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Gegenstand der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur gezielten Oxyfunktionalisierung mehrfach ungesättigter Fettsäuren wie Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure zur Herstellung bioaktiver Lipidmediatoren, insbesondere der hydroxylierten und epoxidierten Lipidmediatoren.
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Stand der Technik
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Es besteht ein hohes Bedürfnis an biotechnologischen Herstellungsverfahren für Lipidmediatoren, insbesondere der Eicosanoide aus Arachidonsäure (AA), Eicosapentaensäure (EPA) sowie Docosanoide aus Docosahexaensäure (DHA) sowohl als therapeutisches Ziel, als auch als Diagnostikum.
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Lipidmediatoren stellen eine Substanzgruppe von hydrophoben Signalmolekülen mit hormonähnlicher Wirkung dar, welche aus den langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Omega-3 und Omega-6 Familien gebildet werden. Diese bioaktiven Lipide spielen eine wichtige Rolle in physiologischen sowie pathophysiologischen Stoffwechselvorgängen.
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Im Fokus der vorliegenden Erfindung stehen die Derivate der Omega-6-Fettsäure Arachidonsäure (AA; C20H32O2; 20:4; IUPAC (5Z,8Z,11Z,14Z-Eicosa-5,8,11,14-tetraensäure) und der Omega-3-Fettsäuren Eicosapentaensäure (EPA; C20H30O2; 20:5; IUPAC (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-Eicosa-5,8,11,14,17-pentaensäure) und Docosahexaensäure (DHA; C22H32O2; 22:6; IUPAC (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-Docosa-4,7,10,13,16,19-hexaensäure) . Diese gelten als die wichtigsten Vorstufen für die gängigsten Klassen der Lipidmediatoren. AA und deren Derivate erfüllen u.a. wichtige Funktionen des Muskel- und Nervensystems, regulieren Entzündungsprozesse, sind bei der Abwehr von Allergien und Parasiten beteiligt und regulieren den Blutdruck sowie die Blutgerinnung (Tallima und El Ridi, 2018).
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Des Weiteren ist AA ein wichtiger Bestandteil der Phospholipidmembranen. AA sorgt für eine hohe Fluidität, und wirkt so auch als natürliches Antifrostschutzmittel bei arktischen Tieren (Shanab et al., 2018).
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AA ist eine essentielle Fettsäure und findet sich vermehrt in tierischen Fetten, Innereien und Eiern und dessen Vorstufe Linolsäure (ω-6) wiederum in pflanzlichen Ölen wie z.B. Sonnenblumenöl.
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Physiologisch liegt AA fest verankert in der Phospholipidmembran vor und wird erst durch ein extrazelluläres Signal mittels Phospholipasen aus der Membran herausgelöst. Dadurch wird AA verschiedenen Enzymen zugänglich gemacht, die durch Oxyfunktionalisierungsreaktionen die Hydroxyeicosatetraensäuren (HETEs) und Epoxyeicosatriensäuren (EETs) bilden.
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AA wird u.a. durch die Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs; EC 1.14.-.-) metabolisiert. Diese membranständigen Häm-Thiolat-Enzyme oxidieren AA in diversen Geweben, u.a. im Gehirn, in der Lunge, im Herz, in der und in dem peripheren Gefäßsystem zu den EETs und HETEs ( ).
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Diese Metaboliten stehen im Fokus der vorliegenden Erfindung. Sowohl HETEs als auch EETs spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Nieren-, Lungen- und Herzfunktion, des Gefäßtonus und der langfristigen Kontrolle des arteriellen Drucks (Kroetz und XU, 2005).
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Die Superfamilie der CYPs weist 57 Isoenzyme im Menschen auf, wobei die Subtypen der CYP1, CYP2 und CYP4 Familien AA in erster Linie mittels einer Oxidations-Reaktion hydroxylieren.
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Dabei wird eine Hydroxylgruppe an das terminale und die subterminalen Kohlenstoffatome (C16-C20) angelagert. Der für die Reaktion benötigte molekulare Sauerstoff wird dabei zu einer Hydroxylgruppe und Wasser reduziert, während gleichzeitig das Cosubstrat NAD(P)H oxidiert wird (Hardwick 2008) .
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Bei dieser Reaktion wird hauptsächlich das terminal hydroxylierte 20-HETE durch Vertreter der CYP4A und CYP4F Familien gebildet. Dieser Metabolit wirkt vasokonstriktiv und pro-inflammatorisch und wird in Verbindung mit kardiovaskulären Erkrankungen gesehen (Waldmann et al., 2016).
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Im Gegensatz dazu zeigen die subterminal hydroxylierten HETEs (16-19-HETE) in der Regel einen anti-inflammatorische Effekt. Die gesamte physiologische und pathophysiologische Rolle der subterminalen HETEs ist, auch aufgrund eines Mangels an Probenmaterial, bis heute noch nicht vollständig geklärt. Das vorrangig durch CYP2C19, CYP1A2 und CYP4A11 gebildete 19-HETE weist eine direkte antagonistische Wirkung auf 20-HETE auf, da es den renalen vasokonstriktiven Effekten von 20-HETE entgegenwirkt (Dakarapu et al., 2019).
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Die Vertreter der CYP2C und CYP2J Familien weisen vorrangig Epoxygenase-Aktivität auf, wodurch die EETs aus AA gebildet werden. Diese entstehen durch Epoxidation einer der vier cisständigen Doppelbindungen, wodurch die Metaboliten 5,6-, 8,9-, 11,12- und 14,15-EET gebildet werden. EETs wirken im Gegensatz zu 20-HETE vasodilatorisch, anti-inflammatorisch, inhibieren die Migration der Muskelzellen und verhindern Apoptose (Konkel und Schunck, 2011).
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All diese HETEs und EETS werden ad hoc gebildet, sobald ein Signal die Freisetzung von AA aus der Phospholipidmembran veranlasst. Die Lebensdauer der Metaboliten beträgt nur wenige Minuten. Daher stellt die selektive Herstellung dieser kurzlebigen bioaktiven HETEs und EETs sowie der adäquaten Vertreter von EPA und DHA für umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich ihrer Wirkung und auch für die Wirkstoffentwicklung eine große Herausforderungen dar.
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Im Stand der Technik ist keine zellfreie biotechnologische Herstellung von hydroxylierten und epoxidierten Lipidmediatoren aus Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure mit Pilzenzymen beschrieben.
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Im Stand der Technik kann die Epoxidierung von Fettsäuren zur Herstellung der EETs mittels chemischer Synthese z.B. mit Persäuren wie meta-Chlorperoxybenzoesäure (mCPBA) erreicht werden. Arachidonsäure muss dafür im ersten Schritt mit Diazomethan methyliert werden. Nach anschließender Extraktion erfolgt die Epoxidierung der cis-Doppelbindungen in cis-Epoxide mit mCPBA. Da diese Methode weder regio- noch enantioselektiv ist, sind aufwendige Trenn- und Reinigungsschritte erforderlich, wie z.B. chirale Chromatographie, um reine Verbindungen zu erhalten. Die Ausbeute aller Epoxide als Gemisch liegt bei max. 10 % (mg-Maßstab). Zudem kommen die begrenzte Löslichkeit, Instabilität und die damit einhergehenden anspruchsvollen Lagerbedingungen (Sudharar et al., 2010).
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Ein biologisches System für die regio- und enantioselektive Epoxidierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren stellt die Verwendung des CYP450 Enzyms BM3 aus Bacillus megaterium dar. Dabei wird AA regioselektiv zu 14,15-EET umgewandelt; DHA in 19,20-EDP (Epoxydocosapentaensäure) und EPA in 17,18-EEQ (Epoxyeicosapentaensäure). Für die Trennung der Produkte ist eine Veresterung zum Methylester erforderlich. Die erhaltenen Enantiomer-reinen Methylester werden in diesem Verfahren mit Ausbeuten von 30-50% erhalten (Cinelli et al., 2018). Diese Methode stellt eine einfache Möglichkeit gegenüber der chemischen Synthese dar, um die gewünschten Epoxymetaboliten herzustellen. Jedoch ist hierbei die Zugabe des kostspieligen Cofaktors NADPH sowie die intrazelluläre Produktion des Biokatalysators für die enzymatische Reaktion von Nöten.
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In der Literatur sind Totalsynthesen von HETEs beschrieben, allerdings sind diese oft zeitaufwendig und erfordern mehrere Stufen.
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Die Synthese von 20-HETE erfordert sieben Stufen. Ausgehend von Methyl-5-hexynoat sind dabei zwei entscheidende Schritte nötig, einerseits die Cu-vermittelte Bildung der C-C-Bindung sowie die partielle Alkin-Hydrierung. Die dabei erzielte Ausbeute vom Zielmolekül 20-HETE beträgt weniger als 1 % (Hwang et al., 2017).
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In einem chemischen Eintopf-Verfahren mit insgesamt sechs Reaktionsschritten konnte aus (-)-Benzyl-(R)-glycidylether das subterminale 16-HETE mit einer Gesamtausbeute von 28 % gebildet werden (Reddy et al., 2003).
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Neben den Synthesen solcher HETEs konnte auch die regioselektive Hydroxylierung am C-Atom in ω sowie in ω-1 Position mittels biologischer Systeme in der Literatur gezeigt werden. Dafür wurde die Hefe Starmerella bombicola verwendet. Diese enthält CYP Enzyme der CYP52 Familie (CYP52M1). Die verwendete Arachidonsäure wird dabei in einem wässrigen System in 19- und 20-HETE in Form von Sophorolipiden umgewandelt. Um den Abbau der Arachidonsäure durch β-Oxidation zu verringern, wurde die Hefe genetisch so verändert, dass das für die β-Oxidation benötigte Isoenzym MFE-2 deaktiviert ist. Dadurch erfolgt die Metabolisierung von AA vorranging in Richtung der Sophorolipid-Synthese.
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Die Freisetzung der HETEs aus den Sophorolipiden wird anschließend mittels saurer Hydrolyse in Gegenwart von Stickstoff, gefolgt von einer Extraktion, erreicht. Die Ausbeute von 19- und 20-HETE konnte mit diesem Verfahren auf ca. 20 % aller isolierten Sophorolipide gesteigert werden (van Bogaert et al., 2013).
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Zusammengefasst ist die Synthese bestimmter epoxidierter und hydroxylierter Eicosanoide wie EETs und HETEs möglich, jedoch entweder von mehrstufigen Synthesen, aufwendigen Trennprozessen, geringen Ausbeuten oder der Notwendigkeit kostenintensiver Cosubstrate begleitet.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur regio- und enantioselektiven, enzymatischen Oxyfunktionalisierung von Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren zu den entsprechenden epoxidierten und hydroxylierten Lipidmediatoren. Die Umsetzung soll dabei unter moderaten Reaktionsbedingungen mit gleichzeitigem Einsatz kostengünstiger Cosubstrate erfolgen. Die Isolation der Reaktionsprodukte soll dabei mit möglichst geringem verfahrenstechnischem Aufwand stattfinden.
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Diese Aufgabe wurde durch die Patentansprüche gelöst.
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Vorliegende Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur selektiven, enzymatischen Oxyfunktionalisierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur Herstellung von Lipidmediatoren, insbesondere der EETs und HETEs, mittels unspezifischer Peroxygenasen dar. Die Umwandlung findet in einer wässrigen Einstufen-Reaktion unter Zugabe von Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel statt. Mit diesem Verfahren können stereoselektiv Sauerstoffatome an den Positionen C3 - C22 von AA, EPA und DHA eingefügt werden.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von einfach und mehrfach oxyfunktionalisierten (hydroxylierten und/oder epoxidierten) Lipidmediatoren (Eicosanoide/Docosanoide), wobei als Ausgangstoffe die mehrfach ungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure dienen und zur regioselektiven Oxyfunktionalisierung mit einer Peroxygenase in Gegenwart eines Oxidationsmittels in einem wässrigen Medium versetzt werden.
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Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Herstellung bioaktiver epoxidierter und hydroxylierter Lipidmediatoren unter moderaten Bedingungen mit geringem verfahrenstechnischem und apparativem Aufwand in einer Einstufen-Reaktion unter Einsatz kostengünstiger Cosubstrate möglich. Weiterhin wird die Bildung unerwünschter Nebenprodukte minimiert.
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Die Grundlage des erfindungsgemäßen enzymatischen, zellfreien Verfahrens sind spezielle extrazelluläre Enzyme, die Peroxide als Cosubstrate verwenden. Es handelt sich dabei um Peroxygenasen, welche 2011 offiziell als unspezifische Peroxygenasen (UPO) mit der EC Nummer 1.11.2.1 in das Enzymnomenklatursystem aufgenommen wurden. Die Mehrheit der bisher bekannten pilzlichen UPOs gehören zu dem Unterreich der Dikarya, insbesondere aus der Abteilung der Basidiomycota und Ascomycota.
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Die für die vorliegende Erfindung bevorzugten unspezifischen Peroxygenasen stammen aus Pilzen der Ordnung Agaricales, besonders aus den Familien Psathyrellaceae, Marasmiaceae und Strophariaceae, insbesondere der Gattung Agrocybe, Broomella, Chaetomium, Psathyrella, Coprinellus und Marasmius.
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Weiterhin können solche Enzyme rekombinant in einem Wirt hergestellt werden.
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Die unspezifischen Peroxygenasen repräsentieren eine Subklasse der Peroxidasen. Sie katalysieren ähnliche Reaktionen wie die P450-Monooxygenasen, insbesondere den Einbau eines Sauerstoffatoms in das Substrat in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels, vorzugsweise in gepufferten wässrigen Lösungen. Als Cosubstrat für die Oxyfunktionalisierungsreaktion wird lediglich ein Hydroperoxid (R-OOH), bevorzugter Weise Wasserstoffperoxid (H2O2) benötigt.
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Unspezifische Peroxygenasen gehören, wie CYP450-Monooxygenasen, zur Gruppe der Häm-Thiolat-Proteine und besitzen sowohl Peroxygenase- als auch Peroxidase-Eigenschaften. Diese extrazellulären Peroxygenasen katalysieren eine Vielzahl an Reaktion, wie regio- und stereoselektive Monooxygenierung, Halogenierungen, O- und N-Dealkylierungen, Epoxidierungen sowie N- und S-Oxidationen (Hofrichter et al, 2015).
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Die für das erfindungsgemäße vorliegende Verfahren bevorzugten UPOs weisen im Vergleich zu den membrangebundenen CYP-Enzymen, neben dem bevorzugtem Oxidationsmittel H2O2, weitere Vorteile auf. Durch einen hohen Grad an Glykosylierungen wird eine erhöhte Wasserlöslichkeit der Proteine erreicht. Dies hat eine hohe Stabilität zur Folge, besonders im Vergleich zu intrazellulären Mono- oder Dioxygenasen. Des Weiteren können die extrazellulären, nicht-membrangebundenen UPOs vorteilhaft bei unsterilen Bedingungen eingesetzt werden.
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Die für das vorliegende enzymatische Verfahren verwendeten UPOs werden in einer geringen Konzentration von 0,1 U mL-1 bis 10 U mL-1 eingesetzt, wobei eine Konzentration zwischen 2 und 7 U mL-1 für die Oxyfunktionalisierung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren AA, EPA und DHA optimal ist (1 Unit setzt 1 pmol ABTS pro Minute um).
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Die Konzentration des Substrates liegt im vorliegenden Verfahren zwischen 0,1 und 10 mM, wobei zwischen 0,2 und 5 mM, besonders zwischen 0,5 und 2 mM bevorzugt wird.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in wässrigen, gepufferten Lösungen durchgeführt. Dem Reaktionsgemisch können hierbei zur Stabilisierung des pH-Wertes Puffer wie Phosphate oder organische Säuren, vorzugsweise Zitronensäure, zugesetzt werden. Die Pufferkonzentration liegt dabei bevorzugt zwischen 1 mM bis 100 mM, insbesondere zwischen 10 bis 20 mM. Das Reaktionsverfahren wird bei pH-Werten von 3 bis 10, vorzugsweise bei 5 bis 8, insbesondere bei pH 7 durchgeführt.
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Zur Verbesserung der Löslichkeit des Substrates können dem Reaktionsgemisch organische Lösungsmittel zugesetzt werden. Bevorzugt sind dabei mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie Alkohole, Aceton und Acetonitril. Die Konzentration des Lösungsmittels liegt dabei in den Bereichen von 1-90 % (v/v), besonders bevorzugt von 2-50 % (v/v), insbesondere von 5-30 % (v/v).
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Als Oxidationsmittel wird vorzugsweise Wasserstoffperoxid (H2O2) verwendet. Dadurch kann im vorliegenden Verfahren auf kostenintensive Cosubtrate, wie NADH oder NADPH als Elektronendonor, verzichtet werden. Zusätzliche Elektronen-Transportproteine und regulatorischen Proteine (Flavin-Reduktasen, Ferredoxine), wie im P450-System, werden nicht benötigt.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren kann das Cosubstrat einmalig, stufenweise oder kontinuierlich dosiert werden. Die dosierte H2O2-Konzentration liegt dabei zwischen 0,1 und 20 mM pro Stunde, bevorzugt zwischen 0,5 mM und 5 mM, ganz besonders zwischen 1-3 mM pro Stunde.
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Alternativ können organische Hydroperoxide (R-OOH, z. B. tert-Butylhydroperoxid), Peroxycarbonsäuren (R-CO-OOH, z. B. meta-Chlorperbenzoesäure) oder Wasserstoffperoxid-Addukte (z. B. Carbamidperoxid) eingesetzt werden.
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Die Verwendung von UPOs ermöglicht eine Ausführungsform bei Normaldruck und Temperaturen von 4-40°C, besonders bei 15-35°C, insbesondere bei 20-30°C.
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Die enzymatische Umsetzung ist in der Regel innerhalb von 5 Stunden beendet, bevorzugt innerhalb von 30 Minuten bis 4 Stunden, besonders bevorzugt in 1 bis 3 Stunden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer Einstufen-Reaktion durchgeführt und die erhaltenen Produkte gegebenenfalls gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Filtration, Destillation, Rektifikation, Chromatographie, Behandlung mit Ionenaustauschern, Adsorbentien oder Kristallisation. Bevorzugt werden die Produkte mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion und chromatographischer Trennverfahren isoliert und gereinigt.
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Mit den Peroxygenase-katalysierten Reaktionen ist es möglich, hydroxylierte und epoxidierte Lipidmediatoren, insbesondere der EETs und HETEs, in einer Einstufen-Reaktion, unter Verwendung lediglich eines Peroxids als Cosubstrat, zu gewinnen. Die Erfindung soll nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele und Abbildungen näher erläutert werden, ohne jedoch die Erfindung auf diese Beispiele und Abbildungen zu begrenzen.
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1
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Für die enzymatische Synthese von 14,15-EET wurden in einem 1-mL-Ansatz 300 µg Arachidonsäure (1 pmol, final 1 mM) in 200 µL 100 mM Zitrat-Phosphat-Puffer (pH 7.0, final 20 mM), 480 µL Wasser und 200 µL Aceton (final 20 % (v/v)) gelöst. Zu der Suspension wurden 20 mg Glucose und 100 µL (20 U mL-1; final 2 U) der unspezifischen Peroxygenase aus Broomella sp. BspUPO (Units = pmol min-1 bezogen auf die Oxidation von ABTS (2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)) gegeben. Durch die Zugabe von 20 µL Glucose-Oxidase (2 U ml-1; final 0,04 U) wurde die Reaktion gestartet und das Gemisch wurde bei 30°C und 800 rpm gerührt. Die Reaktionszeit betrug 2 Stunden. Um die Produkte zu isolieren und zu analysieren, wurde der Reaktionsansatz mit der äquivalenten Menge an eiskaltem Acetonitril gemischt und dadurch die enzymatische Reaktion gestoppt. Das Gemisch wurde anschließend zentrifugiert (17,000 g, 20 min, 4°C) und jeweils 100 µL der organischen Phase in ein HPLC-Reaktionsgefäß überführt. Die Analyse der Metaboliten erfolgte mittels HPLC-DAD/ELSD sowie LC-MS/MS. Als Hauptprodukt der Reaktion wurde 14,15-EET mit einer Ausbeute von 95% erhalten ( ). Der Metabolit wurde anhand authentischer Standards über Retentionszeiten sowie des zugehörigen Massenspektrums identifiziert.
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Beispiel 2
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Für die enzymatische Synthese der hydroxylierten Metaboliten 18- und 19-HETE wurden in einem 1-mL-Ansatz 300 µg Arachidonsäure (1µmol, final 1mM) in 200 µL 100 mM Zitrat-Phosphat-Puffer (pH 7.0, final 20 mM), 480 µl Wasser und 200 µL Aceton (final 20 % (v/v)) gelöst. Zu der Suspension wurden 20 mg Glucose und 100 µL (20 U mL-1; final 2 U) der unspezifischen Peroxygenase aus Coprinellus sp. CspUPO (Units = µmol min-1 bezogen auf die Oxidation von ABTS (2,2'-Azinodi(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)) gegeben. Durch die Zugabe von 20 µL Glucose-Oxidase (2 U ml-1; final 0,04 U) wurde die Reaktion gestartet und das Gemisch wurde bei 30°C und 800 rpm gerührt. Die Reaktionszeit betrug 3 Stunden. Um die Produkte zu isolieren und zu analysieren, wurde der Reaktionsansatz mit der äquivalenten Menge an eiskaltem Acetonitril gemischt und dadurch die enzymatische Reaktion gestoppt. Das Gemisch wurde anschließend zentrifugiert (17,000 g, 20 min, 4°C) und jeweils 100 µL der organischen Phase in ein HPLC-Reaktionsgefäß überführt. Die Analyse der Metaboliten erfolgte mittels HPLC-DAD/ELSD sowie LC-MS/MS. Als Hauptprodukte der Reaktion wurden 42% 18- und 53% 19-HETE erhalten ( ). Die Metabolite wurden anhand authentischer Standards über Retentionszeiten sowie des zugehörigen Massenspektrums identifiziert.
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Figurenliste
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- zeigt die Biosynthese von CYP-gebildeten HETEs und EETs aus Arachidonsäure durch die Enzyme der Cytochrom P450 Enzyme (CYPs). Dabei werden einerseits Epoxide an den Positionen C5-6, C8-9, C11-12 und C14-15 durch CYPs gebildet, aber auch terminale sowie subterminale Hydroxylierungen an den Positionen C16-C20.
- zeigt die Enzym-katalysierte Umwandlung von ARA durch BacUPO. AA (•) wird in vitro durch die unspezifische Peroxygenase von Broomella sp. zu 14,15-EET (■) umgewandelt. 2 UABTS/mL BspUPO wandeln 300 µg AA nach ca. 1,5 h zu 95% zu dem Hauptmetabioliten 14,15-EET um.
- zeigt die Enzym-katalysierte Umwandlung von ARA durch CspUPO. AA (•) wird in vitro durch die unspezifische Peroxygenase von Coprinellus sp. zu 18- (■) und 19-HETE (▲) umgewandelt. 2 UABTS/mL CspUPO wandeln 300 µg AA nach ca. 3 h zu 53% 19-HETE und zu 42% 18-HETE um.
