DE102023205715B3

DE102023205715B3 - Verfahren, Verwendung des Verfahrens und Mikroskop zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum

Info

Publication number: DE102023205715B3
Application number: DE102023205715.8A
Authority: DE
Inventors: Annette Bergter; Volker Doering
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2023-06-19
Filing date: 2023-06-19
Publication date: 2024-08-01
Anticipated expiration: 2043-06-20

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mikroskop zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum (419). Umfasst sind die Schritte des Erfassens einer Detektionsstrahlung aus einem in dem Probenraum (419) erzeugten konfokalen Volumen mit einer Mehrzahl von Detektorelementen (1 bis 32) eines Detektors (414) in Form eines Detektorarrays zu mehreren Zeitpunkten über eine Messdauer, wobei der Detektor (414) in einer zur rückseitigen Bildebene eines Objektivs (47) konjugierten Ebene angeordnet ist und die Messwerte der Detektorelemente (1 bis 32) jeweils einzeln analysiert werden können; und das Auswählen mindestens eines Paares von Detektorelementen (1 bis 32). Es werden Kreuzkorrelationen der erfassten Messwerte der Detektorelemente (1 bis 32) mindestens eines Paares in zwei Richtungen erzeugt und analysiert.Gekennzeichnet ist die Erfindung dadurch, dass das konfokale Volumen an mindestens zwei voneinander verschiedenen Orten (L1 bis L5) des Probenraums (419) erzeugt wird und an jedem der Orte (L1 bis L5) eine Geschwindigkeit und optional eine Bewegungsrichtung als Strömungseigenschaften des Mediums ermittelt werden. Anhand dieser wird ein Strömungsprofil über mindestens einen Bereich des Probenraums (419) erstellt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum. Die Erfindung betrifft außerdem ein für die Ausführung des Verfahrens geeignet konfiguriertes Mikroskop.
Auf dem Gebiet der Mikroskopie, insbesondere der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie, besteht ein Interesse, Bewegungen von Objekten in einem Probenraum zu erkennen und deren Eigenschaften, wie Geschwindigkeit und Richtung, zu bestimmen. Insbesondere interessiert dabei die Bereitstellung von Daten zu Strömungsprofilen, um beispielsweise Auswirkungen der Gestaltung von Probenräumen wie zum Beispiel Röhren, Reaktionskammern oder von miniaturisierten Reaktionsräumen (Kavitäten) in Zellkulturkammern („Lab-on-a-chip“; „organ-on-a-chip“) zu bewerten.
Aus der DE 10 2023 201 620 (unveröffentlicht) ist ein Verfahren bekannt, mit dem Bewegungen von Molekülen untersucht werden können. Dabei wird die Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy; FCS) verwendet, um beispielsweise die Dynamik des Verhaltens von Molekülen in Zellen zu untersuchen. Die nachfolgend auch kurz als FCS bezeichnete Methode steht in verschiedenen Varianten zur Verfügung (z.B.: LENNE, Pierre-Francois [u.a.]: Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. In: The EMBO Journal, Vol. 25, 2006, No. 14, S. 3245-3256. ISSN 1460-2075 (E); 0261-4189 (P). DOI: 10.1038/sj.emboj.7601214 und WENGER, Jerome [u.a.]: Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. In: Biophysical Journal, Vol. 92, 2007, No. 3, S. 913-919. ISSN 1542-0086 (E); 0006-3495 (P). DOI: 10.1529/biophysj.106.096586). Eine der Varianten ist die sogenannte „spot-variation FCS“ (z. B.: WAWREZINIECK, Laure [u.a.]: Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. In: Biophysical Journal, Vol. 89, 2005, No. 6, S. 4029-4042. ISSN 1542-0086 (E); 0006-3495 (P). DOI: 10.1529/biophysj.105.067959). Dabei wird eine Anregungsstrahlung fokussiert und in einen Probenraum gerichtet. Infolge der Fokussierung und der Ausdehnung des Fokus des fokussierten Strahlenbündels der Anregungsstrahlung sowohl quer (x- beziehungsweise y-Richtung) zur Ausbreitungsrichtung (i.d.R. optische Achse) als auch entlang der Ausbreitungsrichtung (z-Richtung) ist in Verbindung mit der konfokalen Detektion in dem Probenraum ein sogenanntes konfokales Volumen (in diesem Zusammenhang auch vereinfachend als „Fokus“ bezeichnet) beleuchtet. Helligkeitsinformationen (Messwerte) können für verschieden große konfokale Volumina erfasst werden. Die Helligkeitsinformationen werden mittels eines optischen Detektors (z.B. Photodiode) erfasst.
Aus der Publikation von Scipioni et al. (SCIPIONI, L. [u.a.]: Comprehensive correlation analysis for super-resolution dynamic fingerprinting of cellular compartments using the Zeiss Airyscan detector. In: Nature Communications, Vol. 9, 2018, Artikelnummer: 5120. ISSN 2041-1723 (E). DOI: 10.1038/s41467-018-07513-2) ist eine Abwandlung der spot-variation FCS bekannt. Zur Erfassung wird ein ortsauflösender Flächendetektor verwendet, dessen Detektorelemente einzeln und unabhängig voneinander ausgelesen und ausgewertet werden können. Konkret wird bei Scipioni et al. ein als „Airyscan-Detektor“ bezeichneter Detektortyp verwendet, der in einer Zwischenbildebene eines Detektionsstrahlengangs angeordnet ist und dessen jeweilige Detektorelemente als individuelle Lochblenden (Pinhole) fungieren (HUFF, Joseph: The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. In: Nature Methods, Vol. 12, 2015, S. i-ii. ISSN 1548-7105 (E); 1548-7091 (P). DOI: 10.1038/nmeth.f.388).
Die DE 10 2023 201 620 beschreibt das gezielte Auslesen der Messwerte von ausgewählten Paaren eines solchen flächigen Detektors. Anhand von Kreuzkorrelationen können Geschwindigkeit und Richtung sich bewegender Moleküle, die eine Detektionsstrahlung in Form einer Fluoreszenzstrahlung emittieren, innerhalb biologischer Zellen ermittelt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Möglichkeit zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum, insbesondere in Probenräumen mit kleinen Abmessungen, vorzuschlagen.
Die Aufgabe wird durch die Gegenstände des unabhängigen Anspruchs und des nebengeordneten Anspruchs gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Von dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum sind die nachstehenden Schritte umfasst. In einem Schritt A wird eine Detektionsstrahlung erfasst, die ihren Ursprung in einem in dem Probenraum erzeugtem konfokalen Volumen hat. Die Erfassung erfolgt mit einer Mehrzahl von Detektorelementen eines Detektorarrays zu mehreren Zeitpunkten über eine Messdauer (auch: Messzeitraum, Messintervall; beispielsweise jeweils 10 Sekunden bis zu einigen Minuten je Messdauer), wobei das Detektorarray in einer zur rückseitigen Bildebene eines Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist. Diese konjugierte Ebene wird auch als „Pinholeebene“ bezeichnet. Die Messwerte der Detektorelemente können jeweils einzeln ausgelesen und analysiert werden. Es ist auch möglich, die Messwerte jeweils ausgewählter Detektorelemente miteinander zu kombinieren („binning“).
Außerdem wird mindestens ein Paar von Detektorelementen ausgewählt, wobei jeder der beiden Partner eines Paares durch wenigstens ein Detektorelement gebildet ist. Ein Paar ist durch wenigstens ein ausgewähltes Detektorelement und ein weiteres ausgewähltes Detektorelement gebildet.
In einem weiteren Verfahrensschritt (Schritt B) werden aus den Messwerten mindestens eines Paares untereinander Kreuzkorrelationen der erfassten Messwerte erzeugt. Dabei werden in einem ersten Teilschritt B1 Kreuzkorrelationen ausgehend von einem der ausgewählten Detektorelemente in einer ersten Richtung zu dem weiteren ausgewählten Detektorelement berechnet. Diese erste Richtung kann auch als Vorwärtsrichtung bezeichnet werden.
In einem zweiten Teilschritt B2 werden zusätzlich Kreuzkorrelationen ausgehend von dem weiteren ausgewählten Detektorelement in einer zweiten Richtung (Rückrichtung) zu dem ersten ausgewählten Detektorelement berechnet.
In einem Schritt C werden die Kreuzkorrelationen beziehungsweise deren Ergebnisse hinsichtlich des Auftretens einer Veränderung der Intensität der Messwerte ausgewählter Detektorelemente analysiert.
Gekennzeichnet ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch, dass das konfokale Volumen an mindestens zwei voneinander verschiedenen Orten des Probenraums erzeugt wird. Um verschiedene Orte zu adressieren, dürfen die konfokalen Volumina sich dabei optional zu höchstens 50% ihrer Ausdehnung in der z-Richtung beziehungsweise in ihrem Querschnitt in der x-Richtung und/oder in der y-Richtung zur z-Richtung überlappen.
In der vorliegenden Beschreibung wird, entsprechend einem kartesischen Koordinatensystem, eine Richtung der Hauptströmung des Mediums im Probenraum als Richtung x und eine orthogonal dazu verlaufende Richtung als Richtung y bezeichnet. Senkrecht zu beiden Richtungen verläuft die z-Achse (Richtung z), entlang der üblicherweise eine Erfassung der Detektionsstrahlung erfolgt.
Die Auswahl der Orte, an denen Messungen erfolgen, kann manuell, beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten Benutzeroberfläche, oder automatisiert erfolgen. So kann beispielsweise durch einen Nutzer eine Vorschrift vorgegeben werden, nach der die Anzahl und Positionen der Orte festgelegt werden. Dabei können Orte absolut im Probenraum oder relativ beispielsweise zu jeweils in dem Probenraum befindlichen Proben gewählt werden. Die Orte können auch anhand eines zuvor erfassten Übersichtsbildes des Probenraums und/oder einer Probe gewählt werden. Als Proben werden in dem Probenraum befindliche künstliche oder biologische Strukturen bezeichnet, die von dem Medium angeströmt und/oder umflossen werden. Künstliche Strukturen bestehen im Wesentlichen aus technischen Werkstoffen wie Metall, Legierungen und Kunststoffen, aber optional auch aus biogenen Materialien und können beispielsweise Gefäßimplantate, sein. Biologische Strukturen sind zum Beispiel Zellen, Zellschichten, Sphäroide, Organoide und Gewebe von Organismen oder ganze Organismen.
An jedem der Orte werden anhand der Kreuzkorrelationen eine Geschwindigkeit und optional eine Bewegungsrichtung des Mediums ermittelt, indem insbesondere mehrere Kreuzkorrelationen über Paare unterschiedlicher Ausrichtung berechnet und alle so erhaltenen Kurven mit den Richtungen und/oder einer Geschwindigkeit als Parameter angepasst werden.
Die Geschwindigkeiten und gegebenenfalls die Bewegungsrichtungen werden je Ort einander zugeordnet und wiederholt abrufbar abgespeichert, um ein Geschwindigkeitsprofil, beziehungsweise bei Hinzunahme der jeweiligen Bewegungsrichtung ein Strömungsprofil, über mindestens einen räumlichen Bereich des Probenraums zu erstellen.
Der Begriff der Richtung wird im Zusammenhang mit einer Berechnung von Kreuzkorrelationen in dieser Beschreibung im Sinne eines Vektors mit einem Startpunkt und einer virtuellen Ausbreitungslinie gebraucht. Das bedeutet, dass beispielsweise in einer Horizontalen eine erste Richtung (Vorwärtsrichtung) von einem Startpunkt nach 0° und eine zweite Richtung (Rückrichtung) von einem Startpunkt nach 180° verlaufen (siehe auch 4). Entsprechendes gilt für (Polar-) Koordinatensysteme mit einer anderen Ausrichtung.
Kern der Erfindung ist, Messwerte ausgewählter und insbesondere einzeln auslesbarer Detektorelemente zu nutzen, um Informationen von Strömungen, beispielsweise anhand von Bewegungen bestimmter Objekte, in einem strömenden Medium zu erlangen und im Ergebnis ein Strömungsprofil über mindestens einen Bereich des Probenraums zu erzeugen. Dabei werden je Messpunkt (Ort) eine dort aktuell erreichte Geschwindigkeit und optional eine Bewegungsrichtung der Objekte ermittelt. Vereinfachend wird nachfolgend von einem Strömungsprofil gesprochen, auch wenn lediglich ein Geschwindigkeitsprofil erstellt werden kann. Ein Strömungsprofil wird aus Messwerten einer Mehrzahl von unterschiedlichen Messpunkten erzeugt. Die zu einem Strömungsprofil zusammengestellten Messwerte werden vorteilhaft innerhalb eines festgelegten Messzeitraum ermittelt, um deren Interaktion beziehungsweise deren gleichzeitiges Vorliegen sicherzustellen. Als Objekte werden im Rahmen dieser Beschreibung insbesondere Moleküle, beispielsweise Proteine, Nukleinsäuren und deren Derivate, Aggregationen, Komplexe, Konglomerate und Chelate bezeichnet.
Die zur Bestimmung der Strömungseigenschaften herangezogenen Objekte werden vorzugsweise mit Fluorophoren markiert oder sind selbst zur Emission von Fluoreszenzstrahlung in der Lage (Fluorophore). Die emittierte und als Detektionsstrahlung erfasste Fluoreszenzstrahlung wird insbesondere mittels einer in den Probenraum eingestrahlten Anregungsstrahlung bewirkt.
Um eine in dem Probenraum befindliche Probe und/oder in dem Medium befindliche Objekte zu schonen, wird die Anregungsstrahlung geformt und jeweils nur in ausgewählte Bereiche des Probenraums gerichtet. Eine örtlich begrenzte Anregung wird vorteilhaft mit einer Erfassung von Detektionsstrahlung an dem betreffenden Ort synchronisiert.
Vorteilhaft kann zur Ausführung der Erfindung eine bereits vorhandene Konfiguration einer zur Erzeugung konfokaler Volumina geeigneten optischen Anordnung, beispielsweise eines Mikroskops, verwendet werden, um ohne gerätetechnischen Zusatzaufwand Daten zu ermitteln. Genutzt wird dabei der Umstand, dass jedes der Detektorelemente einen etwas anderen Ausschnitt des konfokalen Volumens abbildet. Es werden also eine Mehrzahl voneinander verschiedener Detektionsfoki erzeugt und deren Messwerte analysiert, wobei die sehr hohe Präzision der Fertigung und Anordnung der Detektorelemente sowie der diesen vorgeordneten optischen Elemente, beispielsweise Mikrolinsenarrays, bei den sogenannten Airyscan-Detektoren (Huff, 2015, Nature Methods; Application Notes, December 2015) und Arrays von SPAD-Detektoren (Single-Photon-Avalanche-Diode) vorteilhaft eine sehr präzise Kenntnis der Abstände der jeweiligen konfokalen Volumina bedingt. Gegenüber den Lösungen des Standes der Technik kann aufgrund der exakten Kenntnis der Lage und Ausprägung der jeweiligen konfokalen Volumina vorteilhaft auf deren Kalibrierung, beispielsweise unter Verwendung bekannter Farbstoffmoleküle als Referenzen, verzichtet werden.
Die prinzipielle Herangehensweise gemäß der Erfindung wird im Folgenden beispielhaft anhand eines Airyscan-Detektors mit 32 Kanälen erläutert (Huff, 2015, Nature Methods; Application Notes, December 2015). Weitere für die Umsetzung der Erfindung geeignete Detektoren sind beispielsweise SPAD-Arrays und andere Flächendetektoren mit einzeln auslesbaren beziehungsweise zusammengefassten („gebinnten“) Detektorelementen.
Wie beispielhaft aus der 4 zu entnehmen ist, können bei der Verwendung des Airyscan-Detektors sechs Kreuzkorrelationen berechnet werden, wenn zwischen den ein Paar bildenden Detektorelementen jeweils ein Detektorelement Abstand verbleibt und die äußeren Detektorelemente nicht genutzt werden (siehe weiter unten). Dabei zeigt eine Differenz zwischen den Kreuzkorrelationen, die für einander entgegengesetzte Richtungen berechnet wurden, eine Bewegung eines die Detektionsstrahlung verursachenden oder abgebenden Objekts an.
Um eine Geschwindigkeit und eine Richtung des sich bewegenden Objekts zu ermitteln, kann eine experimentelle Kreuzkorrelation der zu Gleichung [1] angegebenen Form oder mittels weiterführender Modelle erzeugt werden.
Die Gleichung zu [1] lautet: $G (τ) = A exp (- \frac{r_{0}^{2} + τ^{2} v^{2} - 2 r_{0} τ v cos α}{4 D τ + w_{0}^{2}}) G_{d i f f} (τ)$
,wobei v die Fließgeschwindigkeit (Fit-Parameter); α ein Winkel zwischen der Fließrichtung und einem die Detektorelemente verbindenden Vektor (Fit-Parameter); r₀ die Distanz zwischen den Foki der Detektorelemente eines (erweiterten) Paares; w₀ der 1/e² Radius des konfokalen Volumens in XY für ein Detektorelement; D der Diffusionskoeffizient und G_diff(τ) der Diffusionsterm (2D oder 3D) ist. Letzterer beschreibt die Autokorrelation in Abwesenheit einer Bewegung für ein Detektorelement.
Der Parameter r₀ kann nicht direkt aus dem Abstand der Detektorelemente voneinander berechnet werden, sondern muss empirisch oder theoretisch ermittelt werden. Grund dafür ist der Umstand, dass die PSF (Punktbildübertragungsfunktion, point spread function) der Beleuchtungsstrahlung und die PSF der Detektionsstrahlung nicht gleich sind. Der Parameter r₀ kann einerseits ermittelt werden, indem eine statische Probe, beispielsweise eine Farblösung, vermessen wird, wobei r₀ als zu fittender (anzupassender) Parameter eingesetzt und die Fließgeschwindigkeit v = 0 gesetzt wird. Alternativ kann r₀ von einer theoretischen PSF abgeleitet werden, indem zum Beispiel Kreuzkorrelationen mit der theoretischen PSF verwendet und mittels der Gleichung [1] angepasst („fitting“) werden.
Die Anpassung (Fitten; fitting) mehrerer Kreuzkorrelationen für unterschiedliche Richtungen verbessert die Stabilität der Anpassungen hinsichtlich des Winkels α. Anders als bei Verfahren des Standes der Technik mit zwei Foki können zudem alle Kreuzkorrelationen aus einem einzigen Satz von Messwerten ermittelt werden.
In einer weiteren Verfahrensausgestaltung ist es möglich, dass eine Mehrzahl von Detektorelementen zu je einem der Teile oder Partner eines Paares zusammengefasst werden, was nachfolgend als erweitertes Paar bezeichnet wird. Dabei werden die erfassten Messwerte je Partner des erweiterten Paares miteinander verrechnet, beispielsweise gemittelt, bevor eine Kreuzkorrelation zwischen den so verrechneten Messwerten der beiden Partner des erweiterten Paares ermittelt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit nur einem Paar beziehungsweise einem erweiterten Paar von Detektorelementen ausgeführt werden. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, kann in einer weiteren Ausgestaltung eine Gruppe mehrerer Paare und/oder erweiterter Paare von Detektorelementen festgelegt werden. Dabei verlaufen die gedachten Verbindungslinien der Mittelpunkte jedes Paares beziehungsweise erweiterten Paares zueinander im Wesentlichen parallel. Lediglich beispielsweise können die gedachten Verbindungslinien zwar an Mittelpunkten unterschiedlicher Detektorelemente beginnen, diese verlaufen aber sämtlich zum Beispiel nach 0° (siehe auch 5). Auf die Messwerte der so ausgewählten Paare kann wieder Gleichung [1] angewendet werden, nachdem die je Paar erfassten Messwerte gemittelt wurden. Entsprechendes gilt für die zweite Richtung, also die Rückrichtung, beispielsweise nach 180°. In diesen Fällen kann die Vorwärtsrichtung auch als gemeinsame erste Richtung und die Rückrichtung auch als gemeinsame zweite Richtung bezeichnet werden.
Insbesondere für weiterführende Analysen und/oder Berechnungen kann jeweils ein Mittelwert der von den Messwerten der Paare beziehungsweise erweiterten Paare erzeugten Kreuzkorrelationen der ersten Richtung und/oder der zweiten Richtung gebildet und optional für eine weitere Verwendung vorgehalten werden.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in dem Umstand, dass gleichzeitig eine Mehrzahl von Paaren oder erweiterten Paaren analysiert werden kann. Vorteilhaft werden dabei Gruppen von Paaren beziehungsweise erweiterten Paaren analysiert, wobei die jeweils gemeinsamen Richtungen der gedachten Verbindungslinien zwischen den (erweiterten) Paaren jeder der Gruppen voneinander verschieden ausgerichtet sind.
Anhand der Ergebnisse der Kreuzkorrelationen kann zudem vorteilhaft eine aktuelle Konzentration von zur Emission von Fluoreszenzstrahlung angeregten Objekten bestimmt werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können mehrere Kreuzkorrelationen beispielsweise über Paare/erweiterte Paare unterschiedlicher Ausrichtung, beispielsweise mindestens zweier verschiedener Gruppen, oder deren Mittelwerte (siehe oben) berechnet werden. Optional können alle so erhaltenen Kurven mit den entsprechenden Richtungen und/oder Geschwindigkeit als Parameter angepasst werden (globaler Fit).
Bei der Auswahl der Detektorelemente der jeweiligen Paare/erweiterten Paare kann eine hinreichende Diffusionsstrecke oder Fließstrecke abgebildet werden, indem die ausgewählten Paare räumlich jeweils durch mindestens ein nicht zu dem betreffenden Paar gehörendes Detektorelement getrennt sind. Entsprechend können die zu einem erweiterten Paar gehörenden Detektorelemente um mindestens die Distanz entsprechend der Breite eines Detektorelements voneinander entfernt gewählt werden.
Wie weiter unten noch erläutert werden wird, können insbesondere diejenigen Detektorelemente ausgewählt werden, die einen hinreichend ähnlichen Radius des konfokalen Volumens aufweisen und deren Distanzen voneinander gleich sind. Die Ergebnisse, die unter Verwendung von Messwerten randständiger Detektorelemente für örtliche Geschwindigkeiten und Bewegungsrichtungen erhalten wurden, haben sich jedoch ebenfalls als valide und robust herausgestellt.
Um die Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens zu steigern, kann eine Punktbildübertragungsfunktion (point spread function, PSF) einer zur Erzeugung des konfokalen Volumens verwendeten und entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs in den Probenraum gerichteten Beleuchtungsstrahlung und/oder der erfassten Detektionsstrahlung so geformt werden, dass insbesondere diejenigen Detektorelemente Messwerte erfassen, die für eine nachfolgende Analyse als Partner der Paare oder der erweiterten Paare vorgesehen beziehungsweise geeignet sind.
So kann beispielsweise der Querschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs in einer Richtung quer zum jeweiligen Strahlengang gestreckt werden, sodass dieser einen länglich-ovalen Querschnitt aufweist. Eine solche Strahlformung kann mittels einer geeigneten Schlitzblende oder durch Wirkung eines entsprechend angesteuerten räumlichen Lichtmodulators (spatial light modulator, SLM) erreicht werden.
Anhand der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Daten, insbesondere anhand der Ergebnisse der Kreuzkorrelationen, können optional weitere Eigenschaften sich bewegender Objekte abgeleitet werden. So ist es vorteilhaft möglich, eine lokale Temperatur (Mikrotemperatur) eines Mediums, beispielsweise einer Matrix oder eines Lösungsmittels der Probe, am Ursprungsort der Detektionsstrahlung zu ermitteln.
Weiterhin ist es möglich, eine Viskosität des Mediums am Ursprungsort der Detektionsstrahlung, genauer: des jeweiligen Anteils der Detektionsstrahlung, zu bestimmen. Grundlage ist beispielsweise die auch als Einstein-Stokes-Gleichung bezeichnete Gleichung [2]: $D (T) = k_{B} T / (6 πη (T) r)$
Dabei sind:

D der Diffusionskoeffizient,
kB die Boltzmannkonstante,
T die absolute Temperatur,
η die dynamische Viskosität des Mediums und
r der hydrodynamische Radius (Stokesradius) eines Objekts.

Aus Gleichung [2] sind die mehrfachen Temperaturabhängigkeiten von Elementen der Beziehung zu erkennen. Die Viskosität η beziehungsweise deren Änderung kann beispielsweise bei konstanter Temperatur T und auftretenden Druckänderungen bestimmt werden.
Die Erfindung kann vorteilhaft in durchströmten Probenräumen wie Röhren, Kavitäten von sogenannten Zellkulturkammern, Biochips, Reaktionskammern, Durchflusskammern und dergleichen eingesetzt werden. Die Probenräume sind dabei vorzugsweise Bestandteile mikrofluidischer Anordnungen oder Systeme.
Beispielsweise kann in einer Verwendungsmöglichkeit der Einfluss der Wand des betreffenden Probenraums im Bereich der Messungen auf wenigstens ein Geschwindigkeitsprofil untersucht werden, indem Eigenschaften der Wand in Zusammenhang mit (zugehörigen) ermittelten Strömungseigenschaften gesetzt werden. Eigenschaften der Wand können neben den Dimensionierungen auch durch das Material der Wand und/oder einer Makro- und/oder Mikrostrukturierung ihrer Oberfläche gegeben sein.
Die mittels der Erfindung vorteilhaft erreichbare hohe räumliche Auflösung der Messungen erlaubt es, Strömungseigenschaften in sehr kleinen Probenräumen zu bestimmen und entsprechend kleinräumige Strömungsprofile zu erstellen. Das räumliche Auflösungsvermögen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch die beugungsbegrenzte Ausdehnung des Beleuchtungsvolumens bestimmt. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erreichbare Auflösung liegt in den Richtungen x und y bei weniger als 100 nm, insbesondere bei etwa 40 nm. In Richtung z kann eine Auflösung von etwa 10 nm erreicht werden.
Messwerte in Richtung z, also in Detektionsrichtung, können je nach den optischen Eigenschaften der Wand des Probenraums, des Mediums und der fluoreszierenden Objekte aktuell bis in eine Tiefe von wenigen Millimetern, beispielsweise weniger als 3 mm, zum Beispiel etwa 1 mm, insbesondere bis etwa 500 µm, mit hinreichender Qualität erfasst. Beispielsweise können konfokale Volumina mit einer für die Auswertung qualitativ geeigneten PSF bis in Tiefen (Richtung z) von 150 bis 200 µm (bei einem Arbeitsabstand von beispielsweise 400 µm) erzeugt werden. Dabei ist die Ausprägung der PSF in Abhängigkeit von den optischen Eigenschaften der beteiligten Komponenten sowie von der Wellenlänge der Anregungsstrahlung und der emittierten Detektionsstrahlung von besonderer Bedeutung für die erreichbare Qualität der ermittelten Daten. Größere Tiefen sind bei weiteren Verbesserungen und Abstimmung der optischen Elemente erreichbar.
In einer weiteren möglichen Anwendung der Erfindung kann sowohl das Strömungsverhalten eines in dem Medium befindlichen Objektes, beispielsweise einer sich bewegenden Zelle („moving or (free)-floating cell“) als auch deren Einfluss auf das Strömungsverhalten im Probenraum untersucht werden. Ist beispielsweise die Zelle oder ein Gewebe in der Lage, beispielsweise mittels ihrer Zilien, selbst eine Strömung zu erzeugen, können euch die erzeugte Strömung und/oder deren Wechselwirkung mit einer eventuell im Probenraum vorhandenen weiteren Strömung untersucht werden.
Strömungseigenschaften, insbesondere Strömungsprofile, können zudem in Abhängigkeit des Vorhandensein und/oder einer konkreten Dimensionierung von als Probe dienenden Objekten wie Sphäroiden, Geweben, Organoide und/oder anderen dreidimensionalen Strukturen ermittelt werden.
Eine weitere Anwendung der Erfindung ist die Messung von Strömungseigenschaften in vivo innerhalb eines Blutgefäßes oder des Blutgefäßsystems eines Organismus. Beispielsweise ist dies beim Zebrafisch möglich, solange dieser während seiner Entwicklung für die Anregungsstrahlung und die Detektionsstrahlung noch optisch durchlässig ist.
Aufgrund der hohen erreichbaren räumlichen Auflösung können in Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Beispiel Wirkungen der Modifikation einer Wand des Probenraums untersucht werden. So ist es möglich, die Strömungseigenschaften eines Mediums in einer Nachbildung eines Blutgefäßes in einem unbehandelten Zustand zu bestimmen und mit den Strömungseigenschaften in einem behandelten Zustand, beispielsweise nach Einsetzen eines Gefäßimplantats (Stent), zu vergleichen.
Weitere Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die biomedizinische Grundlagenforschung. So kann zum Beispiel die Verteilung pharmakologisch wirksamer Stoffe in einem Probenraum sowie deren Zufuhr zu einer biologischen Probe untersucht und beschrieben werden. Das Verfahren kann auch in der, insbesondere biomedizinischen, Materialforschung sowie in der Qualitätskontrolle eingesetzt werden. Vorteilhaft ist zudem, dass einerseits mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens Strömungseigenschaften des Mediums und das Transportverhalten des pharmakologischen Wirkstoffs ermittelt werden kann, und außerdem unter Nutzung desselben Mikroskops die Aufnahme und der Verbleib des Wirkstoffs unter Anwendung beispielsweise der in der DE 10 2023 201 620 beschriebenen Methodik innerhalb biologischer Strukturen erfasst und untersucht werden kann. Vorteilhaft kann dazu der Probenraum einfach auf dem Probentisch des Mikroskops verbleiben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zusätzlich oder alternativ zur Bereitstellung von Messwerten als Eingangsdaten für Modelle und/oder zur Verifizierung bestehender Simulationen eingesetzt werden. Solche Eingangsdaten können zum Beispiel neben mathematischen Simulationen und Modellen auch für Methoden des maschinellen Lernens und der künstlichen Intelligenz genutzt werden (zusammenfassend als Simulationen und Modelle bezeichnet). Beide Herangehensweisen können sowohl für allgemeine als auch für individuelle Situationen im Probenraum umgesetzt werden. Simulationen und Modelle können zum Beispiel mit oder ohne Probe im Probenraum entwickelt, verbessert und angewendet werden.
Ein grundlegender Vorteil der Erfindung besteht darin, dass Eingriffe in die Probe beziehungsweise in den zu beobachtenden Probenraum sehr gering gehalten werden können. Es bedarf keiner weiteren Hardware, sondern es können bestehende Systeme genutzt werden. Lediglich deren Ansteuerung und Auswertung wird an das erfindungsgemäße Verfahren angepasst.
Die Erfindung wird typischerweise mit Wellenlängen der Anregungsstrahlung in einem Bereich von etwa 440 bis 640 nm ausgeführt. Möglich sind in weiteren Ausgestaltungen Anregungswellenlängen beispielsweise bis zu 1600 nm, beispielsweise bei Nutzung einer Mehrphotonenanregung.
Um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, kann ein Mikroskop zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum verwendet werden. So können Mikroskope verwendet werden, die zur Durchführung fluoreszenzbasierter Methoden wie der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) oder der FRAP-Mikroskopie (engl. fluorescence-recovery-after photobleaching) geeignet sind. Solche Mikroskope können beispielsweise punkt- oder linienscannende Mikroskope sein.
In weiteren Ausführungen der Erfindung kann eine Beleuchtung mit einer Anregungsstrahlung beispielsweise in Form eines dünnen Lichtblattes erfolgen. Auf diese Weise werden lediglich Objekte innerhalb des schichtweise beleuchteten Bereichs des Lichtblatts zur Emission von Fluoreszenzstrahlung angeregt (z. B.: Singh, A.P. et al., The performance of 2D array detectors for light sheet based fluorescence correlation spectroscopy, Optics Express, 21(7) (2013) 8652-8668).
Das Mikroskop weist in einer vorteilhaften Ausführung den Probenraum ein Objektiv zur Erfassung einer aus einem in dem Probenraum erzeugten konfokalen Volumen kommenden Detektionsstrahlung und einen Detektionsstrahlengang auf, entlang dem die erfasste Detektionsstrahlung auf ein Detektorarray mit einer Mehrzahl von Detektorelementen gelenkt wird, wobei das Detektorarray in einer zur rückseitigen Bildebene des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist (Bildebene; Pinholeebene) und die Messwerte der Detektorelemente jeweils einzeln ausgelesen werden können. Die Ebene ist insbesondere eine Zwischenbildebene, in der in einem konfokalen Detektionsstrahlengang mindestens eine Lochblende (pinhole) angeordnet ist. In einem erfindungsgemäßen Mikroskop wird die Funktion der Lochblende durch die einzelnen Detektorelemente des Detektors erfüllt.
Als Detektor kann vorteilhaft einer der bereits erwähnten Airyscan-Detektoren oder SPAD-Arrays vorhanden sein. Den Detektorelementen können optische Elemente wie z. B. Mikrolinsenarrays vorgeordnet sein. Möglich sind auch andere flächige Detektoren mit einzeln auslesbaren Detektorelementen.
Ein erfindungsgemäßes Mikroskop kann eine Zoomoptik aufweisen. Diese kann der gesteuerten Veränderung einer Ausdehnung des Strahlenbündels der Detektionsstrahlung dienen, um zum Beispiel die Ausdehnung eines Strahlenbündels der erfassten Detektionsstrahlung an die Größe einer Detektionsfläche (Detektionsebene) eines ortsauflösenden Detektors anzupassen.
Das erfindungsgemäße Mikroskop weist zudem eine zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Verfahrensansprüche konfigurierte Analyseeinheit auf. Eine solche Analyseeinheit kann beispielsweise ein Rechner, ein Mikrocontroller oder ein FPGA sein.
Weiterhin ist eine Steuereinheit vorhanden, die neben der Ansteuerung von Komponenten des Mikroskops auch für eine Auswahl von Orten und/oder das Anfahren ausgewählter Orte eingerichtet sein kann. Ausgewählte Orte werden angefahren, indem der Probenraum und/oder das Objektiv in eine Relativposition zueinander gebracht werden, an der ein Fokus des Detektionsstrahlengangs des Mikroskops in den ausgewählten Ort gerichtet ist.
Analyse- und Steuereinheit können jeweils einzelne Komponente des Mikroskops sein. In einer weiteren Ausführung sind diese entsprechend konfigurierte Kompartimente einer rechentechnischen Vorrichtung, wie eines Rechners oder eines Steuerschaltkreises.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft unterstützt werden, indem die Strahlform der Beleuchtungsstrahlung beziehungsweise der Detektionsstrahlung entsprechend der aktuellen Erfordernisse angepasst wird. Dazu kann beispielsweise als eine strahlformende Optik eine gesteuert einstellbare Irisblende im Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise im Detektionsstrahlengang des Mikroskops angeordnet sein. So erzeugt beispielsweise ein Reduzieren des Durchmessers des Beleuchtungsstrahlengangs einer Unterfüllung an der Eingangsseite der Objektivpupille und führt somit zu einer Vergrößerung des konfokalen Volumens.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops kann als eine strahlformende Optik ein gesteuert einstellbarer (Laser-)strahlaufweiter (beam expander) im Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise im Detektionsstrahlengang des Mikroskops angeordnet sein. Strahlaufweiter basieren typischerweise auf teleskopischen Bauformen. Durch Wirkung der Einstellungen eines motorisierten variablen Strahlaufweiters kann ebenfalls das konfokale Volumen vergrößert oder verkleinert werden.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops kann als eine strahlformende Optik eine Schlitzblende im Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise im Detektionsstrahlengang angeordnet sein, durch deren Wirkung eine quer zum Strahlengang längliche PSF erzeugt wird. Ebenfalls möglich ist das Vorhandensein eines die PSF räumlich und/oder zeitlich modulierenden optischen Elements, wie zum Beispiel eines räumlichen Lichtmodulators (spatial light modulator, SLM) oder entsprechender verstellbarer und/oder gesteuert in bzw. aus dem Strahlengang verbringbarer Phasenmasken.
Die genannten Blenden beziehungsweise optischen Elemente können vorteilhaft angesteuert und ihre optische Wirkung gezielt beeinflusst werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen erläutert. Dabei zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines ersten Beispiels eines Detektorarrays;
2 eine schematische Darstellung eines zweiten Beispiels eines Detektorarrays;
3 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
4 eine schematische Darstellung eines Detektorarrays und beispielhaft ausgewählte Paare von Detektorelementen;
5 eine schematische Darstellung des Detektorarrays und eine Gruppe von ausgewählten Paaren von Detektorelementen;
6 eine schematische Darstellung eines Detektorarrays und ein beispielhaft ausgewähltes erweitertes Paar von Detektorelementen;
7 eine schematische Darstellung eines von einem Medium durchflossenen Probenraums, eines erfindungsgemäßen Mikroskops sowie von Komponenten einer Vorrichtung zur Medienförderung; und
8 eine Schema einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In den Ausführungsbeispielen und Figuren sind gleiche technische Elemente mit gleichen Bezugszeichen versehen. Die Abbildungen sind nicht maßstabsgetreu.
In der 1 ist ein Detektor 414 in Form eines sogenannten Airyscan-Detektors in einer Draufsicht auf seine Detektionsebene oder Detektionsfläche zu sehen. Der Detektor 414 dieser Ausführungsform weist 32 Detektorelemente 1 bis 32 auf und kann als ein ortsauflösender Detektor 414 verwendet werden. Die erfassten Helligkeitsinformationen (Messwerte) der Detektorelemente 1 bis 32 sind einzeln auslesbar und können zudem beliebig miteinander kombiniert werden („binning“). Die Ausdehnung des Strahlenbündels einer Detektionsstrahlung (siehe auch 3) kann beispielsweise so gewählt werden, dass diese mit 1,25 Airy-Units (AU) auf die Detektionsebene fällt. Dabei kann beispielsweise jedes der Detektorelemente 1 bis 32 einen Ausschnitt von 0,2 AU erfassen. Das zentrale und mit dem Bezugszeichen „1“ bezeichneten Detektorelement befindet sich auf der optischen Achse (oA) des Detektionsstrahlengangs 410 (siehe 3).
In der 2 ist eine weitere Ausführung eines ortsauflösenden Detektors 414 in einer zeilen- und spaltenweisen Anordnung der Detektorelemente 1 bis 31 gezeigt, wie diese beispielsweise in einem SPAD-Array, einem CMOS-Chip oder sCMOS-Chip realisiert sein kann. Auch hier sind die Helligkeitsinformationen der Detektorelemente 1 bis 31 einzeln auslesbar oder können beliebig kombiniert werden.
Die 3 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop M. Dieses umfasst eine Lichtquelle 41, beispielsweise eine Laserlichtquelle, von der ausgehend ein Strahlenbündel einer Anregungsstrahlung (Beleuchtungsstrahlung) ausgesendet und entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs 42 (Anregungsstrahlengang 42) geführt wird. Optional vorhandene optische Elemente zur Formung und/oder Kollimation der Anregungsstrahlung sind nicht dargestellt. Im Beleuchtungsstrahlengang 42 ist optional eine strahlformende Optik 44 zur gesteuerten Veränderung einer Ausdehnung des Strahlenbündels angeordnet, das im Ausführungsbeispiel als eine gesteuert einstellbare Blende ausgebildet ist. In weiteren Ausführungen kann auch ein Revolver oder ein Schieber vorhanden sein, mittels dem unterschiedliche Blenden in den Beleuchtungsstrahlengang 42 eingebracht werden können. Alternativ kann die strahlformende Optik 44 auch ein gesteuert einstellbares Teleskop, ein Strahlaufweiter, eine Zoom-Optik, ein akustooptisches Element oder ein SLM sein.
Die strahlformende Optik 44 kann mittels eines Antriebs 416 aus dem Beleuchtungsstrahlengang 42 herausbewegt werden (mit unterbrochener Volllinie angedeutet gezeigt), um unterschiedliche Numerische Aperturen zu bewirken, unter deren jeweiligen Winkelbereichen die Anregungsstrahlung in eine abzubildende Probe 48 gerichtet werden kann. Die strahlformende Optik 44 kann in weiteren Ausführungen hinsichtlich seiner Durchlässigkeit für die Anregungsstrahlung , insbesondere hinsichtlich eines Lochdurchmesser (Lochblende, Irisblende) oder der Länge und Breite eines Schlitzes oder eines transparenten Bereiches (einstellbare Schlitzblende, akustooptisches Element) oder der Winkelausrichtung und der Phaseninformation einstellbar sein.
Die Anregungsstrahlung trifft nach dem Durchgang durch die strahlformende Optik 44 auf einen Hauptfarbteiler 43, der für die Anregungsstrahlung durchlässig ist und diese passieren lässt. Nach dem Hauptfarbteiler 43 durchläuft die Anregungsstrahlung einen Abschnitt des Strahlengangs des Mikroskops M, der als gemeinsamer Strahlengang 4210 bezeichnet wird und entlang dem die Anregungsstrahlung und eine Detektionsstrahlung (siehe unten) gemeinsam geführt sind beziehungsweise gemeinsam geführt werden können.
Mittels eines nachfolgend angeordneten Scanners 46 kann das zuvor mittels eines Spiegels 45 umgelenkte Strahlenbündel der Anregungsstrahlung gesteuert abgelenkt und in die Eintrittspupille EP eines Objektivs 47 gerichtet werden. Der Spiegel 45 erlaubt eine kompakte Bauweise und kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung fehlen, wenn keine Umlenkung des Beleuchtungsstrahlengangs 42 erforderlich oder vorgesehen ist.
Die durch Wirkung der strahlformenden Optik 44 in seiner lateralen Ausdehnung eingestellte und mittels des Scanners 46 gesteuert abgelenkte Anregungsstrahlung wird durch Wirkung des Objektivs 47 in einen Probenraum fokussiert, in dem die abzubildende Probe 48 auf einem Probentisch 49 vorhanden sein kann. Die derart fokussiert eingestrahlte Anregungsstrahlung bewirkt in Kombination mit der konfokalen Detektion ein konfokales Anregungsvolumen.
Eine in der Probe 48 durch die Anregungsstrahlung in dem konfokalen Anregungsvolumen bewirkte Detektionsstrahlung wird mit dem Objektiv 47 erfasst und entlang eines Detektionsstrahlengangs 410 geführt (mit unterbrochenen Volllinien gezeigt), der bis zum Hauptfarbteiler 43 mit dem Anregungsstrahlengang 42 zusammenfällt.
In weiteren Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Detektionsstrahlung mittels eines weiteren Objektivs (nicht gezeigt) erfasst werden. In einem solchen Fall können Anregungsstrahlengang 42 und Detektionsstrahlengang 410 vollständig voneinander getrennt sein oder diese werden, beispielsweise mittels eines weiteren Farbteilers (nicht gezeigt), wieder zu dem gemeinsamen Strahlengang 4210 vereinigt.
Die Detektionsstrahlung wird im dargestellten Ausführungsbeispiel infolge des Passierens des Scanners 46 in einen ruhenden Strahl überführt („descannt“) und gelangt zum Hautfarbteiler 43. Dieser ist für die Wellenlänge der Detektionsstrahlung, die von der Wellenlänge der Anregungsstrahlung verschieden ist, reflektierend. Die am Hauptfarbteiler 43 reflektierte Detektionsstrahlung gelangt zu einer im Detektionsstrahlengang 410 optional vorhandenen Zoomoptik 411. Diese ist mittels eines Zoomantriebs 412 einstellbar. In weiteren Ausführungen können die Durchlässigkeit und die Reflektivität des Hauptfarbteilers 43 auch umgedreht umgesetzt sein, sodass die Anregungsstrahlung reflektiert und die Detektionsstrahlung durchgelassen wird. Entsprechend sind dann die Strahlengänge 42 und 410 zu gestalten.
Die strahlformende Optik 44, der Scanner 46, der Zoomantrieb 412 und die Antriebe 415 und 416 sowie optional die Lichtquelle 41 stehen mit einer Analyse- und Steuereinheit 413 in einer zum Austausch von Daten und Steuerbefehlen geeigneten Verbindung. Die Analyse- und Steuereinheit 413 ist beispielsweise ein Rechner oder ein geeigneter Steuerschaltkreis und zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens konfiguriert. Insbesondere ist diese für die Ausführung und Bewertung von Kreuzkorrelationen von Bilddaten der oben beschriebenen Paare, erweiterten Paare und/oder Gruppen konfiguriert sowie optional zur Ermittlung von Diffusionskoeffizienten, Fließgeschwindigkeiten und Fließrichtungen sich bewegender Objekte, lokaler Temperaturen und/oder lokaler Viskositäten.
Die Zoomoptik 411 stellt ein Mittel zur gesteuerten Veränderung einer Ausdehnung des Strahlenbündels der Detektionsstrahlung dar, mittels der die Ausdehnung eines Strahlenbündels der erfassten Detektionsstrahlung an die Größe einer Detektionsfläche (Detektionsebene) eines ebenfalls im Detektionsstrahlengang 410 in einem Zwischenbild („Pinhole-Ebene“) angeordneten ortsauflösenden Detektors 414 angepasst werden kann. Ziel dabei ist es, die Detektionsfläche möglichst vollständig auszuleuchten oder den jeweiligen Anforderungen entsprechend anzupassen. Dementsprechend wird die Detektionsstrahlung mittels der Zoomoptik 411 auf den Detektor 414 gerichtet und mittels des Zoomantriebs 412 hinsichtlich der Ausdehnung ihres Strahlenbündels angepasst.
Optional können die Steuereinheit 413 und der Detektor 414 miteinander verbunden sein, um zum Beispiel der Steuereinheit 413 anhand der erfassten Helligkeitsinformationen des Detektors 414 die Generierung von Steuerbefehlen zu ermöglichen und/oder um diese zu validieren. Diese Steuerbefehle dienen beispielsweise dazu, die Lichtquelle 41, das Mittel 44, den Scanner 46, den Zoomantrieb 412 und/oder einen optionalen Antrieb 415 des Probentischs 49 anzusteuern.
In den 4 bis 6 werden jeweils technische Sachverhalte anhand der Detektorelemente 1 bis 32 eines Detektors 414 des Typs eines Airyscan-Detektors angegeben. Für Detektoren 414 des zu 2 dargestellten Typs gilt entsprechendes. Bei einer nachfolgenden Angabe der Nummern der betreffenden Detektorelemente wird auf 1 Bezug genommen. Das zentrale Detektorelement 1 ist in den folgenden 4 bis 6 zum Zwecke der besseren Übersichtlichkeit ohne Musterfüllung gefüllt dargestellt.
Die 4 zeigt erneut eine Draufsicht auf die Detektionsfläche des Detektors 414 (gegenüber der 1 um etwa 30° gegen den Uhrzeigersinn gedreht). Zum Zwecke der Beschreibung sind ausgehend von Detektorelement 1 Richtungen definiert und beispielhaft mit Gradzahlen zwischen 0° und 180° beziehungsweise mit -60° und -120° bezeichnet. Mit Pfeilen sind bespielhaft drei Paare von ausgewählten Detektorelementen gezeigt, wobei Anfang und Ende jedes Pfeils einen Partner des betreffenden Paares anzeigen. Die Pfeilrichtung gibt die Vorwärtsrichtung und die Rückrichtung der auf Basis der von den Partnern jedes Paares erfassten Intensitätswerten (Helligkeitswerte, Messwerte) durchgeführten insgesamt sechs Kreuzkorrelationen an. Die unterschiedlichen Musterfüllungen heben die drei um das zentrale Detektorelement 1 angeordneten Ringe hervor.
Werden lediglich die zu 4 beispielhaft gezeigten Paare und Richtungen der Ermittlung von Kreuzkorrelationen zugeführt, ist die Effizienz des Verfahrens gering, da erfasste Messwerte anderer Detektorelemente unberücksichtigt bleiben. Nutzt man jedoch den Umstand, dass der Radius des konfokalen Volumens w₀ für das zentrale Detektorelement 1 und die inneren beiden Ringe der Detektorelemente 2 bis 19 näherungsweise konstant ist, können für jede Richtung neun Paare von Detektorelementen ausgewählt und festgelegt werden, wie dies in 5 beispielhaft für die Richtung 180° - >0° veranschaulicht ist. Die daraus erhaltenen neun Kurven können gemittelt und unter Verwendung der Gleichung [1] angepasst werden. Die Nutzung der Mehrzahl von Kurven verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis.
In gleicher Weise können Kreuzkorrelationen für die anderen fünf Richtungen (-120°->60°, -60°->120°, 0°->180°, 60°->-120° und 120°->-60°; nicht gezeigt) berechnet werden.
In einer weiteren Verfahrensausgestaltung können die Messwerte der Detektorelemente 20 bis 32, beziehungsweise 19 bis 31 gemäß 2, beispielsweise in Abhängigkeit von einem gewählten Abbildungsverhältnis der Zoomoptik 411 (siehe 3) und den sich daraus ergebenden Signalstärken der einzelnen Kanäle (Detektorelemente) ebenfalls verwendet werden. So können beispielsweise die Messwerte der Detektorelemente 1 bis 19 beziehungsweise 1 bis 18 für die eigentliche FCS-Berechnung und die Messwerte der Detektorelemente 20 bis 32, beziehungsweise 19 bis 31 für die Ermittlung von Strömungseigenschaften und im Ergebnis zur Erstellung eines Strömungsprofils verwendet werden.
In einer alternativen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mehrere Detektorelemente zu erweiterten Paaren zusammengefasst. In 6 ist dies für die Detektorelemente 5, 6, 7, 16, 17 und 18 als Elemente des einen Partners des erweiterten Paares und die Detektorelemente 2, 3, 4, 10, 11 und 12 als Elemente des anderen Partners des erweiterten Paares beispielhaft gezeigt. Kreuzkorrelationen können in diesem Beispiel für die Richtungen 180° -> 0° (gemeinsame erste Richtung, Vorwärtsrichtung) und 0°->180° (gemeinsame zweite Richtung, Rückrichtung) berechnet werden, wobei die Messwerte der Elemente jedes Partners des erweiterten Paares zuvor gemittelt werden. Die Mittelpunkte der jeweiligen Partner des erweiterten Paares sind voneinander um mehr als die Ausdehnung eines der Detektorelemente 1 bis 32 voneinander beabstandet.
In der 7 ist schematisch ein Probenraum 419 in Form einer röhrenförmigen Kavität, beispielsweise eines Bioreaktors oder einer Zellkulturkammer, gezeigt. Der Probenraum 419 ist seitlich von einer Wand 419.1 begrenzt. Diese kann in weiteren Ausführungen abschnittsweise plan oder geschwungen ausgeführt sein. Die Wand 419.1 kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen und optional auf ihrer dem Probenraum 419 zugewandten Seitenfläche Oberflächenstrukturierungen aufweisen.
In der Wand 419.1 kann optional ein für eine Anregungsstrahlung und/oder eine Detektionsstrahlung transparentes Fenster 420 vorhanden sein. Dies ist dann von Vorteil, wenn die Wand 419.1 nicht transparent ist oder die Ausprägung der Detektions-PSF beim Durchgang durch die Wand 419.1 sehr nachteilig beeinflusst wird. Ein Fenster 420 erlaubt eine inverse oder seitliche Anordnung der Strahlengänge zur Anregung und Detektion, sodass beispielsweise der Bauraum oberhalb des Probenraums 419 weiterhin für andere technische Elemente zur Verfügung steht.
Alternativ ist der Probenraum 419 nach oben hin offen und die Anregung sowie die Detektion erfolgt durch die entsprechende Öffnung des Probenraums 419.
Ein den Probenraum 419 durchströmendes Medium (als Punktmuster veranschaulicht) kann in einem Behälter 417 frisch bereitgestellt und/oder gespeichert sein. Mittels einer Pumpe 418 kann Medium aus dem Behälter 417 über (vereinfacht gezeigte) Leitungen in den Probenraum 419 hinein und aus diesem wieder abgeführt werden. Die Pumpe 418 ist mittels der Steuereinheit 413 ansteuerbar. Optional gelangt das Medium zur erneuten Nutzung zurück zum Behälter 417. In weiteren Ausführungen kann das Medium nach Verlassen des Probenraums 419 auch entsorgt oder anderweitig verwendet werden.
Der Behälter 417 kann mit weiteren Komponenten in Verbindung stehen, durch deren Wirkung genutztes Medium für eine erneute Verwendung aufbereitet wird. Beispielsweise können diesem Nährstoffe, Hormone, Wachstumsfaktoren, pharmakologische Wirkstoffe und/oder Gase wie Sauerstoff zugesetzt werden.
Der Probenraum 419 enthält beispielsweise einen Zellhaufen als eine Probe 48, der hier dunkel punktiert gezeigt ist.
Innerhalb des Probenraums 419 sind beispielhaft ausgewählte Orte L1 bis L5 mit einem + markiert. Die an dem betreffenden Ort L1 bis L5 jeweils aktuell vorliegende Strömungsrichtung sowie eine jeweilige Strömungsgeschwindigkeit sind mittels Pfeilen veranschaulicht. Um eine wenigstens über eine Messdauer stabile turbulente Strömung, wie diese beispielhaft am Ort L3 angedeutet ist, zu bestimmen, sind in der näheren Umgebung des Ortes L3 mehrere räumlich getrennte Messungen erforderlich.
Für jeden der Orte L1 bis L5 sind die genauen räumlichen Positionen bekannt und liegen beispielsweise in Form von zugehörigen Koordinaten eines kartesischen Koordinatensystems vor.
Um Strömungseigenschaften an einigen oder allen diesen Orten L1 bis L5 zu erfassen, kann ein Erfassungsbereich, insbesondere ein Fokus F, eines verwendeten Mikroskops M, hier vereinfacht durch das Objektiv 47 symbolisiert, in den betreffenden Ort L1 bis L5 gerichtet werden. Dazu können der Probenraum 419 und/oder das Mikroskop M in mindestens einer der Richtungen x, y und z, beispielsweise unter Nutzung des Probentisches 49 (3), gesteuert bewegt werden (durch die Doppelpfeile symbolisiert). Die Fokuslage F des Mikroskops M ist vorteilhaft in Richtung z einstellbar, indem beispielsweise das Mikroskop M mit einer Zoomoptik (nicht gezeigt) und/oder mit einer Verstellmöglichkeit des Objektivs 47 in Richtung z ausgestattet ist.
Die Steuereinheit 413 ist optional mit einem Datenspeicher ausgestattet oder steht mit einem solchen in einer zur Übertragung von Daten geeigneten Verbindung. In dem Datenspeicher können erfasste Messwerte abgelegt werden. Den Messwerten können Metadaten wie die Koordinaten des Ursprungsorts der Messwerte sowie optional Informationen zu Eigenschaften des verwendeten Mediums, der Probe 48, des verwendeten Fluorophors sowie zum Beispiel von Temperaturen, Zeitdauern, Lichtregimen und ähnliches zugeordnet gespeichert werden. Außerdem können Eigenschaften des Probenraums 419, beispielsweise dessen Dimensionierung und/oder Eigenschaften der Wand 419.1 den Messwerten zugeordnet und wiederholt abrufbar gespeichert werden.
Mit der 8 wird eine mögliche Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens illustriert. Zuerst wird mindestens ein Paar von Detektorelementen 1 bis 32 ausgewählt und festgelegt, dessen Messwerte in den nächsten Schritten verwendet werden sollen. Entsprechendes gilt für Gruppen von Paaren beziehungsweise für erweiterte Paare (siehe oben). Eine aus einem zuvor ausgewählten und angefahrenen Ort L1 bis L5 aus dem Probenraum 419 kommende Detektionsstrahlung wird erfasst und die daraus resultierenden Messwerte der ausgewählten Paare werden ausgelesen, um sie der Berechnung der entsprechenden Kreuzkorrelationen jeweils in Vorwärtsrichtung und Rückrichtung zuführen zu können. Die Ergebnisse der Kreuzkorrelationen werden anschließend analysiert, Strömungseigenschaften bestimmt und wenigstens ein Strömungsprofil erstellt.
Optional ist es möglich, nach dem Berechnen der Kreuzkorrelationen beziehungsweise in Reaktion auf die Ergebnisse der Analyse weitere Daten zu erfassen und/oder erneut Orte I1 bis L5 und die entsprechenden Paare von Detektorelementen 1 bis 32 auszuwählen.
Die praktische Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mittels einer Menüführung („wizard“) unterstützt werden, die einem Nutzer zu den einzelnen Verfahrensschritten jeweils entsprechende Optionen vorschlägt.
Die Nutzung der Menüführung bedingt, dass einige technische Voraussetzungen durch den Nutzer spezifiziert werden. Beispielsweise gibt dieser zu verwendende Objektive, unterstützte Laserlinien und den korrekten Strahlengang (Beleuchtung und/oder Detektion) vor. Zusätzlich oder alternativ können zu verwendende Farbstoffe oder Fluorophore seitens des Nutzers vorgegeben werden. Durch die Menüführung werden entsprechend geeignete Laserlinien, Strahlengänge und/oder Steuerungsparameter vorgeschlagen beziehungsweise eingestellt. Zudem ist eine korrekte Ausrichtung des zu nutzenden Detektors 414 erforderlich, um nachfolgend eine gute Qualität der Messwerte zu erreichen und somit die Möglichkeit der Berechnung einer Mehrzahl von Kreuzkorrelationen zu schaffen.
In einem weiteren Schritt kann ein Referenzbild der Probe aufgenommen werden. Beispielsweise können von einem oder mehreren Orten Bilder der Probe mit unterschiedlichen Wellenlängen („Tracks“) aufgenommen und dargestellt werden. Ein Nutzer und/oder eine geeignete Programmierung (zum Beispiel Bildauswertungsverfahren, Einsatz künstlicher Intelligenz) kann anhand der Darstellungen wenigstens einen interessierenden Ort („region of interest“; ROI) auswählen. Vorteil der Verwendung mehrerer Wellenlängen ist eine höhere Informationsdichte für die vorzunehmende Auswahl der interessierenden Orte. Von den ausgewählten Orten wird nachfolgend eine FCS-Messung durchgeführt. Diese erfolgt mit nur einer Wellenlänge.
Das Referenzbild kann durch den Nutzer als eine Karte verwendet werden, auf der er beispielsweise bis zu zehn Positionen je eines Spots festlegen kann (Schritt 3). Ein entsprechendes Symbol (zum Beispiel: „spot selection icon“) gibt die verlinkten Beziehungen zwischen den ausgewählten Spotpositionen und den Bildkoordinaten der zugehörigen Detektorelemente, insbesondere der inneren Ringe mit den Detektorelementen 1 bis 19, wieder. Die Quantität und/oder Qualität der erfassten Messwerte, optional per Spot, kann grafisch dargestellt werden, indem beispielsweise Zähldaten mit unterschiedlichen Farbkodierungen angezeigt werden. Dies ermöglicht dem Nutzer, gegebenenfalls in Rückgriff auf den zweiten Track (siehe oben), bei Bedarf die Positionen anders zu wählen. Um die CMP (counts per molecule) zu optimieren, können die Intensität eines zur Anregung der Detektionsstrahlung verwendeter Laser, ein Gain (z. B. Hochspannung des PMT) und die betrachtete z-Position nachgeregelt werden.
Ein vierter Schritt der Menüführung ist nur dann verfügbar, wenn ein Referenzbild vorliegt. In jedem Schritt werden Messwerte in einer Metadatei abgelegt. Wird die Menüführung ein weiteres Mal gestartet, können sämtliche Werte wieder aufgerufen werden.
Bezugszeichen

1 bis 32: Detektorelemente
41: Lichtquelle
42: Beleuchtungsstrahlengang, Anregungsstrahlengang
43: Hauptfarbteiler
44: strahlformende Optik
45: Spiegel
46: Scanner
47: Objektiv
48: Probe
49: Probentisch
410: Detektionsstrahlengang
411: Zoomoptik
412: Zoomantrieb
413: Steuereinheit
414: Detektor
415: Antrieb
416: Antrieb
4210: gemeinsamer Strahlengang
417: Behälter
418: Pumpe
419: Probenraum
419.1: Wand (des Probenraums 419)
420: Fenster
F: Fokuslage
L1 bis L5: Ort 1 bis Ort 5
M: Mikroskop

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum (419), umfassend die Schritte: - A. Erfassen einer Detektionsstrahlung aus einem in dem Probenraum (419) erzeugten konfokalen Volumen mit einer Mehrzahl von Detektorelementen (1 bis 32) eines Detektors (414) in Form eines Detektorarrays zu mehreren Zeitpunkten über eine Messdauer, wobei der Detektor (414) in einer zur rückseitigen Bildebene eines Objektivs (47) konjugierten Ebene angeordnet ist und die Messwerte der Detektorelemente (1 bis 32) jeweils einzeln analysiert werden können; und Auswählen mindestens eines Paares von Detektorelementen (1 bis 32), wobei jeder Partner eines Paares durch wenigstens ein Detektorelement (1 bis 32) gebildet wird; - B. Erzeugen von Kreuzkorrelationen der erfassten Messwerte der Detektorelemente (1 bis 32) mindestens eines Paares untereinander, wobei o in einem ersten Teilschritt B1 Kreuzkorrelationen ausgehend von einem der ausgewählten Detektorelemente in einer ersten Richtung zu dem weiteren ausgewählten Detektorelement berechnet werden; - und in einem zweiten Teilschritt B2 zusätzlich Kreuzkorrelationen ausgehend von dem weiteren ausgewählten Detektorelement in einer zweiten Richtung, Rückrichtung, zu dem ersten ausgewählten Detektorelement berechnet werden; und - in einem Schritt C die Kreuzkorrelationen hinsichtlich des Auftretens einer Veränderung der Intensität der Messwerte ausgewählter Detektorelemente (1 bis 32) analysiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass - das konfokale Volumen an mindestens zwei voneinander verschiedenen Orten (L1 bis L5) des Probenraums (419) erzeugt wird und - an jedem der Orte (L1 bis L5) anhand der Kreuzkorrelationen eine Geschwindigkeit und optional eine Bewegungsrichtung als Strömungseigenschaften des Mediums ermittelt werden, indem mehrere Kreuzkorrelationen über Paare unterschiedlicher Ausrichtung berechnet und alle so erhaltenen Kurven mit den Richtungen und/oder einer Geschwindigkeit als Parameter angepasst werden, und - und die Geschwindigkeiten und gegebenenfalls Bewegungsrichtungen je Ort (L1 bis L5) einander zugeordnet und wiederholt abrufbar abgespeichert werden, um ein Geschwindigkeitsprofil über mindestens einen Bereich des Probenraums (419) zu erstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl von Detektorelementen (1 bis 32) zu je einem der Partner eines erweiterten Paares zusammengefasst werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Gruppe mehrerer Paare beziehungsweise mehrerer erweiterter Paare von Detektorelementen (1 bis 32) festgelegt wird, wobei die gedachten Verbindungslinien der Mittelpunkte der Paares beziehungsweise der erweiterten Paare zueinander parallel verlaufen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittelwert der von der Messwerten der Paare beziehungsweise erweiterten Paare erzeugten Kreuzkorrelationen der ersten Richtung und/oder der zweiten Richtung gebildet wird beziehungsweise gebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, gekennzeichnet durch ein Bestimmen einer Mehrzahl von Gruppen von Detektorelementen (1 bis 32), wobei die jeweils gedachten Verbindungslinien zwischen den Gruppen voneinander verschieden ausgerichtet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Kreuzkorrelationen von Messwerten der Paare beziehungsweise erweiterten Paare mindestens zweier verschiedener Gruppen gebildet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Partner eines Paares räumlich jeweils durch mindestens ein nicht zu dem betreffenden Paar gehörendes Detektorelement (1 bis 32) getrennt sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Punktbildübertragungsfunktion einer zur Erzeugung des konfokalen Volumens verwendeten und entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs (42) in den Probenraum (419) gerichteten Beleuchtungsstrahlung und/oder der erfassten Detektionsstrahlung in einer Richtung quer zum jeweiligen Strahlengang gestreckt wird, sodass diese einen ovalen Querschnitt aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenraum (419) in mindestens einer Richtung x, y und z durch eine Wand (419.1) begrenzt ist und beginnend von der Wand (419.1) wenigstens über einen Anteil des Querschnitts des Probenraums (419) eine Mehrzahl von Orten (L1 bis L5) ausgewählt und dort jeweils ein konfokales Volumen erzeugt wird.
Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung des Einflusses der Wand (419.1) des Probenraums (419) auf wenigstens ein Geschwindigkeitsprofil , indem Eigenschaften der Wand (419.1) in Zusammenhang mit ermittelten Strömungseigenschaften gesetzt werden.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit biologischen Strukturen als Probenräumen (419), wobei der Einfluss der mit einem Implantat modifizierten Wand (419.1) des Probenraums (419) auf wenigstens ein Geschwindigkeitsprofil bestimmt wird, indem Eigenschaften der modifizierten Wand (419.1) in Zusammenhang mit ermittelten Strömungseigenschaften gesetzt werden.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-9 zur Bereitstellung von Messwerten als Eingangsdaten für Modelle und/oder zur Verifizierung bestehender Simulationen.
Mikroskop (M) zur Bestimmung von Strömungseigenschaften in einem von einem Medium durchflossenen Probenraum (419), aufweisend - ein Objektiv (47) zur Erfassung einer aus einem in dem Probenraum (419) erzeugten konfokalen Volumen kommenden Detektionsstrahlung; - einen Detektionsstrahlengang (410), entlang dem die erfasste Detektionsstrahlung auf einen Detektor (414) in Form eines Detektorarrays mit einer Mehrzahl von Detektorelementen (1 bis 32) gelenkt wird, wobei der Detektor (414) in einer zur rückseitigen Bildebene des Objektivs (47) konjugierten Ebene angeordnet ist und die Messwerte der Detektorelemente (1 bis 32) jeweils einzeln ausgelesen werden können; - eine zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 konfigurierten Analyse- und Steuereinheit (413).