DE102023100926A1

DE102023100926A1 - MICROSCOPE

Info

Publication number: DE102023100926A1
Application number: DE102023100926.5A
Authority: DE
Inventors: Daniel Schwedt; Christoph Eichhorn; Tiemo Anhut; Michael Gölles
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2023-01-17
Filing date: 2023-01-17
Publication date: 2024-07-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Lichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht, mit einem Beleuchtungsstrahlengang zum Leiten des Anregungslichts auf und/oder in eine Probe, mit einer Scan-Einrichtung zum Variieren eines mit dem Anregungslicht beaufschlagten Orts auf und/oder in der Probe, mit mindestens einem zweidimensional ortsauflösenden Detektor zum Nachweisen von von der Probe abgestrahltem Licht, mit einem Detektionsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten mindestens eines Teils des von der Probe abgestrahlten Lichts zu dem Detektor, eine Steuereinheit zum Ansteuern der Scan-Einrichtung und zum Auswerten von Messdaten des Detektors. Das Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass eine Detektionseinheit vorhanden ist, die den Detektor enthält und eine brennweitenveränderliche Optik zum Abbilden der Probe mit variabler Vergrößerung auf den Detektor und eine ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen mindestens eines Teils des von der Probe abgestrahlten Lichts aufweist, wobei die Steuereinheit auch zum Ansteuern der dispergierenden Einrichtung eingerichtet ist.The invention relates to a microscope with a light source for emitting excitation light, with an illumination beam path for directing the excitation light onto and/or into a sample, with a scanning device for varying a location on and/or in the sample to which the excitation light is applied, with at least one two-dimensional spatially resolving detector for detecting light emitted by the sample, with a detection beam path with a microscope objective for directing at least part of the light emitted by the sample to the detector, a control unit for controlling the scanning device and for evaluating measurement data from the detector. According to the invention, the microscope is characterized in that a detection unit is present which contains the detector and has a focal length-adjustable optics for imaging the sample with variable magnification onto the detector and a controllable and optionally activatable dispersing device for spectrally separating at least part of the light emitted by the sample, wherein the control unit is also designed to control the dispersing device.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a microscope according to the preamble of claim 1.

Ein gattungsgemäßes Mikroskop weist auf: eine Lichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht, einen Beleuchtungsstrahlengang zum Leiten des Anregungslichts auf und/oder in eine Probe, eine Scan-Einrichtung zum Variieren eines mit dem Anregungslicht beaufschlagten Orts auf und/oder in der Probe, mindestens einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor zum Nachweisen von von der Probe abgestrahltem Licht, einen Detektionsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten mindestens eines Teils des von der Probe abgestrahlten Lichts zu dem Detektor und eine Steuereinheit zum Ansteuern der Scan-Einrichtung und zum Auswerten von Messdaten des Detektors. Solch ein Mikroskop ist beispielsweise aus DE 10 2020 120 190 A1 bekannt.A microscope of this type has: a light source for emitting excitation light, an illumination beam path for directing the excitation light onto and/or into a sample, a scanning device for varying a location on and/or in the sample to which the excitation light is applied, at least one two-dimensional spatially resolving detector for detecting light emitted by the sample, a detection beam path with a microscope objective for directing at least part of the light emitted by the sample to the detector and a control unit for controlling the scanning device and for evaluating measurement data from the detector. Such a microscope is made, for example, of EN 10 2020 120 190 A1 known.

Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist das herausragende Werkzeug zur Untersuchung dreidimensionaler Proben, da es aufgrund der Raumfilterung an der konfokalen Blende außerfokales Licht unterdrückt und so sehr kontraststarke Bilder beliebiger Proben erzeugt. In den vergangenen Jahren wurden für diese Technologie verschiedene Messverfahren entwickelt, wie z.B. spektrale Bildgebung mit spektrometerartigen Detektoren ( DE 10 038 528 A1 ) oder hochauflösende Bildgebung mittels räumlicher Überabtastung der Punktverwaschungsfunktion (Point Spread Function, PSF) mit einem kameraartigen Sensor, sogenannte Image Scanning Microscopy (ISM) ( DE 10 2020 120 190 A1 ).Laser scanning microscopy is the outstanding tool for examining three-dimensional samples, as it suppresses out-of-focus light due to spatial filtering at the confocal aperture and thus produces very high-contrast images of any sample. In recent years, various measurement methods have been developed for this technology, such as spectral imaging with spectrometer-like detectors ( DE 10 038 528 A1 ) or high-resolution imaging using spatial oversampling of the point spread function (PSF) with a camera-like sensor, so-called Image Scanning Microscopy (ISM) ( EN 10 2020 120 190 A1 ).

Wegen dieser Vielfalt an unterschiedlichen Messmodi sind Laserscanmikroskope (LSM) oft komplex und teuer. Deshalb ist es marktüblichen Technologien preislich kaum mehr darstellbar, sowohl spektrale Bildgebung als auch spektral mehrkanalige ISM in einem LSM-System zu vereinen. Zudem sinkt häufig auch die Detektionseffizienz mit der Zahl der in einem System integrierten Messmodi. Somit ist es mit marktüblichen LSM-Systemen bislang nur möglich, spektral mehrkanalige Bildaufnahmen entweder nur mit geringerer Auflösung oder sequenziell in einem sogenannten Multitrackmodus zu erstellen.Because of this variety of different measurement modes, laser scanning microscopes (LSM) are often complex and expensive. As a result, it is no longer possible for commercially available technologies to combine both spectral imaging and spectrally multi-channel ISM in one LSM system. In addition, the detection efficiency often decreases with the number of measurement modes integrated in a system. As a result, commercially available LSM systems have so far only been able to create spectrally multi-channel image recordings either with lower resolution or sequentially in a so-called multi-track mode.

2021 wurde über ISM mit einem 5x5 Pixel umfassenden SPAD-Array berichtet. Solche und ähnliche Sensoren sind bereits kommerziell erhältlich. Damit sind grundsätzlich Sensoren verfügbar, die mit einer deutlich kleineren Baugröße als Multianoden-PMTs einen Zugang zur ISM bieten. Derzeit ist die Anzahl der verfügbaren Pixel bei den kommerziellen SPAD-Arrays, welche für die Scanning-Mikroskopie genutzt werden können, noch eher limitiert. Das ist aber keine prinzipielle Limitierung und ist eher durch begrenzte Datenraten begründet. Es ist absehbar, dass die Anzahl der Pixel dieser CMOS-SPAD-Kamerasensoren sich binnen weniger Jahre deutlich erhöhen wird. Schon jetzt gibt es CMOS-SPAD-Arrays mit 1 Million Pixel ( https://doi.org/10.1117/12.2589786 und https://doi.org/10.1364/OPTICA.386574 ).In 2021, ISM with a 5x5 pixel SPAD array was reported. Such and similar sensors are already commercially available. This means that sensors are basically available that offer access to ISM with a significantly smaller size than multi-anode PMTs. Currently, the number of available pixels in the commercial SPAD arrays that can be used for scanning microscopy is still rather limited. However, this is not a fundamental limitation and is more due to limited data rates. It is foreseeable that the number of pixels in these CMOS SPAD camera sensors will increase significantly within a few years. There are already CMOS SPAD arrays with 1 million pixels ( https://doi.org/10.1117/12.2589786 and https://doi.org/10.1364/OPTICA.386574 ).

Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, eine Anordnung anzugeben, die bei vereinfachtem Aufbau, sowohl spektrale Bildgebung als auch ISM ermöglicht.One object of the invention can be considered to provide an arrangement which, with a simplified structure, enables both spectral imaging and ISM.

Diese Aufgabe wird durch das Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.This object is achieved by the microscope having the features of claim 1.

Das oben angegebene Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass eine Detektionseinheit vorhanden ist, die den Detektor enthält und eine brennweitenveränderliche Optik zum Abbilden der Probe mit variabler Vergrößerung auf den Detektor und eine ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen mindestens eines Teils des von der Probe abgestrahlten Lichts aufweist, wobei die Steuereinheit auch zum Ansteuern der dispergierenden Einrichtung eingerichtet ist.The microscope specified above is further developed according to the invention in that a detection unit is provided which contains the detector and has a focal length-adjustable optics for imaging the sample with variable magnification onto the detector and a controllable and optionally activatable dispersing device for spectrally separating at least part of the light emitted by the sample, wherein the control unit is also set up to control the dispersing device.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Mikroskops werden im Folgenden, insbesondere im Zusammenhang mit den abhängigen Ansprüchen und den Figuren erläutert.Preferred embodiments of the microscope according to the invention are explained below, in particular in connection with the dependent claims and the figures.

Die vorliegende Erfindung geht aus von der Erkenntnis, dass schnelle zweidimensional auflösende Detektoren, insbesondere SPAD-Arrays einerseits als Kamera zur überabgetasteten Detektion der PSF und andererseits auch zur Detektion des Spektrums der aus einer Probe abgestrahlten Emission genutzt werden können.The present invention is based on the finding that fast two-dimensional resolving detectors, in particular SPAD arrays, can be used on the one hand as a camera for oversampled detection of the PSF and on the other hand also for detecting the spectrum of the emission emitted from a sample.

Als eine Grundidee der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskop mit einem zweidimensional ortsauflösenden Detektor durch Bereitstellen einer variablen Vergrößerung im Detektionsstrahlengang einerseits und einer variabel aktivierbaren dispergierenden Einrichtung im Detektionsstrahlengang andererseits sowohl zur Image-Scanning-Mikroskopie als auch zur spektralen Bildgebung zu ertüchtigen.A basic idea of the present invention can be considered to enable a microscope with a two-dimensional spatially resolving detector to be used for both image scanning microscopy and spectral imaging by providing a variable magnification in the detection beam path on the one hand and a variably activatable dispersing device in the detection beam path on the other hand.

Als wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, dass die Messmodi Image-Scanning-Mikroskopie einerseits und spektrale Bildgebung andererseits mit ein und derselben Apparatur und damit im Vergleich zum Stand der Technik mit reduziertem apparativem Aufwand verwirklicht werden können.A significant advantage of the present invention can be considered to be that the measurement modes of image scanning microscopy on the one hand and spectral imaging on the other hand can be realized with one and the same apparatus and thus with reduced equipment expenditure compared to the prior art.

Das Anregungslicht ist elektromagnetische Strahlung, insbesondere im sichtbaren Spektralbereich und angrenzenden Bereichen. An das kontrastgebende Prinzip ist für die vorliegende Erfindung nur insoweit eine Anforderung gestellt, als die Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht Emissionslicht abstrahlt und/oder das Anregungslicht ablenkt, streut oder zurückstrahlt. Typischerweise ist das Emissionslicht Fluoreszenzlicht, welches die Probe, insbesondere dort vorhandene Farbstoffmoleküle, infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht abstrahlt oder abstrahlen.The excitation light is electromagnetic radiation, particularly in the visible spectral range and adjacent areas. The contrast-generating principle is only required for the present invention insofar as the sample emits emission light as a result of irradiation with the excitation light and/or deflects, scatters or reflects the excitation light. Typically, the emission light is fluorescent light which the sample, particularly dye molecules present therein, emits or emits as a result of irradiation with the excitation light.

Zum Bereitstellen des Anregungslichts ist mindestens eine Lichtquelle, beispielsweise ein Laser, vorhanden. Die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts kann, insbesondere zwischen zwei oder mehr Farben, einstellbar sein. Das Anregungslicht kann auch simultan polychromatisch sein, beispielsweise wenn gleichzeitig unterschiedliche Farbstoffe nachgewiesen werden sollen.At least one light source, such as a laser, is present to provide the excitation light. The spectral composition of the excitation light can be adjustable, in particular between two or more colors. The excitation light can also be simultaneously polychromatic, for example if different dyes are to be detected simultaneously.

Mit dem Begriff des Beleuchtungsstrahlengangs werden alle optischen strahlführenden und strahlverändernden Komponenten bezeichnet, beispielsweise ein Mikroskopobjektiv, Linsen, Spiegel, Prismen, Gitter, Filter, Blenden, Strahlteiler, Modulatoren, z.B. Spatial-Light Modulatoren (SLM), mit denen und über welche das Anregungslicht der Lichtquelle bis auf die zu untersuchende Probe geleitet wird. Strahlverändernde Komponenten umfassen auch dispersive und insbesondere beugende Elemente, die eine optische Dispersion bewirken, beispielsweise Strukturen, wie Gitter oder Volumenhologramme, die insbesondere teilweise eine räumlich periodische Struktur aufweisen können.The term illumination beam path refers to all optical beam-guiding and beam-changing components, for example a microscope objective, lenses, mirrors, prisms, gratings, filters, apertures, beam splitters, modulators, e.g. spatial light modulators (SLM), with which and via which the excitation light from the light source is guided to the sample to be examined. Beam-changing components also include dispersive and in particular diffractive elements that cause optical dispersion, for example structures such as gratings or volume holograms, which can in particular partially have a spatially periodic structure.

Von der zu untersuchenden Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht ausgesandtes und/oder abgelenktes, beispielsweise gestreutes, Licht kann als Emissionslicht bezeichnet werden und gelangt über den Detektionsstrahlengang auf den mindestens einen Detektor.Light emitted and/or deflected, for example scattered, by the sample to be examined as a result of irradiation with the excitation light can be referred to as emission light and reaches the at least one detector via the detection beam path.

Mit dem Begriff des Detektionsstrahlengangs werden alle strahlführenden und strahlverändernden optischen Komponenten, beispielsweise Objektive, Linsen, Spiegel, Prismen, Gitter, Filter, Blenden, Strahlteiler, Modulatoren, z.B. Spatial-Light Modulatoren (SLM), bezeichnet, mit denen und über welche das Emissionslicht von der zu untersuchenden Probe bis auf den Detektor geleitet wird. Das Mikroskopobjektiv ist Teil des Detektionsstrahlengangs.The term detection beam path refers to all beam-guiding and beam-modifying optical components, such as objectives, lenses, mirrors, prisms, gratings, filters, apertures, beam splitters, modulators, e.g. spatial light modulators (SLM), with which and via which the emission light is guided from the sample to be examined to the detector. The microscope objective is part of the detection beam path.

Mit Abbilden der Probe ist gemeint, dass mindestens ein Teil der Probe abgebildet wird. Der sichtbare Bereich wird durch das Sehfeld des Sensors und/oder durch gegebenenfalls vorhandene Feldblenden im Detektionsstrahlengang begrenzt.Imaging the sample means that at least part of the sample is imaged. The visible area is limited by the field of view of the sensor and/or by any field stops present in the detection beam path.

Mit dem Begriff der Steuereinheit werden alle Hardware- und Softwarekomponenten bezeichnet, die mit den Komponenten des erfindungsgemäßen Mikroskops zu dessen bestimmungsgemäßer Funktion zusammenwirken. Insbesondere kann die Steuereinheit eine Recheneinrichtung, beispielsweise einen PC, und eine Kamerasteuerung aufweisen, die zum schnellen Auslesen von Messsignalen in der Lage ist. Die Rechnerressourcen der Steuereinheit können auf mehrere Rechner und gegebenenfalls auf ein Rechnernetz, insbesondere auch über das Internet, verteilt sein. Die Steuer- und Auswerteeinheit kann insbesondere übliche Bedienungs- und Peripheriegeräte aufweisen, wie Maus, Tastatur, Bildschirm, Speichermedien, Joystick, Internetverbindung. Die Steuereinheit kann insbesondere die Bilddaten von dem Detektor einlesen und kann auch zum Ansteuern der Lichtquelle dienen und eingerichtet sein. Erfindungsgemäß ist die Steuereinheit auch zum Ansteuern der dispergierenden Einrichtung eingerichtet. Die Steuereinheit kann auch zum Einstellen der Vergrößerung mit der brennweitenveränderlichen Optik eingerichtet sein.The term control unit refers to all hardware and software components that interact with the components of the microscope according to the invention to ensure its intended function. In particular, the control unit can have a computing device, for example a PC, and a camera control that is capable of quickly reading out measurement signals. The computer resources of the control unit can be distributed across multiple computers and, if necessary, across a computer network, in particular also via the Internet. The control and evaluation unit can in particular have conventional operating and peripheral devices, such as a mouse, keyboard, screen, storage media, joystick, Internet connection. The control unit can in particular read the image data from the detector and can also be used and set up to control the light source. According to the invention, the control unit is also set up to control the dispersing device. The control unit can also be set up to adjust the magnification with the variable focal length optics.

In typischen Ausführungsbeispielen weist bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop der Beleuchtungsstrahlengang und/oder der Detektionsstrahlengang mindestens eine der Komponenten Hauptstrahlteiler, Scanoptik, Tubuslinse auf. Der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang können teilweise von denselben optischen Komponenten bereitgestellt werden. Als Hauptstrahlteiler wird ein Strahlteiler bezeichnet, der Anregungslicht von Emissionslicht, also von Licht, welches die Probe abstrahlt, trennt. Typischerweise enthält der Detektionsstrahlengang somit strahlabwärts vom Hauptstrahlteiler kaum noch oder gar keine Anteile von Anregungslicht. Der mindestens eine Detektor in der Detektionseinheit kann somit nicht von Anregungslicht überstrahlt werden. Der Hauptstrahlteiler kann ein dichroitischer Strahlteiler sein.In typical embodiments, the illumination beam path and/or the detection beam path in the microscope according to the invention has at least one of the components main beam splitter, scanning optics, tube lens. The illumination beam path and the detection beam path can be provided in part by the same optical components. A main beam splitter is a beam splitter that separates excitation light from emission light, i.e. from light emitted by the sample. Typically, the detection beam path therefore contains hardly any or no excitation light downstream of the main beam splitter. The at least one detector in the detection unit cannot therefore be outshone by excitation light. The main beam splitter can be a dichroic beam splitter.

Die Beleuchtung der Probe kann mit einer separaten Optik, insbesondere über ein separates Mikroskopobjektiv erfolgen. In der Regel wird die Probe aber über ein und dasselbe Mikroskopobjektiv, welches auch Bestandteil des Detektionsstrahlengangs ist, beleuchtet.The sample can be illuminated using separate optics, in particular a separate microscope objective. However, the sample is usually illuminated using one and the same microscope objective, which is also part of the detection beam path.

Die Scan-Einrichtung kann einen im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten zweidimensionalen Scanner aufweisen. Dieser Scanner kann auch Bestandteil des Detektionsstrahlengangs sein, d.h. das von der Probe abgestrahlte und nachzuweisende Licht wird descannt. Der zweidimensionale Scanner kann beispielsweise ein Galvo-Scanner sein. Ergänzend oder alternativ kann die Scan-Einrichtung einen ansteuerbaren lateral verschiebbaren Probentisch aufweisen. Der Probentisch kann vorteilhaft in zwei unabhängigen Koordinatenrichtungen, die jeweils zu einer Richtung einer optischen Achse des Mikroskopobjektivs senkrecht sind, lateral verschiebbar sein. Die Scan-Einrichtung kann auch durch eine Kombination eines zweidimensionalen Scanners mit einem lateral verschiebbaren Probentisch verwirklicht sein.The scanning device can have a two-dimensional scanner arranged in the illumination beam path. This scanner can also be part of the detection beam path, ie the light emitted by the sample and to be detected is descanned. The two-dimensional scanner can be a galvo scanner, for example. In addition or alternatively, the scanning device can have a controllable, laterally displaceable sample table. The sample table can advantageously be moved in two independent coordinate directions. which are each perpendicular to a direction of an optical axis of the microscope objective. The scanning device can also be implemented by a combination of a two-dimensional scanner with a laterally displaceable sample stage.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Detektionseinheit eine Aperturblende mit einstellbarer Größe auf. Die Aperturblende kann zwei Funktionen erfüllen. Einerseits kann an ihr außerfokales Emissionslicht abgeblendet werden und andererseits fungiert sie als Eintrittsöffnung für einen spektral dispergierenden Modus, der weiter unten noch im Einzelnen beschrieben wird. Beim spektral auflösenden oder dispergierenden Modus beeinflusst die Größe der Eintrittsöffnung die spektrale Auflösung und, wenn mehrere spektrale Detektionskanäle vorhanden sind, die Trennung der Detektionskanäle. Vorteilhaft kann zur Erzeugung einer Zwischenbildebene, in der die Aperturblende positioniert werden kann, außerdem eine Eintrittsoptik vorhanden sein.In a preferred embodiment, the detection unit has an aperture stop with an adjustable size. The aperture stop can fulfill two functions. On the one hand, it can be used to stop out-of-focus emission light and, on the other hand, it acts as an entrance opening for a spectrally dispersing mode, which is described in more detail below. In the spectrally resolving or dispersing mode, the size of the entrance opening influences the spectral resolution and, if several spectral detection channels are present, the separation of the detection channels. Advantageously, an entrance optic can also be present to generate an intermediate image plane in which the aperture stop can be positioned.

Bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel bildet die brennweitenveränderliche Optik unabhängig von einer Einstellung der Brennweite ein und dieselbe Ebene der Probe auf den Detektor oder die Detektoren ab. Dadurch wird der Vorteil erreicht, dass der Detektor oder die Detektoren unabhängig von der Einstellung der brennweitenveränderlichen Optik jeweils am selben Ort verbleiben können.In a particularly preferred embodiment, the variable focal length optics images one and the same plane of the sample onto the detector or detectors, regardless of the setting of the focal length. This provides the advantage that the detector or detectors can remain in the same place regardless of the setting of the variable focal length optics.

Die brennweitenveränderliche Optik kann durch eine Zoom-Optik gebildet sein. Dabei wird der Vorteil erreicht, dass die Vergrößerung der abgebildeten Probenebene besonders fein eingestellt werden kann. Insbesondere kann die Vergrößerung im Hinblick auf die Parameter eines Pixelabstands des mindestens einen verwendeten Detektors und der Ausdehnung der Punktverwaschungsfunktion besonders genau auf einen günstigen Wert eingestellt werden.The variable focal length optics can be formed by a zoom optics. This has the advantage that the magnification of the imaged sample plane can be adjusted particularly finely. In particular, the magnification can be adjusted particularly precisely to a favorable value with regard to the parameters of a pixel pitch of the at least one detector used and the extent of the point blurring function.

Mit dem Begriff der Punktverwaschungsfunktion ist diejenige Intensitätsverteilung des Lichts gemeint, in welche z.B. eine Linse ein einlaufendes paralleles, den einen bestimmten genutzten Durchmesser der Linse füllendes Strahlenbündel überführt. Für diese Funktion sind auch die Begriffe Punktverteilungsfunktion, Punktbildfunktion oder der englische Begriff Point-Spread-Function (PSF) geläufig. Der genutzte Durchmesser der Linse kann, muss aber nicht notwendig der maximal mögliche Durchmesser sein. D.h. dass die PSF nicht notwendig einer vollständigen Nutzung der maximal zur Verfügung stehende numerische Apertur entsprechen muss. Bei unvollständiger Ausnutzung der numerischen Apertur ist die Ausdehnung der PSF im Vergleich zur maximalen Ausnutzung vergrößert.The term point spread function refers to the intensity distribution of light into which, for example, a lens converts an incoming parallel beam of rays that fills a certain diameter of the lens. The terms point distribution function, point spread function or the English term point spread function (PSF) are also common for this function. The diameter of the lens used can, but does not necessarily have to, be the maximum possible diameter. This means that the PSF does not necessarily have to correspond to a full use of the maximum available numerical aperture. If the numerical aperture is not fully used, the extent of the PSF is increased compared to the maximum use.

Es ist aber auch möglich, dass die brennweitenveränderliche Optik durch ein Linsenwechsel-System gebildet ist, mit dem die Vergrößerung auf mehrere diskrete Werte einstellbar ist. Für viele Anwendungen kann das ausreichend sein.However, it is also possible that the focal length-adjustable optics are formed by a lens-changing system with which the magnification can be set to several discrete values. For many applications, this can be sufficient.

Ein besonderer Vorteil der hier dargestellten Erfindung ist, dass die Detektionseinheit vergleichsweise unaufwendig auf spektral mehrkanalige Varianten aufgerüstet werden kann. Ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel zeichnet sich mithin dadurch aus, dass in der Detektionseinheit ein erster Detektionskanal gebildet ist, der mindestens den Detektor aufweist, dass in der Detektionseinheit mindestens ein weiterer Detektionskanal vorhanden ist, dass jeder weitere Detektionskanal einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor aufweist und dass zum Leiten eines spektralen Anteils des von der Probe abgestrahlten und zu detektierenden Lichts in den jeweiligen weiteren Detektionskanal mindestens ein Farbteiler im Detektionsstrahlengang vorhanden ist.A particular advantage of the invention presented here is that the detection unit can be upgraded to spectrally multi-channel variants with comparatively little effort. A particularly preferred embodiment is therefore characterized in that a first detection channel is formed in the detection unit, which has at least the detector, that at least one further detection channel is present in the detection unit, that each further detection channel has a two-dimensional spatially resolving detector and that at least one color splitter is present in the detection beam path to guide a spectral portion of the light emitted by the sample and to be detected into the respective further detection channel.

In der einfachsten spektral mehrkanaligen Variante kann ein Farbteiler mit einer Filterkante vorhanden sein, der das zu detektierende Licht, bezogen auf die Filterkante, mindestens in einen langwelligen und einen kurzwelligen Anteil aufspaltet. Der kurzwellige Anteil gelangt dann z.B. in den ersten Detektionskanal und der langwellige Anteil entsprechend in den zweiten Detektionskanal. Der Farbteiler kann insbesondere ein dichroitischer Strahlteiler sein.In the simplest spectrally multi-channel variant, a color splitter with a filter edge can be present, which splits the light to be detected into at least a long-wave and a short-wave portion relative to the filter edge. The short-wave portion then goes into the first detection channel, for example, and the long-wave portion goes into the second detection channel. The color splitter can in particular be a dichroic beam splitter.

Um die Aufteilung der spektralen Anteile auf die Detektionskanäle an eine Probe anpassen zu können, ist es von Vorteil, wenn die spektrale Position der Filterkante des dichroitischen Teilers diskret oder besonders vorteilhaft kontinuierlich variiert werden kann. Der Farbteiler kann aber auch verwirklicht sein durch eine Filteranordnung mit vielen Filterschichten, an denen das zu detektierende Licht entsprechend oft reflektiert wird (Interferenzfilter, beispielsweise Bandpassfilter).In order to be able to adapt the distribution of the spectral components to the detection channels to a sample, it is advantageous if the spectral position of the filter edge of the dichroic splitter can be varied discretely or, particularly advantageously, continuously. The color splitter can also be implemented using a filter arrangement with many filter layers, on which the light to be detected is reflected accordingly often (interference filter, e.g. bandpass filter).

Die mindestens eine ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen von zu detektierendem Licht ist dazu ausgelegt, nachzuweisendes Licht spektral aufzutrennen. Mit spektralem Auftrennen ist eine spektrale Zerlegung dergestalt gemeint, dass die spektralen Komponenten des Lichts nach Passieren einer Einrichtung zum spektralen Auftrennen je nach Wellenlänge der jeweiligen Komponente in unterschiedliche Raumrichtungen gestrahlt werden. Das Auftrennen kann unter Nutzbarmachung von Beugung und/oder Brechung erfolgen. Die Eigenschaft der dispergierenden Einrichtung, wahlweise aktivierbar zu sein bezieht sich darauf, dass sie das nachzuweisende Licht im Detektionsstrahlengang wahlweise entweder auftrennt oder nicht. Bei bevorzugten Ausgestaltungen wird die dispergierende Einrichtung zu diesem Zweck in den Detektionsstrahlengang eingebracht oder entfernt. Alternativ oder ergänzend wird der Detektionsstrahlengang so umgeleitet, dass die fragliche dispergierende Einrichtung Teil des umgeleiteten Detektionsstrahlengangs ist. Die Eigenschaft der dispergierenden Einrichtung, ansteuerbar zu sein, bezieht sich darauf, dass das wahlweise Aktivieren durch die Steuereinheit gesteuert werden kann.The at least one controllable and optionally activatable dispersing device for spectrally separating light to be detected is designed to spectrally separate light to be detected. Spectral separation means a spectral decomposition such that the spectral components of the light are radiated in different spatial directions after passing through a device for spectral separation, depending on the wavelength of the respective component. The separation can be carried out by making use of diffraction and/or refraction. The property The property of the dispersing device to be selectively activatable refers to the fact that it selectively either separates the light to be detected in the detection beam path or not. In preferred embodiments, the dispersing device is introduced into or removed from the detection beam path for this purpose. Alternatively or additionally, the detection beam path is redirected such that the dispersing device in question is part of the redirected detection beam path. The property of the dispersing device to be controllable refers to the fact that the selective activation can be controlled by the control unit.

Für die Verwirklichung der Erfindung reicht es aus, wenn nur eine einzige ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen von zu detektierendem Licht vorhanden ist. Im Fall einer mehrkanaligen Detektionseinheit kann die dispergierende Einrichtung im Detektionsstrahlengang strahlaufwärts von dem mindestens Farbteiler oder den Farbteilern angeordnet sein. Sie wirkt dann auf alle spektralen Kanäle gemeinsam.To implement the invention, it is sufficient if only a single controllable and optionally activatable dispersing device is present for spectrally separating the light to be detected. In the case of a multi-channel detection unit, the dispersing device can be arranged in the detection beam path upstream of the at least one color splitter or splitters. It then acts on all spectral channels together.

Vorteilhaft kann die ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen von zu detektierendem Licht auch nur in einem der Detektionskanäle wirksam sein und/oder es kann mindestens eine weitere ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen von zu detektierendem Licht vorhanden sein, die nur in einem der Detektionskanäle wirksam ist. Beispielsweise kann die erfindungsgemäß vorhandene dispergierende Einrichtung Teil des ersten Detektionskanals sein.Advantageously, the controllable and optionally activatable dispersing device for spectrally separating light to be detected can also be effective in only one of the detection channels and/or there can be at least one further controllable and optionally activatable dispersing device for spectrally separating light to be detected, which is effective in only one of the detection channels. For example, the dispersing device present according to the invention can be part of the first detection channel.

Wenn in dieser Beschreibung davon die Rede ist, dass mindestens eine Komponente eine bestimmte Eigenschaft oder ein bestimmtes Merkmal aufweisen kann, dann ist damit auch gemeint, dass mehrere oder alle Komponenten des jeweiligen Typs die jeweilige Eigenschaft oder das jeweilige Merkmal aufweisen können.When this description states that at least one component can have a certain property or characteristic, it is also meant that several or all components of the respective type can have the respective property or characteristic.

Beispielsweise kann bei einer vorteilhaften Variante auch in jedem einzelnen Detektionskanal eine ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen von zu detektierendem Licht vorhanden sein. Dadurch wird der Vorteil erreicht, dass die spektrale Dispersion in jedem einzelnen Detektionskanal gezielt eingestellt werden kann. Beispielsweise können die in den einzelnen Detektionskanälen jeweils einzusetzenden dispergierenden Einrichtungen und die Farbteiler aufeinander abgestimmt werden. Diese Variante ist insbesondere von Vorteil, wenn Prismen als Dispersionselemente eingesetzt werden, weil deren spektrale Dispersion mit zunehmender Wellenlänge abnimmt.For example, in an advantageous variant, a controllable and optionally activatable dispersing device for spectral separation of light to be detected can be present in each individual detection channel. This has the advantage that the spectral dispersion can be specifically adjusted in each individual detection channel. For example, the dispersing devices and the color splitters to be used in the individual detection channels can be coordinated with one another. This variant is particularly advantageous when prisms are used as dispersion elements because their spectral dispersion decreases with increasing wavelength.

Die ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung zum spektralen Auftrennen von zu detektierendem Licht kann, insbesondere in mindestens einem oder für mindestens einen Detektionskanal, mindestens eine der folgenden Komponenten aufweisen oder durch eine der folgenden Komponenten gebildet sein: in den Detektionsstrahlengang einbringbares, insbesondere einschwenkbares Gitter, insbesondere Transmissionsgitter oder Reflexionsgitter, in den Detektionsstrahlengang einbringbares, insbesondere einschwenkbares Prisma, insbesondere Geradsichtprisma oder Pellin-Broca-Prisma. Die dispergierende Einrichtung kann auch eine holographisch hergestellte Komponente aufweisen. Alternativ kann eine ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung auch verwirklicht werden, wenn der Detektionsstrahlengang zur Aktivierung der dispergierenden Einrichtung dergestalt umgeleitet wird, beispielsweise mit schwenkbaren Spiegeln, dass die dispergierende Einrichtung dann Teil des umgeleiteten Detektionsstrahlengangs ist. Die dispergierende Einrichtung soll dann auch als einbringbar gelten. Die dispergierende Einrichtung selbst kann in diesem Fall, muss aber nicht, ortsfest angeordnet sein.The controllable and optionally activatable dispersing device for spectrally separating light to be detected can have at least one of the following components, in particular in at least one or for at least one detection channel, or can be formed by one of the following components: a grating that can be introduced into the detection beam path, in particular a pivotable grating, in particular a transmission grating or reflection grating, a prism that can be introduced into the detection beam path, in particular a pivotable prism, in particular a straight-vision prism or Pellin-Broca prism. The dispersing device can also have a holographically produced component. Alternatively, a controllable and optionally activatable dispersing device can also be implemented if the detection beam path is redirected to activate the dispersing device, for example with pivotable mirrors, so that the dispersing device is then part of the redirected detection beam path. The dispersing device should then also be considered to be insertable. In this case, the dispersing device itself can, but does not have to, be arranged in a fixed location.

Um in einen spektral detektierenden Modus umzuschalten, wird im einfachsten Fall die spektral dispergierende Einrichtung in den Strahlengang eingebracht.To switch to a spectrally detecting mode, in the simplest case the spectrally dispersing device is inserted into the beam path.

Vorteilhafterweise wird beim Umschalten auf spektrale Bildgebung die Vergrößerung der Abbildung von der Probe auf den zweidimensional ortsauflösenden Detektor so angepasst, dass die Halbwertsbreite (FWHM) der PSF von der Größenordnung von wenigen Pixeln, idealerweise von nur einem Pixel oder noch weniger ist, um einen möglichst großen spektralen Bereich gleichzeitig vermessen zu können. Außerdem kann die spektrale Auflösung des Detektionssystems durch Verschiebung des Spektrums über dem Sensor für zwei aufeinanderfolgende Bildaufnahmen und deren nachfolgende Verrechnung verbessert werden.When switching to spectral imaging, the magnification of the image from the sample to the two-dimensional spatially resolving detector is advantageously adjusted so that the full width at half maximum (FWHM) of the PSF is on the order of a few pixels, ideally just one pixel or even less, in order to be able to measure as large a spectral range as possible at the same time. In addition, the spectral resolution of the detection system can be improved by shifting the spectrum over the sensor for two consecutive image recordings and their subsequent calculation.

In der Mikroskopie ist es allgemein immer erwünscht, bei den aufzunehmenden Bildern vernünftige Grauwerte zu erhalten. Es wird, mit anderen Worten, angestrebt, die zum Einsatz kommenden Detektoren sinnvoll auszulasten, also weder im Bereich der Sättigung, wo die Proportionalität des Meßsignals zur Lichtmenge verlorengeht, und andererseits auch nicht bei sehr geringen Zählraten zu betreiben, wo das Signal klein ist im Vergleich zu Detektorrauschen.In microscopy, it is generally always desirable to obtain reasonable gray values in the images to be recorded. In other words, the aim is to use the detectors used sensibly, i.e. not to operate them in the saturation range, where the proportionality of the measurement signal to the amount of light is lost, and on the other hand not to operate them at very low count rates, where the signal is small compared to the detector noise.

In dieser Hinsicht ist außerdem zu beachten, dass die Zählrate der zum Einsatz kommenden Detektoren typischerweise auf einige Megahertz bis bestenfalls wenige 10 MHz begrenzt ist. Bei SPAD-Arrays ist der physikalische Grund für die Beschränkung der Zählrate die photonenzählende Natur der SPAD-Pixel mit deren inhärenter Totzeit während des Lawinenquenchings. Um bei für die Laser-Scanning-Mikroskopie typischen Pixelverweilzeiten von circa 1 Mikrosekunde oder weniger vernünftige Grauwerte bei den erzeugten Bildern zu erhalten, ist es daher von Vorteil, die Emission eines Farbstoffs auf mehrere Pixel des Detektors zu verteilen. In gewissem Maß wird das schon durch die spektrale Dispersion erreicht. Weitere Verbesserungen sind in dieser Hinsicht möglich bei einem weiteren besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel, bei dem in der Detektionseinheit und/oder in mindestens einem Detektionskanal eine wahlweise in den Detektionsstrahlengang einbringbare Zylinderoptik vorhanden ist, die für eine Richtung, die senkrecht ist zu einer Richtung, in der die dispergierende Einrichtung des betreffenden Detektionskanals die spektrale Aufspaltung bewirkt, eine Bildebene axial verschiebt. Die axiale Verschiebung der Bildebene, mithin in Richtung der optischen Achse, führt dazu, dass das nachzuweisende Licht eines Wellenlängenbereichs auf mehrere Pixel des Detektors verteilt wird. Im Extremfall kann das nachzuweisende Licht eines Wellenlängenbereichs auf alle Pixel in der betreffenden Zeile oder Spalte des Detektors verteilt werden. Mit der einbringbaren, insbesondere einschwenkbaren, Zylinderoptik kann die PSF in der zur Dispersionsrichtung senkrecht orientierten Achse defokussiert und so auf dem Detektor über viele Pixel ausgedehnt werden.In this respect, it should also be noted that the counting rate of the detectors used is typically limited to a few megahertz to a few tens of MHz at best. In SPAD arrays, the physical reason for the limitation of the counting rate is the photon-counting nature of the SPAD pixels with their inherent dead time during avalanche quenching. In order to obtain reasonable gray values in the images generated with pixel dwell times of around 1 microsecond or less, which are typical for laser scanning microscopy, it is therefore advantageous to distribute the emission of a dye across several pixels of the detector. To a certain extent, this is already achieved by spectral dispersion. Further improvements are possible in this regard in another particularly preferred embodiment in which a cylinder optics system is present in the detection unit and/or in at least one detection channel, which can be optionally introduced into the detection beam path and which axially shifts an image plane for a direction that is perpendicular to a direction in which the dispersing device of the relevant detection channel effects the spectral splitting. The axial shift of the image plane, thus in the direction of the optical axis, results in the light to be detected in a wavelength range being distributed across several pixels of the detector. In extreme cases, the light to be detected in a wavelength range can be distributed across all pixels in the relevant row or column of the detector. With the insertable, in particular pivotable, cylinder optics system, the PSF can be defocused in the axis oriented perpendicular to the dispersion direction and thus extended across many pixels on the detector.

Es kann nur eine einzige wahlweise einbringbare Zylinderoptik vorhanden sein, die im Detektionsstrahlengang strahlaufwärts von dem mindestens einen Farbteiler oder den Farbteilern angeordnet sein kann. Diese Zylinderoptik wirkt dann auf alle spektralen Kanäle gemeinsam. Bei einer anderen vorteilhaften Variante ist mehreren Detektionskanälen oder in jedem einzelnen Detektionskanal jeweils eine separate wahlweise einbringbare Zylinderoptik vorhanden. Die Verteilung der PSF auf die Pixel des Detektors kann dann in den entsprechenden Kanälen oder in jedem Kanal individuell erfolgen. Gegebenenfalls können auch unterschiedliche Zylinderoptiken in den verschiedenen Detektionskanälen zum Einsatz kommen. Mindestens eine der Zylinderoptiken kann mindestens eine Zylinderlinse aufweisen oder kann durch mindestens eine Zylinderlinse verwirklicht sein.There can only be a single optionally insertable cylinder optic, which can be arranged in the detection beam path upstream of the at least one color splitter or the color splitters. This cylinder optic then acts on all spectral channels together. In another advantageous variant, a separate optionally insertable cylinder optic is present in several detection channels or in each individual detection channel. The PSF can then be distributed to the pixels of the detector in the corresponding channels or in each channel individually. If necessary, different cylinder optics can also be used in the different detection channels. At least one of the cylinder optics can have at least one cylinder lens or can be implemented by at least one cylinder lens.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Detektionseinheit und/oder mindestens einer der Detektionskanäle ein mit Bezug auf seine spektralen Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften einstellbares Filter auf. Dieses Filter kann dazu dienen, die spektralen Detektionsbandbreiten beispielsweise für ISM einzustellen und auf die jeweils ausgewählten Farbstoffe zu begrenzen.In a further preferred embodiment of the invention, the detection unit and/or at least one of the detection channels has a filter that can be adjusted with respect to its spectral transmission and/or reflection properties. This filter can be used to adjust the spectral detection bandwidths, for example for ISM, and to limit them to the dyes selected in each case.

Besonders bevorzugt ist dabei, wenn mindestens eines der Filter eine Einstellung aufweist, in der das Licht breitbandig transmittiert und/oder reflektiert wird. Diese Einstellung kann dann vorteilhaft für spektral auflösende Messmodi gewählt werden. Beispielsweise kann mindestens eines der Filter mehrere diskrete Filtersegmente aufweisen, die jeweils in den Detektionsstrahlengang einbringbar sind. Alternativ oder ergänzend kann bei einer anderen Ausführungsform mindestens eines der Filter durch ein kontinuierlich einstellbares Filter verwirklicht sein.It is particularly preferred if at least one of the filters has a setting in which the light is transmitted and/or reflected over a broad band. This setting can then advantageously be selected for spectrally resolving measurement modes. For example, at least one of the filters can have several discrete filter segments, each of which can be introduced into the detection beam path. Alternatively or additionally, in another embodiment, at least one of the filters can be implemented by a continuously adjustable filter.

Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung ist in der Detektionseinheit und/oder in mindestens einem Detektionskanal eine einstellbare Optik zum lateralen Verschieben von spektral aufgetrenntem Licht relativ zu dem Detektor des jeweiligen Detektionskanals vorhanden. Mit der einstellbaren Optik zum lateralen Verschieben von spektral aufgetrenntem Licht kann die Ablage eines Teilspektrums in einem Detektionskanal auf dem Detektor dieses Detektionskanals besonders günstig eingestellt werden.In a further particularly preferred embodiment, an adjustable optic for laterally shifting spectrally separated light relative to the detector of the respective detection channel is present in the detection unit and/or in at least one detection channel. With the adjustable optic for laterally shifting spectrally separated light, the storage of a partial spectrum in a detection channel on the detector of this detection channel can be set particularly favorably.

Die einstellbare Optik zum lateralen Verschieben kann in der Detektionseinheit und/oder in mindestens einem Detektionskanal mindestens eine der folgenden Komponenten aufweisen oder durch eine der folgenden Komponenten verwirklicht sein: einstellbarer verkippbarer Spiegel, einstellbar verkippbare planparallele transparente Platte, insbesondere Glasplatte. Dadurch kann ein für die angeregten Fluorophore jeweils relevanter Spektralbereich auf jeden der einzelnen Detektoren Sensoren optimal abgelegt werden.The adjustable optics for lateral displacement can have at least one of the following components in the detection unit and/or in at least one detection channel or can be implemented by one of the following components: adjustable tilting mirror, adjustable tilting plane-parallel transparent plate, in particular glass plate. This allows a spectral range relevant to the excited fluorophores to be optimally applied to each of the individual detector sensors.

Die mechanischen Manipulationen der Komponenten im Strahlengang, wie Ein- und Herausschwenken, Hineinschieben, Herausziehen aus dem Strahlengang sowie Verkippen, können in grundsätzlich bekannter Weise durch ansteuerbare motorische Antriebe verwirklicht werden.The mechanical manipulations of the components in the beam path, such as swiveling in and out, pushing in, pulling out of the beam path and tilting, can be realized in a basically known manner by controllable motor drives.

Pixellierte Detektoren, insbesondere SPAD-Array-Detektoren, weisen in der Regel einen Füllfaktor von kleiner als 1 auf, womit gemeint ist, dass die Detektoren Bereiche zwischen den Pixeln aufweisen, wo dort eintreffende Photonen nicht detektiert werden. Die Detektoren können eintreffende Photonen mithin nur auf einem Bruchteil der Detektor-Fläche detektieren. Zur Kompensation dieser Eigenschaft kann der Detektor mit einem Mikrolinsenarray versehen sein, wobei jedem Pixel, beispielsweise jedem SPAD-Pixel, eine Mikrolinse zugeordnet sein kann. Bei einer bevorzugten Variante ist also bei mindestens vor einem Detektor ein Multilinsenarray angeordnet. Mit der Anordnung vor einem Detektor ist gemeint, dass das Multilinsenarray sich im Strahlengang strahlaufwärts von dem Detektor befindet, dass also das zu detektierende Licht durch das Multilinsenarray hindurchtritt, bevor es auf den Detektor trifft. Ein Multilinsenarray kann auf dem zugehörigen Detektor angeordnet sein. Das Multilinsenarray und der zugehörige Detektor können dann eine bauliche Einheit bilden.Pixelated detectors, especially SPAD array detectors, usually have a fill factor of less than 1, which means that the detectors have areas between the pixels where incoming photons are not detected. The detectors can therefore only detect incoming photons on a fraction of the detector surface. To compensate for this property, the detector can be equipped with a microlens array, with each pixel, for example, each SPAD pixel can be assigned a microlens. In a preferred variant, a multi-lens array is arranged in front of at least one detector. The arrangement in front of a detector means that the multi-lens array is located upstream of the detector in the beam path, i.e. that the light to be detected passes through the multi-lens array before it hits the detector. A multi-lens array can be arranged on the associated detector. The multi-lens array and the associated detector can then form a structural unit.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind bei mindestens einem der Detektoren Pixel, insbesondere benachbarte, beispielsweise in Richtung der Detektorzeilen und/oder Detektorspalten benachbarter Pixel, durch Binning zusammenfassbar. Wenn jedes einzelne Pixel eines Detektors separat ausgelesen wird, liefert jedes Pixel ein separates Detektionssignal entsprechend der am jeweiligen Ort des Pixels einkommenden Menge des nachzuweisenden Lichts. Wenn mehrere Pixel durch Binning zusammengefasst werden, liefert ein einzelner „Bin“ ein Detektionssignal, dass der Summe der auf die das „Bin“ bildenden Pixel einkommenden Menge des nachzuweisenden Lichts entspricht. Die Anzahl der auszuwertenden Detektionssignale wird so reduziert und das Auslesen der Detektors kann beschleunigt werden. Vorteilhaft können ganze Pixelzeilen und/oder ganze Pixelspalten durch Binning zusammengefasst werden. Je nach Messaufgabe kann es zweckmäßig sein, Pixel in einer zur Richtung der spektralen Dispersion senkrechten Richtung durch Binning zusammenzufassen. In diesem Fall bleibt die spektrale Auflösung erhalten während aber eine hohe Dynamik durch Nutzung mehrerer Detektorelemente und eine Reduktion der Datenrate erzielt wird. Bei anderen Messaufgaben kann es zweckmäßig sein, Pixel in Richtung der spektralen Dispersion zusammenzufassen. Dadurch wird die spektrale Auslösung reduziert, die Auslesegeschwindigkeit und damit eine Bildrate können aber gesteigert werden. Weiterhin können beide beschriebenen Binningmethoden auch kombiniert auftreten.In a preferred embodiment, pixels, in particular neighboring pixels, for example in the direction of the detector rows and/or detector columns of neighboring pixels, can be combined by binning in at least one of the detectors. If each individual pixel of a detector is read out separately, each pixel delivers a separate detection signal corresponding to the amount of light to be detected arriving at the respective location of the pixel. If several pixels are combined by binning, a single "bin" delivers a detection signal that corresponds to the sum of the amount of light to be detected arriving at the pixels forming the "bin". The number of detection signals to be evaluated is thus reduced and the reading of the detector can be accelerated. Entire pixel rows and/or entire pixel columns can advantageously be combined by binning. Depending on the measurement task, it may be expedient to combine pixels by binning in a direction perpendicular to the direction of the spectral dispersion. In this case, the spectral resolution is retained, but high dynamics are achieved by using several detector elements and a reduction in the data rate. For other measurement tasks, it may be useful to group pixels in the direction of spectral dispersion. This reduces the spectral resolution, but the readout speed and thus the frame rate can be increased. Furthermore, both binning methods described can also be combined.

Vorteilhaft können auch spektrale Kanäle auf dem Sensor durch ein Binning definiert werden. Zum Beispiel können zwei Farbstoffe mit je 50 nm Bandbreite detektiert werden, die bei beispielsweise 500 nm beziehungsweise 580 nm emittieren. Dann lassen sich zwei Bins aufspannen, die den Wellenlängenbereichen 500 +/- 25 nm und 580 +/- 25 nm entsprechen. Jeder der beiden Bins entspricht dann einem spektralen Kanal und sämtliche anderen Daten werden verworfen oder anderweitig gebinnt und übertragen.Spectral channels on the sensor can also be advantageously defined by binning. For example, two dyes with a bandwidth of 50 nm each can be detected, which emit at 500 nm and 580 nm respectively. Two bins can then be created, which correspond to the wavelength ranges 500 +/- 25 nm and 580 +/- 25 nm. Each of the two bins then corresponds to a spectral channel and all other data is discarded or otherwise binned and transmitted.

Der mindestens eine zweidimensional ortsauflösende Detektor ist ein hinreichend schneller optischer Detektor mit einer zweidimensional ortsauflösenden Sensorfläche. Der Detektor kann insbesondere eine Kamera, insbesondere mit einem CCD-, sCMOS-, CMOS- oder SPAD-Kamera-Chip oder SPAD-Array sein. Besonders bevorzugt kann in jedem Detektionskanal der jeweilige Detektor ein SPAD-Array aufweisen. Eine Reihe von Eigenschaften von schnellen zweidimensional auflösenden Detektoren, insbesondere SPAD-Arrays, bildet die Grundlage für deren bevorzugte Nutzung. So können diese Detektoren zum Beispiel das Fluoreszenzsignal zeitaufgelöst detektieren. Da sich Fluorophore sehr oft auch in ihrer Fluoreszenzlebensdauer unterscheiden, ist die Einbeziehung dieses Parameters in das mathematische Entmischungsproblem vorteilhaft möglich. Weiterhin können Sensorelemente flexibel an- und abgeschaltet werden. Flexible Schaltmuster für eine Pixelmatrix sind für derartige Anwendungen in WO2020207571A1 beschrieben.The at least one two-dimensional spatially resolving detector is a sufficiently fast optical detector with a two-dimensional spatially resolving sensor surface. The detector can in particular be a camera, in particular with a CCD, sCMOS, CMOS or SPAD camera chip or SPAD array. Particularly preferably, the respective detector can have a SPAD array in each detection channel. A series of properties of fast two-dimensionally resolving detectors, in particular SPAD arrays, form the basis for their preferred use. For example, these detectors can detect the fluorescence signal in a time-resolved manner. Since fluorophores very often also differ in their fluorescence lifetime, the inclusion of this parameter in the mathematical demixing problem is advantageously possible. Furthermore, sensor elements can be flexibly switched on and off. Flexible switching patterns for a pixel matrix are available for such applications in WO2020207571A1 described.

Der zweidimensional ortsauflösende Detektor und der korrespondierende optische Aufbau sind insbesondere dazu geeignet, eine PSF des Emissionslichts lateral überabgetastet, mindestens dem Nyquist-Theorem genügend, zu detektieren. Dies ist insbesondere dann wesentlich, wenn das Verfahren der sogenannten Image-Scanning-Microscopy (Markenname Carl Zeiss: Airyscan) durchgeführt werden soll. Allerdings sind auch klassisch konfokale Messungen mit diesem Detektor möglich, beispielsweise indem man die Werte aller oder wenigstens einer größeren Anzahl von Pixeln addiert. Die Detektoren können bevorzugt eine rechtwinklige oder eine hexagonale Anordnung der Pixel aufweisen.The two-dimensional spatially resolving detector and the corresponding optical structure are particularly suitable for detecting a PSF of the emission light laterally oversampled, at least in accordance with the Nyquist theorem. This is particularly important if the so-called image scanning microscopy method (Carl Zeiss brand name: Airyscan) is to be carried out. However, classic confocal measurements are also possible with this detector, for example by adding the values of all or at least a large number of pixels. The detectors can preferably have a rectangular or hexagonal arrangement of the pixels.

Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist eine Farbteilereinrichtung vorhanden mit einem Rotor, auf dem mehrere Farbteiler angeordnet sind, wobei durch Einstellen von unterschiedlichen Drehpositionen des Rotors unterschiedliche Farbteiler in den Detektionsstrahlengang einbringbar sind, über welche jedem Detektionskanal ein spektraler Anteil des von der Probe abgestrahlten Lichts zuführbar ist. Dadurch können die Detektionskanäle sehr kompakt angeordnet werden.In a particularly preferred embodiment of the microscope according to the invention, a color splitter device is provided with a rotor on which several color splitters are arranged, whereby by setting different rotational positions of the rotor, different color splitters can be introduced into the detection beam path, via which a spectral portion of the light emitted by the sample can be fed to each detection channel. The detection channels can therefore be arranged very compactly.

Die Farbteiler können jeweils dazu eingerichtet sein, dass der Reihe nach an jedem der Farbteiler jeweils ein spektraler Anteil des Licht reflektiert wird und ein Anteil transmittiert wird, wobei die transmittierten spektralen Anteile jeweils einem der Detektionskanäle zuführbar sind. Die Farbteiler können insbesondere Bandpassfilter sein.The color splitters can each be designed so that a spectral portion of the light is reflected and a portion is transmitted at each of the color splitters in sequence, wherein the transmitted spectral portions can each be fed to one of the detection channels. The color splitters can in particular be bandpass filters.

Bei einer vorteilhaften Weiterbildung dieser Farbteilereinrichtung können durch Einstellen von unterschiedlichen Drehpositionen des Rotors unterschiedliche Gruppen von Farbteilern in den Detektionsstrahlengang einbringbar sein.In an advantageous further development of this color splitter device, different groups of color splitters can be introduced into the detection beam path by setting different rotational positions of the rotor.

Besonders vorteilhaft können die Farbteiler auf dem Rotor auf der Mantelfläche eines Zylinders angeordnet sein, wobei die Rotationsachse des Rotors kollinear ist mit einer Hauptachse des Zylinders und quer, insbesondere senkrecht, zu einer Einfallsrichtung des Lichts auf die Farbteilereinrichtung orientiert ist. Dadurch wird der Vorteil erreicht, dass wegen der stabilen Rotation der Filterflächen um die Hauptachse des Zylinders die Strahlrichtung der resultierenden Detektions-strahlengänge nach veränderter Konfiguration erhalten bleibt. Das ist aufgrund der für beispielsweise für SPAD-Array-Detektoren typischen kleinen Sensorflächen von zumeist deutlich weniger als 1 mm² von besonderem Vorteil.The color splitters can be arranged on the rotor on the outer surface of a cylinder in a particularly advantageous manner, with the axis of rotation of the rotor being collinear with a main axis of the cylinder and oriented transversely, in particular perpendicularly, to a direction of incidence of the light on the color splitter device. This has the advantage that, due to the stable rotation of the filter surfaces around the main axis of the cylinder, the beam direction of the resulting detection beam paths is retained after a changed configuration. This is particularly advantageous due to the small sensor surfaces of usually significantly less than 1 mm ² that are typical for SPAD array detectors, for example.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren beschrieben. Darin zeigt:

1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
2: eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Detektionseinheit für ein erfindungsgemäßes Mikroskop;
3: Diagramme zur Veranschaulichung der Bestrahlung eines zweidimensional ortsauflösenden Detektors in unterschiedlichen Betriebsmodi des erfindungsgemäßen Mikroskops; und
4: ein Ausführungsbeispiel einer Filtereinrichtung für ein erfindungsgemäßes Mikroskop.

Further advantages and features of the present invention are described below in connection with the accompanying figures, in which:

1 a schematic representation of a microscope according to the invention;
2 : a schematic representation of an embodiment of a detection unit for a microscope according to the invention;
3 : Diagrams to illustrate the irradiation of a two-dimensional spatially resolving detector in different operating modes of the microscope according to the invention; and
4 : an embodiment of a filter device for a microscope according to the invention.

Ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 100 wird mit Bezug auf die 1 bis 3 erläutert. Das in 1 schematisch dargestellte Mikroskop 100 weist als wesentliche Komponenten eine Lichtquelle 1, einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv 7, einen Detektionsstrahlengang, eine Detektionseinheit 10 und eine Steuereinheit 11 auf. Die Lichtquelle 1, bei der es sich typischerweise um einen, insbesondere über mehrere Wellenlängen verfügenden, Laser handelt, dient zum Aussenden von Anregungslicht 2, das über den Beleuchtungsstrahlengang auf und/oder in eine zu untersuchende Probe 8 geleitet wird. Im schematisch gezeigten Beispiel umfasst der Beleuchtungsstrahlengang einen Hauptstrahlteiler 3, eine Scan-Einrichtung 4, eine Scanoptik 5, eine Tubuslinse 6 und das Mikroskopobjektiv 7. Bei dem Mikroskop 100 kann in bekannter Weise ein Stativ zum Aufnehmen einer Probe in einem Probenraum unter dem Mikroskopobjektiv 7 vorhanden sein. Der in 1 dargestellte Aufbau entspricht im Wesentlichen einem Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) zum sequenziellen Abtasten und Beleuchten der Probe 8 mit einem Anregungslaser als Lichtquelle 1.An embodiment of a microscope 100 according to the invention is described with reference to 1 to 3 explained. The 1 The schematically illustrated microscope 100 has as essential components a light source 1, an illumination beam path with a microscope objective 7, a detection beam path, a detection unit 10 and a control unit 11. The light source 1, which is typically a laser, in particular one with several wavelengths, is used to emit excitation light 2, which is guided via the illumination beam path onto and/or into a sample 8 to be examined. In the example shown schematically, the illumination beam path comprises a main beam splitter 3, a scanning device 4, a scanning optics 5, a tube lens 6 and the microscope objective 7. In the microscope 100, a stand for holding a sample in a sample space under the microscope objective 7 can be present in a known manner. The 1 The structure shown essentially corresponds to a laser scanning microscope (LSM) for sequentially scanning and illuminating the sample 8 with an excitation laser as light source 1.

Von der Lichtquelle 1 ausgehend gelangt das Anregungslicht 2 zunächst zum Hauptfarbteiler 3 und wird von diesem in Richtung der Scan-Einrichtung 4 geleitet, bei der es sich beispielsweise um einen zweidimensionalen Galvo-Scanner handeln kann. Von dort gelangt das Anregungslicht 2 über die Scanoptik 5 und die Tubuslinse 6 zum Mikroskopobjektiv 7, welches das Anregungslicht 2 auf und/oder in die Probe 8 fokussiert.Starting from the light source 1, the excitation light 2 first reaches the main color splitter 3 and is guided by it in the direction of the scanning device 4, which can be a two-dimensional galvo scanner, for example. From there, the excitation light 2 reaches the microscope objective 7 via the scanning optics 5 and the tube lens 6, which focuses the excitation light 2 on and/or into the sample 8.

Von der Probe 8, insbesondere infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht 2, abgestrahltes Licht 9, das auch als Emissionslicht 9 bezeichnet werden kann, wird über den Detektionsstrahlengang zur Detektionseinheit 10 geleitet. Bei dem Emissionslicht kann es sich insbesondere um Fluoreszenzlicht von Farbstoffen handeln, mit denen die Probe 8 präpariert wurde.Light 9 emitted by the sample 8, in particular as a result of irradiation with the excitation light 2, which can also be referred to as emission light 9, is guided via the detection beam path to the detection unit 10. The emission light can in particular be fluorescent light from dyes with which the sample 8 was prepared.

Erster Bestandteil des Detektionsstrahlengangs ist das Mikroskopobjektiv 7, welches das Emissionslicht 9 aufnimmt und kollimiert. Über die Tubuslinse 6 und die Scanoptik 5 gelangt das Emissionslicht 9 zu der Scan-Einrichtung 4, wird dort descannt und trifft sodann über den Hauptstrahlteiler 3, wo es im Unterschied zum Anregungslicht 2 transmittiert wird, zur Detektionseinheit 10 und wird darin ortsfest auf den erfindungsgemäß vorhandenen zweidimensional ortsauflösenden Detektor 28 abgebildet.The first component of the detection beam path is the microscope objective 7, which receives and collimates the emission light 9. The emission light 9 reaches the scanning device 4 via the tube lens 6 and the scanning optics 5, is descanned there and then hits the detection unit 10 via the main beam splitter 3, where it is transmitted in contrast to the excitation light 2, and is imaged therein in a fixed position on the two-dimensional, spatially resolving detector 28 provided according to the invention.

Die Steuereinheit 11 dient im gezeigten Ausführungsbeispiel mindestens zur Ansteuerung der Lichtquelle 1, der Scan-Einrichtung 4 und zum Auswerten von Messdaten der Detektionseinheit 10, also des mindestens einen Detektors 28. Beispielsweise kann die Steuereinheit 11 die Intensität des Anregungslichts 2 in Abhängigkeit von einem Ort auf oder in der Probe 8 und gegebenenfalls in Abhängigkeit von einer Intensität des von dem betreffenden Probenort kommenden Emissionslichts 9 einstellen. Schließlich kann die Steuereinheit 11 gegebenenfalls nach geeigneten Verrechnungen der Messdaten Bilder der Probe 8 erzeugen.In the exemplary embodiment shown, the control unit 11 serves at least to control the light source 1, the scanning device 4 and to evaluate measurement data from the detection unit 10, i.e. the at least one detector 28. For example, the control unit 11 can adjust the intensity of the excitation light 2 depending on a location on or in the sample 8 and, if appropriate, depending on an intensity of the emission light 9 coming from the relevant sample location. Finally, the control unit 11 can, if appropriate, generate images of the sample 8 after suitable calculations of the measurement data.

Ein Ausführungsbeispiel einer Detektionseinheit 10 für ein erfindungsgemäßes Mikroskop 100 wird mit Bezug zu 2 erläutert. Die darin gezeigte Detektionseinheit 10 weist als wesentliche Bestandteile eine Pinholeoptik 21 mit einer einstellbaren größenveränderlichen Aperturblende, eine erfindungsgemäß vorhandene brennweitenveränderliche Optik 22, sowie einen ersten spektralen Detektionskanal 30a und einen zweiten spektralen Detektionskanal 30b auf.An embodiment of a detection unit 10 for a microscope 100 according to the invention is described with reference to 2 explained. The detection unit 10 shown therein has as essential components a pinhole optics 21 with an adjustable size-variable aperture stop, an optics 22 with variable focal length provided according to the invention, as well as a first spectral detection channel 30a and a second spectral detection channel 30b.

In der in 2 schematisch gezeigten Anordnung enthalten der erste Detektionskanal 30a und der zweite Detektionskanal 30b im Wesentlichen gleiche optische Komponenten die gegebenenfalls auf die unterschiedlichen spektralen Zusammensetzungen der Teilstrahlen hin optimiert sind. Äquivalente optische Komponenten in den beiden Detektionskanälen 30a und 30b sind jeweils mit denselben Bezugszeichen bezeichnet mit der Maßgabe, dass die Komponenten des ersten Detektionskanals 30a zusätzlich mit dem Buchstaben a und diejenigen des zweiten Detektionskanals 30b zusätzlich mit dem Buchstaben b versehen sind.In the 2 In the arrangement shown schematically, the first detection channel 30a and the second detection channel 30b contain essentially the same optical components which are optionally optimized for the different spectral compositions of the partial beams. Equivalent The optical components in the two detection channels 30a and 30b are each designated by the same reference numerals, with the proviso that the components of the first detection channel 30a are additionally provided with the letter a and those of the second detection channel 30b are additionally provided with the letter b.

Im ersten Detektionskanal 30a und im zweiten Detektionskanal 30b ist jeweils ein zweidimensional ortsauflösender Detektor 28a bzw. 28b vorhanden, wobei es sich im Ausführungsbeispiel jeweils um SPAD-Array-Detektoren handelt.In the first detection channel 30a and in the second detection channel 30b there is a two-dimensional spatially resolving detector 28a and 28b, respectively, which in the exemplary embodiment are SPAD array detectors.

Die Pinholeoptik 21 erzeugt eine Zwischenbildebene, in der die einstellbare Aperturblende, die auch als Pinhole bezeichnet werden kann, angeordnet ist. Die Aperturblende kann einerseits dazu dienen, außerfokale Emission auszublenden und andererseits kann sie als Eintrittsöffnung für einen spektral auflösenden Modus dienen. Im letzteren Fall beeinflusst die Größe der Öffnung der Aperturblende eine spektrale Auflösung und damit auch eine Trennung der spektralen Detektionskanäle.The pinhole optics 21 generates an intermediate image plane in which the adjustable aperture stop, which can also be referred to as a pinhole, is arranged. The aperture stop can be used to block out-of-focus emission and can also be used as an entrance opening for a spectrally resolving mode. In the latter case, the size of the aperture stop opening influences the spectral resolution and thus also the separation of the spectral detection channels.

Strahlabwärts der Pinholeoptik 21 befindet sich die brennweitenveränderliche Optik 22, die im gezeigten Ausführungsbeispiel durch eine schematisch dargestellte Zoom-Optik verwirklicht ist. Die brennweitenveränderliche Optik 22 ist so ausgelegt, dass ihre rückseitige Brennebene immer in der Ebene der SPAD-Detektoren 28a, 28b liegt. Die Ebenen der SPAD-Detektoren 28a, 28b sind mit anderen Worten optisch konjugiert zur Ebene der einstellbaren Aperturblende. Mit der brennweitenveränderlichen Optik 22 kann einerseits eine Ausleuchtung der Detektoren 28a, 28b nach Wechsel eines Mikroskopobjektivs geeignet angepasst werden. Andererseits kann für einen spektral auflösenden Messmodus die Vergrößerung von der Ebene der einstellbaren Aperturblende auf die Detektoren 28a, 28b dergestalt verkleinert werden, dass die FWHM der PSF auf den Detektoren 28a, 28b von der Größenordnung eines Abstandes d (siehe 3B) der Pixel der Detektoren 28a, 28b oder kleiner ist, um die spektrale Auflösung zu erhöhen. Die Größe des auf dem Sensor abgelegten Spektralbereichs hängt von der im Prisma erzeugten Winkeldispersion und dem Abstand des Prismas zum Sensor ab.Downstream of the pinhole optics 21 is the variable focal length optics 22, which in the embodiment shown is implemented by a schematically shown zoom optics. The variable focal length optics 22 are designed so that their rear focal plane is always in the plane of the SPAD detectors 28a, 28b. In other words, the planes of the SPAD detectors 28a, 28b are optically conjugated to the plane of the adjustable aperture stop. On the one hand, the variable focal length optics 22 can be used to suitably adjust the illumination of the detectors 28a, 28b after changing a microscope objective. On the other hand, for a spectrally resolving measurement mode, the magnification from the plane of the adjustable aperture stop to the detectors 28a, 28b can be reduced such that the FWHM of the PSF on the detectors 28a, 28b is of the order of a distance d (see 3B) the pixels of the detectors 28a, 28b or smaller in order to increase the spectral resolution. The size of the spectral range stored on the sensor depends on the angular dispersion generated in the prism and the distance of the prism from the sensor.

An einem Farbteiler 23, bei dem es sich beispielsweise um einen diskret oder kontinuierlich einstellbaren dichroitischen Strahlteiler handeln kann, wird der Detektionsstrahlengang strahlabwärts von der brennweitenveränderlichen Optik 22 im gezeigten Ausführungsbeispiel in dem in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel in die beiden Detektionskanäle 30a und 30b aufgetrennt, die strahlabwärts des Farbteilers 23 dann unterschiedliche Spektralbereiche des Emissionslichts 9 führen.At a color splitter 23, which can be, for example, a discretely or continuously adjustable dichroic beam splitter, the detection beam path downstream of the focal length-adjustable optics 22 in the embodiment shown in the 2 shown embodiment is separated into the two detection channels 30a and 30b, which then guide different spectral ranges of the emission light 9 downstream of the color splitter 23.

Unmittelbar strahlabwärts von dem Farbteiler 23 sind jeweils ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtungen 24a, 24b vorhanden, die zum spektralen Auftrennen des Emissionslichts 9 in dem ersten Detektionskanal 30a bzw. dem zweiten Detektionskanals 30b dienen. Im gezeigten Ausführungsbeispiel sind die dispergierenden Einrichtungen 24a und 24b jeweils durch eine verschiebbare Kombination aus unterschiedlichen Glaskeilen verwirklicht, die ansteuerbar motorisch in den Strahlengang hinein- oder aus diesem herausbewegt werden können. Diese Bewegung ist jeweils durch Doppelpfeile angedeutet. Das Emissionslicht 9 wird durch die spektral dispergierenden Einrichtungen 24a, 24b, wenn sich diese im Strahlengang befinden, mithin aktiviert sind, strahlabwärts von der jeweiligen dispergierenden Einrichtung 24a, 24b in einer Dispersionsebene aufgetrennt oder spektral aufgefächert. In der 2 ist die Dispersionsebene identisch mit der Zeichenebene.Immediately downstream of the color splitter 23 there are controllable and optionally activatable dispersing devices 24a, 24b which serve to spectrally separate the emission light 9 in the first detection channel 30a or the second detection channel 30b. In the embodiment shown, the dispersing devices 24a and 24b are each implemented by a movable combination of different glass wedges which can be controlled and moved into or out of the beam path by a motor. This movement is indicated by double arrows. The emission light 9 is separated or spectrally fanned out in a dispersion plane by the spectrally dispersing devices 24a, 24b when they are in the beam path and are therefore activated, downstream of the respective dispersing device 24a, 24b. In the 2 the dispersion plane is identical to the drawing plane.

Das spektral aufgetrennte Emissionslicht 9 trifft sodann jeweils auf Zylinderoptiken 25a und 25b, die die Fokuslage für eine Richtung senkrecht zur Detektionsebene dergestalt verlagern, dass sich das Emissionslicht 9 in der Ebene der SPAD-Array-Detektoren 28a, 28b senkrecht zur Dispersionsrichtung über viele Pixel verteilt (siehe 3B). In der Dispersionsrichtung verändern die Zylinderoptiken 25a, 25b die Fokussierung im wesentlichen nicht. Der Bildort in der Dispersionsrichtung ist eine Funktion der Wellenlänge. Dieser Sachverhalt wird weiter unten im Zusammenhang mit 3B genauer erläutert.The spectrally separated emission light 9 then hits cylinder optics 25a and 25b, which shift the focus position for a direction perpendicular to the detection plane in such a way that the emission light 9 is distributed over many pixels in the plane of the SPAD array detectors 28a, 28b perpendicular to the dispersion direction (see 3B) . In the dispersion direction, the cylinder optics 25a, 25b do not change the focus essentially. The image location in the dispersion direction is a function of the wavelength. This fact will be discussed further below in connection with 3B explained in more detail.

Mit winkelverstellbaren planparallelen Platten 26a, 26b kann das mit den dispergierenden Einrichtungen 24a, 24b jeweils erzeugte Spektrum je nach Einstellung des Farbteiler 23 jeweils noch relativ zu den Detektoren 28a, 28b dergestalt verschoben werden, dass die interessierenden spektralen Bereiche möglichst zentral auf den Detektoren 28a, 28b liegen. Beispielsweise können die Spektren so lateral verschoben werden, dass ein spektraler Schwerpunkt der Emission jeweils zentral auf einem der Detektoren 28a, 28b zu liegen kommt oder dass möglichst eine gesamte spektrale Emissionsbandbreite durch den betreffenden Detektor 28a, 28b erfasst wird.With angle-adjustable plane-parallel plates 26a, 26b, the spectrum generated by the dispersing devices 24a, 24b can be shifted relative to the detectors 28a, 28b depending on the setting of the color splitter 23 in such a way that the spectral ranges of interest are as centrally located as possible on the detectors 28a, 28b. For example, the spectra can be shifted laterally in such a way that a spectral focus of the emission is centrally located on one of the detectors 28a, 28b or that as far as possible an entire spectral emission bandwidth is recorded by the relevant detector 28a, 28b.

Schließlich ist strahlabwärts von den Komponenten 26a, 26b jeweils ein einstellbares Filter 27a, 27b vorhanden, mit welchem für den Messmodus Image-Scanning (ISM) die spektralen Detektionsbandbreiten für den ersten Detektionskanal 30a und den zweiten Detektionskanal 30b eingestellt werden können.Finally, downstream of the components 26a, 26b, there is an adjustable filter 27a, 27b with which the spectral detection bandwidths for the first detection channel 30a and the second detection channel 30b can be set for the image scanning (ISM) measurement mode.

Im ISM-Betrieb werden die dispergierenden Einrichtungen 24a, 24b und die Zylinderoptiken 25a, 25b in den durch die Pfeilrichtungen angedeuteten Richtungen aus den Strahlengängen entfernt und die einstellbaren Filter 27a, 27b werden vorteilhaft auf Positionen eingestellt, die zusammen mit dem Strahlteiler 23, eine spektrale Diskriminierung von unerwünschten Signalen ermöglichen.In ISM operation, the dispersing devices 24a, 24b and the cylinder optics 25a, 25b are removed from the beam paths in the directions indicated by the arrows and the adjustable filters 27a, 27b are advantageously set to positions which, together with the beam splitter 23, enable spectral discrimination of unwanted signals.

Die Bewegung der dispergierenden Einrichtungen 24a im ersten Detektionskanal 30a kann gemeinsam, aber auch unabhängig von derjenigen der dispergierenden Einrichtung 24b im zweiten Detektionskanal 30b erfolgen. Es ist also möglich beide Detektionskanäle 30a, 30b im ISM-Modus, beide Detektionskanäle 30a, 30b im spektral auflösenden Modus oder den ersten Detektionskanal 30a im ISM-Modus und den zweiten Detektionskanal 30b im spektral auflösenden Modus zu betreiben oder umgekehrt. Es können also gleichzeitig ISM-Daten und spektrale Bilddaten erzeugt werden.The movement of the dispersing devices 24a in the first detection channel 30a can occur together, but also independently of that of the dispersing device 24b in the second detection channel 30b. It is therefore possible to operate both detection channels 30a, 30b in ISM mode, both detection channels 30a, 30b in spectrally resolving mode or the first detection channel 30a in ISM mode and the second detection channel 30b in spectrally resolving mode or vice versa. ISM data and spectral image data can therefore be generated simultaneously.

An den Filtern 27a, 27b reflektiertes Emissionslicht kann auch auf weitere Detektoren gelenkt werden, die in 2 nicht dargestellt sind. Wie weiter oben schon beschrieben kann eine Ausspiegelung von spektralen Anteilen des Detektionslichts in weitere Detektionskanäle auch mit Hilfe von weiteren Farbteilern erfolgen, die beispielsweise strahlabwärts nach dem Farbteiler 23 und vor einer oder beiden der Komponenten 24a, 24b angeordnet sein können.Emission light reflected at the filters 27a, 27b can also be directed to further detectors which are 2 are not shown. As already described above, spectral components of the detection light can also be reflected into further detection channels with the aid of further color splitters, which can be arranged, for example, downstream of the color splitter 23 and upstream of one or both of the components 24a, 24b.

Im dispersiven Modus können die einstellbaren Filter 27a, 27b vorteilhaft auf Positionen eingestellt werden, in denen sich möglichst nur breitbandig reflexmindernde Schichten im Strahlengang befinden.In dispersive mode, the adjustable filters 27a, 27b can advantageously be set to positions in which, if possible, only broadband reflection-reducing layers are located in the beam path.

Die Reihenfolge der optischen Komponenten in den Detektionskanälen 30a, 30b kann eine andere sein, ohne dass es zu Einschränkungen hinsichtlich der beschriebenen Funktion kommt. Wegen der fokussierenden Wirkung der Zylinderoptiken 25a, 25b ist es aber zweckmäßig, diese jeweils strahlabwärts von den dispergierenden Einrichtungen 24a, 24b anzuordnen.The order of the optical components in the detection channels 30a, 30b can be different without this leading to restrictions with regard to the function described. However, due to the focusing effect of the cylinder optics 25a, 25b, it is expedient to arrange these downstream of the dispersing devices 24a, 24b.

Vor den Detektoren 28a, 28b kann zum Kompensieren eines endlichen Füllfaktors dieser Detektoren ein Multilinsenarray vorhanden sein, was in der 2 nicht dargestellt ist. Dabei kann jedem Pixel der Detektoren 28a, 28b eine Mikrolinse zugeordnet sein. Bevorzugt werden SPAD-Array-Detektoren mit einem Multilinsenarray verwendet, die einen großen Akzeptanzraumwinkel auf ihrer Eingangsseite verfügen, um die durch die dispergierenden Einrichtungen 24a, 24b und die Zylinderoptiken 25a, 25b erzeugten Spektren, die winkelmäßig aufgetrennt sind, möglichst jeweils vollständig auf die jeweilige aktive Fläche der Detektoren 28a, 28b abzubilden. Dazu darf eine Brennweite der Linsen des Multilinsenarrays nicht zu klein gewählt werden, damit eine Änderung des Einfallswinkels nicht eine zu große Änderung der Bildablage bewirkt. Außerdem sollte darauf geachtet werden, dass ein auf den aktiven Flächen der Detektoren 28a, 28b erzeugtes Abbild der Systempupille deutlich kleiner ist als die zu einem einzelnen Pixel gehörende Sensorfläche. Die verwendeten SPAD-Array-Detektoren 28a, 28b können über ein gesamtes Wellenlängenspektrum eine gute Empfindlichkeit aufweisen; sie können aber auch auf bestimmte Bereiche des optischen Spektrums, welches in dem jeweiligen Detektionskanal zu detektieren ist, optimiert sein.A multi-lens array may be provided in front of the detectors 28a, 28b to compensate for a finite fill factor of these detectors, which is 2 is not shown. A microlens can be assigned to each pixel of the detectors 28a, 28b. SPAD array detectors with a multi-lens array are preferably used, which have a large acceptance solid angle on their input side in order to image the spectra generated by the dispersing devices 24a, 24b and the cylinder optics 25a, 25b, which are separated by angle, as completely as possible onto the respective active surface of the detectors 28a, 28b. For this purpose, the focal length of the lenses of the multi-lens array must not be chosen to be too small, so that a change in the angle of incidence does not cause too great a change in the image storage. In addition, care should be taken to ensure that an image of the system pupil generated on the active surfaces of the detectors 28a, 28b is significantly smaller than the sensor surface belonging to an individual pixel. The SPAD array detectors 28a, 28b used can have good sensitivity over an entire wavelength spectrum; however, they can also be optimized for specific regions of the optical spectrum to be detected in the respective detection channel.

In 3 sind in den Figuren A und B jeweils schematisch Sensorflächen mit typischen Lichtverteilungen für den ISM-Betrieb (3A, links) und den spektral auflösenden Betrieb (3B, rechts) dargestellt.In 3 Figures A and B each show schematic sensor surfaces with typical light distributions for ISM operation ( 3A , left) and the spectrally resolving operation ( 3B , right).

In den gezeigten Beispielen sind die Pixel des Detektors rechtwinklig angeordnet. Es sind aber auch hexagonale oder andere Anordnungen möglich. In 3A ist die PSF des Emissionslichts 9 etwa so auf der Detektorfläche positioniert, dass ein Intensitätsmaximum der PSF etwa zentral auf dem Detektor liegt. Damit ist gewährleistet, dass die Intensität der PSF am Rand des Detektors möglichst abgeklungen ist. Außerdem ist die Vergrößerung der Abbildung durch geeignete Einstellung der brennweitenveränderlichen Optik 22 (siehe 2) so gewählt, dass die PSF, genauer gesagt der Durchmesser des ersten Airy-Rings, mit mindestens fünf Pixeln oder fünf Bins von Pixeln abgetastet wird. Dieser Sachverhalt wird durch die Beziehung $F W H M (p s f) \geq 5 d$

zum Ausdruck gebracht, worin d der Abstand der Pixel des Detektors (Pixelpitch) beziehungsweise der Bins von Pixeln ist. Ein Bin von Pixeln also eine Gruppe von, insbesondere benachbarten Pixeln, die zu einem Bin zusammengefasst sind, kann als Pixelbin bezeichnet werden.In the examples shown, the detector pixels are arranged at right angles. However, hexagonal or other arrangements are also possible. In 3A the PSF of the emission light 9 is positioned on the detector surface in such a way that an intensity maximum of the PSF is located approximately centrally on the detector. This ensures that the intensity of the PSF at the edge of the detector has decayed as much as possible. In addition, the magnification of the image can be achieved by suitable adjustment of the variable focal length optics 22 (see 2 ) is chosen such that the PSF, or more precisely the diameter of the first Airy ring, is sampled with at least five pixels or five bins of pixels. This is expressed by the relationship

F W H M (p s e) \geq 5 d

where d is the distance between the pixels of the detector (pixel pitch) or between the bins of pixels. A bin of pixels, i.e. a group of, particularly neighboring pixels, which are combined to form a bin, can be referred to as a pixel bin.

3B zeigt die Anordnung einer PSF von Licht einer einzigen Wellenlänge λ₀ auf dem Detektor im spektral auflösenden Modus. Wie ersichtlich, weist die PSF wegen der Wirkung der Zylinderoptik 25a oder 25b eine stark asymmetrische Form auf. Die Dispersionsrichtung verläuft in 3B horizontal, also entlang der x-Richtung (siehe Koordinatensystem in 3). Das bedeutet, dass die PSF von anderen Wellenlängen, die in 3B nicht gezeigt sind, je nachdem ob die betreffende Wellenlänge größer oder kleiner ist als die Wellenlänge λ₀, rechts oder links von der gezeigten PSF zu liegen kommen. Mit der brennweitenveränderlichen Optik 22 wird für diesen Modus vorteilhaft eine Vergrößerung dergestalt eingestellt, dass die FWHM der PSF für eine einzelne Wellenlänge, wie aus 3B ersichtlich, kleiner als ein Pixelabstand d ist. Dadurch wird eine verbesserte spektrale Auflösung erreicht.. Um außerdem zu erreichen, dass für die PSFs der einzelnen Wellenlängen jeweils möglichst viele Pixel des Detektors zur Signalerzeugung beitragen und um so eine gute Dynamik der Grauwerte in den Bildern bereitzustellen, wird die PSF mit der Zylinderoptik 25a, 25b senkrecht zur Dispersionsrichtung, also in y-Richtung, defokussiert. Das führt dazu, dass in der y-Richtung viele Pixel von Licht mit derselben Wellenlänge λ₀ beleuchtet werden. 3B shows the arrangement of a PSF of light of a single wavelength λ ₀ on the detector in spectrally resolving mode. As can be seen, the PSF has a strongly asymmetric shape due to the effect of the cylinder optics 25a or 25b. The dispersion direction runs in 3B horizontally, i.e. along the x-direction (see coordinate system in 3 ). This means that the PSF of other wavelengths that are in 3B not shown, depending on whether the wavelength in question is greater or smaller than the wavelength λ ₀ , to the right or left of the PSF shown. With the variable focal length optics 22, a magnification is advantageously set for this mode in such a way that the FWHM of the PSF for a individual wavelength, as shown 3B is smaller than a pixel pitch d. This results in improved spectral resolution. In order to ensure that as many pixels of the detector as possible contribute to signal generation for the PSFs of the individual wavelengths and thus to provide good dynamics of the gray values in the images, the PSF is defocused with the cylinder optics 25a, 25b perpendicular to the dispersion direction, i.e. in the y-direction. This means that many pixels in the y-direction are illuminated by light with the same wavelength λ ₀ .

4 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Farbteilereinrichtung 80, mit welcher einkommendes Emissionslicht 9 auf insgesamt fünf spektrale Detektionskanäle Ch1,..,Ch5 verteilt werden kann. Die Bezugszeichen λ1 bis λ5 bezeichnen die Wellenlängenspektren des Emissionslichts 9 in den jeweiligen Detektionskanälen Ch1,..,Ch5. Jedes der Bezugszeichen λ1 bis λ5 kann für einen endlichen spektralen Bereich und auch für mehrere nichtzusammenhängende spektrale Bereiche stehen. 4 shows an embodiment of a color splitter device 80 with which incoming emission light 9 can be distributed over a total of five spectral detection channels Ch1,..,Ch5. The reference symbols λ1 to λ5 designate the wavelength spectra of the emission light 9 in the respective detection channels Ch1,..,Ch5. Each of the reference symbols λ1 to λ5 can stand for a finite spectral range and also for several non-contiguous spectral ranges.

Die Farbteilereinrichtung 80 weist einen Rotor 60 auf, auf dem über eine Umfangsrichtung einer Mantelfläche eines Zylinders verteilt zunächst Farbteiler BP1,..,BP4 angeordnet sind, welche eine erste Gruppe von Farbteilern bilden. In der in 4 gezeigten Situation befinden sich die Farbteiler BP1,..,BP4 dieser ersten Gruppe im Strahlengang. Eine Rotationsachse des Rotors 60, die sich durch einen mit M bezeichneten Punkt senkrecht zur Papierebene erstreckt, ist kollinear zu einer Hauptachse des Zylinders und ist insbesondere senkrecht orientiert zu einer Einfallsrichtung des Emissionslichts 9 auf die Farbteilereinrichtung 80.The color splitter device 80 has a rotor 60 on which color splitters BP1,...,BP4 are arranged distributed over a circumferential direction of a cylinder surface, which form a first group of color splitters. In the 4 In the situation shown, the color splitters BP1,..,BP4 of this first group are located in the beam path. A rotation axis of the rotor 60, which extends through a point designated M perpendicular to the plane of the paper, is collinear with a main axis of the cylinder and is in particular oriented perpendicular to a direction of incidence of the emission light 9 onto the color splitter device 80.

In der in 4 gezeigten Situation arbeitet die Farbteilereinrichtung 80 wie folgt: Einkommendes Emissionslicht 9 tritt durch ein Fenster W1 ein und trifft auf den ersten Farbteiler BP1. Ein erster spektraler Anteil λ1 wird an dem Farbteiler BP1 transmittiert und in den ersten Detektionskanal Ch1 ausgekoppelt. Ein von dem Farbteiler BP1 nicht transmittierter spektraler Anteil des Emissionslichts 9 wird von dem Farbteiler BP1 im wesentlichen reflektiert und trifft dann auf den zweiten Farbteiler BP2. Dort wird ein zweiter spektraler Anteil λ2 transmittiert und in den zweiten Detektionskanal Ch2 ausgekoppelt. Analog geht es über die Farbteiler BP3 und BP4 weiter, an denen jeweils die spektralen Anteile λ3 und λ4 in den dritten Detektionskanal Ch3 beziehungsweise den vierten Detektionskanal Ch4 ausgekoppelt werden.In the 4 In the situation shown, the color splitter device 80 works as follows: Incoming emission light 9 enters through a window W1 and strikes the first color splitter BP1. A first spectral component λ1 is transmitted at the color splitter BP1 and coupled out into the first detection channel Ch1. A spectral component of the emission light 9 not transmitted by the color splitter BP1 is essentially reflected by the color splitter BP1 and then strikes the second color splitter BP2. There, a second spectral component λ2 is transmitted and coupled out into the second detection channel Ch2. The process continues analogously via the color splitters BP3 and BP4, at which the spectral components λ3 and λ4 are coupled out into the third detection channel Ch3 and the fourth detection channel Ch4, respectively.

Der verbliebene spektrale Anteil λ5 des Emissionslichts 9, der am vierten Farbteiler BP4 reflektiert wird, gelangt über ein Austrittsfenster W2 in den fünften Detektionskanal Ch5.The remaining spectral component λ5 of the emission light 9, which is reflected at the fourth color splitter BP4, enters the fifth detection channel Ch5 via an exit window W2.

Im gezeigten Ausführungsbeispiel sind das Eintrittsfenster W1 und das Austrittsfenster W2 neutral, d. h. das hindurchtretende Licht wird dort spektral nicht verändert. Es wäre aber möglich, auch dort Filter vorzusehen.In the example shown, the entrance window W1 and the exit window W2 are neutral, i.e. the light passing through them is not spectrally changed. However, it would be possible to provide filters there as well.

Unter der Annahme, dass in den Farbteilern BP1 bis BP4 und den Komponenten W1 und W2 kein Licht absorbiert wird, wird das einkommende Emissionslicht 9 vollständig auf die Detektionskanäle Ch1 bis Ch5 aufgeteilt.Assuming that no light is absorbed in the color splitters BP1 to BP4 and the components W1 and W2, the incoming emission light 9 is completely split into the detection channels Ch1 to Ch5.

Eine besonders vorteilhafte Eigenschaft der in 4 gezeigten Farbteilereinrichtung 80 ergibt sich sodann aus dem Umstand, dass auf der Mantelfläche des Zylinders 60 zusätzlich weitere Farbteiler BP5 bis BP8 angeordnet sind, durch die eine zweite Gruppe von Farbteilern gebildet ist. Durch Verdrehen des Zylinders 60 um 30° in der Richtung des Uhrzeigers kann erreicht werden, dass die bisher als Austrittsfenster wirkende Komponente W2 zum Eintrittsfenster für das einlaufende Emissionslicht 9 wird. Der Strahlengang ist dann derselbe wie zuvor beschrieben, mit der Maßgabe, dass an die Stelle der Farbteiler BP1,..,BP4 der ersten Gruppe diejenigen Farbteiler BP5,..,BP8 der zweiten Gruppe treten und dass ein Fenster W3 an die Stelle des Austrittsfensters W2 tritt. Die Farbteiler BP5,..,BP8 der zweiten Gruppe können im Vergleich zu den Farbteilern BP1 ,..,BP4 der ersten Gruppe spektral unterschiedliche Eigenschaften aufweisen.A particularly advantageous feature of the 4 The color splitter device 80 shown then results from the fact that additional color splitters BP5 to BP8 are arranged on the outer surface of the cylinder 60, which form a second group of color splitters. By rotating the cylinder 60 by 30° in a clockwise direction, the component W2, which previously acted as an exit window, can be made the entry window for the incoming emission light 9. The beam path is then the same as previously described, with the proviso that the color splitters BP5,...,BP8 of the second group take the place of the color splitters BP1,...,BP4 of the first group and that a window W3 takes the place of the exit window W2. The color splitters BP5,...,BP8 of the second group can have spectrally different properties compared to the color splitters BP1,...,BP4 of the first group.

Das Umschalten von einer Untersuchung einer ersten Probe, die mit einer ersten Auswahl von Farbstoffen präpariert wurde, insbesondere unter Verwendung eines ersten Spektrums des Anregungslichts 2, zu einer Untersuchung einer zweiten Probe, die mit einer von der ersten Auswahl verschiedenen zweiten Auswahl von Farbstoffen präpariert wurde, insbesondere unter Verwendung eines von dem ersten Spektrum verschiedenen zweiten Spektrums des Anregungslichts 2, ist bei Verwendung einer solchen Farbteilereinrichtung besonders komfortabel. Ein besonderer Vorteil ist, dass wegen der stabilen Rotation der Filterflächen um die Hauptachse des Zylinders die Strahlrichtung der resultierenden Detektionsstrahlengänge nach Einstellen einer anderen Gruppe von Farbteilern vollständig erhalten bleibt. Insbesondere wenn SPAD-Array-Detektoren mit Sensorflächen von typischerweise kleiner als 1 mm² verwendet werden, ist das ein wichtiger Vorteil.Switching from an examination of a first sample that was prepared with a first selection of dyes, in particular using a first spectrum of the excitation light 2, to an examination of a second sample that was prepared with a second selection of dyes that is different from the first selection, in particular using a second spectrum of the excitation light 2 that is different from the first spectrum, is particularly convenient when using such a color splitter device. A particular advantage is that, due to the stable rotation of the filter surfaces about the main axis of the cylinder, the beam direction of the resulting detection beam paths is completely retained after setting a different group of color splitters. This is an important advantage, in particular when SPAD array detectors with sensor surfaces that are typically smaller than 1 mm ² are used.

Im gezeigten Ausführungsbeispiel beinhaltet jede Gruppe von Farbteilern jeweils vier Farbteiler, was naturgemäß nicht zwingend ist. Je nach zur Verfügung stehendem Bauraum und je nach Anforderungen des Experiments, können auch mehr oder weniger Farbteiler und/oder Gruppen von Farbteilern und entsprechend mehr oder weniger spektrale Detektionskanäle vorhanden sein.In the example shown, each group of color dividers contains four color dividers, which is naturally not mandatory. Depending on the available space and the requirements of the experiment, more or fewer color dividers and/or groups of color dividers can be used. and accordingly more or fewer spectral detection channels may be available.

Das in die jeweiligen Detektionskanäle ausgekoppelte Licht kann unter Verwendung von Filtern vor der Detektion noch weiter konditioniert werden. Dieses ist in 4 beispielhaft für den ersten Detektionskanal Ch1 gezeigt, wo die Filter F1 und F2 im Strahlengang positioniert sind.The light coupled into the respective detection channels can be further conditioned using filters before detection. This is shown in 4 shown as an example for the first detection channel Ch1, where the filters F1 and F2 are positioned in the beam path.

BezugszeichenlisteList of reference symbols

11: LichtquelleLight source
22: AnregungslichtExcitation light
33: Hauptstrahlteiler, dichroitischer StrahlteilerMain beam splitter, dichroic beam splitter
44: Scan-Einrichtung, zweidimensionaler ScannerScanning device, two-dimensional scanner
55: ScanoptikScanning optics
66: TubuslinseTube lens
77: MikroskopobjektivMicroscope objective
88th: Probesample
99: von der Probe 8 abgestrahltes Licht, Emissionslichtlight emitted by sample 8, emission light
1010: DetektionseinheitDetection unit
1111: SteuereinheitControl unit
2121: einstellbare Aperturblendeadjustable aperture diaphragm
2222: brennweitenveränderliche Optik, Zoom-Optikvariable focal length optics, zoom optics
2323: FarbteilerColor divider
24a24a: ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung des ersten Detektionskanals 30acontrollable and optionally activatable dispersing device of the first detection channel 30a
24b24b: ansteuerbare und wahlweise aktivierbare dispergierende Einrichtung des zweiten Detektionskanals 30bcontrollable and optionally activatable dispersing device of the second detection channel 30b
25a25a: Zylinderoptik, wahlweise in Detektionsstrahlengang im ersten Detektionskanal 30a einbringbarCylinder optics, optionally insertable into detection beam path in the first detection channel 30a
25b25b: Zylinderoptik, wahlweise in Detektionsstrahlengang im zweiten Detektionskanal 30b einbringbarCylinder optics, optionally insertable into detection beam path in the second detection channel 30b
26a26a: einstellbare Optik zum lateralen Verschieben von spektral aufgetrenntem Licht relativ zum Detektor 28aadjustable optics for laterally shifting spectrally separated light relative to the detector 28a
26b26b: einstellbare Optik zum lateralen Verschieben von spektral aufgetrenntem Licht relativ zum Detektor 28badjustable optics for laterally shifting spectrally separated light relative to the detector 28b
27a27a: Filter, mit Bezug auf spektrale Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften einstellbarFilter, adjustable with respect to spectral transmission and/or reflection properties
27b27b: Filter, mit Bezug auf spektrale Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften einstellbarFilter, adjustable with respect to spectral transmission and/or reflection properties
2828: zweidimensional ortsauflösenden Detektortwo-dimensional spatially resolving detector
28a28a: zweidimensional ortsauflösender Detektor des ersten Detektionskanals 30atwo-dimensional spatially resolving detector of the first detection channel 30a
28b28b: zweidimensional ortsauflösender Detektor des zweiten Detektionskanals 30btwo-dimensional spatially resolving detector of the second detection channel 30b
30a30a: erster Detektionskanalfirst detection channel
30b30b: weiterer Detektionskanal, zweiter Detektionskanaladditional detection channel, second detection channel
6060: Rotorrotor
8080: FarbteilereinrichtungColor splitter device
BP1,..,BP8BP1,..,BP8: FarbteilerColor divider
BP1,..,BP4BP1,..,BP4: erste Gruppe von Farbteilernfirst group of color dividers
BP5,..,BP8BP5,..,BP8: zweite Gruppe von Farbteilernsecond group of color dividers
Ch1,..,Ch5Ch1,..,Ch5: DetektionskanäleDetection channels
F1F1: Filterfilter
F2F2: Filterfilter
FWHM(psf)FWHM(psf): Halbwertsbreite der PSF (Full Width Half Maximum)Full Width Half Maximum (PSF)
PSF, psfPSF, psf: Punktverwaschungsfunktion, Point Spread FunctionPoint spread function
xx: lineare Koordinatenrichtunglinear coordinate direction
yy: lineare Koordinatenrichtunglinear coordinate direction
zz: lineare Koordinatenrichtung, Richtung einer optischen Achse z, insbesondere des Mikroskopobjektivs 7linear coordinate direction, direction of an optical axis z, in particular of the microscope objective 7
AA: Wellenlängewavelength
λ0λ0: Wellenlänge des Lichts der dargestellten IntensitätsverteilungWavelength of the light of the displayed intensity distribution
λiλi: Wellenlängenspektrum des Emissionslichts 9 im Detektionskanal iWavelength spectrum of the emission light 9 in the detection channel i

Literaturliterature

[1] DE10038528A1
[2] DE10201220A1
[3] M. Buttafava et al., Optica 7, 755 (2020) .
[4] https://piimaging.com
[5] WO2020207571A1

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 102020120190 A1 [0002, 0003]
DE 10038528 A1 [0003, 0090]
WO 2020207571 A1 [0050, 0090]
DE 10201220 A1 [0090]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

https://doi.org/10.1117/12.2589786 and https://doi.org/10.1364/OPTICA.386574 [0005]
M. Buttafava et al., Optica 7, 755 (2020) [0090]
https://piimaging.com [0090]

Claims

Microscope with a light source (1) for emitting excitation light (2), with an illumination beam path (3, 4, 5, 6, 7) for guiding the excitation light (2) onto and/or into a sample (8), with a scanning device (4) for varying a location on and/or in the sample (8) exposed to the excitation light (2), with at least one two-dimensional spatially resolving detector (28) for detecting light (9) emitted by the sample (8), with a detection beam path with a microscope objective (7) for guiding at least part of the light (9) emitted by the sample (8) to the detector (28), a control unit (11) for controlling the scanning device (4) and for evaluating measurement data from the detector (28), characterized in that a detection unit (10) is present which contains the detector (28) and a focal length-variable optics (22) for imaging the sample (8) with variable magnification onto the detector (28) and a controllable and selectively activatable dispersing device (24a) for spectrally separating at least part of the light emitted by the sample (9), wherein the control unit (11) is also designed to control the dispersing device (24a, 24b).

Microscope after Claim 1 , characterized in that the detection unit (10) has an aperture diaphragm with adjustable size.

Microscope after Claim 1 or 2 , characterized in that the focal length-adjustable optics (22) images one and the same plane of the sample (8) onto the detector (28) or the detectors (28a, 28b) independently of an adjustment of the focal length.

Microscope after one of the Claims 1 until 3 , characterized in that the focal length-adjustable optics is formed by a zoom optics (22).

Microscope after one of the Claims 1 until 3 characterized in that the focal length-adjustable optics are formed by a lens changing system with which the magnification can be adjusted to several discrete values.

Microscope after one of the Claims 1 until 5 , characterized in that a first detection channel (30a) is formed in the detection unit (10), which has at least the detector (28a), that at least one further detection channel (30b) is present in the detection unit (10), that each further detection channel has a two-dimensional spatially resolving detector (28b), that at least one color splitter (23) is present in the detection beam path for guiding a spectral portion of the light emitted by the sample (9) and to be detected into the respective further detection channel (30b).

Microscope after Claim 6 , characterized in that the controllable and selectively activatable dispersing device (24a, 24b) for spectrally separating light to be detected is only effective in one of the detection channels (30a, 30b) and/or that at least one further controllable and selectively activatable dispersing device (24a, 24b) for spectrally separating light to be detected is present, which is only effective in one of the detection channels.

Microscope after one of the Claims 1 until 7 , characterized in that the controllable and selectively activatable dispersing device (24a, 24b) for spectrally separating light to be detected in at least one detection channel (30a, 30b) has at least one of the following components or is formed by one of the following components: grating that can be pivoted into the detection beam path, in particular a transmission grating or reflection grating, prism that can be pivoted into the detection beam path, in particular a straight-view prism or Pellin-Broca prism.

Microscope after one of the Claims 1 until 8th , characterized in that in the detection unit (10), in particular in at least one detection channel (30a, 30b), there is a cylindrical optic (25a, 25b) which can be optionally introduced into the detection beam path and which axially shifts an image plane for a direction which is perpendicular to a direction in which the dispersing device or one of the dispersing devices (24a, 24b) effects a spectral splitting.

Microscope after one of the Claims 1 until 9 , characterized in that the detection unit (10) and/or in at least one of the detection channels (30a, 30b) has a filter (27a, 27b) which can be adjusted with respect to its spectral transmission and/or reflection properties.

Microscope after Claim 10 , characterized in that at least one of the filters (27a, 27b) has a setting in which the light is transmitted and/or reflected in a broadband manner.

Microscope after Claim 10 or 11 , characterized in that at least one of the filters (27a, 27b) has a plurality of discrete filter segments, each of which can be introduced into the detection beam path.

Microscope after one of the Claims 10 until 12 , characterized in that at least one of the filters (27a, 27b) is realized by a continuously adjustable filter.

Microscope after one of the Claims 1 until 13 , characterized in that in the detection unit and/or in at least one detection channel (30a, 30b) there is an adjustable optics (26a, 26b) for laterally shifting spectrally separated light relative to the detector (28a, 28b) of the respective detection channel (30a, 30b).

Microscope after Claim 14 , characterized in that the adjustable optics (26a, 26b) in the detection unit and/or in at least one detection channel (30a, 30b) has at least one of the following components or is implemented by one of the following components: adjustably tiltable mirror, adjustably tiltable plane-parallel transparent plate, in particular glass plate, electrically controllable element which generates a phase gradient such that a focus is shifted laterally.

Microscope after one of the Claims 1 until 15 , characterized in that a multi-lens array is arranged in front of at least one of the detectors (28a, 28b).

Microscope after one of the Claims 1 until 16 , characterized in that in at least one of the detectors (28a, 28b) pixels, in particular adjacent pixels, for example in the direction of the detector rows and/or detector columns and in particular perpendicular to the direction of dispersion, can be combined by binning.

Microscope after one of the Claims 1 until 17 , characterized in that at least one of the detectors (28a, 28b) comprises a SPAD array.

Microscope after one of the Claims 1 until 18 , characterized in that a color splitter device (80) is provided with a rotor (60) on which a plurality of color splitters (BP1,..,BP8) are arranged, that by setting different rotational positions of the rotor (60) different color splitters (BP1,..,BP7) can be introduced into the detection beam path, via which a spectral portion of the light (9) emitted by the sample (8) can be fed to each detection channel (30a, 30b).

Microscope after Claim 19 , characterized in that by setting different rotational positions of the rotor (60), different groups (BP1,..,BP4; BP5,..,BP8) of color splitters can be introduced into the detection beam path and/or that the color splitters are each set up so that a spectral portion of the light is reflected and a portion is transmitted in sequence at each of the color splitters (BP1,..,BP4; BP5,..,BP8), and wherein the transmitted spectral portions can each be fed to one of the detection channels (Ch1,..,Ch5).

Microscope after Claim 19 or 20 , characterized in that the color splitters (BP1,..,BP8) are arranged on the rotor (60) on the outer surface of a cylinder and that the axis of rotation of the rotor (60) is collinear with a main axis of the cylinder and is oriented transversely, in particular perpendicularly, to a direction of incidence of the light on the color splitter device (80).