DE10109532C1 - New fusion protein that blocks Nef protein, useful for treatment or diagnosis of acquired immune deficiency syndrome, has high specificity and affinity - Google Patents

New fusion protein that blocks Nef protein, useful for treatment or diagnosis of acquired immune deficiency syndrome, has high specificity and affinity

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Abstract

Fusion protein (FP) for blocking the Nef protein of human immune deficiency virus (HIV) comprises: (i) protein domain (PD1) that binds to a di-leucine (LL) motif; (ii) a protein domain (PD2) that binds to a PxxP motif; and (iii) a polypeptide linker between PD1 and 2. Independent claims are also included for the following: (1) nucleic acid sequence (I) that encodes FP; (2) expression vector containing (I); (3) host cells containing the vector of (2); and (4) method for producing FP by culturing cells of (3).

Description

Diese Erfindung betrifft ein neuartiges Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuresequenzen, die dieses Fusionsprotein oder einen biologisch aktiven Teil hiervon kodieren, deren Komplementärsequenz, sowie einen Expressions-Vektor, der eine derartige Nukleinsäuresequenz enthält. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung eine mit einem derartigen Vektor transformierte Wirtszelle sowie ein Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Zuletzt betrifft die vorliegende Erfindung therapeutische Zusammensetzungen, die die vorgenannten Fusionsproteine oder Nukleinsäuresequenzen in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen, sowie deren Verwendung bei der in vitro-Diagnose/in vivo-Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids).This invention relates to a novel fusion protein for Blocking the HIV-Nef Protein. The invention relates continue nucleic acid sequences that this fusion protein or encode a biologically active part thereof, the Complementary sequence, as well as an expression vector, the one contains such nucleic acid sequence. Also includes the present invention one with such a vector transformed host cell and a method for production an essentially pure fusion protein for blocking the HIV Nef protein. Finally, the present invention relates therapeutic compositions comprising the foregoing Fusion proteins or nucleic acid sequences in combination with comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and their Use in in vitro diagnosis / in vivo therapy of acquired immune deficiency syndrome (AIDS).

Das Nef-Protein ist ein myristoyliertes "zusätzliches Protein" (Accessory Protein) von 27-35 kDa, das nur bei den Primaten-Lentiviren HIV-1, HIV-2 und SIV anzutreffen ist. Frühe Experimente bei Rhesus-Makaken mit SIV, das große Deletionen im Nef-Gen enthielt, zeigten, daß Nef zur Aufrechterhaltung einer optimalen viralen Replikation und für den Kranheitsverlauf von Aids essentiell ist, und daß ein starker Selektionsdruck funktionell intakte Nef-Varianten im infizierten Wirt aufrechterhält (Kestler et al. 1991, Sawai et al. 1996, Khan et al., 1998). Diese Rolle von Nef als ein Schlüsselfaktor für die lentivirale Pathogenese wurde nachfolgend für HIV-1 beim Menschen bestätigt (Deacon et al., 1995, Kirchhoff et al. 1995). The Nef protein is a myristoylated "additional Protein "(accessory protein) of 27-35 kDa, which is only available in the Primate lentiviruses HIV-1, HIV-2 and SIV can be found. Early experiments on Rhesus macaques with SIV, the big one Deletions contained in the Nef gene showed that Nef for Maintaining optimal viral replication and for the course of the disease of AIDS is essential, and that a strong selection pressure functionally intact Nef variants in infected host (Kestler et al. 1991, Sawai et al. 1996, Khan et al., 1998). This role of Nef as one Key factor for lentiviral pathogenesis has been subsequently confirmed for HIV-1 in humans (Deacon et al., 1995, Kirchhoff et al. 1995).  

Obwohl die Wichtigkeit von Nef für den viralen Lebenszyklus durch diese Arbeiten erkennbar wurde, ist dessen Funktion auf der molekularen Ebene umstritten (Cullen, 1998). Dem Nef- Protein wurden insgesamt drei Funktionen zugeordnet:
Although the importance of Nef for the viral life cycle became apparent through this work, its function at the molecular level is controversial (Cullen, 1998). A total of three functions have been assigned to the Nef protein:

  • 1. verändert das Nef-Protein durch Interaktion mit Tyrosin- und Serin/Threonin-Kinasen die zellulären Signalwege (Baur et al. 1994, Iafrate et al. 1997, Hanna et al. 1998).1. changes the Nef protein through interaction with tyrosine and serine / threonine kinases the cellular signaling pathways (Baur et al. 1994, Iafrate et al. 1997, Hanna et al. 1998).
  • 2. erhöht Nef die virale Infektivität in einem Stadium nach dem Eintritt des Virus in die Zelle (Aiken und Trono, 1995; Schwartz et al. 1995).2. Nef increases viral infectivity at one stage the entry of the virus into the cell (Aiken and Trono, 1995; Schwartz et al. 1995).
  • 3. verringert das Nef-Protein durch Interaktion mit Bestandteilen des Endozytose-Mechanismus die Expression von CD4 und von Antigenen der Haupthistokompatibilitäts-komplex- Klasse I (Major Histokompatibility Complex Class I, MHC I) auf der Oberfläche von infizierten Zellen (Garcia und Miller 1991; Aiken et al. 1994; Schwartz et al. 1996).3. Reduces the Nef protein by interacting with it Components of the endocytosis mechanism the expression of CD4 and antigens of the major histocompatibility complex Class I (Major Histocompatibility Complex Class I, MHC I) on the surface of infected cells (Garcia and Miller 1991; Aiken et al. 1994; Schwartz et al. 1996).

Unter Vorgabe der hohen Polymorphismen zwischen unterschiedlichen Nef-Allelen (Delassus et al. 1991) legt die Konservierung dieser genetisch getrennten Funktionen eine wichtige Rolle jeder individuellen Funktion im viralen Lebenszyklus nahe. In welcher Weise diese Funktionen zur Bedeutung des Nef-Proteins im infizierten Wirt beitragen ist jedoch größtenteils unbekannt und bleibt Gegenstand weiterer Forschungsarbeit.Given the high polymorphisms between different Nef alleles (Delassus et al. 1991) Preservation of these genetically separated functions important role of each individual function in the viral Life cycle close. How these functions are used Importance of the Nef protein in the infected host is contributing however largely unknown and remains the subject of others Research.

Proteolytische Experimente zeigten, daß das Nef-Protein eine Zwei-Domänen-Struktur aufweist, die aus einer N-terminalen Membran-Verankerungsregion und einer gut gefalteten C- terminalen Kern-Domäne (core domain) besteht (Freund et al. 1994). Auf Grundlage dieser Beobachtung wurde die Struktur von Nef für die Kern-Domäne durch NMR-Spektroskopie bestimmt (Grzesiek et al. 1996) und wurde ebenfalls durch Röntgen- Kristallographie bestimmt, jeweils in Komplex mit der SH3- Domäne der Fyn-Tyrosin-Kinase (Lee et al., 1996; Arold et al., 1997) als auch alleine (Arold et al., 1997). Die Strukturen stimmen jeweils gut miteinander überein, es fehlt ihnen jedoch eine flexible Schleife (flexible loop) am C- Terminus, die sich von Rest 159 bis 173 erstreckt. Kürzlich wurde auch die N-terminale Membranverankerungs-Domänen­ struktur in ihrer myristoylierten und nichtmyristoylierten Form aufgeklärt, und zeigte eine flexible Polypeptid-Kette mit zwei helikalen Strukturelementen (Geyer et al., 1999). Diese beiden Protein-Fragmente machen es nun möglich, Einsicht in das Nef-Protein voller Länge zu gewinnen und die vorgeschlagenen Funktionen des Nef-Proteins mit seinen strukturellen Merkmalen in Einklang zu bringen.Proteolytic experiments showed that the Nef protein was a Has two-domain structure consisting of an N-terminal Membrane anchoring region and a well folded C- terminal core domain (Freund et al.  1994). Based on this observation, the structure determined by Nef for the nuclear domain by NMR spectroscopy (Grzesiek et al. 1996) and was also examined by X-ray Crystallography determined, each in complex with the SH3 Fyn tyrosine kinase domain (Lee et al., 1996; Arold et al., 1997) as well as alone (Arold et al., 1997). The Structures are in good agreement with each other, it is missing however, they have a flexible loop on the C- The term extends from remainder 159 to 173. Recently also became the N-terminal membrane anchoring domains structure in their myristoylated and non-myristoylated Form cleared, and showed a flexible polypeptide chain with two helical structural elements (Geyer et al., 1999). These two protein fragments now make it possible Gain insight into the full-length Nef protein and the proposed functions of the Nef protein with its reconciling structural features.

Das HIV-1/-2- und SIV-Nef-Protein wird frühzeitig bei einer Infektion der Zelle mit HIV exprimiert. 1995 wurde entdeckt, daß sogenannte Langzeitüberlebende, die unter dem erworbenen Immunmangelsyndrom (Aids) leiden und mehr als 12 Jahre mit HIV infiziert sind aber kein Aids-Erkrankungsbild entwickeln, weitreichende Deletionen im HIV-Nef-Protein besitzen (Kirchhoff et al., 1995). Die Bedeutung des Nef-Proteins für das HIV-Virus wurde damit deutlich.The HIV-1 / -2 and SIV-Nef protein is premature at one Infection of the cell expressed with HIV. 1995 was discovered that so-called long-term survivors who acquired under the Immune Deficiency Syndrome (AIDS) suffer and have been with for over 12 years HIV infected but do not develop an AIDS disease, have extensive deletions in HIV-Nef protein (Kirchhoff et al., 1995). The importance of the Nef protein for the HIV virus became clear.

Ein Blockieren des HIV-Nef-Proteins stellt also einen vielversprechenden Weg in der Behandlung des erworbenen Immunmangelsyndroms dar. Jedoch existiert derzeit in der HIV- Therapie kein dementsprechender Therapieansatz, der gegen das HIV-Nef-Protein gerichtet ist.Blocking the HIV-Nef protein is one promising path in the treatment of the acquired Immune deficiency syndrome. However, there currently exists in HIV Therapy is not a corresponding therapeutic approach against the HIV-Nef protein is targeted.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Protein bereitzustellen, das zum Blocken des HIV-Nef-Proteins geeignet ist. Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Patentansprüchen angegebenen Merkmale gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.It is therefore an object of the present invention to be a protein provide that to block the HIV-Nef protein suitable is. This task is carried out in the Features specified independent claims solved. Further advantageous embodiments of the invention are in the dependent claims.

Es ist in der vorliegenden Erfindung gelungen, ein Fusionsprotein bzw. die dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz bereitzustellen, daß hochspezifisch an das HIV-Nef-Protein bindet und dieses dadurch blockiert.In the present invention, a Fusion protein or the coding for this protein To provide nucleic acid sequence that is highly specific the HIV-Nef protein binds and thereby blocks it.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, daß bei einem Struktur-Funktionsvergleich zahlreicher Sequenzen des Nef-Proteins von unterschiedlichen HIV- Patienten mit typischem Krankheitsverlauf (d. h. keine Langzeitüberlebenden) drei sequentielle Motive auftreten, die auf der Oberfläche des Nef-Proteins liegen und in allen Sequenzen hochkonserviert sind. Diese Motive sind erstens ein N-terminales Myristoylierungssignal, das die Membranverankerung (und damit die Lokalisation) des Nef- Proteins sicherstellt, zweitens eine PxxP-Protein-Sequenz (P = Prolin, x = jede beliebige Aminosäure), die SH3-Domänen bindet und damit typischerweise eine Funktion in der Signaltransduktion wahrnimmt und drittens ein Di-Leucin- Signal (LL), ein Motiv, das typischerweise den zellulären Proteinverkehr "Trafficking" steuert.The present invention is based on the observation that more in a structure-function comparison Sequences of the Nef protein from different HIV Patients with a typical course of the disease (i.e. none Long-term survivors) three sequential motifs occur that lie on the surface of the Nef protein and in all Sequences are highly conserved. First, these motives are one N-terminal myristoylation signal that the Membrane anchoring (and thus the localization) of the nep Proteins ensures, secondly, a PxxP protein sequence (P = Proline, x = any amino acid), the SH3 domains binds and thus typically a function in the Perceives signal transduction and thirdly a di-leucine Signal (LL), a motif that is typically the cellular Protein traffic controls traffic.

Während das Myristoylierungssignal wenig spezifisch ist und in einer Vielzahl eukaryotischer Proteine vorkommt (wodurch bei einem Angriff an diesem Signal eine große Häufigkeit von unerwünschten Wirkungen zu erwarten wäre), ist die Kombination eines PxxP-Bindungsmotives und eines Di-Leucin- Bindungsmotives (LL), wie sie im HIV-Nef-Protein vorkommen, einzigartig und hochpezifisch. Tatsächlich ist das Nef- Protein das einzige zytosolische und nichttransmembrane Protein, von dem bekannt ist, daß es ein funktionelles Di- Leucin-Motiv besitzt.While the myristoylation signal is not very specific and occurs in a variety of eukaryotic proteins ( if this signal is attacked, a high frequency of undesirable effects would be expected) is the Combination of a PxxP binding motif and a di-leucine  Binding motifs (LL), such as those found in the HIV-Nef protein, unique and highly specific. In fact, the nef- Protein the only cytosolic and non-transmembrane Protein that is known to be a functional di- Owns leucine motif.

Mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein gelang es nunmehr, aus dieser einzigartigen Kombination zweier hochkonservierter Aminosäuresequenz-Motive im Nef-Protein Nutzen zu ziehen und einen hochspezifischen Liganden zu konstruieren. Dieser Ligand besteht aus einem neuartigen Fusionsprotein, das sowohl die LL-Bindungsdomäne als auch eine PxxP- Bindungsdomäne enthält, die über eine kurze Verbindungssequenz (Polypeptid-Linker) verbunden sind. Dieses Hybridmolekül besitzt eine hohe Bindungsaffinität zum HIV- Nef-Protein.With the fusion protein according to the invention it has now been possible from this unique combination of two highly preserved Benefit and Amino Acid Sequence Motifs in Nef Protein to construct a highly specific ligand. This Ligand consists of a novel fusion protein, the both the LL binding domain and a PxxP Contains binding domain over a short Connection sequence (polypeptide linker) are connected. This Hybrid molecule has a high affinity to HIV Nef protein.

Da das Nef-Protein kein bekanntes humanes Homolog besitzt (im Unterschied beispielsweise zur HIV-Protease), ist das hierin offenbarte Fusionsprotein hochspezifisch, so daß ein wirkungsvolles Therapeutikum zur Behandlung des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids) beim Menschen bei vergleichsweise geringen oder keinen unerwünschten Wirkungen für den Patienten bereitgestellt wird. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Anwendung beim Menschen alleine beschränkt. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann beispielsweise bei jedem Säugetier eingesetzt werden, das mit einem HIV-Virus oder einem HIV-ähnlichen Virus infiziert ist (und das ein Nef- Homolog aufweist).Since the Nef protein has no known human homolog (im Difference, for example to the HIV protease), is that here disclosed highly specific fusion protein, so that a effective therapeutic agent for the treatment of the acquired Immune deficiency syndrome (AIDS) in humans in comparison little or no adverse effects for the Is provided to patients. However, the invention is not limited to use in humans alone. The Fusion protein according to the invention can, for example, in each Mammal that is used with an HIV virus or is infected with an HIV-like virus (and that a nep- Homologous).

Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein aus folgenden Komponenten aufgebaut:
Basically, the fusion protein according to the invention is made up of the following components:

  • a) einer Proteindomäne, die ein Di-Leucin (LL)-Motiv bindet,a) a protein domain that has a di-leucine (LL) motif binds
  • b) einer Proteindomäne, die ein PxxP-Motiv bindet, undb) a protein domain that binds a PxxP motif, and
  • c) einem Polypeptidlinker, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.c) a polypeptide linker through which the two Domains (a) and (b) are connected.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Proteindomäne, die ein Di-Leucin-Motiv bindet durch die Aminossäuresequenz von Seq. ID. Nr. 1 oder Homologe oder Fragmente hiervon, die eine LL-Bindungs-Aktivität beibehalten, definiert.According to one embodiment of the invention, the Protein domain that binds a di-leucine motif through the Amino acid sequence from Seq. ID. No. 1 or homologue or Fragments thereof that have an LL binding activity maintained, defined.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die PxxP-Motiv­ bindende Proteindomäne durch eine SH3-Dömäne mit der in der Seq. ID. Nr. 2 definierten Aminosäuresequenz gebildet. Die Aminosäuresequenz eines vollständigen Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist durch Seq. ID. Nr. 3 definiert.According to a further embodiment, the PxxP motif binding protein domain through an SH3 domain with that in the Seq. ID. No. 2 defined amino acid sequence was formed. The Amino acid sequence of a complete fusion protein according to of the present invention is by Seq. ID. No. 3 Are defined.

Vorzugsweise kann das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich ein Signal zur Membranverankerung enthalten. Dieses Signal soll Spezifität und Wirksamkeit des Fusionsproteins erhöhen und es zielgerichtet an die Membran lenken, an der auch das HIV-Nef-Protein verankert ist.Preferably, the fusion protein according to the present Invention additionally a signal for membrane anchoring contain. This signal is said to be specific and effective Increase fusion protein and target it to the membrane to which the HIV-Nef protein is also anchored.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Signal um ein C-terminales Farnesylierungssignal, dessen Sequenz durch Seq. ID. Nr. 4 definiert ist. Weiterhin sind jedoch auch Palmitoylierungs- oder Myristoylierungs­ signale denkbar. According to a preferred embodiment, it is this signal around a C-terminal farnesylation signal, its sequence by Seq. ID. No. 4 is defined. Farther however, are also palmitoylation or myristoylation signals conceivable.  

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein zusätzlich mit einem Signal zur Degradation am Proteasom ausgestattet, wo der Proteinkomplex, bestehend aus dem Fusionsprotein und HIV-Nef, abgebaut wird. Dieses Signal besteht vorzugsweise aus einem Ubiquitinylisierungssignal, das durch Seq. ID. Nr. 5 definiert ist.According to a particularly preferred embodiment, this is Fusion protein according to the invention additionally with a signal equipped for degradation on the proteasome, where the Protein complex consisting of the fusion protein and HIV-Nef, is broken down. This signal preferably consists of a Ubiquitinylation signal, which by Seq. ID. No. 5 is defined.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 6 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine biologische Aktivität beibehalten.The present invention further includes Fusion protein that contains the amino acid sequence of Seq. ID. No. 6 or homologs or fragments thereof, one maintain biological activity.

Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich Nukleinsäure­ sequenzen zur Kodierung eines Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Diese Nukleinsäuresequenzen bestehen grundsätzlich aus drei Bestandteilen, nämlich
The present invention additionally relates to nucleic acid sequences for coding a fusion protein for blocking the HIV-Nef protein. These nucleic acid sequences basically consist of three components, namely

  • 1. einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein Di-Leucin (LL)-Motiv bindende Proteindomäne kodieren,1. a nucleic acid sequence which is a di-leucine Encode (LL) motif binding protein domain,
  • 2. einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein PxxP-Motiv bindende Proteindomäne kodieren und2. a nucleic acid sequence that is a PxxP motif encode binding protein domain and
  • 3. einer Nukleinsäuresequenz, die einen Polypeptidlinker kodiert, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.3. a nucleic acid sequence that contains a polypeptide linker encodes the two domains (a) and (b) are connected.

Gesamt- oder Teilsequenzen dieser Nukleinsäuresequenzen sind in den Seq. ID. Nr. 7, 8, 9 und 10 definiert.All or part of these nucleic acid sequences are in the Seq. ID. Nos. 7, 8, 9 and 10 defined.

Für den auf dem einschlägigen Fachgebiet tätigen Fachmann ist offensichtlich, daß die Ausübung der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der exakten Sequenzen beschränkt ist, wie sie in den Seq. ID. Nr. 1-10 definiert sind.For the specialist working in the relevant field obvious that the practice of the present invention  not limited to using the exact sequences is how they are in the Seq. ID. Nos. 1-10 are defined.

Modifikationen der Sequenzen, wie beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, die im sich ergebenden Protein-Molekül sogenannte "stille" Veränderungen (silent changes) erzeugen, werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.Modifications of the sequences, such as deletions, Insertions or substitutions in the sequence that are in the resulting protein molecule so-called "silent" changes (silent changes) are also considered within the Considered within the scope of the present invention.

Als Beispiel hierfür werden Veränderungen in der Nukleinsäuresequenz betrachtet, die die Erzeugung einer äquivalenten Aminosäure an einer vorgegebenen Stelle zur Folge haben. Vorzugsweise sind derartige Aminosäure- Substitutionen das Ergebnis der Ersetzung einer Aminosäure durch eine ändere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d. h. konservative Aminosäureersetzungen. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Aspartinsäure und Glutaminsäure ein.As an example of this, changes in the Considered nucleic acid sequence that the generation of a equivalent amino acid at a given position Have consequence. Such amino acid Substitutions are the result of the replacement of an amino acid by a different amino acid with similar structural and / or chemical properties, d. H. conservative Amino acid replacements. Amino acid substitutions can be found on Basis of similarity in polarity, charge, Solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or the amphipathic (amphiphilic) nature of the residues involved be made. Examples of non-polar (hydrophobic) Amino acids are alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, Phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral Amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, Thyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (Basic) amino acids include arginine, lysine and histidine on. And close negatively charged (acidic) amino acids Aspartic acid and glutamic acid.

"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von ein bis fünf Aminosäuren. Der erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt werden."Insertions" or "deletions" typically move in the range of one to five amino acids. The allowed Degree of variation can be experimented through systematically insertions, deletions or substitutions made by  Amino acids in a polypeptide molecule using Recombinant DNA techniques and by examining oneself resulting recombinant variants with respect to their biological activity can be determined.

Nukleotidveränderungen, die eine Veränderung der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Proteinmoleküls zur Folge haben, ändern häufig die Protein-Aktivität nicht, weil diese Anteile üblicherweise nicht in der biologischen Aktivität involviert sind. Es kann ebenfalls erwünscht sein, ein oder mehrere der in der Sequenz vorliegenden Cysteine zu eliminieren, weil das Vorhandensein von Cysteinen eine unerwünschte Bildung von Multimeren zur Folge haben kann, wenn die Proteine rekombinant erzeugt werden, wodurch die Reinigung und Kristallisations-Verfahren kompliziert werden. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen bewegt sich innerhalb der technischen und naturwissenschaftlichen Grundkenntnisse, genauso wie die Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der kodierten Produkte.Nucleotide changes that are a change in the N-terminal and C-terminal portions of the protein molecule result, Often change protein activity because of these proportions usually not involved in biological activity are. It may also be desirable to use one or more of the to eliminate cysteines present in the sequence because the Presence of cysteines an undesirable formation of Multimers can result when the proteins are produced recombinantly, which makes cleaning and Crystallization process can be complicated. Each of the proposed modifications moves within the basic technical and scientific knowledge, just like determining the retention of biological Coded product activity.

Daraus ergibt sich, daß, wo der Begriff "DNA-Sequenz" entweder in der Beschreibung oder in den Ansprüchen verwendet wird, er alle derartigen Modifikationen und Varianten umfaßt, die in der Erzeugung eines biologisch äquivalenten Fusionsproteins zum Blocken von HIV-Nef resultieren.It follows that where the term "DNA sequence" used either in the description or in the claims it includes all such modifications and variations, those in producing a biologically equivalent Fusion protein to block HIV-Nef result.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Expressions-Vektor, der eine der vorgenannten Nukleinsäuresequenzen enthält.The present invention further relates to one Expression vector, one of the aforementioned Contains nucleic acid sequences.

Zahlreiche Vektoren, die zur Verwendung beim Transformieren von bakteriellen Zellen geeignet sind, sind bekannt, beispielsweise können Plasmide und Bakteriophagen, wie beispielsweise der Phage λ, als die am häufigst verwendeten Vektoren für bakterielle Wirte verwendet werden. Sowohl in Säugetier- als auch Insektenzellen können beispielsweise virale Vektoren zur Expression eines exogenen DNA-Fragments verwendet werden. Beispielhafte Vektoren sind das SV40 oder Polyoma-Virus.Numerous vectors used for transforming of bacterial cells are known for example, plasmids and bacteriophages such as  for example the phage λ, as the most commonly used Vectors can be used for bacterial hosts. As well in For example, mammalian and insect cells can viral vectors for the expression of an exogenous DNA fragment be used. Exemplary vectors are the SV40 or Polyomavirus.

Die Transformierung der Wirtszellen kann alternativ direkt durch "nackte DNA" ohne Verwendung eines Vektors erfolgen.Alternatively, the host cells can be transformed directly by "naked DNA" without using a vector.

Die Erzeugung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kann entweder in eukaryotischen Zellen oder prokaryotischen Zellen erfolgen. Beispiele von geeigneten eukaryotischen Zellen schließen Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen und Insektenzellen ein. Geeignete prokaryotische Wirte schließen E.coli und Bacillus subtilis ein.The fusion protein according to the invention can be produced either in eukaryotic cells or prokaryotic cells respectively. Examples of suitable eukaryotic cells include mammalian cells, plant cells, yeast cells and Insect cells. Appropriate prokaryotic hosts close E.coli and Bacillus subtilis.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins, das ein Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor, ein Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression der Sequenz durch die Wirtszelle erlauben und ein Isolieren des Fusionsproteins aus der Wirtszelle umfassen.The invention further relates to a method for production an essentially pure fusion protein for blocking the HIV-Nef protein that involves transforming a host cell a vector, cultivating the host cell under Conditions that require expression of the sequence by the Allow host cell and isolate the fusion protein from of the host cell.

Zuletzt umfaßt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines Fusionsproteins, wie hierin offenbart, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Eine derartige Zusammensetzung kann auch durch eine wirksame Menge einer Nukleinsäuresequenz gebildet sein. Finally, the present invention comprises compositions which is an effective amount of a fusion protein as herein disclosed in combination with a pharmaceutical acceptable carrier include. Such a composition can also be by an effective amount of a nucleic acid sequence be educated.  

Aus dem vorher bezüglich der Eigenschaften des HIV-Nef- Proteins und der Funktion des erfindungsgemäßen Fusionsproteins Dargelegten ergibt sich, daß diese Zusammensetzungen zur in vivo-Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids) geeignet sind. Es ist jedoch auch möglich, diese Zusammensetzungen zur in vitro-Diagnose des erworbenen Immunmangelsyndroms einzusetzen. Im letzteren Fall ist eine Verbindung der Fusionsproteine/­ Nukleinsäuresequenzen mit einem geeigneten Nachweisreagenz vorteilhaft, durch das das Vorliegen des HIV Nef-Proteins in einem Test Kit nachgewiesen werden kann.From the previously regarding the properties of the HIV nef- Protein and the function of the invention Fusion protein stated above shows that this Compositions for in vivo therapy of the acquired Immune deficiency syndrome (AIDS) are suitable. However, it is also possible to use these compositions for in vitro diagnosis of acquired acquired immunodeficiency syndrome. In the latter case is a connection of the fusion proteins / Nucleic acid sequences with a suitable detection reagent advantageous in that the presence of the HIV Nef protein in can be demonstrated using a test kit.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der beiliegenden Abbildungen beschrieben. Die Abbildungen zeigen:The present invention is based on the enclosed pictures described. The pictures show:

Abb. 1 die Struktur-Funktionsbeziehung der hochkonservierten Motive für die Myristoylierung (MGxxxS), SH3-Domänen Bindung (PxxP)und LL-bindende Domänen Bindung (LL) in HIV-Nef. Fig. 1 shows the structure-function relationship of the highly conserved motifs for myristoylation (MGxxxS), SH3-domain binding (PxxP) and LL-binding domain binding (LL) in HIV-Nef.

Abb. 2 eine schematische Darstellung der modularen Domänenanordnung in einem Fusionsprotein zum Blocken des HIV Nef Proteins. Fig. 2 is a schematic representation of the modular domain arrangement in a fusion protein for blocking the HIV Nef protein.

Abb. 3, daß das Fusionsprotein bestehend aus einer LL- Domäne und einer SH3-Domäne spezifisch an das HIV Nef Protein bindet. Fig. 3 that the fusion protein consisting of an LL domain and an SH3 domain binds specifically to the HIV Nef protein.

In Abb. 1 zeigt A) die dreidimensionale Proteinstruktur von HIV-1 Nef mit den beschrifteten hochkonservierten Motiven zur Protein-Interaktion, die die Exponiertheit der Bindungsstellen veranschaulicht. Das Sequenzmotiv MGxxxS am N-Terminus von Nef initiiert die co-translationale Myristoylierung des Proteins und damit die Membranständigkeit. Die Polyprolin-Helix (PxxP Motiv oder als exakte Beschreibung: PxxPxR) führt zur Erkennung von SH3- Domänen während das strukturell gegenüberliegende Di-Leuzin Motiv (LL Motiv, bzw.: ExxxLL) mit der Di-Leuzin bindenden Domäne interagiert. Die Darstellung der Voll-Längen- Proteinstruktur von Nef beruht auf der Zusammensetzung der Strukturen der Ankerdomäne (Aminosäuren 1-57; Geyer et al., 1999) und der Kerndomäne (Aminosäuren 57-206; Grzesiek et al., 1996), die mittels Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie bestimmt worden sind und mit anschließender Moleküldynamik energieminimiert wurden.In Fig. 1, A) shows the three-dimensional protein structure of HIV-1 Nef with the labeled highly conserved motifs for protein interaction, which illustrates the exposure of the binding sites. The sequence motif MGxxxS at the N-terminus of Nef initiates the co-translational myristoylation of the protein and thus membrane independence. The polyproline helix (PxxP motif or as an exact description: PxxPxR) leads to the recognition of SH3 domains while the structurally opposite di-leucine motif (LL motif or: ExxxLL) interacts with the di-leucine binding domain. The representation of the full-length protein structure of Nef is based on the composition of the structures of the anchor domain (amino acids 1-57; Geyer et al., 1999) and the core domain (amino acids 57-206; Grzesiek et al., 1996), which by means of Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy have been determined and energy-minimized with subsequent molecular dynamics.

B) zeigt die Korrelation von Sequenzkonservierung und Oberflächenzugänglichkeit, die die Struktur- Funktionsbeziehung des HIV Nef Proteins verdeutlicht. Aminosäuren, die eine Schlüsselfunktion für die Faltung der Proteinstruktur einnehmen sind überdurchschnittlich hoch konserviert und liegen im Inneren der Struktur verborgen (siehe z. B. Trp-183). Demgegenüber sind Aminosäuren, die stark exponiert sind aber trotzdem hoch konserviert sind, häufig für die Interaktionen des Proteins wichtig (siehe LL- Motiv, 164 165). Die für die Funktionalität des viralen Proteins wichtigen Motive können so ermittelt werden.B) shows the correlation of sequence conservation and Surface accessibility that the structural Functional relationship of the HIV Nef protein clarified. Amino acids that play a key role in folding The protein structure is above average preserved and hidden inside the structure (see e.g. Trp-183). In contrast, amino acids are the are heavily exposed but are still highly preserved, often important for protein interactions (see LL- Motif, 164 165). The for the functionality of the viral Protein's important motives can be identified in this way.

Der Grad der Sequenzkonservierung wurde aus einem Alignment von 186 einzelnen Nef Aminosäuresequenzen unterschiedlicher HIV-1 Subtypen bestimmt. Die Oberflächenzugänglichkeit der einzelnen Aminosäuren, unterteilt in Haupt- und Seitenkette, wurde anhand der in A) gezeigten Nef Proteinstruktur berechnet. The degree of sequence conservation was from an alignment of 186 individual Nef amino acid sequences different HIV-1 subtypes determined. The surface accessibility of the individual amino acids, divided into main and side chain, was based on the Nef protein structure shown in A) calculated.  

In Abb. 2 zeigt A) die etwa 350 Aminosäuren umfassende LL- bindende Domäne (LL-Domäne), die über einen Polypeptid-Linker variabler Länge (10 bis 60 Aminosäuren) mit einer 61 Aminosäuren großen PxxP-bindenden Domäne (SH3-Domäne) verbunden wird. Die Spezifität dieses Hybridmoleküles zum Blocken des HIV Nef Proteins ergibt sich aus der hier geschaffenen Chimäre einer Domäne aus vesikulären Transportprozessen (LL-Domäne) mit einer Domäne aus Signaltransduktionsprozessen (SH3-Domäne).In FIG. 2, A) shows the LL-binding domain (LL domain), which comprises approximately 350 amino acids, and which via a polypeptide linker of variable length (10 to 60 amino acids) with a 61 amino acid PxxP-binding domain (SH3 domain) is connected. The specificity of this hybrid molecule for blocking the HIV Nef protein results from the chimera created here of a domain from vesicular transport processes (LL domain) with a domain from signal transduction processes (SH3 domain).

Das damit geschaffene Fusionsprotein zielt spezifisch auf die beiden Motive höchster Konservierung (LL und PxxP) in Nef, die aus sehr unterschiedlichem zellulärem Kontext stammen.The resulting fusion protein specifically targets the two motifs of the highest conservation (LL and PxxP) in Nef, that come from a very different cellular context.

B) von Abb. 2 stellt eine Skizze eines Fusionsproteins mit ungekehrter Anordnung der Proteindomänen dar. C) Das Fusionsprotein zum Blocken des HIV Nef Proteins kann durch die Einführung zweier zusätzlicher sequentieller Motive weiter spezifiziert und optimiert werden. Ein Farnesylierungsmotiv am C-Terminus zur Membranverankerung (oder auch Palmitoylierungsmotiv, Myristoylierungsmotiv) gewährleistet die Lokalisation des Fusionsproteins in den Umgebung des membranständigen Nef Proteins. Ein Signal zur Ubiquitinylierung (oder auch Sumoylierung) kann den Komplex aus dem Fusionsprotein mit Nef zum Abbau am Proteasom der Zelle lenken. Die Anordnung der Domänen, Linker und zusätzlichen Motive muß auf größte Affinität, Spezifität und Funktionalität zum Blocken des HIV Nef Proteins optimiert werden. B) of Fig. 2 shows a sketch of a fusion protein with the reverse arrangement of the protein domains. C) The fusion protein for blocking the HIV Nef protein can be further specified and optimized by introducing two additional sequential motifs. A farnesylation motif at the C-terminus for membrane anchoring (or palmitoylation motif, myristoylation motif) ensures the localization of the fusion protein in the vicinity of the membrane-bound Nef protein. A signal for ubiquitinylation (or also sumoylation) can direct the complex from the fusion protein with Nef to break down at the proteasome of the cell. The arrangement of the domains, linkers and additional motifs must be optimized for the greatest affinity, specificity and functionality for blocking the HIV Nef protein.

Bindungsexperimente (Abb. 3)Binding experiments ( Fig. 3)

Zwei verschiedene Nef Proteine von den beiden in Laboratorien am häufigsten benutzten HIV-1 Stämmen NL4-3 und SF2 wurden für die Bindungsexperimente verwendet. Die beiden Nef Proteine wurde als Fusionsproteine mit Glutathion-S- Transferase (GST) in Echerichia Coli exprimiert und mittels GST-Sepharose Beads aufgereinigt. Das Fusionsprotein bestehend aus der LL-Domäne der β-Untereinheit des Adaptor- Protein-Komplexes AP-1 (β-1) und der PxxP-bindenden SH3- Domäne der Tyrosin-Kinase Hck (SH3-Hck) wurde mit zwei unterschiedlichen Längen des Verbindungslinkers kloniert (vgl. Abb. 2). Die Verwendung der beiden Linker von 60 Aminosäuren Länge bzw. 106 Aminosäuren Länge führt zu den beiden Varianten des Fusionsproteins LL-SH3(470) und LL- SH3(516) mit einem Laufverhalten von 48 kDa bzw. 56 kDa. [Im Detail besteht die Chimäre aus AC: AAA40807 (β1), AS 171-578 (LL-Domäne und Linker) bzw. AS 171-624, -Threonin- (für die Restriktionsschnittstelle) und AC: P08631, AS 78-138 (Hck- SH3).] Die Fusionsproteine wurden in vitro transkribiert und mit dem TnT T7 gekoppelten Reticulozyten Lysat System (Promega, Wisconsin) in Gegenwart von [35S]-markiertem Cystein translatiert.Two different Nef proteins from the two most commonly used HIV-1 strains NL4-3 and SF2 in the laboratory were used for the binding experiments. The two Nef proteins were expressed as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST) in Echerichia Coli and purified using GST-Sepharose beads. The fusion protein consisting of the LL domain of the β-subunit of the adapter-protein complex AP-1 (β-1) and the PxxP-binding SH3 domain of the tyrosine kinase Hck (SH3-Hck) was made with two different lengths of the Linker cloned (see Fig. 2). The use of the two linkers of 60 amino acids in length and 106 amino acids in length leads to the two variants of the fusion protein LL-SH3 (470) and LL-SH3 (516) with a running behavior of 48 kDa and 56 kDa, respectively. [In detail, the chimera consists of AC: AAA40807 (β1), AS 171-578 (LL domain and linker) or AS 171-624, -Threonin- (for the restriction interface) and AC: P08631, AS 78-138 ( Hck-SH3).] The fusion proteins were transcribed in vitro and translated with the TnT T7 coupled reticulocyte lysate system (Promega, Wisconsin) in the presence of [ 35 S] -labeled cysteine.

Der Bindungsassay zwischen GST-Nef und in vitro translatiertem Fusionsprotein wurde in Standard Kinase- Extraktions-Puffer (KEB) durchgeführt (250 mM NaCL, 0.5% NP40, 2 mM EDTA, 10% Glycerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) und 1 mg/ml Proteinase-Inhibitoren Cocktail). Etwa 4 µl des GST-Nef Proteins wurden mit 7 µl des Fusionsproteins über 3 Stunden bei 4°C in 500 µl KEB langsam geschüttelt. Anschließend wurden die GST-Beads drei Mal in KEB gewaschen, die Proteine durch 10% SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.The binding assay between GST-Nef and in vitro translated fusion protein was in standard kinase Extraction buffer (KEB) performed (250 mM NaCL, 0.5% NP40, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mg / ml Proteinase inhibitor cocktail). About 4 µl of the GST-Nef Protein was mixed with 7 µl of the fusion protein over 3 hours Shaken slowly at 4 ° C in 500 µl KEB. Subsequently the GST beads were washed three times in KEB, the proteins  separated by 10% SDS-PAGE gel electrophoresis and by Autoradiography made visible.

Das Bindungsexperiment zeigt, dass die beiden Fusionsproteine unterschiedlicher Länge spezifisch an das HIV-1 Nef Protein der Allele NL4-3 und SF2 binden (Spur 2, 3 und 5, 6) während keine Bindung zwischen GST allein und den Fusionsproteinen detektiert werden kann (Spur 1, 4). Die hohe Affinität der Bindung wird durch die Darstellung von 10% des Inputs der Fusionsproteine deutlich (Spur 7, 8).The binding experiment shows that the two fusion proteins different lengths specific to the HIV-1 Nef protein of alleles NL4-3 and SF2 bind (lanes 2, 3 and 5, 6) during no binding between GST alone and the fusion proteins can be detected (lane 1, 4). The high affinity of the Binding is represented by 10% of the input of the Fusion proteins clearly (lanes 7, 8).

Literaturliterature

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SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (24)

1. Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-Proteins, das aus Folgendem besteht:
  • a) einer Proteindomäne, die ein Di-Leucin (LL)-Motiv bindet,
  • b) einer Proteindomäne, die ein PxxP-Motiv bindet, und
  • c) einem Polypeptidlinker, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.
1. Fusion protein for blocking the HIV-Nef protein, which consists of the following:
  • a) a protein domain that binds a di-leucine (LL) motif,
  • b) a protein domain that binds a PxxP motif, and
  • c) a polypeptide linker through which the two domains (a) and (b) are connected.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, bei dem die Proteindomäne von a) die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 1 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine LL-Bindungs-Aktivität beibehalten.2. Fusion protein according to claim 1, wherein the protein domain of a) the amino acid sequence of Seq. ID. No. 1 or homologue or fragments thereof which have an LL binding activity maintained. 3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Proteindomäne von b) eine SH3-Domäne mit der Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 2 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine PxxP-Bindungs-Aktivität beibehalten.3. Fusion protein according to claim 1 or 2, wherein the Protein domain of b) an SH3 domain with the amino acid sequence by Seq. ID. No. 2 or homologues or fragments thereof which maintain PxxP binding activity. 4. Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 3 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine biologische Aktivität beibehalten.4. Fusion protein that contains the amino acid sequence of Seq. ID. No. 3 or homologs or fragments thereof, one maintain biological activity. 5. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich ein Signal zur Membranverankerung enthält.5. fusion protein according to any one of the preceding claims, which also contains a signal for membrane anchoring. 6. Fusionsprotein nach Anspruch 5, bei dem das Signal ein C- terminales Farnesylierungssignal gemäß Seq. ID. Nr. 4 ist.6. Fusion protein according to claim 5, wherein the signal is a C- terminal farnesylation signal according to Seq. ID. No. 4 is. 7. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich ein Signal zur Degradation am Proteasom enthält. 7. Fusion protein according to one of the preceding claims, which is also a signal for degradation on the proteasome contains.   8. Fusionsprotein nach Anspruch 7, bei dem das Signal ein Ubiquitinylierungssignal gemäß Seq. ID. Nr. 5 ist.8. Fusion protein according to claim 7, wherein the signal Ubiquitinylation signal according to Seq. ID. No. 5 is. 9. Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 6 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine biologische Aktivität beibehalten.9. Fusion protein that contains the amino acid sequence of Seq. ID. No. 6 or homologs or fragments thereof, one maintain biological activity. 10. Nukleinsäuresequenz zur Kodierung eines Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins, das aus Folgendem in funktioneller Verbindung besteht:
  • a) einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein Di-Leucin (LL)-Motiv bindende Proteindomäne kodiert,
  • b) einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein PxxP-Motiv bindende Proteindomäne kodiert, und
  • c) einer Nukleinsäuresequenz, die einen Polypeptidlinker kodiert, durch den die beiden. Domänen (a) und (b) verbunden sind.
10. Nucleic acid sequence for coding a fusion protein for blocking the HIV-Nef protein, which consists of the following in a functional connection:
  • a) a nucleic acid sequence encoding a protein domain that binds a di-leucine (LL) motif,
  • b) a nucleic acid sequence encoding a protein domain that binds a PxxP motif, and
  • c) a nucleic acid sequence encoding a polypeptide linker through which the two. Domains (a) and (b) are connected.
11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, bei der die Nukleinsäuresequenz von a) die Sequenz von Seq. ID. Nr. 7 oder einen Teil hiervon umfasst, der eine Proteindomäne mit LL- Bindungs-Aktivität kodiert.11. The nucleic acid sequence according to claim 10, wherein the Nucleic acid sequence from a) the sequence from Seq. ID. No. 7 or includes a portion thereof that contains a protein domain with LL Encoding binding activity. 12. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10 oder 11, bei der die Nukleinsäuresequenz von b) die Sequenz von Seq. ID. Nr. 8 oder einen Teil hiervon umfasst, der eine Proteindomäne mit PxxP- Bindungs-Aktivität kodiert.12. Nucleic acid sequence according to claim 10 or 11, wherein the Nucleic acid sequence from b) the sequence from Seq. ID. No. 8 or includes a portion thereof that contains a protein domain with PxxP Encoding binding activity. 13. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, die die Seq. ID. Nr. 9 oder einen Teil hiervon umfasst, der ein biologisch aktives Fusionsprotein kodiert.13. Nucleic acid sequence according to claim 10, which the Seq. ID. No. 9 or a part thereof, which is a biologically active Fusion protein encoded. 14. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 10-13, die zusätzlich ein Signal zur Membranverankerung kodiert. 14. Nucleic acid sequence according to any one of claims 10-13, the additionally encoded a signal for membrane anchoring.   15. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10-14, die zusätzlich ein Signal zur Degradation am Proteasom kodiert.15. nucleic acid sequence according to claim 10-14, the additional encodes a degradation signal on the proteasome. 16. Nukleinsäuresequenz, die die Seq. ID. Nr. 10 oder einen Teil hiervon umfasst, der ein biologisch aktives Fusionsprotein kodiert.16. Nucleic acid sequence that the Seq. ID. No. 10 or one Part of which includes a biologically active Fusion protein encoded. 17. Nukleinsäuresequenz, die die Komplementärsequenz einer der Nukleinsäuresequenzen von Anspruch 10-16 umfasst.17. Nucleic acid sequence that is the complementary sequence of one of the Nucleic acid sequences of claims 10-16. 18. ExpressionsVektor der eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10-17 enthält.18. Expression vector of a nucleic acid sequence Claim 10-17 contains. 19. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 18 transformiert ist.19. A host cell containing a vector according to claim 18 is transformed. 20. Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV Nef-Proteins, das ein Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor nach Anspruch 18, ein Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression der Sequenz durch die Wirtszelle erlauben, und ein Isolieren des Fusionsproteins aus der Wirtszelle umfassen.20. Process for producing a substantially pure Fusion protein for blocking the HIV Nef protein, which is a Transforming a host cell with a vector according to claim 18, cultivating the host cell under conditions that a Allow expression of the sequence by the host cell, and a Isolate the fusion protein from the host cell. 21. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1-9 umfasst, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.21. Therapeutic composition that is an effective amount of a fusion protein according to any one of claims 1-9, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 22. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10-17 umfasst, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.22. Therapeutic composition that is an effective amount a nucleic acid sequence according to claims 10-17, in Combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 23. Verwendung der Zusammensetzungen nach Anspruch 21 und 22 bei der in vitro-Diagnose des erworbenen Immunmangelsyndroms (AIDS).23. Use of the compositions according to claims 21 and 22 in the in vitro diagnosis of acquired immune deficiency syndrome (AIDS). 24. Verwendung der Zusammensetzungen nach Anspruch 21 und 22 zur in vivo Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (AIDS) beim Menschen.24. Use of the compositions according to claims 21 and 22 for in vivo therapy of acquired immune deficiency syndrome (AIDS) in humans.
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