DE102021214582A1 - Verfahren zur zellfreien Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen und deren Verwendung - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur zellfreien Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen aus Pilzen und/oder genetischen Varianten davon, unter Einsatz von eukaryontischen Zelllysaten, vorzugsweise aus Pilzen, insbesondere filamentösen Pilzen, und deren Verwendung als Biokatalysatoren in oxyfunktionalisierenden Reaktionen.

Description

  • Gegenstand der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur zellfreien Herstellung von maßgeschneiderten unspezifischen Peroxygenasen aus Pilzen und/oder Varianten davon unter Einsatz eukaryontischer Zelllysate, vorzugsweise von Pilzen, insbesondere filamentöser Pilze, und deren Verwendung als Biokatalysatoren in oxyfunktionalen Reaktionen.
  • Stand der Technik
  • Es besteht ein erhebliches Interesse an Herstellungsverfahren für unspezifische Peroxygenasen (UPOs, EC 1.11.2.1), um diese effektiv als Biokatalysatoren für die pharmazeutische und chemische Industrie einsetzen zu können.
  • UPOs gehören zu den Häm-Thiolat-Proteinen und katalysieren selektiv Sauerstofftransferreaktionen von Hydroperoxiden (bevorzugt Wasserstoffperoxid) in organische Moleküle, u.a. nicht-aktivierte Kohlenwasserstoffe und erzeugen dabei u.a. Hydroxylierungen und Epoxidierungen. Die klassische Chloroperoxidase aus Leptoxyphium fumago gehört ebenfalls in diese Proteinfamilie. Die Mehrheit der bisher bekannten pilzlichen UPOs gehören zu dem Unterreich der Dikarya, insbesondere aus der Abteilung der Basidiomycota und Ascomycota.
  • Dabei arbeiten UPOs im Vergleich zu anderen Sauerstofftransfer-katalysierenden Enzymen unabhängig von Elektronendonatoren, Transportproteinen und zusätzlichen Cofaktoren.
  • Eine Auswahl von UPOs konnte bereits für die Umwandlung verschiedener Pharmazeutika und zur Synthese von Fein- und Spezialchemikalien eingesetzt werden (Hofrichter et al., 2020, Kiebist et al., 2019). Jedoch gibt es eine große Diskrepanz zwischen der Anzahl an tatsächlich herstellbaren UPOs und der Anzahl an bioinformatisch annotierten putativen UPO-Genen aus Genomsequenzierungen. Daraus leitet sich ab, dass es noch keinen zuverlässigen Zugang zu dem vollen Spektrum an UPOkatalysierten Reaktionen gibt.
  • Im Stand der Technik ist keine zellfreie biotechnologische Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen unter Nutzung eukaryontischer Zelllysate, z.B. von Pilzen, beschrieben.
  • Im Stand der Technik erfolgt die Synthese von UPOs homolog oder heterolog. Die erste UPO wurde 2004 im Südlichen Ackerling (Agrocybe aegerita) entdeckt (Ullrich et al., 2004). Weitere UPOs konnten seither u.a. aus Coprinellus radians, Marasmius rotula, Chaetomium globosum und Marasmius wettsteinii isoliert werden. Die Ausbeuten lagen zwischen 10 und 450 mg Protein/L.
  • EP2468852B1 beschreibt die Isolierung eines Polypeptids mit Peroxygenase-Aktivität, jedoch unter Verwendung von intakten Wirtszellen.
  • WO2016207373A1 beschreibt Polypeptide mit Peroxygenase-Aktivität und deren Herstellung, jedoch nicht im zellfreien Produktionssystem.
  • Im Stand der Technik ist nachteilig, dass trotz bioinformatisch identifizierter UPO-Gene im pilzlichen Genom, selten die Expression und Isolierung der entsprechenden Enzyme möglich ist. Daher können putative UPOs durch homologe Herstellung nicht in ausreichender Ausbeute und Vielfalt produziert werden.
  • Im Stand der Technik wurde die heterologe Herstellung von UPOs erstmals 2014 für AaeUPO in Saccharomyces cerevisiae beschrieben und später als Tandem-Expressionssystem mit Pichia pastoris erweitert (Molina-Espeja et al., 2015).
  • WO2017081355A1 beschreibt Polypeptide mit Peroxygenase-Aktivität und deren heterologe Herstellung, jedoch nicht im zellfreien System.
  • Die erste heterologe Expression von UPOs im bakteriellen System gelang 2018 mit MroUPO in Escherichia coli. Nachfolgend konnten einige Varianten und weitere UPOs wie Collariella virescens UPO exprimiert werden.
  • EP3594332A1 beschreibt ein Verfahren zur heterologen Expression aktiver Peroxygenase aus Pilzen und/oder Varianten in bakteriellen Zellen, vorzugsweise Escherichia coli, jedoch nicht im zellfreien System.
  • Im Stand der Technik zur heterologen Expression in eukaryontischen Zellsystemen ist nachteilig, dass es bis zu einer erfolgreichen Expression einer UPO und deren Anpassung zumeist Jahre dauert. Die Ausbeuten liegen bei etwa 300 mg Protein/L. Seit der erstmaligen Beschreibung 2014 konnte lediglich eine UPO sowie deren Varianten produziert werden.
  • Die heterologe Expression in prokaryontischen Zellsystemen erweist sich bislang als universell einsetzbar und ist ebenfalls für Mutationen geeignet. Jedoch liegen die Ausbeuten im unteren zweistelligen mg/L Bereich.
  • Die Erfindung stellt sich die Aufgabe selektierte UPOs zellfrei herzustellen und auf diese Weise ausgewählte neue oxyfunktionalisierende Biokatalysatoren bereitzustellen.
  • Besonders effektiv können die Biokatalysatoren in der pharmazeutischen Industrie (zur Synthese von Wirkstoffen und Wirkstoffmetaboliten) und chemischen Industrie (zur Synthese von z.T. chiralen Spezial- und Feinchemikalien) sowie in neuen Sensortechnologien eingesetzt werden.
  • Diese gestellte Aufgabe wird durch mindestens einen Patentanspruch gelöst.
  • Vorliegende Erfindung
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur zellfreien Herstellung von maßgeschneiderten unspezifischen Peroxygenasen aus Pilzen und/oder Varianten davon unter Einsatz eukaryontischer Zelllysate, vorzugsweise von Pilzen, insbesondere filamentöser Pilze, und deren Verwendung als Biokatalysatoren in oxyfunktionalen Reaktionen.
  • Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Herstellung ausgewählter schwer exprimierbarer unspezifischer Peroxygenasen in aktiver Form mit geringem verfahrenstechnischem und apparativem Aufwand in einem Batch- oder Dialyseverfahren möglich.
  • Die Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet die zellfreie Proteinsynthese mit eukaryontischen Lysaten. Die zellfreie Proteinsynthese hat sich als effiziente Alternative zur Proteinexpression in vivo etabliert. Die für die Proteinsynthese notwendigen hochmolekularen Komponenten aus Zellen werden dabei durch Zellextrakte gewonnen und mit niedermolekularen Komponenten wie Aminosäuren, energiereiche Triphosphate (ATP, GTP) und verschiedenen Ionen versetzt. Die endogene mRNA wird durch unterschiedliche Verfahren entfernt und durch Zugabe exogener mRNA das spezifische Zielprotein synthetisiert.
  • Die Vorteile dieser Methodik liegen in der Herstellungsgeschwindigkeit spezifischer Proteine, der hohe Durchsatz, die Variabilität in Bezug auf Sequenzmodifikationen (Protein Engineering) und die Möglichkeit zur Zugabe exogener Komponenten wie z.B. Hämin. Zudem wird die Herstellung von potentiell cyotoxischen Proteinen ermöglicht sowie eine effiziente Markierung von Proteinen erleichtert.
  • Methodisch kommen bei der zellfreien Proteinsynthese zwei Verfahren zum Einsatz. In Batch-Systemen findet die Proteinsynthese in einem abgeschlossenen System statt, in welchem sich alle notwendigen Komponenten befinden. Eine kontinuierliche Zufuhr oder Entnahme von Komponenten ist nicht möglich, sodass die Synthese nach Verbrauch der Komponenten zum Erliegen kommt. Im Dialyse-Verfahren ist eine ständige Zufuhr von Edukten und Abfuhr von Produkten möglich, wodurch die Syntheseleistung über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten wird.
  • Verschiedene Translationssysteme wurden sowohl aus prokaryontischen Organismen wie Lysate von Escherichia coli als auch eukaryontischen Organismen wie Weizenkeimlysate, Kaninchen-Retikoluzytenlysate, Insektenzelllysate und CHO-Zelllysate (engl. Chinese Hamster Ovary) entwickelt.
  • Das eingesetzte eukaryontische Lysat ist nicht beschränkt, so lange es alle zur in vitro Translation der exogenen Nukleinsäurematrize notwendigen Komponenten zur Synthese einer unspezifischen Peroxygenase enthält.
  • Die für die vorliegende Erfindung bevorzugten eukaryontischen Lysate stammen von Pilzen, vorzugsweise filamentösen Pilze, besonders bevorzugt von Aspergillus spp. und Neurospora spp., insbesondere Aspergillus niger und Neurospora crassa.
  • In der speziellen Ausführungsform stammen die eingesetzten Pilzzelllysate aus Aspergillus niger und Neurospora crassa. Die Organsimen werden in Flüssigkulturen kultiviert, vorzugsweise zwischen 50 mL und 30 L, besonders bevorzugt zwischen 100 mL und 1 L, insbesondere in 200 mL Medium.
  • Das Kultivierungsmedium setzt sich aus Glukose und Hefeextrakt zusammen, bevorzugt zwischen jeweils 5 und 50 g/L, im Fall von Neurospora crassa besonders bevorzugt bei 10 g/L, im Fall von Aspergillus niger besonders bevorzugt bei 20 g/L.
  • Die Kultivierungstemperatur der filamentösen Pilze liegt bevorzugt zwischen 10°C und 50°C, besonders bevorzugt zwischen 20°C und 40°C, insbesondere bei 34°C für Neurospora crassa und 30°C für Aspergillus niger.
  • Die Kultivierungszeit liegt bevorzugt zwischen 6 h und 96 h, besonders bevorzugt zwischen 12 h und 60 h, insbesondere bei 48 h für Neurospora crassa und 24 h für Aspergillus niger. Die erzeugte Biomasse kann mit verschiedenen Methoden aufgeschlossen werden. In der speziellen Ausführungsform wurde der Aufschluss mittels Hochdruckzelle durchgeführt.
  • Das jeweilige Mycel wird nach der Ernte durch filtrieren und mehrmaligem Waschen mit Mannitol-Puffer in Lysepuffer suspendiert. Der Aufschluss des Mycels erfolgt bei Temperaturen um die 4°C mittels Hochdruckzellaufschluss bei Drücken zwischen 1.000 und 20.000 psi, bevorzugt bei 5.000 psi für Neurospora crassa und 10.000 psi für Aspergillus niger. Das aufgeschlossene Mycel wird vor dem Einsatz mehrfach bei 5.000- 10.000 g (vorzugsweise 6.500 g) zentrifugiert.
  • Die endogene mRNA des Rohlysats kann mit verschiedenen Methoden entfernt werden. Im speziellen Ausführungsbeispiel wurde eine Micrococcale Nuklease eingesetzt.
  • Das Nukleinsäure-Templat, welches die unspezifische Peroxygenase kodiert, kann aus DNA oder RNA bestehen und in linearer oder zyklischer Form vorliegen. Dabei kann die eingesetzte Sequenz vom Wild-Typ sein oder gezielte oder randomisierte Mutationen enthalten sowie in Form von Chimären eingesetzt werden. Die protein-kodierenden Nukleinsäuren sind aus Sequenzierungsstudien bekannt und werden kontinuierlich erweitert, sodass für selektierte UPOs geeignete Expressionskonstrukte mit entsprechenden Promotoren und regulatorischen Sequenzen konstruiert und flexibel variiert werden können. Die Identifizierung der UPO-Gene erfolgt durch konservierte Aminosäuren im Bereich der proximalen Hämbindenden Umgebung im UPO-Protein. Das Motiv GPCPG-EGD- ist dabei typisch für lange basidomycetale UPOs und das Motiv xxCPx-EHD eher typisch für kurze UPOs, wie zum Beispiel die ascomycetale UPO von Chaetomium globosum (Hofrichter et al. 2015, Kiebist et al., 2017).
  • Der Reaktionsansatz zur zellfreien Synthese von UPOs enthält erfindungsgemäß neben dem eukaryontischen Zelllysat und dem gewählten Nukleinsäure-Templat weitere niedermolekulare Komponenten wie Aminosäuren und energiereiche Triphosphate (ATP, GTP). Zudem können weitere für die Synthese oder Proteinstabilität notwendigen Zusätze wie Hämin oder Detergenzien enthalten sein. Die Reaktionsansätze können sowohl im Batch- als auch im Dialyse-Verfahren durchgeführt werden. Die Reaktionssätze können zwischen 30 min und 48 h durchgeführt werden (vorzugsweise 4 h).
  • Die zellfrei hergestellten Peroxygenasen können gereinigt oder ungereinigt im Gesamtreaktionsansatz in Einzel- bis Hochdurchsatz-Screenings mit Substraten eingesetzt werden, die relevant sind z.B. für die pharmazeutische und chemische Industrie.
  • Die zellfrei hergestellten Proteine können mit bekannten proteinchemischen Verfahren wie hydrophobe Interaktionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie oder mit speziellen Tags über Affinitätschromatographie isoliert und gereinigt werden.
  • UPOs katalysieren ähnliche Reaktionen wie die P450-Monooxygenasen, insbesondere den Einbau eines Sauerstoffatoms in das Substrat in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels, vorzugsweise in gepufferten wässrigen Lösungen. Die katalysierten Reaktionen umfassen Sauerstofftransferreaktion von Hydroperoxiden in organische Moleküle vom Kohlenwassertofftyp bestehend aus aromatischen, aliphatischen, linearen, zyklischen, und verzweigten Kohlenwasserstoffen sowie Strukturanaloga. Bevorzugt sind Verfahren zur Hydroxylierung und Epoxidierung, um Produkte mit verbesserten oder gewünschten Eigenschaften zu erhalten, wie die Synthese von Agrochemikalien, Herbiziden, Insektiziden, Medikamenten, Kosmetika, Klebstoffe, Farbstoffe.
  • Als Cosubstrat für die Oxyfunktionalisierungsreaktion wird lediglich ein Hydroperoxid (R-OOH), bevorzugter Weise Wasserstoffperoxid (H2O2) benötigt.
  • Die durch das vorliegende Verfahren hergestellten UPOs werden in einer geringen Konzentration von 0,01 U mL-1 bis 10 U mL-1 eingesetzt, wobei eine Konzentration zwischen 1 und 5 U mL-1 für die Oxyfunktionalisierung von organischen Verbindungen optimal ist (1 Unit setzt 1 pmol Veratrylalkohol pro Minute um) .
  • Die Konzentration des Substrates liegt im vorliegenden Verfahren zwischen 0,1 und 10 mM, wobei zwischen 0,2 und 5 mM, besonders zwischen 0,5 und 2 mM bevorzugt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in wässrigen, gepufferten Lösungen durchgeführt. Dem Reaktionsgemisch können hierbei zur Stabilisierung des pH-Wertes Puffer wie Phosphate oder organische Säuren, vorzugsweise Zitronensäure, zugesetzt werden. Die Pufferkonzentration liegt dabei bevorzugt zwischen 1 mM bis 100 mM, insbesondere zwischen 10 bis 20 mM. Das Reaktionsverfahren wird bei pH-Werten von 3 bis 10, vorzugsweise bei 5 bis 8, insbesondere bei pH 7 durchgeführt.
  • Zur Verbesserung der Löslichkeit des Substrates können dem Reaktionsgemisch organische Lösungsmittel zugesetzt werden. Bevorzugt sind dabei mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie Alkohole, Aceton und Acetonitril. Die Konzentration des Lösungsmittels liegt dabei in den Bereichen von 1-90 % (v/v), besonders bevorzugt von 2-50 % (v/v), insbesondere von 5-30 % (v/v) .
  • Als Oxidationsmittel wird vorzugsweise Wasserstoffperoxid (H2O2) verwendet. Dadurch kann im vorliegenden Verfahren auf kostenintensive Cosubtrate, wie NADH oder NADPH als Elektronendonor, verzichtet werden. Zusätzliche Elektronen-Transportproteine und regulatorischen Proteine (Flavin-Reduktasen, Ferredoxine), wie im P450-System, werden nicht benötigt.
  • In Reaktionen mit durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten UPOs kann das Cosubstrat einmalig, stufenweise oder kontinuierlich dosiert werden. Die dosierte H2O2-Konzentration liegt dabei zwischen 0,1 und 20 mM pro Stunde, bevorzugt zwischen 0,5 mM und 5 mM, ganz besonders zwischen 1-3 mM pro Stunde.
  • Alternativ können organische Hydroperoxide (R-OOH, z. B. tert-Butylhydroperoxid), Peroxycarbonsäuren (R-CO-OOH, z. B. meta-Chlorperbenzoesäure) oder Wasserstoffperoxid-Addukte (z. B. Carbamidperoxid) eingesetzt werden.
  • Die Verwendung von UPOs ermöglicht eine Ausführungsform bei Normaldruck und Temperaturen von 4-40°C, besonders bei 15-35°C, insbesondere bei 20-30°C.
  • Die enzymatische Umsetzung ist in der Regel innerhalb von 24 Stunden beendet, bevorzugt innerhalb von 5 Minuten bis 4 Stunden, besonders bevorzugt in 30 Minuten bis 3 Stunden.
  • Reaktionen mit durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten UPOs können in einer Einstufen-Reaktion durchgeführt und die erhaltenen Produkte gegebenenfalls gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Filtration, Destillation, Rektifikation, Chromatographie, Behandlung mit Ionenaustauschern, Adsorbentien oder Kristallisation.
  • Bevorzugt werden die Produkte mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion und chromatographischer Trennverfahren isoliert und gereinigt.
  • Die Erfindung soll nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele und Abbildungen näher erläutert werden, ohne jedoch die Erfindung auf diese Beispiele und Abbildungen zu begrenzen.
  • Ausführungsbeispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlicher unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert.
  • Bezugsbeispiel 1 - Herstellung der Zellextrakte
  • 1) Kultivierung der Pilze
  • Beispiel 1 Aspergillus niger
  • Die Kultivierung von Aspergillus niger (DSM 11167) erfolgte in 500 mL Erlenmeyerkolben, die jeweils 100 mL 2HA-MS Medium (nach Nieland et al, 2021; jedoch ohne Antischaummittel) enthielten. Nach der Inokulation mit je einem Tropfen Sporensuspension (3*108 Sporen/mL Glycerol) wurden die Kolben auf dem Rotationsschüttler bei 30 °C für 24 h bei 150 rpm inkubiert.
  • Beispiel 2 Neurospora crassa
  • Die Kultivierung von Neurospora crassa (DSM 1257) erfolgte in 500 mL Erlenmeyerkolben, die jeweils 200 mL HA-Vollmedium (Nieland und Stahmann, 2013; 10 g/L Glukose und 10 g/L Hefeextrakt) enthielten. Nach der Inokulation mit je einem Tropfen Sporensuspension (107 Sporen/mL Glycerol) wurden die Kolben auf dem Rotationsschüttler bei 34 °C für 48 h bei 120 rpm inkubiert.
  • 2) Herstellung der Zellextrakte für die zellfreie Proteinsynthese
  • Beispiel 1 Aspergillus niger
  • Geerntet wurde das, wie unter (1) kultivierte, Mycel durch Abnutschen mit einem Büchnertrichter (bestückt mit VWR Filterpapier 413) und zweimaligem Waschen mit jeweils 50 mL 4 °C kaltem Mannitolpuffer A (Hodgman und Jewett, 2013). Aus 200 ml Medium wurden von A. niger 5,14 g Biomasse (Frischgewicht) geerntet. Hiernach wurde das Mycel jeweils mit 1,5 mL Lysispuffer A (Hodgman und Jewett, 2013) pro g Frischgewicht suspendiert und anschließend bei 4 °C mittels Hochdruckzellaufschluss (HTU Digi-F-Press, Hersteller G. Heinemann Ultraschall- und Labortechnik) mit 10.000 psi aufgeschlossen. Bei allen Schritten wurde möglichst zügig und so weit wie möglich auf Eis gearbeitet. Das aufgeschlossene Mycel wurde bei 4 °C und 6500 g für 5 Minuten zentrifugiert. Mit dem Überstand wurde erneut auf die gleiche Weise verfahren.
  • Zur Entfernung der endogenen mRNA aus dem Überstand erfolgte anschließend eine Vorbehandlung des Rohlysates bei Zimmertemperatur für 10 min mit Micrococcal Nuclease (Thermo Scientific) in Anlehnung an Hodgman und Jewett, 2013. Das so behandelte Lysat kann aliquotiert mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert werden.
  • Beispiel 2 Neurospora crassa
  • Geerntet wurde das, wie unter (1) kultivierte, Mycel durch Abnutschen mit einem Büchnertrichter (bestückt mit VWR Filterpapier 417) und zweimaligem Waschen mit jeweils 50 mL 4 °C kaltem Mannitolpuffer A (Hodgman und Jewett, 2013). Aus 200 mL Medium wurden von N. crassa 6 g Biomasse (Frischgewicht) geerntet. Hiernach wurde das Mycel jeweils mit 1,5 mL Lysispuffer A (Hodgman und Jewett, 2013) pro g Frischgewicht resuspendiert und anschließend bei 4 °C mittels Hochdruckzellaufschluss (HTU Digi-F-Press, Hersteller G. Heinemann Ultraschall- und Labortechnik) mit 5.000 Psi aufgeschlossen. Das weitere Vorgehen erfolgte analog zu Beispiel 1 Aspergillus niger.
  • Bezugsbeispiel 2 - Herstellung von Nukleinsäurematrize
  • Beispiel 1 Herstellung von mRNA AaeUPO-His
  • 1) Herstellung einer DNA-Matrize für die in vitro Transkription
  • Es wurde ein Plasmid generiert, das aus dem pYES2-Vektor und der Saccharomyces cerevisiae-Codon optimierten Sequenz für die Wildtyp-UPO AaeUPO mit Signal- und Propeptid und einem C-terminalen His6-Tag (synthetisiert von GeneArt) besteht. Upstream vom AaeUPO-Gen befindet sich ein Promotor für die T7 RNA Polymerase. Für die Run-off Transkription wurde das Plasmid mit der Restriktionsendonuclease BstEII linearisiert und anschließend mittels Chromatographie gereinigt.
  • 2) In vitro Transkription
  • Das im obigen Abschnitt (1) hergestellte DNA-Fragment mit T7-Promotor und AaeUPO His-Gen wurde als Matrize in einer in vitro Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs mit dem HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit (with tailing) durchgeführt.
  • Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt.
  • Auf diese Art wurden 26 µg 5'-gecappte, polyadenylierte AaeUPO-His mRNA erhalten, verifiziert durch Extinktionsmessung bei 260 nm.
  • Beispiel 2 Herstellung von mRNA AaeUPO PaDa-I-His
  • 1) Herstellung einer DNA-Matrize für die in vitro Transkription
  • Es wurde ein Plasmid generiert, das aus dem pYES-DEST52-Vektor und der Saccharomyces cerevisiae-Codon optimierten Sequenz für die UPO-Mutante AaeUPO PaDa-I mit Signal- und Propeptid (Molina-Espeja et al., 2015; synthetisiert von GeneArt) besteht. Upstream vom AaeUPO PaDa-I-Gen befindet sich ein Promotor für die T7 RNA Polymerase. Mittels PCR (98°C, 10 s, 63°C, 20 s und 72°C, 35 s über 30 Zyklen) wurde eine AaeUPO PaDa-I-Variante mit C-terminalen His6-Tag unter Verwendung des zuvor genannten Plasmids, eines Primers (T7-PaDa_fw) mit einer in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Basensequenz und eines Primers (6HisPaDa_rev) mit einer in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Basensequenz hergestellt. Das DNA-Fragment wurde mittels Chromatographie gereinigt.
  • 2) In vitro Transkription und Polyadenylierung
  • Das im obigen Abschnitt (1) hergestellte DNA-Fragment mit T7-Promotor und AaeUPO PaDa-I-His-Gen wurde als Matrize in einer in vitro Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs mit dem HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit durchgeführt. Die Transkriptionsreaktion wurde 2,5 h lang bei 37 °C inkubiert.
  • Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt.
  • Für die Polyadenylierung am 3'-Ende der zuvor beschriebenen RNA wurden nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs E. coli Poly (A) Polymerase, 1x E. coli Poly(A) Polymerase Reaktionspuffers, 1 mM ATP und 53 µg der AaeUPO PaDa-I-His RNA verwendet. Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt. Auf diese Art wurden 73 µg polyadenylierte AaeUPO PaDa-I-His mRNA erhalten, verifiziert durch Extinktionsmessung bei 260 nm.
  • Bezugsbeispiel 3 - Herstellung von UPO im zellfreien System
  • Für die zellfreie Herstellung von UPO wurden die nach Bezugsbeispiel 1 Beispiel 1 Aspergillus niger und Beispiel 2 Neurospora crassa gefertigten Zellextrakte, die nach Bezugsbeispiel 2 Beispiel 1 5'-Cap/ Poly(A) AaeUPO-His und Beispiel 2 Poly(A) AaeUPO PaDa-I-His gefertigten mRNAs und Poly(A) AaeUPO PaDa-I mRNA ohne C-terminalen His6-Tag verwendet. Für die letztgenannte mRNA wurde das in Bezugsbeispiel 2 (1) aufgeführte Plasmid mit der Restriktionsendonuclease PmeI für run-off Transkription linearisiert und gereinigt. Die anschließende in vitro Transkription und Polyadenylierung wurde wie in Bezugsbeispiel 2 Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
  • [Zusammensetzung der zellfreien Translationsreaktionen]
    • - 25 % Translationsmix, bestehend aus: Energiemix (80 mM HEPES; 4 mM ATP; 0,4 mM GTP; 8 mM DTT; 80 mM Kreatinphosphat); 200 mM Kaliumacetat; 4,8 mM Magnesiumacetat; 0,24 mg/ml tRNA aus Hefe; Aminosäuremischung (jede Aminosäure 0,08 mM); 0,24 U/µl Kreatinphosphokinase; 3 U/µl RNase Inhibitor (Hersteller applied biosystems)
    • - 12,5 ng/µl mRNA
    • - 50 % Zellextrakt
    • - DEPC-behandeltes Wasser (Hersteller Carl Roth)
  • Die Inkubation erfolgte bei 18°C für 270 min.
  • Experimentelles Beispiel
  • Die Herstellung der Wildtyp-UPO AaeUPO und der UPO-Mutante AaeUPO PaDa-I mit His6-Tag nach Bezugsbeispiel 3 wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließendem Western Blot nachgewiesen. Die Proteinkonzentrationen in den Translationsreaktionen ohne mRNA, mit Poly(A) AaeUPO PaDa-I-His mRNA beziehungsweise Poly(A) AaeUPO PaDa-I mRNA ohne C-terminalen His6-Tag wurden mittels BCA-Assay bestimmt. Von jedem Reaktionsansatz wurden 20 µg Protein auf ein 10 %-iges BisTris-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit einem MES-Puffer durchgeführt. In einem Semidry Blot Verfahren wurden die Proteine auf eine PVDF Membran transferiert. Der Primärantikörper gegen den His6-Tag war ein monoklonaler Maus 6x-His Tag Antikörper vom Hersteller Invitrogen. Die Detektion erfolgte über einen anti-Maus Sekundärantikörper, an den eine Meerrettichperoxidase gekoppelt war, deren katalytische Aktivität ein Chemilumineszenzsignal generiert ( ).
  • Bezugsbeispiel 4 - Oxyfunktionalisierung von Propranolol
  • Die selektive Oxyfunktionalisierung von Propranolol zu 5-Hydroxypropranolol (5-OHP) erfolgte mit zellfrei hergestellter UPO ( ). Für die enzymatische Synthese von 5-OHP wurden in einem 200 µL-Ansatz 20 µL Reaktionsmedium der zellfreien UPO-Synthese in 180 µL Reaktionslösung gegeben. Die Reaktionslösung enthielt folgende Komponenten: 800 µM Propranolol (Hydrochlorid), 1 mM Wasserstoffperoxid, 5 mM Ascorbat und 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0). Das Reaktionsgemisch wurde für 5 min bei 25°C und 800 rpm im Thermoschüttler inkubiert. Nachfolgend wurden die Reaktionsansätze durch Zugabe von 200 µl Acetonitril (-20°C) abgestoppt und für 10 min zentrifugiert. Die Überstände wurden mittels HPLC-MS und den folgenden Bedingungen analysiert:
    • Die chromatografische Trennung für die LC-MS-Experimente erfolgte mit einem Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC-System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit einer Kinetex®-Säule (C18, 5 µm, 100 Å, 150 × 2,1 mm, Phenomenex). Das Injektionsvolumen betrug 1 µL und die Säule wurde bei einer Flussrate von 0,5 mL/min und 40 °C mit zwei mobilen Phasen A (diH2O, 0,1 % Ameisensäure) und B (Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) und folgendem Gradienten eluiert: 0 min 10 % B; 1 min, 10 % B; 6 min, 80 % B; 7 min, 80 % B; 7.1 min, 10 % B; 10 min, 10 % B.
  • MS- und MS2-Spektren wurden mit einem Thermo Scientific Q Exactive Plus Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Electron, Waltham, MA, USA), das mit einer beheizten Elektrospray-Ionisationsquelle im positiven Modus ([M+H]+) gekoppelt ist, aufgenommen. Die Betriebsparameter waren wie folgt: Die Durchflussrate des Mantelgases und des Hilfsgases betrug 60 bzw. 15 (willkürliche Einheit); die Sprühspannung 4,0 kV; die Temperatur der Kapillare und des Hilfsgasheizers betrug 320 °C bzw. 400 °C; das hochauflösende MS wurde im Full-Scan-Modus mit einem Massenbereich von m/z 150-1.500 bei einer Auflösung von 70.000 (m/z 200) betrieben. Die MS2-Daten mit einer Auflösung von 35.000 wurden im Modus der parallelen Reaktionsüberwachung (PRM) erhalten, ausgelöst durch eine Liste von den vorausgewählten Parentionen von Propranolol und 5-Hydroxypropranolol (C16H22NO2 + & C16H22NO3 +) . Die Kollisionsenergie lag bei CE15.
  • Die detektierten Aktivitäten der in Bezugsbeispiel 3 zellfrei hergestellten UPOs sind in dargestellt.
  • Bezugsbeispiel 5 - Substratscreening mit ungereinigter zellfrei hergestellter UPO
  • Die enzymatische Umsetzung von analytischen UPO-Substraten (Veratrylalkohol; 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid [ABTS]; 5-Nitrobenzodioxol [NBD]; Naphthalen) und Pharmazeutika (Propranolol, Diclofenac and Clopidogrel) erfolgte mit ungereinigter, zellfrei hergestellter UPO.
  • Für die Reaktionen mit den analytischen Substraten wurden in einem 200 µL-Ansatz 10 µL Reaktionsmedium der zellfreien UPO-Synthese in 190 µL Reaktionslösung gegeben. Die Reaktionslösung enthielt folgende Komponenten: 5 mM Veratrylalkohol oder 0,6 mM ABTS oder 0,5 mM NBD oder 1 mM Naphthalen, 2 mM Wasserstoffperoxid und 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0 oder pH 4,5 bei ABTS). Die gebildeten Produkte aus den analytischen Substraten wurden mit einem Mikrotiterplattenphotometer gemessen (CLARIOstar Plus, BMG Labtech, Ortenberg, Germany): Umsetzung von Veratrylalkohol zu Veratralaldehyd (ε310 = 9,300 M-1 cm-1); Bildung des ABTS Radikals (ε420 = 36,000 M-1 cm-1), Umsetzung von NBD zu 5-Nitrocatechol (ε425 = 9,700 M-1 cm-1) und Umsetzung von Naphthalen zu 1-Naphthtol (ε303 = 9,700 M-1 cm-1). Die Messung der Reaktionskinetik erfolgte über 30 sec bei Raumtemperatur.
  • Die Reaktionen mit den Pharmazeutika und die Detektion der Reaktionsprodukte ( ) wurden, wie in Bezugsbeispiel 4 für Propranolol beschrieben, durchgeführt.
  • Die detektierten Aktivitäten der in Bezugsbeispiel 3 zellfrei hergestellten AaeUPO-His sind in Tabelle 1 gelistet. Die Enzymaktivitäten sind in U/ L angegeben, wobei 1 U der Bildung von 1 pmol Produkt pro min entspricht.
  • Figurenliste
    • Anti-His-tag Western Blot Analyse von zellfrei und zellbasiert hergestellter Wildtyp-UPO AaeUPO und der UPO-Mutante AaeUPO PaDa-I mit C-terminalem His6-Tag. (1) Ni-NTA gereinigte AaeUPO PaDa-I-His aus S. cerevisiae Kulturüberstand (2)-(8) zellfreie Proteinsynthese: (2) Kontrolle ohne mRNA (3) AaeUPO PaDa-I mRNA (4) interne Kontrolle (5) AaeUPO PaDa-1 mRNA (6) interne Kontrolle (7) Wildtyp-UPO AaeUPO mRNA (8) Kontrolle ohne mRNA (9) MagicMark™ XP Western Protein.
    • Selektive Oxyfunktionalisierung von Propranolol durch zellfreie UPOs (cfUPO).
    • Das Diagramm zeigt die Peakflächen-Intensitäten im Extracted-Ion-Chromatogramm (EIC) für 5-Hydroxypropranolol (C16H22NO3 +) . Die Zelllysate wurden wie im Bezugsbeispiel 4 für die Umsetzung von Propranolol eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden 50 mU/mL (Veratrylalkohol) AaeUPO eingesetzt.
    • Die Abbildung zeigt die Oxyfunktionalisierung von Diclofenac und Clopidogrel durch zellfreie AaeUPO (cfAaeUPO).
  • Tab. 1 Die Tabelle zeigt die Enzymaktivität von zellfreier AaeUPO-His mit verschiedenen Substraten. Tab. 1
    Substrat Enzymaktivität
    Veratrylalkohol 100 mU/mL
    ABTS 229 mU/mL
    5-Nitrobenzodioxol 93 mU/mL
    Naphthalen 212 mU/mL
    Propranolol 9972 µU/mL
    Diclofenac 4875 µU/mL
    Clopidogrel 2616 µU/mL
  • Primer Sequenzen (PCR)
    • SEQ ID Nr. 1 5'-AGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGG-3'
    • SEQ ID Nr. 2 5'-TTTTTTTTCTCAATGGTGATGGTGATGATGATCTCTACCATATGGAAAAACTTGAG-3'
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • EP 2468852 B1 [0008]
    • WO 2016207373 A1 [0009]
    • WO 2017081355 A1 [0012]
    • EP 3594332 A1 [0014]

Claims (13)

  1. Verfahren zur Herstellung von Häm-haltigen Polypeptiden mit Peroxidase- und Peroxygenase-Aktivität in zellfreien Systemen unter Verwendung von eukaryontischen Zellextrakten und der Verwendung dieser biokatalytisch aktiven Polypeptide in der oxidativen Umsetzung von niedermolekularen, organischen Verbindungen, das folgende Schritte umfasst: 1) Herstellung von eukaryontischen Zellextrakten zur Verwendung in der zellfreien Proteinsynthese 2) Bereitstellung einer Nukleinsäurematrize, die die kodierten Informationen für das UPO-Gen enthält 3) Zusammenfügen des Zellextraktes, der Nukleinsäurematrize und weiterer Komponenten, die für die Translation notwendig sind 4) Verwendung der im zellfreien System hergestellten UPO zur oxidativen Umsetzung von Substraten
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellextrakte von Pilzen stammen.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pilzlichen Zellextrakte von filamentösen Pilzen stammen, insbesondere der Gattungen Aspergillus und Neurospora, insbesondere der Arten Aspergillus niger und Neurospora crassa.
  4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellextrakte mittels mechanischem Aufschluss, insbesondere Hochdruckzellaufschluss gewonnen werden.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zelllysat Membranvesikel enthält.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäurematrize eine Peroxygenase der Klasse EC 1.11.2.1 kodiert.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Peroxygenase kodierende Nukleinsäurematrize linear oder zirkulär ist.
  8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die translatierte Peroxygenase gezielte oder zufällige Mutationen enthält.
  9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die translatierte Peroxygenase gezielte Tags enthält.
  10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die translatierte Peroxygenase gezielte Marker enthält.
  11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die translatierte Peroxygenase für ein Screening mit niedermolekularen, organischen Verbindungen eingesetzt wird, die relevant sind in Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmittel, Klebstoffe, Farbstoffe, Sensoren oder biologischen Assays.
  12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die translatierte Peroxygenase aus dem Reaktionsmedium isoliert wird.
  13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die translatierte Peroxygenase für organische Synthesen, Bioremediationsprozesse, zur Herstellung von Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmittel, Klebstoffe, Farbstoffe, Sensoren oder biologische Assays eingesetzt wird.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2468852B1 (de) 2007-03-30 2014-07-16 Novozymes A/S Pilz-Peroxygenasen und Anwendungsverfahren
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EP3594332A1 (de) 2018-07-10 2020-01-15 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Verfahren zur heterologen expression von aktiver pilzlicher unspezifischer peroxygenase in bakteriellen wirtszellen für fettsäureepoxidation und andere sauerstoffreaktionen

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