DE102020214294A1 - Neuartiger Biomarker für die Vorhersage und Prognose der Nierenfunktion - Google Patents

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Fabian Braun
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Abstract

Die Nierentransplantation ist die bevorzugte Nierenersatztherapie. Dennoch ist das Langzeitüberleben nach einer Transplantation unbefriedigend, was zum Teil auf die unzureichenden Möglichkeiten der Langzeitüberwachung und des Verständnisses der biologischen Prozesse nach der Transplantation zurückzuführen ist. Kleine extrazelluläre Urinvesikel (suEVs) - als nicht-invasive Informationsquelle - wurden von 22 lebenden Spendern und Empfängern gesammelt. Eine unvoreingenommene proteomische Analyse ergab zeitliche Muster der suEV-Proteinsignatur und enthüllte zelluläre Prozesse, die sowohl an der frühen Reaktion als auch an der längerfristigen Anpassung des Transplantats beteiligt sind. Die Komplementaktivierung war eine der am dynamischsten regulierten Komponenten. Dieser einzigartige Atlas des suEV-Proteoms wird über ein Online-Archiv bereitgestellt, das dynamische Abfragen durch den Benutzer ermöglicht. Darüber hinaus wurden im Rahmen einer korrelativen Analyse mutmaßliche Prognosemarker für die künftige Allotransplantatfunktion ermittelt. Einer dieser Marker - Phosphoenol-Pyruvat-Carboxykinase (PCK2) - konnte durch gerichtete MS („targeted MS“) in einer unabhängigen Validierungskohorte von 22 weiteren Patienten bestätigt werden. Diese Studie wirft ein Licht auf die Auswirkungen der Nierentransplantation auf den Gehalt der extrazellulären Urinvesikel und ermöglicht erste Rückschlüsse auf frühe molekulare Prozesse in der Transplantationsbiologie. Darüber hinaus unterstreichen unsere Daten das Potenzial von suEVs als Quelle für Biomarker in diesem Umfeld.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage oder Prognose einer akuten Nierenschädigung/eines akuten Nierenversagens der Nierenfunktion eines Patienten, ein Verfahren zur Überwachung von Patienten mit einem Nierenleiden und die Verwendung von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase PCK2 als Biomarker für die Nierenfunktion.
  • Einleitung
  • Chronische Nierenerkrankungen haben sich zu einem der größten Gesundheitsprobleme und Kostenfaktoren für die Gesundheitssysteme weltweit entwickelt und betreffen alle Altersgruppen (1). Eine Nierenersatztherapie durch Dialyse kann zwar die Nierenfunktion in Bezug auf die Säure-Basen-Homöostase sowie die Wasser- und Toxinausscheidung bis zu einem gewissen Grad wiederherstellen, geht aber mit einem dramatischen Anstieg der kardiovaskulären und allgemeinen Sterblichkeit einher (2, 3). Die Behandlungsstrategie, die zu einer höheren Lebensqualität und Überlebensrate der Patienten führt, ist die Nierentransplantation (4, 5). Die Zahl der potenziellen Empfänger übersteigt jedoch bei weitem die Zahl der Spender. Dieser ungedeckte Bedarf hat zu einem Anstieg der Transplantation von Lebendspenden geführt, wodurch die Notwendigkeit der Dialyse umgangen wird (6).
  • Die Abstoßung des Transplantats und die chronische Allotransplantations-Nephropathie schränken jedoch das Überleben des Organs ein, so dass in vielen Fällen eine wiederholte Transplantation erforderlich ist. (7). Die Diagnose der zugrundeliegenden Erkrankung beruht in erster Linie auf einer Nierenbiopsie mittels einer Hohlnadel-Gewebeentnahme, die sowohl ein Blutungsrisiko mit möglicher Organschädigung als auch die Gefahr einer Fehldiagnose aufgrund von Fehlern bei der Entnahme birgt (8, 9). Da der Primärharn alle Zellen der Nephrone passiert, wäre die Identifizierung von Urinmarkern als Ergänzung zur Histologie von großem Nutzen. Bislang sind Harnsediment und Proteinurie die einzigen Instrumente, die in der klinischen Routine zur Verfügung stehen (10).
  • In den letzten Jahren sind verschiedene extrazelluläre Vesikel (EVs) in den Fokus der Forschung gerückt, sowohl wegen ihrer biologischen Funktion als auch wegen ihres Potenzials als Quelle von Biomarkern für verschiedene Krankheiten (11). Im Gegensatz zu Analysen von Vollurin versprechen EVs, die aktiv von Epithelzellen, die das Nephron auskleiden, abgesondert werden, die Zellbiologie direkter widerzuspiegeln. Die meisten Studien haben zwischen drei Arten von EVs (Exosome, Mikrovesikel und apoptotische Körper) in Abhängigkeit von ihrer Biogenese unterschieden (12, 13).
  • Aktuelle Untersuchungen haben jedoch sowohl die Unzulänglichkeiten früherer Trennungsmethoden und Vesikelcharakterisierungen als auch eine erhebliche Überschneidung in Größe, Dichte sowie Protein- und Nukleinsäuregehalt aller drei Gruppen aufgezeigt (14-18). Als Konsequenz schlägt die International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) eine operative Terminologie für getrennte extrazelluläre Vesikel vor, die die biochemischen und physikalischen Eigenschaften angibt (15). Diese Terminologie umfasst die Herkunft, die durch die Bioflüssigkeit, das Organ oder die Zellen, von denen die Vesikel abgetrennt werden, angegeben wird, spezifische Marker (einschließlich Nukleinsäuren, Proteine oder Lipide) sowie die Größe und Dichte der Vesikel. Unsere Studie charakterisiert kleine extrazelluläre Vesikel, die aus dem Urin abgetrennt wurden und daher als kleine extrazelluläre Urinvesikel (suEVs) bezeichnet werden.
  • Um das Proteom von suEVs und seine Veränderungen während der Transplantation von Lebendspenden quantitativ zu bewerten, verwendeten wir ein einfaches Trennungsprotokoll für Urin-EVs durch differentielle (Ultra-)Zentrifugation. Die abgetrennten suEVs wurden mittels Massenspektrometrie und markierungsfreier Quantifizierung auf ihren Proteingehalt hin untersucht. Der daraus resultierende Datensatz stellt eine neuartige und einzigartige Ressource dar, die einen Einblick in die biologischen Prozesse gibt, die während der Nierentransplantation ablaufen. Darüber hinaus gibt die Korrelation mit der Nierenfunktion nach der Transplantation in Kombination mit gerichteter Massenspektrometrie („Target-MS“) für spezifische Marker in einer Validierungskohorte einen ersten Einblick in die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes für die Ergebnisvorhersage nach Nierentransplantation.
  • Materialien und Methoden
  • Rekrutierung von Patienten
  • Die Rekrutierung der Patienten erfolgte durch die Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Krebschirurgie, Abteilung für Transplantationschirurgie, Transplantationszentrum Köln, gemäß den genehmigten Ethikerklärungen 11-310 und 15-032 der Ethikkommission der Universität zu Köln, Köln, Deutschland. Die durchgeführten Studien sind beim Deutschen Register für Klinische Studien unter der ID: DRKS00010534 und DRKS00007704 registriert.
  • Urinsammlung und -aufbereitung ≥ 50ml Urinproben wurden entweder als zweite morgendliche Mittelstrahlprobe (Zeitpunkt A, D und E) oder als Katheterurin aus einem frischen Sammelbeutel (Zeitpunkt B und C) in Standard-Urinprobenbecher (Sarstedt, Deutschland) gesammelt. Konservierungsmittel und Proteaseinhibitoren wurden innerhalb von 90 Minuten nach der Probenentnahme in den Endkonzentrationen 6,6mM NaN3, 2,0mM EGTA, 1,0mM PMSF zugegeben. Anschließend wurden Zellen, Fragmente und große bis mittelgroße EVs durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation in einer Beckman Avanti-Zentrifuge mit einem TLA 16,250 Festwinkelrotor in 50ml-Zentrifugationsröhrchen (Greiner Bio-One, Deutschland) bei 17.000g, 4°C für 20 Minuten abgetrennt. Der Überstand wurde in frische 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und die Proben bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C gelagert.
  • Abtrennung kleiner extrazellulärer Urinvesikel
  • Für die suEV-Trennung wurden die gefrorenen Proben aufgetaut und anschließend 20 Minuten lang bei 17.000g, 4°C zentrifugiert, um die durch den Gefrier-/Auftau-Zyklus entstandenen Proteinausfällungen zu pelletieren. Der Überstand wurde anschließend in Polycarbonat-Ultrazentrifugationsflaschen (Beckman Coulter, USA) überführt und die suEVs wurden bei 200.000g, 4°C, 60 Minuten mit einer Beckman Coulter Optima Ultrazentrifuge mit einem 70Ti Festwinkelrotor getrennt. Der Überstand wurde verworfen und die suEV-Pellets wurden resuspendiert und in 4°C 20mM Tris Puffer pH 8,6 gepoolt. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das suEV-Pellet von ursprünglich ≥25ml Vollurin in 50µl Paraformaldehyd resuspendiert und für die Elektronenmikroskopie bei 4°C gelagert oder 40µl 8M Urea Buffer + Protease Inhibitor Mix (Sigma-Aldrich, USA) und für die Proteinanalyse bei -80°C gelagert.
  • Für die Größenausschlusschromatographie wurden 10 ml des Überstands nach 17.000 g Zentrifugation mit der IZON qEV10/35nm-Säule gemäß dem Herstellerprotokoll (IZON Science LTD, USA) verarbeitet. Die resultierenden Fraktionen 1-4 wurden gesammelt und durch Ultrazentrifugation bei 200.000g, 4°C, 60 Minuten für die EV-Trennung nach dem oben genannten Protokoll verarbeitet.
  • Elektronenmikroskopie und Bewertung der Größenverteilung
  • Die Proben wurden nach einer geänderten Version von bereits veröffentlichten Protokollen verarbeitet (19). Kurz gesagt: Das suEV-Pellet wurde in 50µl 2% PFA (Gewicht/Volumen) in PBS resuspendiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. 5 µl wurden auf mit Formwar beschichtete Gitter gegeben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet. Die Gitter wurden siebenmal 2 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS gewaschen, bevor sie 5 Minuten lang in 1%igem Glutaraldehyd (Vol/Vol) inkubiert wurden. Nach dem Spülen in destilliertem Wasser wurden die Gitter in 1,5%igem Uranylacetat in destilliertem Wasser (Gew/Vol) 4 Minuten lang im Dunkeln kontrastiert und anschließend getrocknet. Die Gitter wurden am TEM109 von Zeiss mit einer CCD-Kamera von Tröndle analysiert. Die Größenverteilung wurde in 5 zufällig ausgewählten Bildern von zwei einzelnen gesunden Probanden mit dem Messwerkzeug in FIJI (20, 21) bestimmt.
  • Elektronenmikroskopie und Immunogoldmarkierung von PCK2
  • Für die Immunogoldfärbung wurden 5 µl resuspendierte Paraformaldehyd-fixierte suEVs auf mit Formvar-Kohle beschichtete Nickelgitter übertragen (20 Minuten Inkubation). Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben auf den Gittern mit 0,05 % Tween (in der Blockierlösung) permeabilisiert und 30 Minuten lang mit 0,5 % BSA blockiert. Die suEVs wurden mit dem primären Kaninchen-Anti-PCK2-Antikörper (Abcam - ab187145), verdünnt im Verhältnis 1:200, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und mit einem sekundären Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit 1,4 nm großen Goldpartikeln, verdünnt im Verhältnis 1:200 (Jackson ImmunoResearch - 711-205-152), 1 Stunde lang bei Raumtemperatur markiert. Nach dem Waschen wurden die Nanogoldpartikel 2 Minuten lang mit dem HQ-Silber-Kit (Nanoprobes) verstärkt. Die Raster wurden wie oben beschrieben kontrastiert. Die Bildgebung erfolgte mit einem Philipps CM 100 TEM und der Olympus Imaging Software ITEM.
  • Western-Blot-Analyse
  • Die in 8M-Harnstoffpuffer resuspendierten suEV-Pellets wurden mit 1%igem Triton X-100-Puffer verdünnt und entsprechend mit 4%igem SDS-Probenpuffer versetzt. Die Größentrennung wurde mit SDS-PAGE durchgeführt. Die Proben wurden auf Polyvinylidendifluorid-Membranen geblottet und nach Inkubation der Blots mit den entsprechenden Antikörpern (anti-ALIX-Antikörper BD Bioscience - 611620, anti-TSG101-Antikörper Abcam - ab30871) mit verstärkter Chemilumineszenz visualisiert.
  • Unvoreingenommene proteomische Analyse
  • Die Proben wurden von der CECAD/CMMC Proteomics Core Facility gemessen. Die Peptide wurden mit einem Q Exactive Plus Tandem-Massenspektrometer (Thermo Scientific,(22)) analysiert. Eine 50 cm lange Säule wurde mit 1,9 µm C18-Beads (Dr. Maisch GmbH) gepackt. Die Säule wurde in einem Säulenofen bei 50° C verwendet. Die Peptide wurden vor der MS-Messung durch Nano-Flüssig-Chromatographie getrennt. Dazu wurde ein binäres Puffersystem bestehend aus 0,1 % Ameisensäure (Puffer A) und 80% Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (Puffer B) verwendet. Es wurden lineare Gradienten von 150 Minuten Dauer nach folgendem Schema verwendet: anfangs 4 % B, bis zu 6 % B über 5 Minuten, bis zu 23 % B über 120 Minuten, bis zu 54 % B über 7 Minuten. Das Waschen erfolgte durch Erhöhung des B-Gehalts auf 85 % über 6 Minuten, wobei der Wert von 85 % B für 5 Minuten gehalten wurde. Die Äquilibrierung erfolgte durch Verringerung von B auf 5 % über 5 Minuten, gefolgt von 2 Minuten Äquilibrierung bei den Ausgangsbedingungen. Peptide wurden in Top10 DDA mit den folgenden Parametern für MS1-Scans erfasst: Injektionszeit 20 ms, Auflösung 70.000, Massenbereich 300-1750 m/z, 3E6 als AGC-Ziel. Peptide, die für die Fragmentierung durch Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (HCD) ausgewählt wurden, wurden mit den folgenden Parametern analysiert: 35.000 Auflösung, Massenbereich 200-2000 m/z, AGC-Ziel von 5E5, maximale Injektionszeit 60 ms. Die Rohdaten (.raw) wurden mit MaxQuant V 1.5.0.1 ausgewertet. (23) Die Suche (Target-Decoy-Strategie) wurde gegen eine menschliche Uniprot-Referenzdatenbank von 2017 durchgeführt. Es wurden die Standardeinstellungen verwendet und die Optionen „MQLFQ“ und „Match between runs“ genutzt (24). Die FDR-Cutoffs waren FDR 0,01 für alle Peptid-, PSM- und Proteinidentifizierungen. Perseus (v. 1.4.0.1 und v. 1.5.2.4) (25) wurde für die weitere Analyse verwendet. Zur Korrektur von Mehrfachtests wurde ein SAM-Ansatz gewählt (Cutoff s0 = 1, FDR <0,001) (26). Signifikant angereicherte GeneOntology-Begriffe wurden mit dem Fisher's Exact Test (FDR = 0,05) ermittelt.
  • Korrelative Analyse
  • Die ermittelten Proteine wurden durch lineare Regressionsmodelle mit der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (eGFR) korreliert. Die eGFR wurde anhand der CKD-EPI-Kreatinin-Gleichung geschätzt (27). Die Modelle wurden mit einem Leave-One-Out-Kreuzvalidierungsverfahren erstellt (28). Dabei werden alle Werte außer einem als Trainingsmenge (n-1) verwendet, um mit der R-Funktion Im ein lineares Modell zu berechnen. Die ausgelassene Messung (der „Testsatz“) wird mit der Methode predict.lm berechnet und die Differenz zwischen vorhergesagtem und wahrem Wert wird zur Berechnung des Vorhersagefehlers des Modells verwendet. Der Prozess wird entsprechend der Anzahl der gemessenen Proteine (n) wiederholt, was zu n linearen Modellen führt. Anhand dieser Modelle wird für jedes erfasste Protein ein mittleres lineares Modell erstellt. Aus diesen Modellen wurden Kandidatenproteine für die gerichtete Massenspektrometrie („Target-MS“) anhand der im Haupttext beschriebenen Kriterien ermittelt. Zusätzlich wurde eine multiple lineare Regression mit der R-Funktion Im durchgeführt, um ein lineares Modell mit allen klinischen Merkmalen, d. h. Alter des Spenders, Geschlecht des Spenders, Bluthochdruck des Spenders (ja/nein), eGFR des Spenders, Alter des Empfängers und Geschlecht des Empfängers, zusätzlich zu PCK2 anzupassen.
  • Gerichtete proteomische Analyse
  • Es wurde ein Assay zur parallelen Reaktionsüberwachung (PRM) eingerichtet. Die Analyse wurde mit dem LC-MS-System durchgeführt, wie für die ungerichtete Proteomik beschrieben. Die Erfassungsparameter für gerichtete Proteomikdaten („targeted proteomics“) waren wie folgt: Es wurden 70 Peptide für die geplante PRM-Analyse ausgewählt (Daten nicht gezeigt). Die MS2-Auflösung wurde auf 140k eingestellt. Das AGC-Ziel wurde auf 1.000.000 bei einer maximalen Injektionszeit von 100 ms festgelegt. Die Peptide wurden mit einem Isolationsfenster von 1,0 Th isoliert und mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 27 fragmentiert. Es wurden die beiden PCK2-Peptide mit der Aminosäuresequenz HGVFVGSAMR (Ladungszustand 2, m/z = 530.771468, Retentionszeit = 31.92 min; SEQ ID NO: 2) und EGALDLSGLR, Ladungszustand 2, m/z = 515.780013, Retentionszeit = 46.77; SEQ ID NO: 3 min verwendet. Eine geplante Methode wurde mit der Skyline-Softwareumgebung erstellt (29, 30). Ein Retentionszeitfenster von 4 Minuten wurde für die Aufnahme auf einem 1h-Gradienten verwendet, der zuvor beschrieben wurde. Die Analyse und Quantifizierung der Daten der gerichteten Proteomik wurde mit Skyline durchgeführt. Eine Bibliothek von 6 repräsentativen suEV-Rohdateien aus der ungerichteten Analyse wurde zur Erstellung der Spektralbibliothek verwendet. Die Peaks wurden mit skyline integriert und quantifiziert. Die normalisierten Intensitäten wurden exportiert und verarbeitet. Es wurden nur Peptide innerhalb eines 5 ppm-Massenfensters berücksichtigt.
  • Anschließend wurde eine fokussierte PRM-Methode entwickelt, die ein schnelles Screening von PCK2 ermöglicht. Zusätzlich zu den Peptiden HGVFVGSAMR (SEQ ID NO: 2) und EGALDLSGLR (SEQ ID NO: 3) wurde das Peptid TMYVLPFSMGPVGSPLSR (Ladungszustand 2, m/z = 969,99440; SEQ ID NO: 4) berücksichtigt, um die Stabilität des Assays zu erhöhen. Außerdem wurden die Peptide von PODXL, PROM1, LG3BP und FN3K überwacht, um eine stabile Normalisierung zwischen den Proben zu ermöglichen. Die Proben wurden mit einem Orbitrap Exploris 480 analysiert, der mit einem EasyLC 1200 (beide Thermo Scientific) gekoppelt war. Die Trennung erfolgte auf einer 30 cm langen Pico-Tip-Säule (New Objective), die auf 50 °C erhitzt und mit 2,7 µm PoroShell 120 (Agilent) gepackt war. Die Orbitrap wurde im PRM-Modus mit einer Auflösung von 60.000, einem AGC-Ziel von 100 %, einer maximalen Injektionszeit von 110 ms, einem Quadropol-Isolationsfenster von 0,7 m/z und einer HCD-Fragmentierung von 30 % betrieben. Alle Proben wurden von der CECAD/CMMC Proteomics Core Facility gemessen.
  • Die Proben wurden in einem vordefinierten Skyline-Dokument analysiert, um eine schnelle Bewertung des Vorhandenseins von PCK2 und eine Signalnormalisierung zu ermöglichen.
  • Immunhistochemie
  • Das Gewebe wurde in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert und anschließend für die Histologie in Paraffin eingebettet. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur (RT) mit einem Autostainer 480S und einem Protokoll von Thermo Scientific durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Objektträger nach der Entparaffinierung mit Xylol und der Rehydrierung durch abgestufte Ethanolreihen mit TRIS-NaCI mit Tween (Medac-diagnostica, Deutschland) gewaschen. Die Peroxidase wurde blockiert (Ultra Vision Hydrogen Peroxidase Block, Medac-diagnostica, Deutschland) und es folgte eine Vorbehandlung mit Citratpuffer bei pH 6 (PT modul Buffer 1, Thermo Scientific). Der primäre Antikörper Kaninchen-Anti-PCK2-Antikörper (Abcam - ab187145) wurde mit Antikörperverdünner (Medac-diagnostica, Deutschland) 1:1000 verdünnt und mit Poly-HRP-Anti-Maus-/Kaninchen-IgG (Bright Vision, Medac-diagnostica, Deutschland) und DAB Away Kit (Biocare Medical, Deutschland) entwickelt. Alle Reagenzien wurden gemäß den Herstellerprotokollen verwendet. Die Proben wurden mit dem Aperio Slidescanner (Leica, Deutschland) mit einem 20x-Objektiv und numerischer Apertur gescannt und analysiert: 0,75 bei 20°C ohne Bildträger und Aperio ImageScope Software für die Aufnahme und QuPath (31) für die Auswertung.
  • Analyse der Verfolgung von Nanopartikeln
  • Die EVs wurden mit dem ZetaView PMX-120-Gerät (Particle Metrix, Deutschland) analysiert. Alle Proben wurden entweder 1:1000 oder 1:5000 in PBS auf ein Endvolumen von 1 ml verdünnt, um einen idealen Wert von 140 bis 200 Partikeln pro Bild zu erreichen. Bei jeder Messung wurden dreimal 11 Zellpositionen nach einer Videoaufnahme von 30 Bildern pro Position analysiert. Der Autofokus wurde eingestellt und alle Proben wurden mit einer Kameraempfindlichkeit von 75, einem Shutterwert von 100 und einer konstanten Temperatur von 25°C gemessen. Die Videos wurden mit der Software ZetaView 8.05.10 SP1 mit einer minimalen Fläche von 5, einer maximalen Fläche von 1000 und einer minimalen Helligkeit von 25 analysiert. Die Anzahl der abgeschlossenen Spuren bei NTA-Messungen war immer größer als 1000 (32).
  • Ergebnisse
  • Ein schnelles und breit anwendbares Protokoll der differentiellen Zentrifugation ermöglicht eine robuste Trennung von suEVs.
  • Wir haben ein schnelles, kosteneffizientes und einfaches Protokoll für die Abtrennung kleiner extrazellulärer Vesikel aus dem Urin mit Hilfe der differentiellen Ultrazentrifugation entwickelt, das in Zukunft in die klinische Routine übertragen werden könnte ( ). Nach der Zugabe von Konservierungsmitteln und Proteaseinhibitoren werden in einem Zentrifugationsschritt von 17.000 g bei 4°C für 20 Minuten alle Zellen, Zellfragmente und große bis mittlere EVs pelletiert. Die Analyse des endgültigen suEV-Pellets mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Nanopartikel-Tracking-Analyse mittels ZetaView zeigte eine Vielzahl kleiner EVs mit einer typischen becherförmigen Morphologie, die von suEVs mit 30 bis 60 nm bis zu einer kleinen Fraktion großer Urin-EVs mit einem Durchmesser von bis zu 500 nm reichte ( / und ). Um die Stabilität der suEV-Proteine bei Langzeitlagerung nach Auflösung des endgültigen Pellets in 8 M Hamstoffpuffer zu überprüfen, führten wir nach 1 und 6 Monaten bei -80°C Western-Blot-Analysen für kleine EV-Markerproteine durch und konnten keine lagerungsabhängigen Unterschiede im Immunoblot-Signal feststellen ( ). Darüber hinaus führte unser Trennungsprotokoll zu einer Verringerung des Verhältnisses zwischen dem ubiquitären Urinprotein Uromodulin und dem suEV-Protein TSG101 ( ), und wir konnten die Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 - die typischerweise auf der Oberfläche von EVs vorhanden sind - in einem durchflusszytometrischen Bead-Assay ( ) des endgültigen suEV-Pellets zuverlässig nachweisen. Eine massenspektrometrische Pilotanalyse bestätigte, dass unser Protokoll Partikel abtrennt, die Markerproteine für alle Segmente des Nephrons (33) enthält sowie Alix und TSG101 - zwei Proteine, die typischerweise in EVs vorkommen ( ).
  • Klinische Merkmale von Spendern und Empfängern von 22 Lebendspender-Nierentransplantationen (Screening-Kohorte)
  • Wir sammelten suEV-Pellets im Verlauf von 22 Transplantationen von Lebendspenden. zeigt einen kurzen Überblick über die Studie. Urin wurde am Tag vor der Transplantation von Allograft-Spendem (Probe A) und den entsprechenden Empfängern direkt nach der Transplantation (Probe B), einen Tag nach der Transplantation (Probe C), vier Wochen (Probe D) und ein Jahr nach der Transplantation (Probe E) gesammelt. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die klinischen Merkmale der Spender (Tbl. 1A) und der entsprechenden Empfänger (Tbl. 1B). Das Durchschnittsalter der Spender betrug 51,5 Jahre, wobei etwa zwei Drittel der ersten Kohorte Frauen waren. Die meisten Spender wiesen eine gemessene Kreatinin-Clearance von mehr als 100 ml/min/1,73m2 auf, und nur 3 Spender litten an arterieller Hypertonie (Tbl. 1A). Die Empfänger waren jünger, meist männlich und hatten im Durchschnitt ein geringeres Körpergewicht als die Spender. Mehr als zwei Drittel wurden präventiv transplantiert, die übrigen waren zwischen 2 und 39 Monaten dialysepflichtig. Die zugrundeliegenden Nierenerkrankungen waren nahezu dreigeteilt in genetische, autoimmune und andere Ursachen, nur ein Patient litt an diabetischer Nephropathie. 72 % der Patienten erhielten Basiliximab als Induktionstherapie und Prednisolon, Mycophenolsäure und Tacrolimus zur Erhaltungstherapie nach der Transplantation (Tab. 1B). Bei drei von 22 Patienten sanken die Serumkreatininwerte innerhalb der ersten 48 Stunden nicht um >1 mg/dl und fielen innerhalb der ersten Woche nicht unter einen Wert von 3 mg/dl. Für diese Studie wurden diese Patienten anhand der folgenden Korrelationen als Patienten mit „initialer Transplantatdysfunktion“ eingestuft.
  • Unvoreingenommene Proteomanalyse der ersten 22 Transplantatsätze zeigt zeitliche Veränderungen des suEV-Proteoms.
  • Mithilfe der Massenspektrometrie konnten wir > 1700 einzelne Proteine nachweisen, die in ≥ 50 % der Proben vorhanden waren. Der gewonnene Datensatz ist bei PRIDE/ProteomExchange frei verfügbar (http://www.ebi.ac.uk/pride (34) - Zugriffsnummer: PXD005219). Zur technischen Validierung führten wir die Größenausschlusschromatographie (SEC) im Vergleich zu unserem Ultrazentrifugationsprotokoll (UC) in 8 unabhängigen Kontrollproben von 6 gesunden Spendern durch. Die erfolgreiche Vesikeltrennung wurde mit Hilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse und des durchflusszytometrischen Bead-Assays validiert ( & ). Das proteomische Profil der durch SEC abgetrennten suEVs überschnitt sich zu 97 % mit dem Proteom der durch UC abgetrennten Vesikel ( ). Beide Trenntechniken zeigten eine minimale Überlappung mit einer vorgeschlagenen Liste von mutmaßlichen Verunreinigungen der abgetrennten suEVs (35) ( ). Ebenso waren nur 11 % der Proteine, die in suEVs zum Zeitpunkt a (Spenderprobe) identifiziert wurden, in dieser vorgeschlagenen Liste von Verunreinigungen vertreten. Außerdem überschnitt sich das suEV-Proteom zum Zeitpunkt a erheblich mit veröffentlichten Proteomanalysen von extrazellulären Urinvesikeln, die mit unterschiedlichen Protokollen (35, 36) abgetrennt wurden ( ). 77 % der Proteine, die in den durch Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie gewonnenen Vesikeln nachgewiesen wurden, fanden sich auch in unserer Analyse, und 79 % der von uns nachgewiesenen Proteine waren in der mit Vesikeln angereicherten Fraktion des dichtebasiert fraktionierten Urins vorhanden. Darüber hinaus konnten wir mutmaßliche Marker für alle Segmente des Nephrons sowohl in den durch SEC als auch in den durch UC getrennten suEVs nachweisen ( ).
  • Bei der hierarchischen Clusterbildung zeigte sich eine starke Tendenz, Proben, die zum gleichen Zeitpunkt während der Transplantation entnommen wurden, zusammen zu gruppieren ( ). Insbesondere die beiden früh nach der Transplantation gewonnenen Proben (B und C) teilen sich einen Subcluster, der sich deutlich von den Proben A, D und E unterscheidet - d. h. die Proteomprofile einen Monat und ein Jahr nach der Transplantation zeigen mehr Ähnlichkeit mit dem Profil der Spenderprobe.
  • Um einen schnellen und unkomplizierten Zugang zu einer primären Analyse und Visualisierung des Datensatzes zu ermöglichen, haben wir eine browserbasierte Anwendung entwickelt, die die direkte Suche nach Protein-LFQs, deren Rang innerhalb des Datensatzes sowie die zeitlichen Veränderungen ihrer Häufigkeit in suEVs während einer Lebendspender-Nierentransplantation ermöglicht (http://shiny.cecad.uni-koeln.de:3838/suEV/).
  • Beim Vergleich der 20 meistvertretenen Proteine pro Zeitpunkt, die durch markierungsfreie Quantifizierung ermittelt wurden, nachdem Proteine, die nicht annotiert werden konnten, ausgeschlossen wurden, konnten wir feststellen, dass 25 % dieser Proteine zu allen Zeitpunkten unter den 20 meistvertretenen Proteinen zu finden waren ( ). Diese Proteine enthalten das ubiquitäre Urinprotein Uromodulin (UMOD) sowie Albumin (ALB), AMBP und Komplementfaktor 3 (C3), aber interessanterweise auch zytoplasmatisches Aktin (ACTG). Trotz der Ergebnisse der hierarchischen Clusterung unterscheiden sich die Spenderproben hinsichtlich der 20 wichtigsten suEV-Proteine am stärksten von allen anderen Zeitpunkten, was auf eine durch die Transplantation selbst verursachte Verschiebung hinweist. Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP), ein eindeutiger Marker für kleine extrazelluläre Vesikel, wurde zum Beispiel nur in den Spenderproben unter den 20 meistvertretenen Proteinen gefunden. Alle frühen Zeitpunkte bis zu 4 Wochen nach der Transplantation (B/C/D) zeigen eine Überrepräsentation von Proteinen, die typischerweise eher im Serum als im Urin zu erwarten sind, darunter die Fibrinogenketten alpha und beta sowie Apolipoprotein A1 und A4. Wichtig ist, dass wir die meisten dieser Marker auch in Vesikeln nachweisen konnten, die durch SEC aus Urinproben gesunder Freiwilliger abgetrennt wurden ( ).
  • Um die Auswirkungen der Nierentransplantation auf das suEV-Proteom weiter zu untersuchen, führten wir Gene Ontology (GO)-Analysen aller entdeckten Proteine pro Zeitpunkt durch ( ). Wir beobachteten eine auffällige Überschneidung zwischen den GO-Begriffen mit der höchsten Signifikanz pro Zeitpunkt. „Thrombozytendegranulation“ und „Retina-Homöostase“ wurden zu allen Zeitpunkten als hochsignifikant erkannt, während „Rezeptor-vermittelte Endozytose“ nur zum Zeitpunkt E fehlte ( ). „Gluconeogenese“ war zu den Zeitpunkten b und c nicht annotiert und zu Zeitpunkt d nicht unter den 20 Begriffen mit der höchsten Signifikanz, während „Zytolyse“ das genaue Gegenteil zeigte. GO-Terme für Komplementaktivierung und - regulierung waren unter den 10 wichtigsten GO-Terms ausschließlich nach der Transplantation zu finden ( , & ), fehlten jedoch in der Spenderprobe und nahmen 12 Monate nach der Transplantation an Bedeutung ab ( & und http://shiny.cecad.uni-koeln.de:3838/suEV/).
  • Auch bei der Rangfolge der wichtigsten GO-Begriffe nach Anreicherung wurde eine erhebliche Überschneidung festgestellt ( ). Allerdings waren Proteine, die mit der Cholesterinaufnahme und der Lipoproteinbindung in Verbindung stehen, nur in den Proben früh nach der Transplantation angereichert ( & ), während Proteine, die mit dem Toll-like-Rezeptor 4 und der Arachidonsäurebindung in Verbindung stehen, in der Spenderprobe und ein Jahr nach der Transplantation überrepräsentiert waren ( & ).
  • Im Gegensatz zur GO-Analyse, die für jeden Zeitpunkt separat durchgeführt wurde, zeigten die GO-Begriffe für den Unterschied im Gehalt des suEV-Proteoms zu jedem Zeitpunkt nach der Nierentransplantation im Vergleich zum ursprünglichen suEV-Proteom des Spenders eine weitaus geringere Überlappung, sowohl in Bezug auf die Anreicherung als auch auf die Signifikanz ( / ). Interessanterweise konnten wir einen Tag und einen Monat nach der Transplantation eine signifikante Veränderung der Proteine feststellen, die mit der Regulation der Komplementaktivierung in Verbindung stehen ( , und ). Vier Wochen nach der Transplantation waren „Zytolyse“, „Beseitigung apoptotischer Zellen“ und Protein- sowie Membran-Transportwege überrepräsentiert ( ).
  • Um die zeitpunktabhängige Verschiebung des suEV-Proteoms während der Nierentransplantation weiter aufzuklären, analysierten wir den Datensatz nach Clustern von Proteinen, die die gleichen zeitlichen Signaturen aufweisen. Wir konnten 9 Cluster identifizieren, die spezifische zeitliche Verschiebungen in ihren Proteinhäufigkeiten aufweisen ( ). Proteine, deren Häufigkeiten nach der Transplantation ansteigen und anschließend auf Werte abfallen, die über denen des ursprünglichen Spender-SuEV-Pellets liegen, scheinen eine Rolle bei der Immunität und der Blutgerinnung zu spielen ( ), während HDL-assoziierte Proteine ein Jahr nach der Transplantation auf Spenderwerte abfallen. Proteine mit einem anhaltenden Anstieg nach der Transplantation ( ) waren in GO-Begriffen der Protease-Homöostase und „Thrombophilie“ angereichert. Eine S-förmige zeitliche Signatur (Anstieg der Abundanz zu den Zeitpunkten B und C, Abnahme zum Zeitpunkt D und Normalisierung zum Zeitpunkt E) wurde für Proteine festgestellt, die an der ribosomalen und chromosomalen Biologie sowie an der „Dynein“-Aktivität beteiligt sind ( ). Umgekehrt wurden unmittelbar nach der Transplantation verringerte Häufigkeiten für Proteine beobachtet, die in GO-Begriffen für „Glykoproteine“ und sekretierte Proteine angereichert waren ( ). Diese Begriffe zeigten ein Jahr nach der Transplantation eine „Erholung“ auf die Spenderwerte, während die Mehrheit der Proteine in den Begriffen „Transmembrane“, „Glycosidase“ und „Signal-Anchor“ im suEV-Pellet nach einem Jahr leicht vermindert blieb ( ). Interessanterweise wurden die Stressreaktionsproteine innerhalb des Clusters nachgewiesen und zeigten die geringsten bis nicht nachweisbaren Veränderungen im suEV-Proteom ( ). Zwei Cluster, einer mit einer ausgeprägten und dauerhaften Abnahme der Häufigkeit direkt nach der Transplantation und einer mit einer langsamen, kontinuierlichen Abnahme der Häufigkeit, konnten nicht mit Standard-GO-Begriffen annotiert werden ( und ).
  • Identifizierung potenzieller Biomarker zur Vorhersage der Nierenfunktion 6 und 12 Monate nach einer Nierentransplantation mit Hilfe eines Kreuzvalidierungsmodells (leave-one-out)
  • Um das Potenzial der gewonnenen Proteomikdaten für die Identifizierung neuer Biomarker für das Ergebnis der Nierentransplantation zu bewerten, führten wir eine korrelative Analyse mit der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (eGFR) 6 und 12 Monate nach der Nierentransplantation mit einem Leave-One-Out-Kreuzvalidierungsmodell durch. Wir untersuchten den prädiktiven Wert der Fold-Change der Proteinhäufigkeiten zwischen den Zeitpunkten A und B und A und C sowie der einzelnen Proteinintensitäten zu den Zeitpunkten A und C, normalisiert auf die mittlere Proteinintensität. Die daraus resultierenden Protein-Kandidatenlisten wurden gefiltert nach I) den 10 Kandidaten, die den niedrigsten Fehler (niedrigstes RSS-Quadrat) und die höchste Stabilität (niedrigste stdev RSS-Quadrat) aufweisen, wenn sie mit der geschätzten GFR nach 12 Monaten korrelieren, und II) den 20 Kandidaten, die den niedrigsten Fehler aufweisen, wenn sie sowohl mit der geschätzten GFR 6 als auch 12 Monate nach der Transplantation korrelieren.
  • Um eine Kandidatenliste von Markern für die weitere Validierung zu erstellen, ergänzten wir diese Auswahl um 5 Proteine, die spezifisch nicht detektiert wurden, und 10 Proteine mit signifikant höherer Expression bei Patienten mit anfänglicher Transplantatdysfunktion zu den Zeitpunkten A und C. Diese Proteine, die unter I) beschriebenen 10 Kandidaten und die unter II) beschriebene Überlappung von Proteinen, die sowohl als prädiktiv für die eGFR nach 6 als auch nach 12 Monaten identifiziert wurden, ergaben eine Zielliste von 64 Proteinen (Tab. 2).
  • Gerichtete Massenspektrometrie in suEVs einer unabhängigen Validierungskohorte identifiziert PCK2 als Prädiktor für die langfristige Transplantatfunktion
  • Um die Gültigkeit dieser 64 suEV-Kandidatenmarker zu überprüfen, haben wir gerichtete Massenspektrometrie-Assays für diese Proteine durchgeführt. Diese Assays wurden dann zur Messung von suEV-Pellets verwendet, die in einer unabhängigen Validierungskohorte bei 22 weiteren Lebendspendertransplantationen gesammelt wurden. Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Patientenmerkmale dieser Validierungskohorte.
  • Die Nierenfunktion, die sowohl durch die gemessene Kreatinin-Clearance (68,9 ml/min/1,73m2) als auch durch die geschätzte GFR (55,41 ml/min/1,73m2) angegeben wird, war im Vergleich zur ersten Kohorte niedriger, wobei 7 Patienten hypertensiv waren und entsprechende Medikamente erhielten (Tab. 3A). Die Empfänger waren schwerer als die der ersten Kohorte, ähnelten dieser aber ansonsten sehr, auch bei der Untersuchung der Nierenfunktion 6 und 12 Monate nach der Transplantation (Tab. 3B).
  • Wir führten erneut sowohl unsere korrelative Analyse als auch den Filteralgorithmus durch, um Proteine mit einer robusten Korrelation zur Nierenfunktion 6 und 12 Monate nach der Transplantation zu identifizieren. Dieses Validierungsexperiment führte zur Bestätigung von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 2 (PCK2 / PCK2) als frühem Marker, der das Transplantationsergebnis nach einem Jahr vorhersagt ( ). Die PCK2-Häufigkeit in suEVs 1 Tag nach der Transplantation (Zeitpunkt c) zeigte eine robuste positive Korrelation mit der geschätzten GFR 6 und 12 Monate nach der Nierentransplantation in unserer ersten Kohorte ( & ). Um den Einfluss klinischer Variablen auf die Korrelation von PCK2 mit dem Ergebnis zu untersuchen, führten wir eine multiple lineare Regressionsanalyse durch, die sowohl Spender- als auch Empfängercharakteristika berücksichtigte. Die Modelle mit dem niedrigsten p-Wert ( , / ) bestätigen, dass die PCK2-Häufigkeit ein unabhängiger Prädiktor für die eGFR nach 6 und 12 Monaten ist. Darüber hinaus zeigten zwei klinische Parameter einen potenziellen prädiktiven Wert, da die eGFR des Spenders signifikant mit der GFR nach 6 Monaten korrelierte und eine grenzwertige Signifikanz für die eGFR nach 12 Monaten aufwies. Das Geschlecht des Empfängers zeigte eine ähnliche Tendenz (ohne einen p-Wert ≤ 0,05 zu erreichen). Eine getrennte Korrelation von PCK2 nach Geschlecht des Empfängers mit der eGFR nach 12 Monaten zeigte keine geschlechtsspezifischen Unterschiede ( & ). Im Einklang mit diesem Ergebnis zeigte die PCK2-Häufigkeit in suEVs einen Tag nach der Transplantation keinen signifikanten Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Empfängern ( ). Außerdem korrelierten die eGFR des Spenders ( ) und die aufgezeichnete Zeit der kalten Ischämie ( ) nicht mit den PCK2-Spiegeln, was ihr Potenzial als unabhängiger Indikator zeigt. Wichtig ist, dass die PCK2-Häufigkeit zum Zeitpunkt c mit der geschätzten GFR 12 Monate nach der Transplantation in der Validierungskohorte mittels gerichteter Massenspektrometrie korrelierte ( ). Wir konnten keinen prädiktiven Wert für die PCK2-Häufigkeiten in den suEVs der Spenderprobe oder die Foldchanges direkt nach und 1 Tag nach der Transplantation feststellen ( ).
  • Die suEV-Häufigkeit von PCK2 steigt während einer Nierentransplantation zunächst an, spiegelt aber nicht den PCK2-Spiegel im Nierengewebe wider
  • Bei der ersten unvoreingenommenen Proteomik-Messung wurde PCK2 auf Rang 1515 von 1728 mit einer mittleren labelfreien Quantifizierungsintensität (LFQ) von 21,88 zum Zeitpunkt A nachgewiesen (siehe (http://shiny.cecad.uni-koeln.de:3838/suEV/). Daher erschien es wichtig, seine Lokalisierung innerhalb der suEVs nachzuweisen. Unter Verwendung der oben erwähnten acht unabhängigen Kontrollproben von sechs gesunden Spendern, die durch Größenausschlusschromatographie im Vergleich zu unserem Ultrazentrifugationsprotokoll getrennt wurden, führten wir eine gerichtete Massenspektrometrie für PCK2 durch. Wir waren in der Lage, PCK2 durch mindestens zwei verschiedene Peptidsequenzen in allen Proben robust nachzuweisen, sowohl nach der Ultrazentrifugation als auch nach der Größenausschlusschromatographie ( & ). Zusätzlich konnten wir mittels Immunogoldmarkierung und Transmissionselektronenmikroskopie PCK2 in einer Untergruppe von suEVs mit einem Durchmesser von 100-400 nm nachweisen ( ), die durch unser Ultrazentrifugationsprotokoll abgetrennt wurden. Die Vesikel wurden 30 Minuten lang permeabilisiert (siehe Materialien und Methoden), so dass der Antikörper in das Vesikellumen eindringen konnte und die Färbung erfolgreich war. In nicht permeabilisierten Vesikeln wurde keine Färbung festgestellt ( ).
  • Die PCK2-Konzentration in den suEVs steigt bis 4 Wochen nach der Transplantation an und sinkt dann ein Jahr nach der Transplantation auf die in der Spenderprobe gemessenen Werte ( ). Um zu untersuchen, ob die Veränderungen in den suEV-Konzentrationen von PCK2 auf Unterschiede in der Nierenexpression zurückzuführen sind, führten wir eine immunhistochemische Untersuchung auf PCK2 in Nierenbiopsien durch, die während einer Lebendspender-Nierentransplantation vor der Explantation (prä) und direkt nach der Reperfusion (post) von einer Untergruppe von Patienten entnommen wurden, die auch in die suEV-Analyse einbezogen waren. Wir entdeckten ein starkes Signal vor allem in den proximalen Tubuli, wie zuvor beschrieben, aber keine offensichtlichen Veränderungen nach der Reperfusion oder Hinweise auf eine Korrelation mit den gemessenen LFQs im suEV-Proteom der Spenderproben ( ).
  • Diskussion
  • Trotz der Akzeptanz der Nierentransplantation als bevorzugte Nierenersatztherapie bei terminaler Niereninsuffizienz in den Industrieländern sind die genauen Auswirkungen der kalten Ischämiezeit und der Reperfusion auf die Nierenzellen noch nicht vollständig geklärt. Mausmodelle können diese Mechanismen nur teilweise aufklären, da sich ihr Organismus hinsichtlich des Immunsystems, einem der Hauptakteure in der Transplantationsbiologie, stark unterscheidet (37). Dennoch könnte ein besseres Verständnis künftige therapeutische Ansätze bei der Nierentransplantation beeinflussen und zu einem besseren Gesamtergebnis sowohl bei der Organfunktion in den ersten Tagen als auch beim langfristigen Überleben des Organs führen. Diese Studie stellt die erste Analyse dieser zeitlichen proteomischen Veränderungen beim Menschen dar, die aus suEVs abgeleitet wurden, und ermöglicht neue Einblicke in die molekularen Prozesse, die in den ersten Tagen und Wochen nach der Transplantation ablaufen, sowie in die Prozesse, die der langfristigen Erholung zugrunde liegen.
  • Frühere Studien an Spendern von Nierentransplantaten untersuchten die Korrelation zwischen EVs, die spezifische Marker tragen, und den Gewebemerkmalen, die durch Nierenbiopsie während der Transplantation gewonnen wurden (38). Obwohl eine beeindruckende Anzahl von Patienten untersucht wurde und wertvolle Informationen gewonnen wurden, war ein tieferes Verständnis aufgrund der Verwendung eines spezifischen Antikörper-Panels nur begrenzt möglich. Ganzurin-Proteomik wurde in der Vergangenheit im Rahmen von Nierentransplantationen eingesetzt (39-41). Dabei ist jedoch zu beachten, dass abgesehen von einem „Kernproteom des Urins“ die freien Urinproteine eine ziemlich hohe inter- und intraindividuelle Variabilität aufweisen (42). Mit Hilfe einer unvoreingenommenen proteomischen Analyse konnten wir >1700 Proteine nachweisen, die durch unser Trennungsprotokoll angereichert wurden.
  • Das suEV-Proteom zeigte eine starke Tendenz zur Bildung von zeitpunktabhängigen Subclustern. Dieser Befund bestätigt die technische Reproduzierbarkeit in einem klinischen Umfeld, da die individuelle Vesikeltrennung von verschiedenen geschulten Mitgliedern unserer Gruppe durchgeführt wurde und die Lagerzeit der ursprünglich gesammelten Urinproben von Probe zu Probe variierte. Außerdem konnten wir den Befund reproduzieren, dass die Kanalproteine AQP1 und AQP2 in Urin-EVs nach einer Ischämie-Reperfusionsverletzung reduziert waren in einem Rattenmodell (43) und bei menschlichen Patienten, die sich einer Nierentransplantation unterzogen (44) in unserem unvoreingenommenen proteomischen Ansatz.
  • Um die Reaktion auf die Transplantation besser zu verstehen, wurden sowohl die Häufigkeit einzelner Proteine als auch allgemeine Prozesse untersucht, die mit Hilfe von Gen-Ontologie-Begriffen identifiziert wurden. Betrachtet man die 20 Proteine mit der höchsten Häufigkeit, so waren 5 Proteine zu allen Zeitpunkten in hohem Maße nachweisbar. Während UMOD, ALB und C3 als Zeichen für die Kopräzipitation freier Proteine interpretiert werden könnten, ist es erwähnenswert, dass alle drei Proteine auch in proteomischen Analysen von extrazellulären Urinvesikeln vorhanden waren, die durch Protokolle unter Verwendung eines Saccharosekissens oder Immunaffinität abgetrennt wurden (18, 45, 46). Interessanterweise war PDCD6IP oder ALIX, das als eindeutiger Marker für das späte Endosom und die davon abgeleiteten Vesikel ein integraler Interaktor mit der ESCRT-Maschinerie bei der Vesikelbildung ist, nur unter den Proteinen mit der höchsten Häufigkeit in suEVs vor der Transplantation vorhanden. Dies gilt auch, wenn man den Filter auf die 50 wichtigsten Proteine ausweitet, was auf einen Rückgang der ALIXpositiven Vesikel hinweist, was möglicherweise Auswirkungen auf die Vesikelbildung und die späte Endosomenreifung während der Nierentransplantation hat. Ein weiteres Indiz für eine veränderte Freisetzung von Vesikeln ist der Rückgang von TSG101 unmittelbar nach der Transplantation, da TSG101 in einer kürzlich durchgeführten Studie als Ersatzmarker für die Anzahl der Bläschen im Urin vorgeschlagen wurde (47).
  • Der Anstieg der Serum-assoziierten Proteine zu den Zeitpunkten B-D kann Unterschiede in der EV-Packung sowie eine verringerte interzelluläre Barriere bei der Reperfusion widerspiegeln, die zum Übertritt von extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma in den Urinraum führt (48, 49). Die Tatsache, dass diese Proteine auch noch 4 Wochen nach der Transplantation (Zeitpunkt d) nachgewiesen werden, spricht jedoch eher dafür, dass sie aus Zellen des Nephrons stammen. Dies ist insbesondere für die nachgewiesenen Komplementfaktoren interessant, da unsere Ergebnisse auf eine Quelle innerhalb der Niere hindeuten und Komplement bei vielen Nierenpathologien und Transplantationsstörungen eine Rolle spielt (50, 51)
  • Bei den GO-Begriffsanalysen wurde der Begriff „Thrombozytendegranulation“ zu allen Zeitpunkten als hoch signifikant erkannt ( ). Da der gemeinsame Nenner der meisten Proteine, die mit diesem Begriff assoziiert sind, ihr Einbau in von Thrombozyten stammende extrazelluläre Vesikel ist (49) ist, gehen wir davon aus, dass diese Vesikel entweder durch die glomeruläre Filtrationsbarriere, den undichten interzellulären Raum oder durch aktiven transzellulären Transport ständig in den Harnraum gelangen. Ein möglicher Mechanismus hierfür wurde von Lenzini et al. vorgeschlagen, die berichteten, dass die fluktuierende Steifigkeit und Relaxation von Polymermatrizen es EVs, die größer als die tatsächliche Maschengröße sind, ermöglicht, ohne die Notwendigkeit einer Matrixdegradation hindurchzuwandern (52). Dieser Prozess scheint an der glomerulären Filtrationsbarriere besonders wahrscheinlich zu sein, da die Kapillaren eine konstante pulsierende Dehnung und Kontraktion mit dem Blutfluss aufweisen. Zukünftige Untersuchungen sollten sich mit den Auswirkungen von aus Thrombozyten gewonnenen EVs auf Nierenzellpopulationen befassen sowie mit der Frage, ob der Rückgang solcher Vesikel direkte Auswirkungen auf die Niere hat.
  • Der Anstieg der Proteine, die mit der Komplementaktivierung, der Komplementregulation und der Zytolyse in Zusammenhang stehen, spiegelt höchstwahrscheinlich die anfängliche Immunreaktion wider, die sowohl durch die Ischämie-Reperfusion als auch durch die Exposition gegenüber dem Allotransplantat ausgelöst wird. Dies lässt die Hypothese zu, dass eine frühe Blockade dieser Reaktionen - wahrscheinlich mit Schwerpunkt auf dem Komplementsystem - von Vorteil sein könnte (53, 54). Darüber hinaus könnte die Analyse von suEVs eine diagnostische Strategie zur Überwachung der Komplementaktivierung im Rahmen einer Nierentransplantation darstellen.
  • Die Signalübertragung durch den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) wird seit langem als Vermittler der Nierenfibrose nach einer Transplantation und im Verlauf verschiedener Nephropathien untersucht (55-60). Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass Derivate von Arachidonsäuren und ihre Mimetika antifibrotische Wirkungen haben und dass Polymorphismen in ihrem CYP-abhängigen Metabolismus die Anfälligkeit für Nierenschäden beeinflussen (61-63). Die Überrepräsentation dieser Prozesse in der Spender- und der 1-Jahres-Probe spiegelt nicht unbedingt zwei gegenläufige Mechanismen wider. Tatsächlich milderten EVs, die TLR4-tragende Zellen aktivieren, die Expression von Genen, die zur Lösung von Entzündungsprozessen führen, im Vergleich zur Aktivierung durch LPS (64). Da diese Prozesse in suEVs in der Spenderprobe und ein Jahr nach der Transplantation stark angereichert sind, könnte dies auf ein organspezifisches entzündungshemmendes Umfeld hinweisen, das durch extrazelluläre Vesikel moderiert wird.
  • Die GO-Begriffsanalyse der Unterschiede im suEV-Proteom zu den einzelnen Zeitpunkten im Vergleich zum gesunden (Spender-)Zustand zeigte die enormen und sich schnell anpassenden Veränderungen in der EV-Zusammensetzung und -Fracht. Auch hier ist die signifikante Anreicherung von Proteinen, die den Komplementweg aktivieren, nicht überraschend und bestätigt veröffentlichte Daten auf der Grundlage von Gewebeanalysen (53). Umgekehrt deutet die Anreicherung von Proteinen, die mit dem „Zusammenbau multivesikulärer Körper“ und der „viralen (Vesikel-)Knospung“ assoziiert sind, auf eine erhöhte Aktivität der EV-Produktion hin, die möglicherweise durch die Ischämie-Reperfusionsverletzung ausgelöst wurde, was sich auch in einem kontinuierlichen Anstieg der TSG101-Proteinhäufigkeit nach einem anfänglichen Einbruch direkt nach der Transplantation widerspiegelt (http://shiny.cecad.uni-koeln.de:3838/suEV/). Die Induktion der Vesikelproduktion wurde sowohl in Zellkultur-Schädigungssystemen als auch bei kardialer Ischämie bei Menschen und Mäusen beschrieben und mit der Rekrutierung von Monozyten in das geschädigte Gewebe in Verbindung gebracht (65, 66). Angesichts der Tatsache, dass die Verabreichung von EV nachweislich die Erholung der Nieren nach Ischämie-Reperfusionsschäden erleichtert (67) könnte unser Ergebnis auf einen intrinsischen Gegenmechanismus hindeuten.
  • Wir stellten die Hypothese auf, dass das suEV-Proteom nicht nur eine Ressource für die biologischen zeitlichen Veränderungen nach der Transplantation ist, sondern auch eine zukünftige Quelle für die Identifizierung von Biomarkern sein könnte. Eine Reihe von Proteinen, die in EVs früh nach der Transplantation nachgewiesen wurden, korrelierten eindeutig mit der eGFR 6 und 12 Monate später. Da eine robuste Identifizierung von Markerproteinen mit ungerichteter Proteomik bei einer begrenzten Anzahl von Patienten nicht möglich ist, strebten wir eine Validierung in einer separaten Kohorte an, die gerichtete Massenspektrometrie verwendet. Diese Validierung schränkte die Liste der potenziellen Marker stark ein. Am deutlichsten zeigte sich, dass die Marker, die von den Patienten mit anfänglicher Transplantatdysfunktion stammten, wenig stabil waren, was wahrscheinlich auf die geringe Anzahl von Patienten in dieser Gruppe zurückzuführen ist. Es wurde jedoch bestätigt, dass die PCK2-Häufigkeit im suEV-Pellet einen Tag nach der Transplantation mit der eGFR ein Jahr nach der Transplantation korreliert ( ). Diese Korrelation wurde weder bei der Messung zu einem anderen Zeitpunkt noch bei der Untersuchung der Unterschiede in der Abundanz zwischen den Zeitpunkten festgestellt ( ). Bemerkenswerterweise korrelierte die PCK2-Häufigkeit nicht mit der anfänglichen Spender-Clearance oder der Zeit der kalten Ischämie während der Transplantation ( ).
  • Dieser Befund deutet auf unbekannte Mechanismen bei der Transplantatanpassung oder Resistenz gegen Ischämie-Reperfusion hin, die durch die Untersuchung des suEV-Proteoms aufgedeckt wurden. Mechanistisch gesehen reagiert PCK2 nachweislich auf Zustände des metabolischen Mangels, insbesondere bei Krebs. Bei Glukoseentzug stabilisiert die Hochregulierung von PCK2 mit anschließender Glukoneogenese die Nährstoffversorgung und das Tumorwachstum, wobei das Wachstum bei Hemmung von PCK2 beeinträchtigt wird (68, 69). Dieser Prozess könnte auch bei der Nierentransplantation stattfinden, da PCK2 in hohem Maße im proximalen Tubulus exprimiert wird und das tubuläre Kompartiment das Hauptziel bei ischämischen und akuten Schäden in der Niere ist (70).
  • Ein Anstieg der PCK2-Spiegel könnte möglicherweise dem beobachteten Rückgang der Glukoneogenese ( ) zu den Zeitpunkten b, c und d entgegenwirken, wie unsere GO-Analyse zeigt. Es ist möglich, dass diese PCK2-Induktion nach der Reperfusion aktiviert wird, aber Zeit braucht, um in den Gewebeanalysen einen messbaren Spitzenwert zu erreichen. Dies würde erklären, warum wir in der Immunhistochemie keine Hinweise auf eine Korrelation zwischen den PCK2-Spiegeln im Gewebe direkt nach der Reperfusion und den suEV PCK2-Spiegeln einen Tag nach der Transplantation gefunden haben. Allerdings wird derzeit diskutiert, ob der suEV-Proteingehalt überhaupt mit dem Gewebeproteingehalt korreliert (71, 72). PCK2 ist ein mitochondriales Protein. Eine alternative Erklärung für den erhöhten PCK2-Gehalt in suEVs ohne eine Veränderung des zellulären Gehalts könnte eine Aktivierung der mitochondrialen Aktivität bei den vor Schäden geschützten Individuen und ein damit einhergehender Anstieg der Freisetzung dieses Proteins sein. Dies bleibt jedoch zum jetzigen Zeitpunkt Spekulation und erfordert weitere zellbiologische Untersuchungen.
  • Die hier vorgestellte Studie ist aufgrund des Protokolls für die Abtrennung und der gewählten Patientenkohorte mit Einschränkungen verbunden. Aufgrund des angewandten Protokolls können wir keine Rückschlüsse auf den tatsächlichen Vesikeltyp ziehen, der zu den Proteinsignalen beiträgt. Bis heute gibt es kein anerkanntes „Goldstandard“-Abtrennungsprotokoll, und die meisten Studien verwenden immer noch das weit verbreitete Protokoll der differentiellen (Ultra-)Zentrifugation (13, 15). Auch wir haben uns aus mehreren Gründen für eine Abwandlung dieser Protokolle entschieden. Die differentielle Ultrazentrifugation ermöglicht die Verwendung größerer Volumina der Ausgangsprobe und damit die Abtrennung von mehr EVs (18). Bei der differentiellen Ultrazentrifugation kann keine reine Vesikelfraktion abgetrennt werden, und es hat sich gezeigt, dass Filtrations- und Präzipitationstechniken auch freie Urinproteine unspezifisch aufkonzentrieren und dabei oft spezifische EV-Fraktionen aus dem abgetrennten Pellet ausschließen. Die Tatsache, dass die Massenspektrometrie der durch SEC abgetrennten suEVs die Daten, die wir bei den durch differentielle Ultrazentrifugation abgetrennten Vesikeln erhalten haben, gut rekapituliert, bestätigt die Validität dieses Ansatzes. Aufwändigere Techniken wie die Saccharose-Kissengradiententrennung würden jedoch eine Übertragung auf den klinischen Bereich äußerst schwierig machen.
  • Daher verglichen wir unseren Datensatz mit veröffentlichten Proteomanalysen von Urinvesikeln, die mit verschiedenen Trennverfahren gewonnen wurden, die vermutlich zu einer höheren Reinheit der Vesikel führen (35, 36) ( ). Die auffällige Überlappung unseres Datensatzes mit diesen Analysen und die geringe Menge der vorgeschlagenen mutmaßlichen Verunreinigungen sprechen für seine Zuverlässigkeit und biologische Relevanz. Die verbleibenden Diskrepanzen resultieren unserer Ansicht nach aus mehreren Unterschieden in diesen Protokollen. Oeyen et al. analysierten nur zwei Größenausschlusschromatographie-Fraktionen durch Massenspektrometrie, nachdem sie alle anderen Fraktionen sehr streng zensiert hatten, wodurch möglicherweise Vesikel verloren gingen, die wir effizienter trennen. Die Urinproben in der Studie von Dhondt et al. stammten teilweise von Patienten nach digitaler rektaler Untersuchung mit Prostatastimulation. Dieser Vergleich veranschaulicht sehr schön die ständige Diskussion und Notwendigkeit einer weiteren Standardisierung nicht nur der Trenntechniken, sondern auch der anschließenden proteomischen Analysen. Dies wird auch durch die Tatsache unterstrichen, dass PCK2, ein Protein, das wir in unseren Proben - sowohl mit UC als auch mit SEC aufbereitet - zuverlässig nachweisen und mit Hilfe von Immunogoldmarkierung in der Elektronenmikroskopie direkt in EVs lokalisieren, in keiner der verglichenen Studien nachgewiesen wurde. Ebenso haben mehrere Gruppen eine (unspezifische) Proteinbeschichtung von EVs vorgeschlagen, die mit allen verfügbaren Techniken mitsepariert werden kann und weiterer eingehender Analysen bedarf (73, 74).
  • Die Tatsache, dass Patienten ausgewählt wurden, die sich einer Lebendspendertransplantation unterzogen, führt zu einer Kohorte mit sehr kurzen kalten Ischämieperioden und hervorragenden Ergebnissen, die nicht unbedingt mit Transplantationen verstorbener Spender vergleichbar sind. Nichtsdestotrotz konnten wir auf diese Weise Proben aus einer gut standardisierten Kohorte mit ausreichenden Daten zur Spenderanamnese und Zugang zu repräsentativen Spenderproben einbeziehen. Obwohl es in Zukunft äußerst interessant sein wird, diesen Ansatz auf die Transplantation verstorbener Spender auszuweiten, war dieser Ansatz entscheidend, um einen ersten und vollständigen Atlas des suEV-Proteoms einer gesunden Spenderniere über periprozedurale Proben bis 1 Jahr nach der Transplantation zu erhalten. Aufgrund des Studiendesigns können wir nicht vollständig ausschließen, dass die beobachteten proteomischen Unterschiede zwischen Spendern und Empfängern teilweise auf den Wechsel von einem Zwei-Nieren-Status (Spender) zu einem Ein-Nieren-Status (Empfänger) zurückzuführen sind. In der hierarchischen Clusteranalyse des Proteomdatensatzes der ersten Kohorte stellen wir jedoch fest, dass das suEV-Proteom nach einem Monat und einem Jahr (d- und e-Proben) einen Subcluster mit den Spenderproben (a) teilt. Folglich werden die frühen Zeitpunkte (wie der Zeitpunkt c, an dem wir die PCK2-Häufigkeit analysieren) unserer Ansicht nach in erster Linie durch den Prozess der Nierentransplantation selbst beeinflusst.
  • Während unsere Studie das Potenzial von suEVs als Quelle für Biomarker zeigt, erlaubt die geringe Anzahl von Patienten (22 in der Screening-Kohorte, 22 in der Validierungs-Kohorte) keine eindeutige Aussage über die Vorhersagekraft von suEV PCK2. Ein möglicher Einsatz dieses Markers wird daher von zukünftigen größeren Studien abhängen. Unser Datensatz kann als erster Schritt dienen, um die Gestaltung solcher Studien zu unterstützen. Da PCK2 in Vesikeln nachgewiesen wurde, die durch Größenausschlusschromatographie abgetrennt wurden, und es in Immuno-Goldfärbungen in suEVs mit einer Größe von 100-400 nm lokalisiert wurde, können künftige Analysen Trennmethoden wie SEC einsetzen, um die Untersuchung von PCK2 in suEVs für ein breites Spektrum von Gruppen weltweit zu ermöglichen. Ebenso bietet der Zeitpunkt der Messung die Möglichkeit, den prädiktiven Wert bei der Transplantation verstorbener Spender zu validieren.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir mit Hilfe der differentiellen (Ultra-)Zentrifugation einen prägnanten Atlas zusammengestellt und analysiert haben, der die zeitlichen Veränderungen im Proteom kleiner extrazellulärer Urinbläschen im Verlauf einer Lebendspender-Nierentransplantation widerspiegelt. Wir entdeckten spezifische zeitliche Profile, z. B. einen Anstieg komplement-assoziierter Proteine kurz nach der Transplantation, was auf frühe immunologische Effekte hinweist. Darüber hinaus zeigte unser Ansatz, dass die Häufigkeit von Phosphoenol-Pyruvat-Carboxykinase (PCK2) im suEV-Proteom einen Tag nach der Transplantation einen prädiktiven Wert für die gesamte Nierenfunktion ein Jahr nach der Transplantation hat. Diese Studie unterstreicht das Potenzial der Analyse von suEVs für die Überwachung der Aktivität der Immunantwort und für die Entdeckung von Biomarkern unter Verwendung eines schnellen und einfachen Protokolls für ihre Abtrennung.
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  • Bezugszeichenliste
    • eGFR
    geschätzte glomeruläre Filtrationsrate
    EV
    extrazelluläres Vesikel
    GO
    Gen-Ontologie
    ISEV
    International Society of Extracellular Vesicles
    LFQ
    markierungsfreie Quantifizierung
    suEV
    kleines extrazelluläres Urinbläschen
    TEM
    Transmissionselektronenmikroskopie
  • Tabelle 1. Patientenmerkmale (Kohorte 1). Spender (A), Empfänger (B)
    Kategorie Unterkategorie Wert ± SD
    A (Spender)
    Alter (in Jahren) 51,50 ±11,09
    Geschlecht
    weiblich (%) 63,64
    männlich (%) 36,36
    Gewicht (kg) 76,95 ±13,52
    gemessene Clearance (ml/min/1,73m2) 126,10 ±32,21
    geschätzte GFR (CKD-EPI 2009) 92,91 ±12,64
    Bluthochdruck (%) 13,64
    ACE-Hemmer / AT1 R-Blocker (%) 13,64
    B (Empfänger)
    Alter (in Jahren) 45,68 ±15,86
    Geschlecht
    weiblich (%) 45,45
    männlich (%) 54,55
    Gewicht (kg) 69,89 ±17,03
    Diurese vor der Transplantation (%) 68,18
    Dialyse vor der Transplantation (%) 36,36
    Hämodialyse (%) 100
    Peritonealdialyse (%) 0
    Zeit an der Dialyse in Monaten 15,29 ±12,37
    Zugrundeliegende Nierenerkrankung
    genetisch (%) 31,82
    Diabetiker (%) 4,55
    Glomerulonephritis (%) 31,82
    andere (%) 31,82
    Retransplantation (ja (Anzahl) / nein)
    ja (2. Transplantation) (%) 9,09
    nein (%) 90,91
    CMV-Status (Empfänger/Spender)
    negativ/negativ (%) 18,18
    neg/pos (%) 18,18
    positiv/negativ (%) 13,64
    pos/pos (%) 50,00
    Induktion
    ATG (%) 9,09
    Basiliximab (%) 90,91
    Anfängliche Immunsuppression
    Prednisolon / Cyclosporin A / MMF (%) 27,27
    Prednisolon / Tacrolimus / MMF (%) 72,73
    Kalte Ischämiezeit (in min) 174,00 ±26,80
    GFR nach 6 Monaten 49,82 ±15,58
    GFR nach 12 Monaten 53,23 ±16,88
    Dialyse innerhalb von 1 Woche (verzögerte Transplantatfunktion) 0
    Abstoßungen innerhalb von 1 Jahr 3
    Humoral (%) 100,00
    Borderline (%) 66,66
    Zellulär (%) 0
    Tabelle 2. Liste der Biomarker-Proteinkandidaten
    Herkunft der Liste Namen von Proteinen
    Korreliert mit der 12-Monats-GFR mit dem niedrigsten RSS-Quadrat-Mittelwert und der niedrigsten SD Galaktokinase
    BH3-interacting domain death agonist;BH3-interacting domain death agonist p15; BH3-interacting domain death agonist p13; BH3-interacting domain death agonist p11
    Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2
    Prominin-1
    V-Typ Protonen-ATPase-Untereinheit S1
    Myocilin
    Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C;Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C-like protein
    40S ribosomal protein SA
    Complement C1q subcomponent subunit B
    Tetranectin
    2-Deoxynukleosid-5-Phosphat-N-Hydrolase 1
    Charged multivesicular body protein 2a
    DnaJ homolog subfamily A member 2
    Cadherin-16
    Monocyte differentiation antigen CD14;Monocyte differentiation antigen CD14, urinary form;Monocyte differentiation antigen CD14, membrane-bound form;Monocyte differentiation antigen CD14
    Collagen alpha-2(IV) chain;Canstatin
    Glutathion-S-Transferase A2;Glutathion-S-Transferase
    Villin-1
    Excitatory amino acid transporter 3
    26S protease regulatory subunit 8
    Spectrin beta chain, non-erythrocytic 1
    Galectin-3-bindendes Protein
    Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta
    Importin-Untereinheit beta-1
    Regulatorische Untereinheit 7 der Proteinphosphatase 1
    Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase [GTP], mitochondrial
    Decorin
    Ragulator-Komplex-Protein LAMTOR1
    Annexin;Annexin A4
    Alpha-(1,3)-Fucosyltransferase
    Protocadherin Fat 4
    Sortilin-related receptor
    SLIT and NTRK-like protein 1
    Protein amnionless
    Komplement C1r-Unterkomponente-ähnliches Protein
    Peflin
    Korreliert sowohl mit der 6-Monats- als auch der 12-Monats-GFR mit dem niedrigsten RSS-Quadrat IgGFc-bindendes Protein
    ATP-abhängige RNA-Helikase DDX3X;ATP-abhängige RNA-Helikase DDX3Y
    Cartilage oligomeric matrix protein
    BH3-interacting domain death agonist;BH3-interacting domain death agonist p15; BH3-interacting domain death agonist p13; BH3-interacting domain death agonist p11
    DnaJ homolog subfamily A member 2
    Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase [GTP], mitochondrial
    Haptoglobin-related protein
    Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C;Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C-like protein
    40S ribosomal protein SA
    Syntenin-1
    Fructosamin-3-Kinase
    Top5 - nicht nachweisbar bei früher Transplantatdysfunktion Transcription elongation factor B polypeptide 1
    Ras-related protein Rab-27B
    Natrium-abhängiges Phosphat-Transportprotein 2A
    Calbindin
    Copine-8
    Top10-größere Häufigkeit bei nicht-früher Transplantatdysfunktion Glutamat-Carboxypeptidase 2
    CD177-Antigen
    Protein-Glutamin-Gamma-Glutamyltransferase 4
    Arylsulfatase F
    Semenogelin-1 ;Alpha-inhibin-92;Alpha-inhibin-31 ;Seminal basic protein
    40S ribosomal protein S17-like;40S ribosomal protein S17
    60S ribosomales Protein L23a
    Histon H2B Typ 1-D;Histon H2B
    Komplementkomponente C6
    Podocalyxin
    Marker für extrazelluläre Vesikel TSG101
    ALIX
    CD81
    CD40, Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5
    Annexin A5
    Tabelle 3. Patientenmerkmale (Kohorte 2). Spender (A), Empfänger (B)
    Kategorie Unterkategorie Wert ± SD
    A (Spender)
    Alter (in Jahren) 53,77 ±10,7
    Geschlecht
    weiblich (%) 50,00
    männlich (%) 50,00
    Gewicht (kg) 79,53 ±14,27
    gemessene Clearance (ml/min/1,73m2) 116,00 ±22,90
    geschätzte GFR (CKD-EPI 2009) 94,73 ±16,82
    Bluthochdruck (%) 31,82
    ACE-Hemmer / AT1 R-Blocker (%) 31,82
    B (Empfänger)
    Alter (in Jahren) 46,05 ±15,06
    Geschlecht
    weiblich (%) 45,45
    männlich (%) 54,55
    Gewicht (kg) 81,21 ±15,02
    Diurese vor der Transplantation (%) 77,27
    Dialyse vor der Transplantation (%) 50,00
    Hämodialyse (%) 90,90
    Peritonealdialyse (%) 9,09
    Zeit an der Dialyse in Monaten 16,24 ±43,90
    Zugrundeliegende Nierenerkrankung I
    genetisch (%) 31,82
    Diabetiker (%) 0,00
    Glomerulonephritis (%) 18,18
    andere (%) 50,00
    Retransplantation (ja (Anzahl) / nein) I
    ja (2. Transplantation) (%) 9,09
    nein (%) 90,91
    CMV-Status (Empfänger/Spender)
    negativ/negativ (%) 18,18
    neg/pos (%) 18,18
    positiv/negativ (%) 13,64
    pos/pos (%) 50,00
    Induktion
    ATG (%) 0,00
    Basiliximab (%) 100,00
    Anfängliche Immunsuppression i
    Prednisolon / Cyclosporin A / MMF (%) 22,73
    Prednisolon / Tacrolimus / MMF (%) 72,73
    Kalte Ischämiezeit (in min) 172,70 ±23,62
    GFR nach 6 Monaten 53,33 ±16,18
    GFR nach 12 Monaten 59,16 ±20,50
    Dialyse innerhalb von 1 Woche (verzögerte Transplantatfunktion) 0
    Abstoßungen innerhalb von 1 Jahr 8
    Humoral (%) 75,00
    Borderline (%) 0
    Zellulär (%) 37,50
  • Figurenliste
    • : Differenzialzentrifugation trennt kleine extrazelluläre Urinvesikel (suEVs) aus allen Segmenten des Nephrons. Schematischer Überblick über das verwendete Protokoll der differentiellen Zentrifugation (A). Repräsentative Rasterelektronenmikroskopie von suEV-Pellets zeigt EVs in typischer exosomaler Becherform und -größe sowie kleinere und größere Partikel. Maßstab: 100nm (B). Größenverteilung von suEVs in 4 unabhängigen suEV-Proben gesunder Probanden, gemessen mit Nanoparticle Tracking, bin: 30nm, Fehlerbalken: SD, (C). Repräsentative Western-Blot-Analyse für die exosomalen Marker ALIX und TSG101 in zwei separaten suEV-Pellets nach 1 und 6 Monaten Lagerung in 8M Hamstoffpuffer bei -80°C (D). Massenspektrometrie-Analyse suEV-Pellet ist in der Lage, Proteine aller Nephronabschnitte zu markieren. IBAQ: Intensitätsbasierte absolute Quantifizierung (a.u.) (E) Schematischer Überblick über das verwendete Probeentnahmeprotokoll während der Lebendspendertransplantation, a: Spenderprobe; b: Empfängerprobe Tag 0; c: Empfängerprobe Tag 1; d: Empfängerprobe 1 Monat; e: Empfängerprobe 1 Jahr (F).
    • : Das suEV-Proteom clustert in Abhängigkeit vom Entnahmezeitpunkt während der Lebendspender-Nierentransplantation. Hierarchisches Clustering aller Einzelproben-Proteinmessungen der ersten Kohorte (A). Die 20 häufigsten annotierten Proteine für jeden Zeitpunkt der Probenentnahme (B). Bubble-Plots der 10 häufigsten GO-Begriffe für jeden Zeitpunkt der Probenentnahme. Der P-Wert ist als Farbcode dargestellt, die Anzahl der annotierten Proteine entspricht der Größe der Blase, schwarze GO-Begriffe stehen für biologische Prozesse, graue GO-Begriffe für molekulare Funktionen. (C: Zeitpunkt A - Spenderprobe, D: Zeitpunkt B - Tag 0, E: Zeitpunkt C - Tag 1, F: Zeitpunkt D - 1 Monat, G: Zeitpunkt E - 1 Jahr).
    • : Das suEV-Proteom unterliegt spezifischen zeitlichen Veränderungen, die auf spezifische biologische Prozesse bei der Allotransplantatanpassung hinweisen. Hierarchisches Clustering der mittleren relativen Proteinhäufigkeit pro Zeitpunkt (A). Spaghetti-Plots, die suEV-Proteincluster mit spezifischen zeitlichen Veränderungen während der Nierentransplantation darstellen, mit angereicherten GO-Begriff-Balkengrafiken unterhalb jedes Clusters. Der Farbcode zeigt die Clusterzweige auf der in 3A dargestellten Heatmap an (B-J). a: Spenderprobe; b: Empfängerprobe Tag 0; c: Empfängerprobe Tag 1; d: Empfängerprobe 1 Monat; e: Empfängerprobe 1 Jahr.
    • : Die PCK2-Häufigkeit in suEVs am ersten Tag nach der Transplantation korreliert mit der geschätzten GFR 12 Monate nach der Transplantation. Korrelationsplots der PCK2-Intensitätsveränderung zur mittleren Intensität zum Zeitpunkt C zur GFR 12 Monate nach Transplantation, gemessen in der ersten Transplantationskohorte (A). Signifikanzniveaus von Spender- und Empfängermerkmalen zusammen mit der PCK2-Intensitätsveränderung zum Mittelwert zum Zeitpunkt C korreliert mit der GFR 12 Monate nach der Transplantation durch lineare Regression (B). Boxplot, der die PCK2-Intensität im Vergleich zum Mittelwert zum Zeitpunkt c anzeigt, verglichen mit dem Geschlecht des Empfängers (C). Korrelationsdiagramme der PCK2-Intensitätsveränderung zum Mittelwert zum Zeitpunkt C im Vergleich zur eGFR des Spenders (D) und zur kalten Ischämie (E), gemessen in der ursprünglichen Kohorte. Korrelationsdiagramme der PCK2-Intensitätsveränderung zur mittleren Intensität zum Zeitpunkt C zur GFR 12 Monate nach der Transplantation, gemessen in der ursprünglichen Transplantationskohorte (F). Blau: individuelle lineare Regressionsmodelle; Rot: zusammengefasstes lineares Regressionsmodell für alle Proben.
    • : PCK2 ist in suEVs lokalisiert, steigt in der Anfangsphase der Transplantation an und korreliert nicht mit den PCK2-Werten im Gewebe nach der Reperfusion. PCK2-Häufigkeit (dargestellt für drei verschiedene PRM-Assays/Peptide) in durch Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennten suEVs im Vergleich zur Ultrazentrifugation (UC), dargestellt als Boxplot-Diagramme mit Mittelwert (rote Linie), oberem und unterem Quartil (blauer Kasten), 95%-Konfidenzintervall (graue Whisker) und Ausreißern (graue Kreise) (A) oder Heatmap zur Veranschaulichung von Einzelprobenwerten, Zahlen stellen einzelne Proben dar; n.d.: nicht nachgewiesen (B). Elektronenmikroskopische Darstellung von permeabilisierten kleinen extrazellulären Urinvesikeln, die immunogoldmarkiertes PCK2 beinhalten, Skalenbalken 200 nm (C). Boxplot-Diagramme, die die suEV PCK2-Häufigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten während der Lebendspender-Nierentransplantation in der Erst- und Validierungskohorte darstellen. Mittelwert (rote Linie), oberes und unteres Quartil (blauer Kasten), 95% Konfidenzintervall (graue Whisker) (D). Immunhistochemische Färbung für PCK2 in Nierenbiopsien von zwei Spendern/Patienten (Probe 1 / 2), die in die suEV-Analyse aufgenommen wurden, vor der Explantation (prä) und nach der Reperfusion (post). suEV PCK2 LFQs zum Zeitpunkt C in der unteren linken Ecke, Skalenbalken 100µm (E), a: Spenderprobe; b: Empfängerprobe Tag 0; c: Empfängerprobe Tag 1; d: Empfängerprobe 1 Monat; e: Empfängerprobe 1 Jahr.
    • : Differenzielle Zentrifugation führt zu einer Verringerung des Verhältnisses von Uromodulin zu TSG und trennt kleine Tetraspanin-haltige Vesikel ab. Größenverteilung von suEVs gemessen im SEM von 2 unabhängigen Proben gesunder Probanden (A). Western-Blot-Analyse und Densitometrie von Uromodulin und TSG101 in 2 unabhängigen Proben gesunder Freiwilliger (B). Durchflusszytometrischer Bead-Assay für die Tetraspanine CD9, CD63, CD81 und Phosphatidylserin (PS) bei 4 unabhängigen Proben gesunder Probanden (C).
    • : Validierung der suEV-Trennung durch Größenausschlusschromatographie im Vergleich zur Ultrazentrifugation. Größenverteilung von suEVs, gemessen in 3 unabhängigen suEV-Proben gesunder Probanden, getrennt durch Ultrazentrifugation (UC) oder Größenausschlusschromatographie (SEC), gemessen durch Nanoparticle Tracking, bin: 30nm, Fehlerbalken: SD, (A). Durchflusszytometrischer Bead-Assay für die Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 von 3 unabhängigen Proben gesunder Freiwilliger, die durch Ultrazentrifugation (UC) oder Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennt wurden (B).
    • : Vergleich des durch SEC und UC aufgetrennten suEV-Proteoms und der Überlappung der Spenderprobe (Zeitpunkt a) mit veröffentlichten Daten. Venn-Diagramm der Überlappung des suEV-Proteoms von Vesikeln, die durch Größenausschlusschromatographie (SEC) oder Ultrazentrifugation (UC) aufgetrennt wurden, mit den vorgeschlagenen mutmaßlichen Verunreinigungen der Urinvesikel (A). Venn-Diagramm der Überlappung zwischen dem suEV-Proteom zum Zeitpunkt a und den vorgeschlagenen mutmaßlichen Verunreinigungen der Urin-Vesikel (35) (B). Venn-Diagramm der Überlappung zwischen dem suEV-Proteom zum Zeitpunkt a und veröffentlichten Daten (35, 36) (C). Streudiagramm, das die mittlere LFQ im Verhältnis zum Protein-Rank der Proteine darstellt, die in 50 % der Vesikelproben nachgewiesen wurden, die mittels SEC oder UC aus Urinproben gesunder Probanden getrennt wurden. Der Protein-Rank reicht von 1-510 in SEC- und 1-1248 in UC-Proben. Dargestellt sind Markerproteine für extrazelluläre Vesikel (D), Podozyten (E), proximalen Tubulus (F), distalen Tubulus (G), Sammelkanal (H), Verbindungstubulus (I) und die 20 häufigsten Proteine, die zu allen Zeitpunkten in der Transplantationskohorte von suEV nachgewiesen wurden (J).
    • : Angereicherte GO-Begriffsanalyse der absoluten Proteinquantifizierung pro Zeitpunkt. Blasendiagramme der 10 wichtigsten GO-Begriffe, die für jeden Zeitpunkt der Probensammlung angereichert wurden. P-Wert als Farbcode dargestellt, Anzahl der annotierten Proteine entsprechend der Blasengröße, schwarze GO-Begriffe, die biologische Prozesse anzeigen, graue GO-Begriffe, die molekulare Funktionen anzeigen (A: Zeitpunkt A, B: Zeitpunkt B, C: Zeitpunkt C, D: Zeitpunkt D, E: Zeitpunkt E).
    • : Signifikante GO-Begriffsanalyse der Proteinveränderungen im Vergleich zur ursprünglichen Spenderprobe. Die 10 wichtigsten GO-Begriffe für jeden Zeitpunkt nach der Transplantation im Vergleich zu den ursprünglichen Spenderproben. P-Wert als Farbcode dargestellt, Anzahl der annotierten Proteine entsprechend der Blasengröße, schwarze GO-Begriffe, die biologische Prozesse anzeigen, graue GO-Begriffe, die molekulare Funktionen anzeigen (A: Zeitpunkt B gegenüber A, B: Zeitpunkt C gegenüber A, C: Zeitpunkt D gegenüber A, D: Zeitpunkt E gegenüber A).
    • : Angereicherte GO-Begriffsanalyse der Proteinveränderungen im Vergleich zur ursprünglichen Spenderprobe. Die 10 wichtigsten GO-Begriffe, die für jeden Zeitpunkt nach der Transplantation im Vergleich zu den ursprünglichen Spenderproben angereichert wurden. P-Wert als Farbcode dargestellt, Anzahl der annotierten Proteine entsprechend der Blasengröße, schwarze GO-Begriffe, die biologische Prozesse anzeigen, graue GO-Begriffe, die molekulare Funktionen anzeigen (A: Zeitpunkt B gegenüber A, B: Zeitpunkt C gegenüber A, C: Zeitpunkt D gegenüber A, D: Zeitpunkt E gegenüber A).
    • : Lineare Regressionsanalyse, die klinische Parameter und PCK2-Häufigkeit mit dem langfristigen Transplantationsergebnis korreliert. Regressionstabellen für die multiple lineare Regression mit (A) 12-Monats-EGFR oder (B) 6-Monats-EGFR als abhängige Variable. OLS = gewöhnliche kleinste Quadrate, Adj. R2 = bereinigtes R2, Schätzung = Schätzung, S.E. = Standardfehler, t-Wert = t-Wert und p = p-Wert. Prädiktoren mit einem p-Wert ≤0,05 wurden in rot markiert.
    • : Die PCK2-Häufigkeit in suEVs zu anderen Zeitpunkten korreliert nicht mit der geschätzten GFR 12 Monate nach der Transplantation. Korrelationsdiagramme der PCK2-Intensitätsveränderung zur mittleren Intensität zum Zeitpunkt C zur GFR 12 Monate nach der Transplantation, gemessen in der ersten Transplantationskohorte, aufgeteilt nach weiblichen (A) und männlichen (B) Empfängern. Korrelationsdiagramme der PCK2-Intensitätsveränderung zum Mittelwert der Intensität zum Zeitpunkt A (C) und B (D) und der Veränderungen zwischen den Zeitpunkten A vs. B (E), A vs. C (F) und B vs. C (G) zur GFR 12 Monate nach der Transplantation, gemessen in der Validierungskohorte. Blau: individuelle lineare Regressionsmodelle; Rot: zusammengeführtes lineares Regressionsmodell für alle Proben.
    • : PCK2 ist in suEVs lokalisiert, steigt in der Anfangsphase der Transplantation an und korreliert nicht mit den PCK2-Spiegeln im Gewebe nach der Reperfusion. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von nicht permeabilisierten kleinen extrazellulären Urinvesikeln nach Immunogoldfärbung für PCK2, Maßstab 100 nm (A).
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims (15)

  1. Verfahren zur Vorhersage oder Prognose der Nierenfunktion eines Patienten nach Nierentransplantation oder akuter Nierenschädigung, wobei das Verfahren die Bestimmung des Spiegels der mitochondrialen Form der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase PCK2 (SEQ ID NO: 1) in vitro in einer Urinprobe des Patienten umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eines Patienten kleine extrazelluläre Urinvesikel (suEVs) umfasst, wobei vorzugsweise der Spiegel der PCK2 (SEQ ID NO:1) in suEVs bestimmt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die suEVs aus der Urinprobe durch Ultrazentrifugation bei 100.000 g oder mehr für 30 Minuten oder mehr und/oder Größenausschlusschromatographie vor der Bestimmung der PCK2 (SEQ ID NO: 1)-Spiegel abgetrennt werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Bestimmung des PCK2-Spiegels (SEQ ID NO: 1) unter Verwendung gerichteter Massenspektrometrie („targeted MS“) durchgeführt wird, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer der Peptide HGVFVGSAMR (SEQ ID NO: 2), EGALDLSGLR (SEQ ID NO: 3) und TMYVLPFSMGPVGSPLSR (SEQ ID NO: 4), weiter vorzugsweise mit HGVFVGSAMR (SEQ ID NO: 2) und EGALDLSGLR (SEQ ID NO: 3) in Kombination.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren zur Vorhersage der Nierenfunktion nach einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung handelt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren an einer Probe eines Patienten durchgeführt wird, der ein Nierentransplantat erhalten hat, wobei das Nierentransplantat weiter vorzugsweise nicht von einem verstorbenen Spender stammt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Bestimmung des PCK2-Spiegels (SEQ ID NO: 1) zwischen 12 und 48 Stunden nach der Nierentransplantation, vorzugsweise zwischen 18 und 36 Stunden nach der Nierentransplantation, weiter vorzugsweise etwa 24 Stunden nach der Nierentransplantation, durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren zur Prognose der Nierenfunktion eines Patienten handelt, der keine Nierentransplantation erhalten hat, wobei das Verfahren zur Prognose der Nierenfunktion vorzugsweise die Prognose oder Diagnose einer akuten tubulären Schädigung umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Patient eine Ischämie erlitten hat, vorzugsweise im Verlauf einer Operation unter kardiopulmonalem Bypass (CBP) oder verursacht durch Sepsis, oder der Patient eine toxische akute tubuläre Schädigung erlitten hat, vorzugsweise verursacht durch eine vorherige Verabreichung von Cisplatin oder Kontrastmitteln.
  10. Verfahren zur Überwachung von Patienten, die eine Nierentransplantation erhalten haben, wobei die Häufigkeit der Überwachung der Patienten auf der Grundlage der Ergebnisse des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bestimmt wird.
  11. Verfahren zur Überwachung von Patienten, die keine Nierentransplantation erhalten haben und ein anderes Leiden aufweisen, das bekanntermaßen mit Nierenschäden assoziiert ist, wobei die Häufigkeit der Überwachung der Patienten auf der Grundlage der Ergebnisse des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 8 oder 9 bestimmt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei Patienten, die einen verminderten Spiegel der mitochondrialen Form der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase PCK2 (SEQ ID NO: 1) aufweisen, häufiger auf Nierenfunktion und/oder Akzeptanz einer Nierentransplantation überwacht werden.
  13. Verwendung von PCK2 (SEQ ID NO: 1) als Biomarker für die Nierenfunktion in vitro in Urinproben eines Patienten, wobei der PCK2-Spiegel vorzugsweise durch gerichtete Massenspektrometrie („targeted MS“) unter Verwendung von einem oder mehreren von HGVFVGSAMR (SEQ ID NO: 2), EGALDLSGLR (SEQ ID NO: 3) und TMYVLPFSMGPVGSPLSR (SEQ ID NO: 4) bestimmt wird, weiter vorzugsweise mit HGVFVGSAMR (SEQ ID NO: 2) und EGALDLSGLR (SEQ ID NO: 3) in Kombination.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei PCK2 (SEQ ID NO: 1) als Biomarker bei Patienten mit Nierentransplantaten verwendet wird.
  15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei PCK2 (SEQ ID NO: 1) als Biomarker bei Patienten mit einem Leiden verwendet wird, von dem bekannt ist, dass es mit einer Nierenschädigung verbunden ist, das keine Nierentransplantation ist.
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