting group and subsequent Oxidation by atmospheric oxygen.

Dabei sollte darauf geachtet werden, daß der basische Charakter der jeweiligen Polypeptide erhalten bleibt. Care should be taken that the basic character the respective polypeptides is retained.

Gegebenenfalls aus der Synthese resultierende, unerwünschte Eigenschaften der Polypeptide, wie beispielsweise eine geringe Löslichkeit, können mit Standardmethoden, die dem auf dem Gebiet der Proteinchemie tätigen Fachmann geläufig sind, begegnet werden. Zur Erhöhung der Löslichkeit der Polypeptide können z. B. löslichkeitsvermittelnde Substanzen wie beispielsweise DMSO oder Harnstoff zugesetzt werden. Optionally resulting from the synthesis, undesirable Properties of the polypeptides, such as a low Solubility, can with standard methods that in the field skilled in the art of protein chemistry become. To increase the solubility of the polypeptides z. B. solubilizing substances such as DMSO or Urea be added.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in linearer oder in cyklischer Form eingesetzt werden. Cyklische Polypeptide im Sinne der Erfindung können entweder partielle oder vollständig cyklische Struktur aufweisen. The polypeptides of the invention may be in linear or in be used cyclic form. Cyclic polypeptides in the Sense of the invention may be either partial or complete have cyclic structure.

Bei Polypeptiden mit partiell cyklischer Struktur liegt eine Verknüpfung freier reaktiver Seitengruppen von Aminosäuren innerhalb der Aminosäurekette mit der Folge einer intramolekularen Ringbildung vor, bei der jedoch mindestens einer der Amino- oder Carboxy-Termini der Aminosäurekette nicht in die Ringbildung einbezogen sind. Beispielsweise führt die Bildung einer Disulfidbrücke durch Reaktion zweier Cystein-Reste innerhalb der Primärstruktur zu einem Polypeptid mit partiell cyklischer Struktur. In the case of polypeptides with a partially cyclic structure, there is one Linkage of free reactive side groups of amino acids within the amino acid chain with the consequence of an intramolecular Ring formation, but in which at least one of the amino or Carboxy termini of the amino acid chain are not involved in ring formation are involved. For example, the formation of a Disulfide bridge by reaction of two cysteine residues within the Primary structure to a polypeptide with partially cyclic Structure.

Bei Polypeptiden mit vollständig cyklischer Struktur sind die terminalen Aminosäuren an beiden Enden des Polypeptids in die Ringbildung einbezogen. Eine solche vollständige Cyklisierung eines Polypeptids kann beispielsweise durch eine Expression desselben mittels des IMPACT™-TWIN-Systems (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland) künstlich erreicht werden (Evans et al. (1999), Biopolymers, 51, 333-342). For polypeptides with a fully cyclic structure, the terminal amino acids at both ends of the polypeptide into the Ring formation included. Such a complete cyclization a polypeptide may be expressed, for example, by expression the same by means of the IMPACT ™ TWIN system (New England Biolabs, Schwalbach, Germany) (Evans et al. (1999), Biopolymers, 51, 333-342).

Schließlich können die erfindungsgemäßen Polypeptide als Oligomere, insbesondere als Dimere vorliegen. Finally, the polypeptides of the invention as Oligomers, in particular as dimers.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der die 30 C-terminalen Aminosäuren 74 bis 103 (bezogen auf die SEQ. ID. Nrn. 1 oder 2) umfassenden Fragmente gemäß den SEQ. ID. Nrn. 7 oder 8 als antimikrobielle Mittel. A particularly preferred embodiment of the invention relates the use of the 30 C-terminal amino acids 74 to 103 (based on SEQ ID NOs: 1 or 2) comprising fragments according to the SEQ. ID. Nos. 7 or 8 as antimicrobial agents.

Die 30 C-terminalen Aminosäuren des HE2α2-Polypeptids wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl in Form eines linearen Polypeptids, als auch in Form eines durch Einführung einer intramolekularen Disulfidbrücke partiell cyklisierten Polypeptids chemosynthetisch hergestellt (vgl. Fig. 7; Beispiel 6) und hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Aktivität untersucht. The 30 C-terminal amino acids of the HE2α2 polypeptide have been chemosynthesized within the scope of the present invention both in the form of a linear polypeptide and in the form of a partially cyclized polypeptide by introduction of an intramolecular disulfide bridge (see Figure 7; their antimicrobial activity.

Beide synthetischen Polypeptide erwiesen sich sowohl im Gel- Overlay-Assay als auch im Colony-Forming-Unit Assay als bakterizid gegenüber E. coli (vgl. Fig. 5 und 6; Beispiel 7). Bei den Polypeptiden gemäß SEQ ID Nrn. 7 oder 8 handelt es sich demgemäß um antimikrobiell wirksame Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften werden die oben definierten erfindungsgemäßen Polypeptide zur Behandlung mikrobieller Infektionserkrankungen vorgeschlagen. Both synthetic polypeptides were found to be bactericidal towards E. coli in both the gel overlay assay and the colony-forming unit assay (see Figures 5 and 6, Example 7). The polypeptides according to SEQ ID Nos. 7 or 8 are therefore antimicrobially active fragments of the polypeptides according to the invention. Because of their antimicrobial properties, the above-defined polypeptides according to the invention are proposed for the treatment of microbial infectious diseases.

Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff "Infektionserkrankung" sämtliche durch Mikroorganismen hervorgerufenen pathogenen Änderungen gegenüber dem Normalzustand im Körper von Mensch und Tier. Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Polypeptide liefern somit eine Alternative zu den bekannten Antibiotika, und sie können sowohl hinsichtlich der in Betracht kommenden Indikationen als auch hinsichtlich der Applikationsformen und Formulierungen auf analoge Weise zum Einsatz kommen. In the context of the invention, the term designates "Infectious disease" all caused by microorganisms pathogenic changes to the normal state in the body of Human and animal. The polypeptides proposed according to the invention thus provide an alternative to the known antibiotics, and they can be both in terms of eligible Indications as well as with regard to the forms of application and Formulations are used in an analogous manner.

Erfindungsgemäß fallen unter den Begriff "Mikroorganismus" Bakterien, Protozoen, Hefen, Viren etc., soweit diese in der Lage sind pathogene Veränderungen in Mensch und Tier hervorzurufen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der die Infektionskrankheit verursachende Mikroorganismus ein Bakterium. According to the invention, the term "microorganism" Bacteria, protozoa, yeasts, viruses etc., as far as they are able are pathogenic changes in humans and animals evoke. According to a preferred embodiment of the invention is the the infectious disease causing microorganism Bacterium.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit Hilfe von Gel-Retardations-Assays nachgewiesene Bindung der synthetischen HE2α2- Polypeptide an Nukleinsäuren wie DNA, weist auf eine Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide gegen DNA- und RNA-Viren hin. The in the context of the present invention with the aid of Gel retardation assays demonstrated binding of the synthetic HE2α2- Polypeptides on nucleic acids, such as DNA, indicate activity the polypeptides of the invention against DNA and RNA viruses out.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Infektionserkrankung eine Erkrankung des Urogenital- Traktes. According to a further preferred embodiment of the invention the infectious disease is a disease of the urogenital Tract.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere für die parenterale Applikation, und sie können dementsprechend formuliert sein. Als parenterale Applikation werden vorliegend alle Applikationen bezeichnet, bei denen der Wirkstoff, d. h. die erfindungsgemäß definierten Polypeptide, unter Umgehung des Magen-Darm-Traktes in den Körper des Patienten eingebracht werden. Die parenterale Verabreichung kann beispielsweise subkutan, intravenös oder als Zäpfchen erfolgen. Die Polypeptide können zu diesem Zweck mit geeigneten Adjuvantien, Hilfs- und/oder Trägarstoffen formuliert werden. Geeignete Agentien sind im Stand der Technik bekannt. Erfindungsgemäß können auch Adjuvanzien desjenigen Typs zum Einsatz kommen, welche die Immunantwort im Körper erhöhen. Beispiele hierfür sind Hydroxide verschiedener Metalle, wie Aluminiumhydroxid, Bestandteile der bakteriellen Zellwand, Öle, Saponine oder Cytokine. The polypeptides of the invention are particularly suitable for the parenteral administration, and they can accordingly be formulated. As a parenteral administration are present all applications in which the active substance, d. H. the According to the invention defined polypeptides, bypassing the Gastrointestinal Tract introduced into the body of the patient become. Parenteral administration may be, for example, subcutaneous, done intravenously or as a suppository. The polypeptides may be too this purpose with appropriate adjuvants, auxiliary and / or Carrier substances are formulated. Suitable agents are in the state of Technique known. Adjuvants can also be used according to the invention of the type that regulates the immune response in the body increase. Examples include hydroxides of various metals, such as aluminum hydroxide, components of the bacterial cell wall, Oils, saponins or cytokines.

Ferner können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch für die lokale Applikation formuliert sein. Furthermore, the polypeptides according to the invention can also be used for the be formulated local application.

Die lokale Applikation umfasst im Rahmen der vorliegenden Erfindung u. a. das Aufbringen auf betroffene Körperoberflächen oder die Verabreichung mittels eines Inhalators. Formulierungen, die sich zur Inhalation eignen, können als Aerosol in Verbindung mit einem Treibgas wie Kohlendioxid in einem geeigneten Druckbehälter vorliegen. Bei Formulierungen von Polypeptiden zur topischen Applikation können diese beispielsweise in Gele, Emulsionen, Salben oder in transdermale Systeme eingebracht werden oder als Lösungen vorliegen, die z. B. bei entzündlichen Prozessen im Rachenbereich Anwendung finden können. The local application includes within the scope of the present Invention and. a. the application to affected body surfaces or the administration by means of an inhaler. Formulations that are suitable for inhalation, as an aerosol in conjunction with a propellant such as carbon dioxide in a suitable Pressure vessel present. In formulations of polypeptides for topical These can be applied, for example, in gels, emulsions, Ointments or introduced into transdermal systems or as Solutions exist, the z. B. in inflammatory processes in Throat area can find application.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert: The invention is explained below with reference to examples:

example 1 Production of chemosynthetic polypeptides and recovery of Anti-polypeptide antisera

Immunogene Fragmente der aus HE2 abgeleiteten Polypeptide wurden durch f-moc-Festphasenverfahren synthetisiert. Polyklonale Kaninchen-Anti-Polypeptid-Antiseren wurden durch Kupplung der Polypeptide über Cysteinreste an die Trägersubstanz Keyhole- Limpet-Hämocyanin (KLH, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) hergestellt. Um eine derartige Kupplung zu ermöglichen, wurde den Polypeptiden P1 (SEQ ID Nr. 9) und P2 (SEQ ID Nr. 10) bei der Synthese ein artifizieller Cystein-Rest am C-Terminus zugefügt; das Polypeptid P3 entsprach hinsichtlich seiner Sequenz den 30 C- terminalen Aminosäuren des HE2α2-Polypeptids (SEQ ID Nr. 8) und enthielt einen für diesen Zweck geeigneten N-terminalen Isoleucinrest. Die Polypeptide P4 (SEQ ID Nr. 11) und PS (SEQ ID Nr. 12) enthielten einen C-terminalen, endogenen Cysteinrest. Die Immunseren wurden nach 60, 90 und 125 Tagen der Immunisierung erhalten (Pineda Antikörper-Service, Berlin). Eine monospezifische Reinigung der polyklonalen Antikörper wurde durch Kopplung der Polypeptide an Epoxy-aktivierte Sepharose 6B (Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg, Deutschland) und anschließender Affinitätschromatographie durchgeführt. Immunogenic fragments of the HE2-derived polypeptides were synthesized by f-moc solid phase method. polyclonal Rabbit anti-polypeptide antisera were obtained by coupling the Polypeptides via cysteine residues to the carrier keyhole Limpet Hemocyanin (KLH, Sigma, Deisenhofen, Germany) produced. To enable such a coupling, the Polypeptides P1 (SEQ ID NO: 9) and P2 (SEQ ID NO: 10) in the Synthesis added an artificial cysteine residue at the C-terminus; the Polypeptide P3 corresponded in terms of its sequence to the 30 C terminal amino acids of the HE2α2 polypeptide (SEQ ID NO: 8) and contained an appropriate N-terminal for this purpose Isoleucine residue. The polypeptides P4 (SEQ ID NO: 11) and PS (SEQ ID NO: 12) contained a C-terminal endogenous cysteine residue. The Immune sera were after 60, 90 and 125 days of immunization received (Pineda antibody service, Berlin). A monospecific Purification of the polyclonal antibody was achieved by coupling the Polypeptides on Epoxy-Activated Sepharose 6B (Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg, Germany) and subsequent Affinity chromatography performed.

Example 2 Production of Recombinant HE2α1 Polypeptide in E. coli

Ein HE2α1-cDNA-Fragment (SEQ ID Nr. 15; Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525), dem die für das Signalpeptid kodierende Region fehlte, und das demnach für ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 3 kodierte (im folgenden als proHE2α1 bezeichnet), wurde in den Vektor pMAL-c2x (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland) subkloniert, nachdem mit Hilfe einer PCR eine HindIII-Restriktionsschnittstelle am 3'-Ende generiert worden war. Als Sense-Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr. 13 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Als Anti-Sense-Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr. 14 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Fragmente, die am 3'-Ende mit HindIII geschnitten worden waren und stumpfe 5'-Enden aufwiesen, wurden in einen XmnI/HindIII- verdauten Vektor ligiert. Das rekombinante Plasmid wurde in DH5α-Zellen amplifiziert und durch Sequenzierung bestätigt. Für die heterologe Expression des Polypeptids wurde der hinsichtlich cytosolischer Proteasen defiziente Stamm E. coli ER2508 (New England Biolabs) ausgewählt und transformiert. Transformierte Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 2 × 10⁸ Zellen pro ml kultiviert, und die Expression wurde durch Zugabe von 3 mM IPTG induziert. Nach 3-stündiger Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation abgeerntet, und das Pellet wurde in Säulenpuffer (20 mM TRIS-HCl, pH 7,4; 200 mM NaCl) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Einfrieren über Nacht bei -20°C und nachfolgendem Auftauen bei Raumtemperatur aufgeschlossen. Anschließend wurde die Suspension 7 Minuten lang mit Ultraschall behandelt und 30 Minuten lang bei 27000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde 1 : 5 mit Säulenpuffer verdünnt und auf eine Amylose-Säule geladen. Die Säule wurde mit 5 Volumen Säulenpuffer gewaschen und kompetitiv mit Säulenpuffer, welcher 10 mM Maltose enthielt, eluiert. Der Überstand, der rekombinantes MBP-proHE2α1-Fusionsprotein enthielt, wurde gegen autoklaviertes, deionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. An HE2α1 cDNA fragment (SEQ ID NO: 15; Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525) lacking the signal peptide coding region, and thus corresponding to a polypeptide of SEQ ID No. 3 (hereinafter referred to as proHE2α1) was subcloned into the vector pMAL-c2x (New England Biolabs, Schwalbach, Germany) after using a PCR to generate a HindIII restriction site at the 3 'end. As the sense oligonucleotide, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 13 was used. The antisense oligonucleotide used was the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 14. Fragments cut at the 3 'end with HindIII and having blunt 5' ends were ligated into an XmnI / HindIII digested vector. The recombinant plasmid was amplified in DH5α cells and confirmed by sequencing. For heterologous expression of the polypeptide, the cytosolic protease deficient strain E. coli ER2508 (New England Biolabs) was selected and transformed. Transformed cells were cultured to a cell density of 2 × 10 ⁸ cells per ml, and expression was induced by addition of 3 mM IPTG. After 3 hours of incubation, the cells were harvested by centrifugation and the pellet was resuspended in column buffer (20 mM TRIS-HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl). The cells were disrupted by freezing at -20 ° C overnight and then thawing at room temperature. Then, the suspension was sonicated for 7 minutes and centrifuged at 27,000 × g for 30 minutes. The supernatant was diluted 1: 5 with column buffer and loaded onto an amylose column. The column was washed with 5 volumes of column buffer and competitively eluted with column buffer containing 10 mM maltose. The supernatant containing recombinant MBP-proHE2α1 fusion protein was dialyzed against autoclaved deionized water and lyophilized.

Example 3 Proteolytic cleavage by affinity chromatography purified MBP-proHE2α1 fusion protein

MBP-proHE2α1-Fusionsprotein wurde unter Verwendung von 1,5 U rekombinantem trunkiertem humanem Furin (New England Biolabs) pro µg Fusionsprotein in einem Reaktionspuffer aus 100 mM HEPES, pH 7,5 bei 25°C, 0,5% Triton-X-100, 2 mM CaCl₂, 1 mM β-Mercaptoethanol 3 h lang bei 30°C enzymatisch verdaut. Für den anschließenden Verdau mit Faktor Xa (New England Biolabs) wurde die entsprechenden Ansätze gekühlt und über Nacht bei Raumtemperatur mit 1 µg Faktor Xa pro 50 µg MBP-HE2α1 inkubiert. Die Ansätze wurden mittels einer StrataClean-Säule (Stratagene) extrahiert, um salzfreie Proben für eine SDS-PAGE mit anschließendem Western-Blot und Immundetektion zu erhalten (Ziegler et al. (1997), Anal. Biochem., 250, 257-260). MBP-proHE2α1 fusion protein was prepared using 1.5 U recombinant truncated human furin (New England Biolabs) per μg fusion protein in a reaction buffer of 100 mM HEPES, pH 7.5 at 25 ° C, 0.5% Triton-X. 100, 2 mM CaCl ₂ , 1 mM β-mercaptoethanol for 3 h at 30 ° C enzymatically digested. For subsequent digestion with Factor Xa (New England Biolabs), the respective batches were cooled and incubated overnight at room temperature with 1 μg of factor Xa per 50 μg of MBP-HE2α1. The batches were extracted using a StrataClean column (Stratagene) to obtain salt-free samples for SDS-PAGE followed by Western blot and immunodetection (Ziegler et al., 1997, Anal. Biochem., 250, 257-260). ,

Bei der Western-Blot-Analyse mit nachfolgender Immundetektion wurden proteinhaltige Proben zunächst entweder mittels eines 15%igen Laemmli-Gels oder eines 16,5%igen TRIS-TRICINE-Gels, welches 6M Harnstoff enthielt, getrennt (Schägger und von Jagow (1987), Anal. Biochem., 166, 368-379) und anschließend in einem kontinuierlichen Puffersystem unter Verwendung eines semi-dry Blotters (Phase, Lübeck, Deutschland) auf PVDF-Membranen (Millipore, Eschborn, Deutschland) transferiert. Um die Effizienz des Transfers der kationischen HE2-Polypeptide zu erhöhen, wurde die Standardtransfermethode wie bei Szewcyk und Kozloff (1985), Anal. Biochem., 150, 403-407, beschrieben modifiziert. Die Immundetektion von Polypeptiden wurde nach Standardmethoden unter Verwendung des CL-HRP Substratsystems (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) in einer Verdünnung von 1 : 10 und einem Röntgenfilm (Kodak) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung wurde durch Kompetition bestätigt (Derr et al. (2001), Reproduction, 121, 435-446). Entsprechende Polypeptid-Banden wurden bei Bedarf aus Coomassie-gefärbten Gelen ausgeschnitten und durch eine N- terminale Sequenzierung (TopLab, München, Deutschland) weiter analysiert. Western blot analysis followed by immunodetection were protein containing samples first either by means of a 15% Laemmli gel or a 16.5% TRIS TRICINE gel, which contained 6M urea, separated (Schägger and von Jagow (1987), Anal. Biochem., 166, 368-379) and then in one continuous buffer system using a semi-dry Blotters (Phase, Lübeck, Germany) on PVDF membranes (Millipore, Eschborn, Germany) transferred. To the efficiency of To increase transfers of the cationic HE2 polypeptides, the Standard transfer method as in Szewcyk and Kozloff (1985), Anal. Biochem., 150, 403-407, described modified. The Immunodetection of polypeptides was carried out according to standard methods Use of the CL-HRP Substrate System (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) at a 1:10 dilution and X-ray film (Kodak). The specificity of antibody binding was confirmed by competition (Derr et al. (2001), Reproduction, 121, 435-446). Appropriate polypeptide bands were as needed cut out of Coomassie-stained gels and replaced by an N- terminal sequencing (TopLab, Munich, Germany) analyzed.

Fig. 4 zeigt das Ergebnis der Detektion unter Verwendung des P3-Antiserums. Es zeigte sich, daß das als Affinitätstag benutzte Maltose-Binde-Protein (MBP) ein sowohl theoretisch als auch durch SDS-PAGE bestimmbares Molekulargewicht von 42 KDa aufwies. Das MBP-proHE2α1-Fusionsprotein besaß ein theoretisches Molekulargewicht von 50 KDa. Die obere Bande in Bahn 2, Fig. 4 entsprach dem MBP-proHE2α1-Fusionsprotein, welches noch nicht durch Furin verdaut worden war. Das apparente Molekulargewicht dieses großen Fusionsproteins konnte auf dem in Fig. 4 dargestellten TRICIN-Gel nicht korrekt ermittelt werden, da es außerhalb des Peptidmarkerbereichs bandierte. Die Analyse des ungespaltenen MBP-proHE2α1 mittels herkömmlicher 10% SDS-PAGE-Gele ergab jedoch ebenfalls ein apparentes Molekulargewicht von etwa 50 KDa für das Fusionsprotein. Nach Spaltung durch Furin resultierte das vollständig prozessierte HE2α1, welches ein theoretisches Molekulargewicht von 4,7 KDa besaß. Obwohl das apparente Molekulargewicht sich etwas kleiner als theoretisch erwartet darstellte, entsprach die untere Bande in Bahn 1 und 2 dem Furin-prozessierten HE2α1. Das proHE2α1 besaß ein theoretisches Molekulargewicht von 8,6 KDa. Die obere, im Western-Blot reaktive Bande in Bahn 1 entsprach dem proHE2α1, welches durch Spaltung des MBP- proHE2α1 mit Faktor Xa-Protease freigesetzt und noch nicht durch Furin weiterprozessiert wurde. Fig. 4 shows the result of detection using the P3 antiserum. It was found that the maltose-binding protein (MBP) used as the affinity tag had a molecular weight of 42 KDa, both theoretically and by SDS-PAGE. The MBP-proHE2α1 fusion protein had a theoretical molecular weight of 50 KDa. The upper band in lane 2, Fig. 4 corresponded to the MBP-proHE2α1 fusion protein which had not yet been digested by furin. The apparent molecular weight of this large fusion protein could not be correctly determined on the TRICIN gel shown in FIG. 4 because it bound outside the peptide marker region. However, analysis of the uncleaved MBP-proHE2α1 using conventional 10% SDS-PAGE gels also revealed an apparent molecular weight of about 50 KDa for the fusion protein. Upon cleavage by furin, the fully processed HE2α1, which had a theoretical molecular weight of 4.7 KDa, resulted. Although the apparent molecular weight was slightly smaller than expected theoretically, the lower band in lanes 1 and 2 corresponded to the furin-processed HE2α1. The proHE2α1 had a theoretical molecular weight of 8.6 KDa. The upper, Western blot-reactive band in lane 1 corresponded to the proHE2α1, which was released by cleavage of the MBP-proHE2α1 with factor Xa protease and not further processed by furin.

Example 4 Purification of proHE2α1 to superose 12 and subsequent Investigation of FPLC fractions for antimicrobial activity

Zur Aufreinigung von proHE2α1 zu wurde ein Aliquot des aus Beispiel 2 gewonnen MBP-proHE2α1-Fusionsproteins unter den in Beispiel 3 beschrieben Reaktionsbedingungen mit Faktor Xa, nicht aber mit Furin verdaut. Nach Abspaltung von proHE2α1 vom Maltose-Binde-Protein (MBP) durch Faktor Xa wurden die beiden Spaltprodukte MBP und proHE2α1 durch Gelfiltration an Superose 12 (Amersham-Pharmacia Biotech) voneinander getrennt. For the purification of proHE2α1 to an aliquot of Example 2 gained MBP-proHE2α1 fusion protein among the in Example 3 described reaction conditions with factor Xa, not but digested with furin. After splitting off proHE2α1 from Maltose-binding protein (MBP) by factor Xa were the two Cleavage products MBP and proHE2α1 by gel filtration on Superose 12 (Amersham-Pharmacia Biotech).

Die Superose 12-Säule wurde an einer FPLC-(Fast Protein Liquid Chromatography)-Anlage (LKB-Bromma) betrieben. Als Laufpuffer wurde dabei 120 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8.0 benutzt. Die aufgefangenen Fraktionen wurden über Nacht lyophilisiert. Durch den Unterdruck beim Lyophilisieren sublimierte das Ammoniumbicarbonat ebenfalls aus den Fraktionen, so daß nur Proteinbestandteile zurückblieben. Fig. 9a zeigt die chronologisch auf dem Tricingel aufgetragenen Superose 12-FPLC-Fraktionen eines einzigen Laufs. Dabei zeigte sich, daß Fraktion 16 proHE2α1-Polypeptid enthielt. Die Fraktionen 1 bis 17 von 4 Läufen wurden jeweils vereinigt und in einem herkömmlichen Radial-Diffusions-Assay auf antimikrobielle Aktivität gegen E. coli DH5α untersucht. Es zeigte sich, daß keine der Fraktionen - auch nicht Fraktion 16 - antibiotische Aktivität besaß (Fig. 9b). Das proHE2α1-Polypeptid weist somit keine antimikrobielle Aktivität auf. The Superose 12 column was operated on an FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) system (LKB-Bromma). The running buffer used was 120 mM ammonium bicarbonate, pH 8.0. The collected fractions were lyophilized overnight. The negative pressure during lyophilization also sublimated the ammonium bicarbonate from the fractions, leaving only protein components. Figure 9a shows the Chronose on the Tricingel Superose 12 FPLC fractions of a single run. It was found that fraction 16 contained proHE2α1 polypeptide. Fractions 1 to 17 of 4 runs were each pooled and tested for antimicrobial activity against E. coli DH5α in a conventional radial diffusion assay. It was found that none of the fractions - even fraction 16 - had antibiotic activity ( Figure 9b). The proHE2α1 polypeptide thus has no antimicrobial activity.

Example 5 Expression of mature HE2α1 in the baculovirus expression system

Reifes HE2α1 wurde im Baculovirus-Expressionssystem rekombinant hergestellt. Es wurde ausgehend von dem in Beispiel 2 verwendeten HE2α1-cDNA-Fragment (SEQ ID Nr. 15; Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525) ein Insertkonstrukt hergestellt, das für reifes HE2α1 mit N-terminalem 6-Histidintag und Faktor Xa- Spaltstelle kodiert. Als Sense-Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr. 16 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Als Anti-Sense- Oligonukleotid wurde das in SEQ ID Nr. 17 dargestellte Oligonukleotid verwendet. Das Konstrukt wurde über die BamHI- und HindIII-Restriktionsschittstelle in den pMelBac-Vektor (INVITRO- GEN) kloniert. Nach Co-Transfektion mit Bac-N-Blue-DNA wurde der virionenhaltige Kuturüberstand der transfizierten Zellen im Plaque-Assay auf das Vorkommen rekombinanter Virionen untersucht. Diese wurden vermehrt und für die gezielte Infektion von High-Five-Insektenzellen verwendet. Das rekombinante Protein wurde von den infizierten Zellen in den Kulturüberstand abgegeben und aus diesem über IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) an einer Nickel-NTA-Säule aufgereinigt. Da das Insekten-Kulturmedium niedermolekulare Komponenten (u. a. Histidin) enthielt, die die Nickel-IMAC stören, wurden die Kulturüberstände vor der IMAC-Reinigung mit Aceton präzipitiert und in destilliertem Wasser resuspendiert. Das gereinigte 6-Histidin- HE2α1-Fusionspolypeptid wurde durch Faktor Xa-Spaltung vom Histidintag befreit. Danach lag das reife HE2α1-Polypeptid vor, das durch RP-HPLC (Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography) an einer C4-Säule schließlich zur Homogenität aufgereinigt wurde. Das reife HE2α1-Polypeptid erwies sich wie erwartet in einem herkömmlichen Radial-Diffusions-Assay als antimikrobiell aktiv gegen E. coli DH5α. Mature HE2α1 was recombinant in the baculovirus expression system produced. It was starting from that in Example 2 used HE2α1 cDNA fragment (SEQ ID NO: 15; Osterhoff et al. (1994), Biol. Repro., 50, 516-525) prepared an insert construct which for mature HE2α1 with N-terminal 6-histidine tag and factor Xa Cleavage site encoded. As a sense oligonucleotide was in SEQ ID No. 16 oligonucleotide used. As an anti-sense Oligonucleotide was that shown in SEQ ID NO: 17 Used oligonucleotide. The construct was about the BamHI and HindIII restriction site into the pMelBac vector (INVITRO- GEN) cloned. After co-transfection with Bac-N-Blue DNA, the virion - containing cutaneous supernatant of the transfected cells in Plaque assay for the presence of recombinant virions examined. These were propagated and targeted for infection Used high-five insect cells. The recombinant protein was from the infected cells in the culture supernatant and from this via IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) was purified on a nickel-NTA column. Since that Insect culture medium low molecular weight components (i.a. Histidine) interfering with the nickel IMAC became the Culture supernatants precipitated with acetone prior to IMAC purification and incubated in resuspended in distilled water. The purified 6-histidine HE2α1 fusion polypeptide was obtained by factor Xa cleavage of Histidine day free. Thereafter, the mature HE2α1 polypeptide was present that by RP-HPLC (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography) on a C4 column finally to homogeneity was purified. The mature HE2α1 polypeptide proved to be expected in a conventional radial diffusion assay as antimicrobially active against E. coli DH5α.

Example 6 Preparation of chemosynthetic HE2α2 polypeptide fragments

Ein aus den 30 C-terminalen Aminosäuren der HE2α2-Polypeptidvariante bestehendes Fragment wurde chemisch nach f-moc Festphasenmethoden synthetisiert. Um neben dem linearen Polypeptidfragment auch eine partiell cyklische Form desselben zu erhalten, wurde nach Standardmethoden eine Disulfidbrücke in das lineare HE2α2-Polypeptidfragment eingeführt. Es ließ sich feststellen, daß das lineare HE2α2-Polypeptidfragment aufgrund seiner freien Cystein-Reste zur Aggregatbildung neigte (vgl. Fig. 5a, Bahn 1). Das partiell cyklisierte Fragment zeigte eine geringe Löslichkeit in Wasser und wurde daher in einer Mischung von 99,5% Dimethylsulfoxid/0,5% Trifluoressigsäure gelöst. Beide HE2α2- Polypeptidfragmente wurden im folgenden auf eine antimikrobielle Aktivität untersucht. A fragment consisting of the 30 C-terminal amino acids of the HE2α2 polypeptide variant was synthesized chemically according to f-moc solid-phase methods. In order to obtain a partially cyclic form in addition to the linear polypeptide fragment, a disulfide bridge was introduced into the linear HE2α2 polypeptide fragment by standard methods. It was found that the linear HE2α2 polypeptide fragment tended to aggregate due to its free cysteine residues (see Figure 5a, lane 1). The partially cyclized fragment showed low solubility in water and was therefore dissolved in a mixture of 99.5% dimethyl sulfoxide / 0.5% trifluoroacetic acid. Both HE2α2 polypeptide fragments were subsequently tested for antimicrobial activity.

Example 7 a) Evidence of the antibacterial activity of the HE2α2 polypeptide fragment

Der Nachweis der antimikrobiellen Aktivität erfolgte mittels eines Gel-Overlay-Assays wie bei Lehrer et al. (1991), J Immunol Methods, 137, 167-173, beschrieben. E. coli DH5α-Bakterien wurden über Nacht 18 h lang bei 37°C zur Vorkultur in 3 ml Luria- Bertani (LB)-Medium (10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,2) angezogen. Um eine logarithmisch wachsende Kultur zu erhalten, wurden 50 µl dieser Bakteriensuspension in 50 ml frisches LB-Medium überimpft, und weitere 2,5 h lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien abzentrifugiert und in 10 ml mM Na₃PO₄, pH 7,2, resuspendiert. Anschließend wurde die optische Dichte der Suspension bei 620 nm gemessen. Auf Basis der Beziehung OD₆₂₀ 0,2 = 5 × 10⁷ CFU/ml wurde ein Volumen mit 4 × 10⁶ CFU zu 10 ml 40°C warmen LB-Medium in 10 mM Na₃PO₄, pH 7,2 mit 1% Agarose (MetaPhor, Biozym, kleine Elektroendomose (EEO), niedriger SO₄ ^2--Gehalt) gegeben und gut gemischt. Mit dem E. coli-haltigen Agar wurden Platten gegossen. Der bakterienhaltige Agar sollte eine Dicke von 2-3 mm haben. Die das Polypeptidfragment enthaltenden Proben wurden mittels einer kontinuierlichen Essigsäure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (CAU-PAGE) aufgetrennt. Danach wurde das Gel in 10 mM Na₃PO₄, pH 7,2, 20 min lang gewaschen bis der pH des Gels 7,2 erreicht hatte. Anschließend wurde das Gel auf die vorbereitete Agarplatte gelegt und 3 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurde das Gel entfernt und der Agar mit 2% Agarose (MetaPhor, Biozym) in LB-Medium überschichtet und über Nacht 16 h lang inkubiert. Die Banden antimikrobiell aktiver Proteine und Peptide waren als Hemmhöfe im Agar deutlich zu erkennen. Der Farbstoff Kristallviolett diente dabei als Positivkontrolle. Antimicrobial activity was detected by a gel overlay assay as described by Lehrer et al. (1991) J Immunol Methods, 137, 167-173. E. coli DH5α bacteria were incubated overnight at 37 ° C for preculture in 3 ml Luria-Bertani (LB) medium for 18 hours (10 g / l bacto-tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl, pH 7.2). In order to obtain a logarithmically growing culture, 50 μl of this bacterial suspension were inoculated in 50 ml of fresh LB medium and incubated at 37 ° C. for a further 2.5 h. Subsequently, the bacteria were centrifuged off and resuspended in 10 ml of mM Na ₃ PO ₄ , pH 7.2. Subsequently, the optical density of the suspension was measured at 620 nm. Based on the relationship OD ₆₂₀ 0.2 = 5 x 10 ⁷ CFU / ml, a volume of 4 x 10 ⁶ CFU was added to 10 ml of LB medium at 40 ° C in 10 mM Na ₃ PO ₄ , pH 7.2 with 1 % Agarose (MetaPhor, Biozym, small Electro-Dermose (EEO), low SO ₄ ^2- content) and mixed well. Plates were cast with the E. coli-containing agar. The bacterial agar should have a thickness of 2-3 mm. The samples containing the polypeptide fragment were separated by continuous acetic acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis (CAU-PAGE). Thereafter, the gel was washed in 10 mM Na ₃ PO ₄ , pH 7.2, for 20 minutes until the pH of the gel reached 7.2. Subsequently, the gel was placed on the prepared agar plate and incubated for 3 hours at 37 ° C. After completion of the incubation, the gel was removed and the agar overlaid with 2% agarose (MetaPhor, Biozym) in LB medium and incubated overnight for 16 h. The bands of antimicrobially active proteins and peptides were clearly recognizable as inhibitory sites in the agar. The dye crystal violet served as a positive control.

Die Ergebnisse des Gel Overlay Assays sind in Fig. 5b dargestellt. Es zeigte sich, daß sowohl die lineare Form als auch die partiell cyklisierte Form des die 30 C-terminalen Aminosäuren von HE2α2 umfassenden Fragments eine antimikrobielle Wirkung gegen E. coli aufweisen. Im Essigsäure-Harnstoff-Polyacrylamid- Gel ließ sich erkennen, daß die lineare Form des Fragments trotz homogener Masse in ESI-MS-Untersuchungen mehrere Banden im Gel zeigte, was auf eine Oligomerbildung schließen ließ. Ein großer Teil der partiell cyklischen Moleküle wurde im oberen Teil des Gels unscharf getrennt, während im unteren Bereich des Gels mehrere einzelne Banden zu erkennen waren, was wiederum auf Oligomerbildung hinweist. Im Overlay-Assay entsprachen die Bereiche, in denen eine Lyse der Zellen zu verzeichnen war, den unteren Bereichen des Gels. Die Aggregate im oberen Bereich des Gels zeigten kein Abtötungsvermögen (vgl. Fig. 5b). The results of the gel overlay assay are shown in Fig. 5b. It was found that both the linear form and the partially cyclized form of the fragment comprising the 30 C-terminal amino acids of HE2α2 have an antimicrobial activity against E. coli. In the acetic acid-urea-polyacrylamide gel, it could be seen that the linear form of the fragment showed multiple bands in the gel despite homogeneous mass in ESI-MS studies, which suggested oligomer formation. A large part of the partially cyclic molecules was blurred in the upper part of the gel, while several single bands were visible in the lower part of the gel, which in turn indicates oligomer formation. In the overlay assay, the areas where lysis of the cells occurred corresponded to the lower areas of the gel. The aggregates in the upper part of the gel showed no killing capacity (see Fig. 5b).

b) quantification of antibacterial activity

Der Colony-Forming Unit Assay erfolgte unter Verwendung des Testorganismus E. coli DH5α (Life Technologies Inc., Rockville, USA). E. coli DH5α-Bakterien wurden über Nacht 18 h lang bei 37°C zur Vorkultur in 3 ml Luria-Bertani-Medium (LB) angezogen. Um eine logarithmisch wachsende Kultur zu erhalten, wurden 50 µl dieser Bakteriensuspension in 50 ml frisches LB-Medium überimpft, und bei 37°C inkubiert bis eine OD₆₂₀ von 0,2 erreicht wurde. Die Bakterien wurden dann 1 : 10⁴ mit 10% LB-Medium in 10 mM Na₃PO₄, pH 7,2 verdünnt. Je 100 µl dieser Bakteriensuspension wurden mit je 11 µl einer Lösung des HE2α2-Polypeptidfragments definierter Konzentration 3 h lang bei 37°C inkubiert. The colony-forming unit assay was carried out using the test organism E. coli DH5α (Life Technologies Inc., Rockville, USA). E. coli DH5α bacteria were grown overnight at 37 ° C for 18 hours for preculture in 3 ml of Luria Bertani medium (LB). To obtain a logarithmically growing culture, 50 μl of this bacterial suspension was inoculated in 50 ml of fresh LB medium and incubated at 37 ° C until an OD ₆₂₀ of 0.2 was reached. The bacteria were then diluted 1:10 ⁴ with 10% LB medium in 10 mM Na ₃ PO ₄ , pH 7.2. 100 .mu.l of this bacterial suspension were incubated with each 11 .mu.l of a solution of the HE2α2 polypeptide fragment of defined concentration for 3 hours at 37.degree.

Nach 1 : 10-Verdünnung mit 10 mM Na₃PO₄, pH 7,2 wurden je 100 µl jeder Probe auf LB-Agar ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Kolonien pro Platte wurden gezählt, um eine antibiotische Aktivitätskurve zu erstellen. Die Grenze der Detektierbarkeit in diesem Assay entsprach 10² CFU/ml. After 1:10 dilution with 10 mM Na ₃ PO ₄ , pH 7.2, 100 μl each of each sample were plated out on LB agar and incubated overnight at 37 ° C. The colonies per plate were counted to produce an antibiotic activity curve. The limit of detectability in this assay was 10 ² CFU / ml.

Das Ergebnis der Quantifizierung der Aktivität ist in Fig. 6 gezeigt. Wie der Figur zu entnehmen ist, war eine Konzentration von weniger als 70 µg/ml sowohl des linearen als auch des partiell cyklischen, synthetischen HE2α2-Polypeptidfragments bei einer Natriumkonzentration von 20 mM ausreichend, um 90% einer Kultur von E. coli DH5α abzutöten. The result of the quantification of the activity is shown in FIG . As can be seen from the figure, a concentration of less than 70 μg / ml of both the linear and the partially cyclic synthetic HE2α2 polypeptide fragment at a sodium concentration of 20 mM was sufficient to kill 90% of a culture of E. coli DH5α.

Example 8 Gel retardation assays

Um zu überprüfen, ob die erfindungsgemäßen Peptide direkt mit freien Nukleinsäuren in Wechselwirkung treten, wurden Gel-Retardations-Assays wie bei Park et al. (1998), Biochemical and Biophysical Research Communications, 244, 253-257, beschrieben, durchgeführt. Jeweils 300 ng eines 500 bp-PCR-Amplifikates, das nicht mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden oder deren kodierenden Nukleinsäuren verwandt ist, wurde mit steigenden Konzentration des linearen HE2α2-Polypeptidfragments oder einem als Negativkontrolle dienendem Peptid (P1, vgl. SEQ ID Nr. 9) in 20 µl Bindungs-Puffer (5% Glycerol, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 mM KCl und 50 µg/ml BSA) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 4 µl nativer Ladepuffer (10% Ficoll 400, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM EDTA, 0,25% Bromphenol-Blau und 0,25% Xylen-Cyanol) zugesetzt. 12 µl der Probe wurden auf einem 1%igen Agarose-Gel unter Verwendung eines 0,5 × Tris-Borat-Laufpuffers getrennt. To check whether the peptides of the invention directly with free nucleic acids interact Gel retardation assays as described by Park et al. (1998), Biochemical and Biophysical Research Communications, 244, 253-257, carried out. In each case 300 ng of a 500 bp PCR amplificate, the not with the polypeptides of the invention or their encoding nucleic acids was associated with increasing Concentration of the linear HE2α2 polypeptide fragment or as Negative control peptide (P1, see SEQ ID NO. 9) in 20 ul Binding buffer (5% glycerol, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 mM KCl, and 50 μg / ml BSA) for 1 h Room temperature incubated. Subsequently, 4 μl of native Loading buffer (10% Ficoll 400, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM EDTA, 0.25% Bromophenol blue and 0.25% xylene-cyanol). 12 μl of Sample was run on a 1% agarose gel using a 0.5 × Tris-borate running buffer separated.

Wie in Fig. 8 gezeigt, konnte bei Inkubation des DNA-PCR-Amplifikats mit dem als Negativkontrolle verwendeten synthetischen Peptid P1 auch bei Verwendung der höchsten Peptid-Konzentration keine Interaktion zwischen DNA und Peptid beobachtet werden, die sich in einer Abnahme der Bandenintensität des besagten Amplifikats äußert. Hingegen waren bereits 1,2 µg des HE2α2-Polypeptidfragments ausreichend, um eine vollständige Verschiebung der Amplifikat-Bande im Agarose-Gel zu bewirken ("Gel-Shift"). SEQUENZPROTOKOLL

As shown in Fig. 8, when the DNA-PCR amplicon was incubated with the synthetic peptide P1 used as a negative control, no interaction between DNA and peptide could be observed even when the highest peptide concentration was used, resulting in a decrease in the band intensity of the said one Amplifikats expresses. In contrast, 1.2 μg of the HE2α2 polypeptide fragment was already sufficient to effect a complete shift of the amplificate band in the agarose gel ("gel shift"). SEQUENCE LISTING

Claims

1. Use of polypeptides with the in SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 indicated amino acid sequence or of Fragments or variants thereof for the treatment of microbial infectious diseases.

2. Use according to claim 1, characterized in that the fragment of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 having indicated amino acid sequence.

3. Use according to claim 1, characterized in that the polypeptide at the N-terminal end additional Having amino acids which do not interfere with the activity of the polypeptide influence.

4. Use according to claim 2, characterized in that the fragment at the N-terminal end additional amino acids which does not have the activity of the fragment influence.

5. Use of variants of the polypeptides and / or Fragments according to claims 1 to 4 with the same antimicrobial efficacy for the treatment of microbial Infectious diseases.

6. Use according to claims 1 to 5, characterized in that the polypeptides are linear or cyclic Form present.

7. Use according to claims 1 to 6, characterized characterized in that the polypeptides are used as monomers, dimers or as Oligomers are present.

8. Use according to claims 1 to 7, characterized characterized in that the microbial infectious disease is a bacterial infectious disease.

9. Use according to claim 8, characterized in that the infection disease is a disease of the urogenital Tract is.

10. Use according to one of claims 1 to 9, characterized characterized in that the polypeptides or fragments thereof formulated for parenteral administration.

11. Use according to one of claims 1 to 9, characterized characterized in that the polypeptides or fragments thereof are formulated for local application.

12. Use according to one of claims 1 to 11, characterized characterized in that the polypeptides or fragments or Variants thereof according to claims 1 to 4 at their N-terminal end of an additional amino acid sequence which has the antimicrobial efficacy inactivated, wherein the inactivating amino acid sequence via a proteolytic cleavage site with the polypeptides or Fragments or variants thereof is linked, and the Cleavage site is recognized by an enzyme which of the pathogen (s) of a microbial disease, not However, it is produced by healthy body cells.

13. Use according to claim 12, characterized in that the enzyme is type 2 IgA1 protease.

14. Use according to claim 12, characterized in that the enzyme is the metalloprotease ZapA.