DE102019100419A1

DE102019100419A1 - Angle variable lighting for phase contrast imaging with absorption filter

Info

Publication number: DE102019100419A1
Application number: DE102019100419.5A
Authority: DE
Inventors: Lars Stoppe; Dirk Döring; Thomas Milde
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2020-07-09
Also published as: WO2020144228A1; CN113302538A

Abstract

Ein System (90) umfasst ein Mikroskop (100) mit einem Beleuchtungsmodul (111), einem Probenhalter (113), einem Detektor (114) und einer zwischen dem Probenhalter (113) und dem Detektor (114) angeordneten Abbildungsoptik (112). Das System umfasst auch mindestens eine Recheneinheit (115), die eingerichtet ist, um das Beleuchtungsmodul (111) anzusteuern, um ein Probenobjekt (390) mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381, 382) zu beleuchten, und um den Detektor (114) anzusteuern, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381, 382) entsprechen. Das System umfasst ferner einen Absorptionsfilter (800), der in der Abbildungsoptik (112) angeordnet ist und der eine ortsabhängige Absorptionsrate (810) aufweist.A system (90) comprises a microscope (100) with an illumination module (111), a sample holder (113), a detector (114) and an imaging optics (112) arranged between the sample holder (113) and the detector (114). The system also comprises at least one computing unit (115), which is set up to control the lighting module (111), to illuminate a sample object (390) with light from a plurality of lighting directions (700-703, 381, 382) and to the detector (114) to capture images that each correspond to one of the plurality of lighting directions (700-703, 381, 382). The system further comprises an absorption filter (800) which is arranged in the imaging optics (112) and which has a location-dependent absorption rate (810).

Description

TECHNISCHES GEBIETTECHNICAL AREA

Verschiedene Beispiele der Erfindung betreffen im Allgemeinen ein System umfassend ein Mikroskop und mindestens eine Recheneinheit. Dabei umfasst das Mikroskop ein Beleuchtungsmodul, welches eingerichtet ist, um ein Probenobjekt mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Mittels der Recheneinheit kann eine digitale Nachbearbeitung durchgeführt werden, um ein Ergebnisbild mit maßgeschneidertem Kontrast zu erhalten. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Absorptionsfilters, der in einer Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet ist.Various examples of the invention generally relate to a system comprising a microscope and at least one computing unit. The microscope comprises an illumination module which is set up to illuminate a sample object with light from several illumination directions. A digital postprocessing can be carried out by means of the computing unit in order to obtain a result image with a tailored contrast. The invention relates in particular to the use of an absorption filter which is arranged in an imaging optics of the microscope.

HINTERGRUNDBACKGROUND

In der optischen Bildgebung von Probenobjekten kann es häufig erstrebenswert sein, ein sogenanntes Phasenkontrastbild des Probenobjekts zu erzeugen. In einem Phasenkontrastbild ist zumindest ein Teil des Bildkontrasts durch eine Phasenverschiebung des Lichts durch das abgebildete Probenobjekt bedingt. Damit können insbesondere solche Probenobjekte mit vergleichsweise hohem Kontrast abgebildet werden, die keine oder nur eine geringe Schwächung der Amplitude bewirken, jedoch eine signifikante Phasenverschiebung; solche Probenobjekte werden oftmals auch als Phasenobjekte bezeichnet. Typischerweise können biologische Proben als Probenobjekt in einem Mikroskop eine vergleichsweise größere Phasenänderung als Amplitudenänderung des elektromagnetischen Felds bewirken.In optical imaging of sample objects, it can often be desirable to generate a so-called phase contrast image of the sample object. In a phase contrast image, at least part of the image contrast is caused by a phase shift of the light by the sample object depicted. In this way, in particular, those specimen objects with a comparatively high contrast can be imaged which cause no or only a slight attenuation of the amplitude, but a significant phase shift; such specimens are often referred to as phase objects. Typically, biological samples as a sample object in a microscope can cause a comparatively larger phase change than a change in the amplitude of the electromagnetic field.

Es sind verschiedene Techniken zur Phasenkontrast-Bildgebung bekannt, etwa die Dunkelfeldbeleuchtung, die schiefe Beleuchtung, der differenzielle Interferenzkontrast (DIC) oder auch der Zernike-Phasenkontrast.Various techniques for phase contrast imaging are known, such as dark field illumination, oblique illumination, differential interference contrast (DIC) or Zernike phase contrast.

Solche vorgenannten Techniken weisen diverse Nachteile oder Einschränkungen auf. Oftmals kann es erforderlich sein, zusätzliche optische Elemente zwischen Probe und Detektor im Bereich der sogenannten Abbildungsoptik bereitzustellen, um die Phasenkontrast-Bildgebung zu ermöglichen. Daraus können konstruktive Einschränkungen resultieren. Weiterhin können applikative Einschränkungen bestehen: Zum Beispiel kann die Fluoreszenz-Bildgebung durch Vorsehen der zusätzlichen optischen Elemente erschwert werden.Such techniques mentioned above have various disadvantages or limitations. It may often be necessary to provide additional optical elements between the sample and detector in the area of the so-called imaging optics in order to enable phase-contrast imaging. This can result in design restrictions. There may also be application restrictions: For example, fluorescence imaging can be made more difficult by providing the additional optical elements.

Es sind auch Techniken bekannt, bei denen mittels sog. winkelvariabler Beleuchtung ein Phasenkontrast erzielt werden kann. Dabei soll winkelvariable Beleuchtung im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung eine Technik bezeichnen, bei der das Probenobjekt vollflächig mit unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien beleuchtet werden kann, d.h. insbesondere aus unterschiedlichen Beleuchtungsrichtungen. Eine Beleuchtungsgeometrie wird durch ein oder mehrere Beleuchtungsrichtungen implementiert.Techniques are also known in which phase contrast can be achieved by means of so-called angle-variable illumination. In the context of the present disclosure, variable-angle lighting is intended to denote a technique in which the specimen object can be illuminated over its entire area with different lighting geometries, i.e. especially from different lighting directions. An illumination geometry is implemented by one or more directions of illumination.

Ein erstes Beispiel von Techniken, die mittels winkelvariabler Beleuchtung ein Bild mit Phasenkontrast erzielen können, ist in DE 10 2014 112 242 A1 offenbart. Siehe auch: Tian, Lei, and Laura Waller. „3D intensity and phase imaging from light field measurements in an LED array microscope.“ optica 2.2 (2015): 104-111. Solche Techniken weisen jedoch bestimmte Einschränkungen auf. Beispielsweise wurde es beobachtet, dass bei solchen Techniken die Stärke des Phasenkontrasts abnimmt, wenn die numerische Detektorapertur größer ist, als die numerische Beleuchtungsapertur. Andererseits kann es aber im Zusammenhang mit der hochauflösenden Bildgebung erstrebenswert sein, wenn eine größere numerische Detektorapertur verwendet wird.A first example of techniques that can achieve an image with phase contrast by means of variable-angle illumination is in DE 10 2014 112 242 A1 disclosed. See also: Tian, Lei, and Laura Waller. "3D intensity and phase imaging from light field measurements in an LED array microscope." Optica 2.2 (2015): 104-111. However, such techniques have certain limitations. For example, it has been observed that with such techniques, the strength of the phase contrast decreases when the numerical detector aperture is larger than the numerical illumination aperture. On the other hand, it may be desirable in connection with high-resolution imaging if a larger numerical detector aperture is used.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

Deshalb besteht ein Bedarf für verbesserte Techniken zur Phasenkontrast-Bildgebung. Insbesondere besteht ein Bedarf für Techniken zur Phasenkontrast-Bildgebung, die zumindest einige der oben genannten Nachteile und Beschränkungen beheben.Therefore, there is a need for improved phase contrast imaging techniques. In particular, there is a need for phase contrast imaging techniques that overcome at least some of the above disadvantages and limitations.

Diese Aufgabe wird von den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Die Merkmale der abhängigen Patentansprüche definieren Ausführungsformen. This object is solved by the features of the independent claims. The features of the dependent claims define embodiments.

In einem Beispiel umfasst ein System ein Mikroskop. Das Mikroskop weist ein Beleuchtungsmodul, einen Probenhalter und einen Detektor auf. Das Mikroskop weist auch eine Abbildungsoptik auf, die zwischen dem Detektor und dem Probenhalter angeordnet ist. Außerdem umfasst das System auch mindestens eine Recheneinheit. Dabei ist die mindestens eine Recheneinheit eingerichtet, um das Beleuchtungsmodul anzusteuern, um ein Probenobjekt mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Außerdem ist die mindestens eine Recheneinheit auch eingerichtet, um den Detektor anzusteuern, um Bilder zu erfassen. Dabei entsprechen die Bilder jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen. Das System umfasst ferner einen Absorptionsfilter. Dieser ist in der Abbildungsoptik angeordnet. Der Absorptionsfilter weist eine ortsabhängige Absorptionsrate auf.In one example, a system includes a microscope. The microscope has an illumination module, a sample holder and a detector. The microscope also has imaging optics which are arranged between the detector and the sample holder. The system also includes at least one computing unit. The at least one computing unit is set up to control the lighting module in order to illuminate a sample object with light from a plurality of lighting directions. In addition, the at least one computing unit is also set up to control the detector in order to acquire images. The images correspond to one of the several lighting directions. The system also includes an absorption filter. This is arranged in the imaging optics. The absorption filter has a location-dependent absorption rate.

Es ist möglich, dass die Beleuchtungsrichtungen unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien implementieren. Dabei kann eine Beleuchtungsgeometrie jeweils durch ein oder mehrere Beleuchtungsrichtungen ausgebildet sein.It is possible that the lighting directions implement different lighting geometries. One can Illumination geometry can each be formed by one or more illumination directions.

Solche Techniken können entsprechend auch als winkelvariable Beleuchtung bezeichnet werden, weil jeweils unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien zur vollflächigen Beleuchtung des Probenobjekts bzw. des Probenhalters eingesetzt werden.Such techniques can also be referred to as variable-angle lighting, because different lighting geometries are used to illuminate the entire surface of the sample object or the sample holder.

Durch die Verwendung unterschiedlicher Beleuchtungsrichtungen bzw. unterschiedlicher Beleuchtungsgeometrien können die entsprechenden Bilder unterschiedliche Kontraste aufweisen. Insbesondere können bei Phasenobjekten die Bilder unterschiedliche Kontraste aufweisen. Dann ist es möglich, durch Kombination der Bilder ein Ergebnisbild mit einem Phasenkontrast zu erzeugen.By using different lighting directions or different lighting geometries, the corresponding images can have different contrasts. In particular, in the case of phase objects, the images can have different contrasts. It is then possible to generate a result image with a phase contrast by combining the images.

Beispielsweise könnte in diesem Zusammenhang die mindestens eine Recheneinheit weiterhin eingerichtet sein, um die Bilder zum Erhalten des Ergebnisbilds miteinander zu kombinieren. Das Ergebnisbild kann einen Phasenkontrast aufweisen. Dabei können - je nach Art der Kombination - unterschiedliche Phasenkontraste erzielt werden, z.B. nicht-quantitative Phasenkontraste oder ein Phasengradientenkontrast aufweisen. Entsprechende Techniken sind unter anderem offenbart in: DE 10 2014 112 242 A1 und DE 10 2017 108 873 A1 .In this context, for example, the at least one computing unit could also be set up to combine the images to obtain the result image. The result image can have a phase contrast. Depending on the type of combination, different phase contrasts can be achieved, for example non-quantitative phase contrasts or a phase gradient contrast. Appropriate techniques are disclosed in: DE 10 2014 112 242 A1 and DE 10 2017 108 873 A1 .

Durch die Verwendung des Absorptionsfilters kann eine besonders hohe Bildqualität erzielt werden. Zum Beispiel kann in manchen Beispielen der Phasenkontrast, wie beispielsweise der Phasengradienten-Kontrast, besonders stark ausgebildet werden. Dies bedeutet, dass auch ein kleiner Phasenversatz durch das Probenobjekt einen großen Wert für den Phasenkontrast im Ergebnisbild bewirken kann. Durch die Verwendung des Absorptionsfilters kann es außerdem möglich sein, eine numerische Detektorapertur der Abbildungsoptik flexibel zu dimensionieren. Insbesondere können vergleichsweise große numerische Detektoraperturen verwendet werden. Insbesondere könnte die numerische Detektorapertur größer gewählt werden als eine numerische Beleuchtungsapertur des Beleuchtungsmoduls. Dabei kann die Verwendung einer großen numerischen Detektorapertur eine hohe Qualität für die erfassten Bilder und damit auch für das Ergebnisbild bewirken.A particularly high image quality can be achieved by using the absorption filter. For example, in some examples the phase contrast, such as the phase gradient contrast, can be made particularly strong. This means that even a small phase offset through the sample object can cause a large value for the phase contrast in the result image. By using the absorption filter, it may also be possible to flexibly dimension a numerical detector aperture of the imaging optics. In particular, comparatively large numerical detector apertures can be used. In particular, the numerical detector aperture could be chosen larger than a numerical illumination aperture of the illumination module. The use of a large numerical detector aperture can result in high quality for the captured images and thus also for the result image.

Ein Verfahren umfasst das Ansteuern eines Beleuchtungsmodulseines Mikroskops, um ein Probenobjekt auf einem Probenhalter des Mikroskops mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Das Verfahren umfasst außerdem das Ansteuern eines Detektors des Mikroskops, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen entsprechen. Ein Absorptionsfilter mit einer ortsabhängigen Absorptionsrate ist in einer Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet.One method includes driving an illumination module of a microscope in order to illuminate a sample object on a sample holder of the microscope with light from multiple illumination directions. The method also includes driving a detector of the microscope to capture images that each correspond to one of the multiple directions of illumination. An absorption filter with a location-dependent absorption rate is arranged in an imaging optics of the microscope.

Ein Computer-Programm oder ein Computer-Programmprodukt oder ein computerlesbares Speichermedium umfasst Programmcode. Der Programmcode kann von einer Recheneinheit ausgeführt werden, um ein Verfahren auszuführen. Das Verfahren umfasst das Ansteuern eines Beleuchtungsmodulseines Mikroskops, um ein Probenobjekt auf einem Probenhalter des Mikroskops mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Das Verfahren umfasst außerdem das Ansteuern eines Detektors des Mikroskops, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen entsprechen. Ein Absorptionsfilter mit einer ortsabhängigen Absorptionsrate ist in einer Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet.A computer program or a computer program product or a computer-readable storage medium comprises program code. The program code can be executed by a computing unit in order to carry out a method. The method comprises driving an illumination module of a microscope in order to illuminate a sample object on a sample holder of the microscope with light from several illumination directions. The method also includes driving a detector of the microscope to capture images that each correspond to one of the multiple directions of illumination. An absorption filter with a location-dependent absorption rate is arranged in an imaging optics of the microscope.

FigurenlisteFigure list

1 schematically illustrates a system according to various examples, which comprises a microscope and a computing unit.
2nd 10 is a flow diagram of an example method.
3rd schematically illustrates an exemplary illumination module of the microscope, which is set up for the variable-angle illumination.
4th illustrates schematically an illumination geometry that can be used according to various examples in connection with the variable-angle illumination.
5 illustrates schematically the variable-angle illumination of a sample object that does not cause a phase shift, according to various examples.
6 schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object, which causes a phase shift, according to various examples.
7 schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object, which causes a phase shift, according to various examples, wherein in 7 a numerical detector aperture is larger than a numerical illumination aperture.
8th schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object, which causes a phase shift, according to various examples, wherein in 8th a numerical detector aperture is larger than a numerical illumination aperture and an absorption filter is used in the imaging optics of the microscope.
9 schematically illustrates the course of an absorption rate of the absorption filter according to various examples.
10th schematically illustrates the course of an absorption rate of the absorption filter according to various examples.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMENDETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS

Die oben beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung sowie die Art und Weise, wie diese erreicht werden, werden klarer und deutlicher verständlich im Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele, die im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden.The above-described properties, features and advantages of this invention and the manner in which they are achieved can be more clearly understood in connection with the following description of the exemplary embodiments, which are explained in more detail in connection with the drawings.

In den Figuren bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche oder ähnliche Elemente. Die Figuren sind schematische Repräsentationen verschiedener Ausführungsformen der Erfindung. In den Figuren dargestellte Elemente sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu dargestellt. Vielmehr sind die verschiedenen in den Figuren dargestellten Elemente derart wiedergegeben, dass ihre Funktion und genereller Zweck dem Fachmann verständlich wird. In den Figuren dargestellte Verbindungen und Kopplungen zwischen funktionellen Einheiten und Elementen können auch als indirekte Verbindung oder Kopplung implementiert werden. Eine Verbindung oder Kopplung kann drahtgebunden oder drahtlos implementiert sein. Funktionale Einheiten können als Hardware, Software oder eine Kombination aus Hardware und Software implementiert werden.In the figures, the same reference symbols designate the same or similar elements. The figures are schematic representations of various embodiments of the invention. Elements shown in the figures are not necessarily drawn to scale. Rather, the various elements shown in the figures are reproduced in such a way that their function and general purpose can be understood by the person skilled in the art. Connections and couplings between functional units and elements shown in the figures can also be implemented as an indirect connection or coupling. A connection or coupling can be implemented wired or wireless. Functional units can be implemented as hardware, software or a combination of hardware and software.

Nachfolgend werden Techniken beschrieben, um Bilder mittels eines Mikroskops zu erfassen. Dabei umfasst das Mikroskop ein Beleuchtungsmodul, einen Probenhalter, eine Abbildungsoptik sowie einen Detektor.Techniques for capturing images using a microscope are described below. The microscope includes an illumination module, a sample holder, imaging optics and a detector.

Nachfolgend werden Techniken beschrieben, um ein Ergebnisbild mit maßgeschneidertem Kontrast zu bestimmen. Beispielsweise kann das Ergebnisbild ein Phasenobjekt mit einem Phasenkontrast abbilden. Dabei muss der Phasenkontrast nicht notwendigerweise quantitativ ausgebildet sein, sondern kann im Allgemeinen auch qualitativ ausgebildet sein. Dies bedeutet, dass der Kontrast nicht eins zu eins die Phase des Probenobjekts wiedergeben muss. In manchen Beispielen könnte zum Beispiel ein Phasengradientenkontrast verwendet werden, d. h. der Kontrast könnte die Änderung der Phase indizieren.Techniques for determining a result image with tailored contrast are described below. For example, the result image can depict a phase object with a phase contrast. The phase contrast does not necessarily have to be quantitative, but can generally also be qualitative. This means that the contrast does not have to represent the phase of the sample object one-to-one. For example, in some examples, a phase gradient contrast could be used, e.g. H. the contrast could indicate the change in phase.

Die hierin beschriebenen Techniken ermöglichen es, das Ergebnisbild durch digitale Nachbearbeitung von ein oder mehreren Bildern eines Probenobjekts zu bestimmen. Beispielsweise wäre es möglich, dass das eine oder die mehreren Bilder des Probenobjekts Intensitätsbilder sind, die selbst keinen Phasenkontrast aufweisen.The techniques described herein make it possible to determine the result image by digitally postprocessing one or more images of a sample object. For example, it would be possible for the one or more images of the sample object to be intensity images which themselves have no phase contrast.

Das eine oder die mehreren Bilder des Probenobjekts können mit unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien assoziiert sein. Dies bedeutet, dass das eine oder die mehreren Bilder jeweils bei gleichzeitiger Beleuchtung des Probenobjekts mittels einer entsprechenden Beleuchtungsgeometrie durch einen Detektor erfasst werden können. Dies wird auch als winkelvariable Beleuchtung bezeichnet.The one or more images of the specimen can be associated with different lighting geometries. This means that the one or more images can in each case be captured by a detector when the specimen is simultaneously illuminated by means of an appropriate illumination geometry. This is also known as variable-angle lighting.

Die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien können beispielsweise mit unterschiedlichen Beleuchtungsrichtungen assoziiert sein. Die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien bzw. assoziierte unterschiedliche Bilder können durch ZeitMultiplexen oder Frequenz-Multiplexen voneinander getrennt werden. Es wäre auch eine Trennung mittels unterschiedlicher Polarisationen möglich. Die Beleuchtungsgeometrien können eine Richtungsabhängigkeit aufweisen. Beispielsweise können die Beleuchtungsgeometrien einen Gradienten der Beleuchtungsstärke entlang einer oder mehrerer Raumrichtungen aufweisen. Zum Beispiel könnte die Beleuchtungsstärke stufenförmig entlang einer Raumrichtung variieren, etwa zwischen Null und einem endlichen Wert oder zwischen zwei unterschiedlichen endlichen Werten.The different lighting geometries can be associated with different lighting directions, for example. The different lighting geometries or associated different images can be separated from one another by time multiplexing or frequency multiplexing. Separation by means of different polarizations would also be possible. The lighting geometries can have a directional dependence. For example, the illumination geometries can have a gradient of the illuminance along one or more spatial directions. For example, the illuminance could vary in steps along a spatial direction, for example between zero and a finite value or between two different finite values.

Beispielsweise kann das Probenobjekt ein Phasenobjekt umfassen, beispielsweise eine Zelle oder eine Zellkultur, etc. Das Probenobjekt kann a-priori unbekannt sein, d.h. es können unterschiedliche Probenobjekte durch den Probenhalter fixiert werden. Das Probenobjekt könnte auch für das verwendete Licht nichtlichtdurchlässig sein. Je nach Art des Probenobjekts kann es erstrebenswert sein, das Beleuchtungsmodul und den Detektor in Auflichtgeometrie oder Durchlichtgeometrie zu betreiben.For example, the sample object can comprise a phase object, for example a cell or a cell culture, etc. The sample object can be unknown a priori, i.e. Different sample objects can be fixed by the sample holder. The sample object could also be non-translucent for the light used. Depending on the type of sample object, it may be desirable to operate the illumination module and the detector in incident light geometry or transmitted light geometry.

Gemäß verschiedener Beispiele wird zur Steigerung der Stärke des Phasenkontrasts ein Absorptionsfilter verwendet, der in der Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet ist. Der Absorptionsfilter weist dazu eine ortsabhängige Absorptionsrate auf, die als Funktion der lateralen Positionen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops variiert.According to various examples, an absorption filter which is arranged in the imaging optics of the microscope is used to increase the strength of the phase contrast. For this purpose, the absorption filter has a location-dependent absorption rate which varies as a function of the lateral positions perpendicular to the optical axis of the microscope.

1 illustriert ein beispielhaftes optisches System 90. Beispielsweise könnte das optische System 90 ein Mikroskop 100 umfassen, zum Beispiel ein Lichtmikroskop in Durchlichtgeometrie oder aber in Auflichtgeometrie. 1 illustrates an exemplary optical system 90 . For example, the optical system 90 a microscope 100 include, for example, a light microscope in transmitted light geometry or in incident light geometry.

Mittels des Mikroskops 100 kann es möglich sein, kleine Strukturen eines auf einem Probenhalter 113 fixierten Messobjekts bzw. Probenobjekts vergrößert darzustellen.Using the microscope 100 it may be possible to place small structures on a sample holder 113 to display the fixed measurement object or sample object enlarged.

Das Mikroskop 100 umfasst dazu ein Beleuchtungsmodul 111. Das Beleuchtungsmodul 111 kann eingerichtet sein, um einen Probenhalter 113 vollflächig zu beleuchten, jeweils mit unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien. The microscope 100 includes a lighting module 111 . The lighting module 111 can be set up around a sample holder 113 fully illuminated, each with different lighting geometries.

Die vollflächige Beleuchtung kann bedeuten, dass die Beleuchtungsstärke im Bereich des Probenobjekts bzw. der Probenhalter 113 nicht signifikant variiert. Dies unterscheidet die hierin beschriebenen Techniken von einer strukturierten Beleuchtung mit einem Beleuchtungsmuster.The full-surface illumination can mean that the illuminance in the area of the sample object or the sample holder 113 not significantly varied. This distinguishes the techniques described herein from structured lighting with an illumination pattern.

Das Beleuchtungsmodul 111 weist eine numerische Beleuchtungsapertur auf. Die numerische Beleuchtungsapertur definiert denjenigen Bereich, aus welchem Licht auf ein Probenobjekt eingestrahlt werden kann.The lighting module 111 has a numerical lighting aperture. The numerical illumination aperture defines the area from which light can be radiated onto a sample object.

Außerdem umfasst das Mikroskop 100 eine Abbildungsoptik 112 (manchmal auch als Objektiv oder Detektoroptik bezeichnet), die eingerichtet ist, um ein Abbild des Messobjekts auf einer Detektorfläche eines Detektors 114 zu erzeugen. Eine numerische Detektorapertur der Abbildungsoptik 112 kann eine Hellfeld-Bildgebung und/oder eine Dunkelfeld-Bildgebung ermöglichen, zum Beispiel je nach verwendeter Beleuchtungsgeometrie.It also includes the microscope 100 an imaging optics 112 (sometimes also referred to as a lens or detector optics), which is set up to image the measurement object on a detector surface of a detector 114 to create. A numerical detector aperture of imaging optics 112 can enable bright-field imaging and / or dark-field imaging, for example depending on the lighting geometry used.

Im Beispiel der 1 ist das Beleuchtungsmodul 111 eingerichtet, um eine winkelvariable Beleuchtung des Messobjekts zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass mittels des Beleuchtungsmoduls 111 unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien des zur Beleuchtung des Messobjekts verwendeten Lichts implementiert werden können. Die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien können jeweils eine oder mehrere Rückbeleuchtungsrichtungen bzw. Beleuchtungswinkel umfassen.In the example of the 1 is the lighting module 111 set up to enable variable-angle illumination of the measurement object. This means that by means of the lighting module 111 Different lighting geometries of the light used to illuminate the measurement object can be implemented. The different lighting geometries can each include one or more backlighting directions or lighting angles.

Dabei sind in den verschiedenen hierin beschriebenen Beispielen unterschiedliche Hardware-Implementierungen möglich, um die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien bereitzustellen. Beispielsweise könnte das Beleuchtungsmodul 111 mehrere einstellbare Lichtquellen umfassen, die eingerichtet sind, um lokal Licht zu modifizieren und/oder zu erzeugen (in 1 sind die Lichtquellen nicht dargestellt).Different hardware implementations are possible in the various examples described here in order to provide the different lighting geometries. For example, the lighting module 111 comprise a plurality of adjustable light sources which are set up to locally modify and / or generate light (in 1 the light sources are not shown).

Eine Recheneinheit 115 des optischen Systems 90 kann das Beleuchtungsmodul 111 bzw. die Lichtquellen ansteuern. Beispielsweise könnte die Recheneinheit 115 als Mikroprozessor oder Mikrocontroller implementiert sein. Alternativ oder zusätzlich könnte die Recheneinheit 115 beispielsweise einen FPGA oder ASIC umfassen. Die Recheneinheit 115 kann alternativ oder zusätzlich auch der Probenhalter 113, die Abbildungsoptik 112 und/oder den Detektor 114 ansteuern bzw. auslesen. Die Recheneinheit 115 kann auch Rechenoperationen im Zusammenhang mit der digitalen Nachbearbeitung von mittels des Detektors 114 erfassten Bildern durchführen.A computing unit 115 of the optical system 90 can the lighting module 111 or control the light sources. For example, the computing unit 115 be implemented as a microprocessor or microcontroller. Alternatively or additionally, the computing unit could 115 include an FPGA or ASIC, for example. The computing unit 115 can alternatively or additionally also the sample holder 113 who have favourited Imaging Optics 112 and / or the detector 114 control or read out. The computing unit 115 can also perform arithmetic operations in connection with the digital post-processing by means of the detector 114 perform captured images.

In manchen Beispielen ist es möglich, dass die Recheneinheit 115 in ein Gehäuse des Mikroskops 100 integriert ist. In anderen Beispielen wäre es aber auch möglich, dass die Recheneinheit 115 extern vom Mikroskop 100 vorgesehen ist. Beispielsweise könnte die Recheneinheit 115 durch ein entsprechendes Computerprogramm, das auf einem PC ausgeführt wird, implementiert sein.In some examples it is possible that the computing unit 115 in a housing of the microscope 100 is integrated. In other examples, however, it would also be possible for the computing unit 115 external to the microscope 100 is provided. For example, the computing unit 115 be implemented by an appropriate computer program that is executed on a PC.

2 ist ein Flussdiagramm eines beispielhaften Verfahrens. Beispielsweise könnte das Verfahren gemäß 2 von der Recheneinheit 115 aus 1 ausgeführt werden. Das Verfahren nach 2 ermöglicht es, ein Ergebnisbild mit Phasenkontrast zu erzeugen, indem eine winkelvariable Beleuchtung verwendet wird. 2nd 10 is a flow diagram of an example method. For example, the method according to 2nd from the computing unit 115 out 1 be carried out. The procedure after 2nd enables a result image with phase contrast to be generated by using variable-angle lighting.

Zunächst wird in Block 9001 das Beleuchtungsmodul 111 angesteuert, sodass mehrere Beleuchtungsgeometrien erzeugt werden. Dies bedeutet, dass zum Beispiel nacheinander unterschiedliche Leuchtdioden einer Leuchtdioden-Matrix an- und ausgeschaltet werden können. Es können auch mehrere Leuchtdioden der Leuchtdioden-Matrix gleichzeitig angeschaltet werden, um derart eine Beleuchtungsgeometrie mittels gleichzeitiger Beleuchtung aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu implementieren. Beispielweise könnte eine Halbraum-Beleuchtung umgesetzt werden, bei der alle Leuchtdioden eines Halbraums an- bzw. ausgeschaltet werden.First in block 9001 the lighting module 111 controlled so that several lighting geometries are generated. This means that, for example, different light emitting diodes of a light emitting diode matrix can be switched on and off in succession. A plurality of light-emitting diodes of the light-emitting diode matrix can also be switched on at the same time in order to implement such a lighting geometry by means of simultaneous lighting from several lighting directions. For example, half-room lighting could be implemented in which all the light-emitting diodes in a half-room are switched on or off.

Dann erfolgt in Block 9002 das Ansteuern des Detektors 114, um mehrere Bilder zu erfassen. Dabei erfolgen das Ansteuern des Beleuchtungsmoduls 111 in Block 9001 und das Ansteuern des Detektors 114 in Block 9002 synchronisiert, sodass die verschiedenen erfassten Bilder jeweils einer entsprechenden Beleuchtungsgeometrie bzw. ein oder mehreren entsprechenden Beleuchtungsrichtungen, die die jeweilige Beleuchtungsgeometrie ausbilden, zugeordnet sind. Zeit- oder Wellenlängen- oder Polarisations-Multiplexen kann verwendet werden.Then takes place in block 9002 driving the detector 114 to capture multiple images. The lighting module is activated 111 in block 9001 and driving the detector 114 in block 9002 synchronized, so that the various captured images are each assigned to a corresponding lighting geometry or one or more corresponding lighting directions that form the respective lighting geometry. Time or wavelength or polarization multiplexing can be used.

Im optionalen Block 9003 werden dann die in Block 9002 erfassten Bilder miteinander kombiniert, um derart ein Ergebnisbild zu erhalten. Dieses Ergebnisbild weist einen verbesserten Kontrast auf, zum Beispiel einen Phasenkontrast.In the optional block 9003 then become those in block 9002 captured images combined with each other in order to obtain such a result image. This result image has an improved contrast, for example a phase contrast.

Es können in Block 9003 ganz unterschiedliche Techniken zur Kombination der erfassten Bilder miteinander eingesetzt werden. Je nach Kombination, zum Beispiel mit oder ohne Normierung oder mit oder ohne Betragsbildung usw., kann der Phasenkontrast variieren. Entsprechende Techniken sind zum Beispiel beschrieben in: DE 10 2014 112 242 A1 und DE 10 2017 108 873A1 .It can be in block 9003 very different techniques are used to combine the captured images with each other. The phase contrast can vary depending on the combination, for example with or without normalization or with or without absolute value formation, etc. Appropriate techniques are described for example in: DE 10 2014 112 242 A1 and DE 10 2017 108 873A1 .

Optional können in Blick 9003 auch bildverarbeitende Techniken angewendet werden, z.B. auf die einzelnen erfassten Bilder und/oder das Ergebnisbild. Beispiele für bildverarbeitende Techniken umfassen: Hintergrund-Normalisierung; Entrauschung; Frequenzfilterung; Frequenzmanipulation; etc..Optionally, in view 9003 image processing techniques are also used, for example on the individual captured images and / or the result image. Examples of image processing techniques include: background normalization; Intoxication; Frequency filtering; Frequency manipulation; Etc..

Durch die Verwendung eines Absorptionsfilter im Strahlengang kann insbesondere ein besonders homogen ausgebildeter Phasenkontrast mit allen relevanten Raumfrequenzen der Phase erzielt werden. Dies wird nachfolgend näher erläutert.By using an absorption filter in the beam path, a particularly homogeneous phase contrast can be achieved with all relevant spatial frequencies of the phase. This is explained in more detail below.

3 illustriert eine beispielhafte Implementierung des Beleuchtungsmoduls 111. 3 ist eine Darstellung des Beleuchtungsmoduls 111, das sich senkrecht zur optischen Achse 309 in der durch die X- und Y-Achse aufgespannten lateralen Ebene erstreckt. 3rd illustrates an exemplary implementation of the lighting module 111 . 3rd is an illustration of the lighting module 111 that is perpendicular to the optical axis 309 extends in the lateral plane spanned by the X and Y axes.

Aus 3 ist ersichtlich, dass das Beleuchtungsmodul 111 eine Matrix aus Leuchtdioden 121-1, 121-2 aufweist (wobei aber auch andere Implementierungen möglich wären). Dabei sind die Leuchtdioden 121-1 innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112 angeordnet, während die Leuchtdioden 121-2 außerhalb der numerischen Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112 angeordnet sind. Dies bedeutet, dass mittels des Beleuchtungsmoduls 111 insbesondere eine Hellfeld-Bildgebung, wie auch eine Dunkelfeld-Bildgebung erfolgen kann.Out 3rd it can be seen that the lighting module 111 a matrix of light emitting diodes 121-1 , 121-2 has (although other implementations would also be possible). The LEDs are there 121-1 within the numerical detector aperture 319 the imaging optics 112 arranged while the light emitting diodes 121-2 outside the numerical detector aperture 319 the imaging optics 112 are arranged. This means that by means of the lighting module 111 in particular bright field imaging, as well as dark field imaging.

In verschiedenen hierin beschriebenen Beispielen ist es möglich, dass die numerische Detektorapertur 319 so groß ist, dass alle Leuchtdioden innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112 angeordnet sind. In diesem Fall ist keine Dunkelfeld-Bildgebung möglich.In various examples described herein, it is possible that the numerical detector aperture 319 is so large that all light emitting diodes within the numerical detector aperture 319 the imaging optics 112 are arranged. In this case, dark field imaging is not possible.

4 illustriert Aspekte im Zusammenhang mit dem individuellen Betreiben der verschiedenen Leuchtdioden 121-1, 121-2 des Beleuchtungsmoduls 111. 4 ist eine Schnittansicht entlang der Achse X-X' aus 3. 4th illustrates aspects related to the individual operation of the various light emitting diodes 121-1 , 121-2 of the lighting module 111 . 4th is a sectional view taken along axis XX ' 3rd .

In dem Beispiel der 4 wird eine Beleuchtungsgeometrie 700 durch das isolierte Anschalten der mit dem Pfeil markierten Leuchtdiode 121-1 erreicht. Dadurch wird das Probenobjekt vollflächig aus einer bestimmten Beleuchtungsrichtung beleuchtet, die der relativen Anordnung der markierten Leuchtdiode 121-1 zur optischen Achse 309 entspricht. Im Allgemeinen wäre es aber auch möglich, dass pro Beleuchtungsgeometrie mehr als eine Leuchtdiode 121-1, 121-2 angeschaltet wird, sodass sich eine entsprechende Beleuchtungsgeometrie aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zusammensetzt. Es wäre auch möglich, eine ausgedehnte Leuchtfläche zu verwenden. Unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien können dabei zumindest teilweise verschiedene Beleuchtungsrichtungen aufweisen.In the example of 4th becomes a lighting geometry 700 by switching on the light-emitting diode marked with the arrow 121-1 reached. As a result, the entire sample object is illuminated from a certain direction of illumination, that of the relative arrangement of the marked light-emitting diode 121-1 to the optical axis 309 corresponds. In general, however, it would also be possible for more than one light-emitting diode per lighting geometry 121-1 , 121-2 is switched on, so that a corresponding lighting geometry is composed of several lighting directions. It would also be possible to use an extensive illuminated area. Different lighting geometries can at least partially have different lighting directions.

Im Zusammenhang mit den 5 - 7 wird nachfolgend die Funktionsweise der winkelvariablen Beleuchtung zur Erzeugung eines Ergebnisbilds mit Phasenkontrast beschrieben.In connection with the 5 - 7 The mode of operation of the variable-angle illumination for generating a result image with phase contrast is described below.

5 illustriert dabei Aspekte der Beleuchtung eines Probenobjekts 390, das in einer Probenebene 302 angeordnet ist, wobei das Probenobjekt 390 keinen Phasenversatz des einfallenden Lichts bewirkt. 5 illustrates aspects of illuminating a specimen 390 that in a sample plane 302 is arranged, the sample object 390 does not cause a phase shift of the incident light.

In 5 ist eine numerische Beleuchtungsapertur 301 des Beleuchtungsmoduls 111 schematisch als Feldblende dargestellt (außerdem bestimmt eine Brennweite die numerische Beleuchtungsapertur; die Brennweite ist aber aus Gründen der Einfachheit in 5 nicht gesondert beschriftet). Der Durchmesser 305 einer die Beleuchtungsapertur 301 definierenden Austrittspupille ist auch dargestellt. Der Durchmesser 305 definiert, zusammen mit der Brennweite, die numerische Apertur.In 5 is a numerical lighting aperture 301 of the lighting module 111 shown schematically as a field diaphragm (in addition, a focal length determines the numerical illumination aperture; however, the focal length is in for reasons of simplicity 5 not labeled separately). The diameter 305 one the lighting aperture 301 defining exit pupil is also shown. The diameter 305 defines, together with the focal length, the numerical aperture.

In 5 werden zwei Beleuchtungsgeometrien 701 (durchgezogene Linien) und 702 (gestrichelte Linien) verwendet. Die entsprechenden mittleren Beleuchtungsrichtungen 381, 382 sind auch dargestellt. Das Licht der Beleuchtungsgeometrie 701 fällt aus dem oberen Halbraum auf das Probenobjekt 390 ein; und das Licht der Beleuchtungsgeometrie 702 fällt aus dem unteren Halbraum auf das Probenobjekt 390 ein. Eine beispielhafte Implementierung der Beleuchtungsgeometrien 701, 702 könnte zum Beispiel durch ein Beleuchtungsmodul 111 mit einer Matrix aus Leuchtdioden 121-1, 121-2 erreicht werden, wobei im Zusammenhang mit der Beleuchtungsgeometrie 701 alle Leuchtdioden 121-1, 121-2 oberhalb einer Mittellinie eingeschaltet werden und wobei im Zusammenhang mit der Beleuchtungsgeometrie 702 alle Leuchtdioden 121-1, 121-2 unterhalb von der Mittellinie eingeschaltet werden (vergleiche auch 3, wo die entsprechende Mittellinie mit einer gestrichelt-gepunkteten Linie dargestellt ist).In 5 are two lighting geometries 701 (solid lines) and 702 (dashed lines) are used. The corresponding mean lighting directions 381 , 382 are also shown. The light of the lighting geometry 701 falls from the upper half-space onto the specimen 390 a; and the light of the lighting geometry 702 falls from the lower half-space onto the specimen 390 a. An exemplary implementation of the lighting geometries 701 , 702 could for example by a lighting module 111 with a matrix of light emitting diodes 121-1 , 121-2 be achieved, in connection with the lighting geometry 701 all LEDs 121-1 , 121-2 be switched on above a center line and in connection with the lighting geometry 702 all LEDs 121-1 , 121-2 below the center line (see also 3rd , where the corresponding center line is shown with a dashed-dotted line).

Die Abbildungsoptik 112 umfasst im Beispiel der 5 ein Linsenpaar 311, 312, wobei zwischen den Linsen 311, 312 eine konjugierte Ebene (Pupillenebene) definiert ist. Der Durchmesser 315 einer die numerische Detektorapertur 319 definierende Eintrittspupille der Abbildungsoptik 112 ist in 5 auch dargestellt (die numerische Detektorapertur 319 wird außerdem noch durch die Brennweite der Abbildungsoptik 112 bestimmt, wobei aber die Brennweite aus Gründen der Einfachheit in 5 nicht dargestellt ist).The imaging optics 112 includes in the example the 5 a pair of lenses 311 , 312 , being between the lenses 311 , 312 a conjugate plane (pupil plane) is defined. The diameter 315 one the numerical detector aperture 319 defining entrance pupil of the imaging optics 112 is in 5 also shown (the numerical detector aperture 319 is also due to the focal length of the imaging optics 112 determined, but the focal length for simplicity in 5 is not shown).

Die Detektorebene 321, auf welche das Licht fokussiert wird, ist in 5 ganz rechts illustriert. Außerdem ist in 5 auch noch die optische Achse 309 (Hauptstrahl) dargestellt (gestrichelt-gepunktete Linie in 5). The detector level 321 on which the light is focused is in 5 illustrated on the far right. In addition, in 5 also the optical axis 309 (Main beam) shown (dashed-dotted line in 5 ).

Weil das Probenobjekt 390 in 5 ein Amplitudenobjekt ist und keinen Phasenversatz des einfallenden Lichts bewirkt, erfolgt beim Durchlaufen des Probenobjekts 390 auch keine Richtungsänderung des Lichts. Dies ist im Szenario der 6 anders.Because the specimen 390 in 5 is an amplitude object and does not cause a phase shift of the incident light occurs when passing through the sample object 390 also no change of direction of the light. This is the scenario in the 6 different.

6 illustriert Aspekte der Beleuchtung des Probenobjekts 390. Dabei entspricht das Beispiel der 6 grundsätzlich dem Beispiel der 5. Im Beispiel der 6 wird aber ein Phasenobjekt als Probenobjekt 390 verwendet. Dieses bewirkt eine Ablenkung des Lichts weg von der optischen Achse 309, im Beispiel der 6 nach oben. Deshalb kann nicht alles Licht durch die numerische Detektorapertur 319 hindurch treten. Insbesondere wird ein Teil des Lichts (mit dem Pfeil markiert), welches mit der Beleuchtungsgeometrie 702 assoziiert ist, nicht auf die Detektorebene 321 abgebildet, weil es nicht innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 liegt. Hingegen kann alles Licht, welches mit der Beleuchtungsgeometrie 701 assoziiert ist, auf die Detektorebene 321 fokussiert werden. 6 illustrates aspects of the illumination of the specimen 390 . The example corresponds to the 6 basically the example of 5 . In the example of the 6 but becomes a phase object as a sample object 390 used. This causes the light to be deflected away from the optical axis 309 , in the example of 6 up. Therefore, not all light can pass through the numerical detector aperture 319 step through. In particular, part of the light (marked with the arrow) is associated with the lighting geometry 702 is associated, not at the detector level 321 imaged because it is not within the numerical detector aperture 319 lies. On the other hand, everything can be light that with the lighting geometry 701 is associated to the detector level 321 be focused.

Deshalb liegt eine Asymmetrie zwischen den mit den Beleuchtungsgeometrien 701, 702 assoziierten Bildern vor. Dieses Modell plausibilisiert qualitativ das Vorliegen eines Phasenkontrasts in einem Ergebnisbild, welches durch Kombination der Bilder, die den Beleuchtungsgeometrien 701, 702 entsprechen, erhalten wird. Die Kombination kann durch Addition oder Differenzbildung erfolgen.Therefore there is an asymmetry between those with the lighting geometries 701 , 702 associated images. This model qualitatively verifies the presence of a phase contrast in a result image, which is obtained by combining the images that correspond to the lighting geometries 701 , 702 correspond, is obtained. The combination can be done by adding or subtracting.

Für kleine Phasengradienten ist die Differenz der Bilder, die den Beleuchtungsgeometrien 701, 702, gleich oder in etwa gleich Null: dies ist der Fall, da das Licht aus beiden Beleuchtungshälften (oben und unten in 6) trotz der Verschiebung durch den (kleinen) Phasengradienten ungehindert das System durchlaufen kann und auf den Detektor trifft. Dies trifft insbesondere zu, wenn die numerische Detektorapertur 319 vergleichsweise groß ist und daher das Licht aus beiden Beleuchtungshälften innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 liegt. Dieser Befund wird im Zusammenhang mit 7 erläutert.For small phase gradients, the difference of the images is that of the lighting geometries 701 , 702 , equal to or approximately equal to zero: this is the case because the light comes from both halves of the lighting (top and bottom in 6 ) despite the shift due to the (small) phase gradient, the system can pass through unhindered and hit the detector. This is especially true when the numerical detector aperture 319 is comparatively large and therefore the light from both halves of the illumination within the numerical detector aperture 319 lies. This finding is related to 7 explained.

7 illustriert Aspekte der Beleuchtung des Probenobjekts 390. Dabei entspricht das Beispiel der 7 grundsätzlich dem Beispiel der 6. Im Beispiel der 7 wird aber eine vergrößerte numerische Detektorapertur 319 verwendet, im Vergleich zu dem Beispiel der 6. Insbesondere ist dem Beispiel der 7 die numerische Detektorapertur 319 größer als die numerische Beleuchtungsapertur 301 (was schematisch durch einen größeren Durchmesser 315, im Vergleich zum Durchmesser 305, illustriert ist). 7 illustrates aspects of the illumination of the specimen 390 . The example corresponds to the 7 basically the example of 6 . In the example of the 7 but becomes an enlarged numerical detector aperture 319 used compared to the example of the 6 . In particular, the example is 7 the numerical detector aperture 319 larger than the numerical lighting aperture 301 (which is shown schematically by a larger diameter 315 , compared to the diameter 305 , is illustrated).

In einem solchen Szenario, wie es in 7 dargestellt ist, erreicht auch alles Licht der Beleuchtungsgeometrie 702 die Detektorebene 321 (siehe insbesondere den Lichtstrahl, der mit einem Pfeil in 7 markiert ist und vergleiche mit 6).In such a scenario as in 7 is shown, all light reaches the lighting geometry 702 the detector level 321 (see in particular the light beam which is marked with an arrow in 7 is marked and compare with 6 ).

7 motiviert qualitativ, wieso gemäß Referenzimplementierungen die numerische Detektorapertur 319 vergleichsweise klein dimensioniert werden muss, insbesondere in Bezug auf die numerische Beleuchtungsapertur 301. Nachfolgend werden Techniken beschrieben, welche es ermöglichen, eine große numerische Detektorapertur 319 zu verwenden, ohne die Möglichkeit zu verlieren, auch ein Ergebnisbild ein Phasenkontrast zu erhalten. Die Verwendung einer großen numerischen Detektorapertur 319 ermöglicht es grundsätzlich, Bilder mit einer großen Auflösung zu erfassen. 7 motivates qualitatively, why according to reference implementations the numerical detector aperture 319 must be dimensioned comparatively small, especially with regard to the numerical lighting aperture 301 . Techniques that enable a large numerical detector aperture are described below 319 to be used without losing the possibility of also obtaining a phase contrast result image. The use of a large numerical detector aperture 319 basically makes it possible to capture images with a high resolution.

8 illustriert Aspekte der Beleuchtung des Probenobjekts 390. Dabei entspricht das Beispiel der 8 grundsätzlich dem Beispiel der 7. Insbesondere ist auch im Beispiel der 8 - wie schon voranstehend im Zusammenhang mit 7 erläutert - der Durchmesser 315 der Eintrittspupille, der mit der Detektorapertur 319 assoziiert ist, größer als der Durchmesser 305 der Austrittspupille, der mit der Beleuchtungsapertur 301 assoziiert ist. Dies soll schematisch illustrieren, dass die numerische Detektorapertur 319 größer sein kann, als die numerische Beleuchtungsapertur 301 (wobei bei dieser Betrachtung die Brennweiten der Beleuchtung und der Detektoroptik berücksichtigt werden, die in 8 aus Gründen der Einfachheit nicht beschriftet sind). 8th illustrates aspects of the illumination of the specimen 390 . The example corresponds to the 8th basically the example of 7 . In particular, in the example 8th - as already in connection with 7 explained - the diameter 315 the entrance pupil, the one with the detector aperture 319 is associated larger than the diameter 305 the exit pupil, the one with the illumination aperture 301 is associated. This is intended to illustrate schematically that the numerical detector aperture 319 can be larger than the numerical lighting aperture 301 (taking into account the focal lengths of the lighting and the detector optics, which are shown in 8th are not labeled for the sake of simplicity).

Im Beispiel der 8 ist ein Absorptionsfilter 800 vorgesehen, der in der Abbildungsoptik 112 angeordnet ist und der eine ortsabhängige Absorptionsrate aufweist (die ortsabhängige Absorptionsrate ist in 8 durch die in X-Richtung orientierten, nicht durchgezogenen Linien des Absorptionsfilters 800 illustriert).In the example of the 8th is an absorption filter 800 provided that in the imaging optics 112 is arranged and which has a location-dependent absorption rate (the location-dependent absorption rate is in 8th due to the non-solid lines of the absorption filter oriented in the X direction 800 illustrated).

Durch die Verwendung eines solchen Absorptionsfilters 800 mit einer Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate kann erreicht werden, dass Licht, welches aufgrund des Phasenversatzes des Probenobjekts 390 im Bereich der Pupillenebene der Abbildungsoptik 112 einen großen lateralen Abstand zur optischen Achse 309 aufweist, stärker absorbiert wird. Dadurch kann wiederum, durch Kombination der verschiedenen Bilder, die den unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien 701, 702 entsprechen, ein Ergebnisbild mit Phasenkontrast erzielt werden - obwohl eine große numerische Detektorapertur 319 verwendet wird.By using such an absorption filter 800 With a location-dependent absorption rate it can be achieved that light, which is due to the phase shift of the sample object 390 in the area of the pupil plane of the imaging optics 112 a large lateral distance from the optical axis 309 has more absorption. This in turn can, by combining the different images, the different lighting geometries 701 , 702 correspond, a result image with phase contrast can be achieved - although a large numerical detector aperture 319 is used.

Durch geeignete Dimensionierung der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate kann gleichermaßen erreicht werden, dass auch für weniger verschiedene Beleuchtungsgeometrien - zum Beispiel durch Verwendung von nah beieinanderliegenden Leuchtdioden 121-1, 121-2 zur Implementierung der Beleuchtungsgeometrien - ein verstärkter Phasenkontrast erzielt wird. Appropriate dimensioning of the local dependence of the absorption rate can equally achieve that for less different lighting geometries - for example by using light-emitting diodes that are close together 121-1 , 121-2 for the implementation of the lighting geometries - an increased phase contrast is achieved.

Details im Zusammenhang mit der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate des Absorptionsfilter 800 sind nachfolgend im Zusammenhang mit den 9 und 10 beschrieben.Details related to the location dependence of the absorption rate of the absorption filter 800 are below in connection with the 9 and 10th described.

9 und 10 illustrierten Aspekte im Zusammenhang mit dem Absorptionsfilter 800. Insbesondere illustrieren 9 und 10 die Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 des Absorptionsfilters. 9 and 10th illustrated aspects in connection with the absorption filter 800 . Illustrate in particular 9 and 10th the location dependence of the absorption rate 810 of the absorption filter.

In den Beispielen der 9 und 10 nimmt die Absorptionsrate 810 für größere Abstände zur optischen Achse 309 (d. h. in lateraler Richtung, in 5-8 in X-Richtung) größere Werte an. Dabei weist die Absorptionsrate 810 in der beispielhaften Implementierung der 9 einen stufenförmigen radialen Verlauf auf; und in der Implementierung der 10 einen graduellen radialen Verlauf.In the examples of 9 and 10th takes the absorption rate 810 for larger distances to the optical axis 309 (ie in the lateral direction, in 5-8 values in the X direction). The absorption rate shows 810 in the exemplary implementation of 9 a step-like radial course; and in the implementation of the 10th a gradual radial course.

Die Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 könnte rotationssymmetrisch in Bezug auf die optische Achse 390 in der lateralen Ebene (durch X-Achse und Y-Achse aufgespannt) ausgebildet sein. Es wäre aber auch eine nicht rotationssymmetrische Ausbildung möglich: In den Beispielen der 9 und 10 sind nämlich monotone Verläufe der Absorptionsrate 810 dargestellt. In manchen Beispielen kann die Absorptionsrate 810 auch lokal nicht-monoton ausgebildet sein (z.B. entlang der X-Achse oder entlang der Y-Achse), sofern das Integral über die Fläche monoton verbleibt. Hier soll gelten, dass das Integral des Lichts über die Fläche (in der XY-Ebene, senkrecht zur optischen Achse 309) der Beleuchtungsgeometrie für größere Abstände zur optischen Achse 309 monoton abnimmt.The location dependence of the absorption rate 810 could be rotationally symmetrical with respect to the optical axis 390 be formed in the lateral plane (spanned by the X axis and Y axis). However, a non-rotationally symmetrical design would also be possible: in the examples of 9 and 10th are namely monotonous curves of the absorption rate 810 shown. In some examples, the rate of absorption 810 also be locally non-monotonic (for example along the X-axis or along the Y-axis), provided that the integral remains monotonic over the surface. It should apply here that the integral of the light over the surface (in the XY plane, perpendicular to the optical axis 309 ) the lighting geometry for greater distances from the optical axis 309 decreases monotonously.

Die Absorptionsrate 810 könnte als Funktion des Abstands zur optischen Achse 309 monoton zunehmen.The absorption rate 810 could be a function of the distance to the optical axis 309 increase monotonously.

Durch eine solche Ausbildung der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 kann der im Zusammenhang mit den 5-8 voranstehend beschriebene Effekt der stärkeren Abschwächung von Lichtstrahlen, die einen größeren lateralen Abstand zur optischen Achse 309 aufweisen, erzielt werden - und damit die Verstärkung des Phasenkontrasts im Ergebnisbild erreicht werden.Through such a formation of the location dependence of the absorption rate 810 can the in connection with the 5-8 effect described above of the stronger attenuation of light rays, the greater lateral distance to the optical axis 309 exhibit, are achieved - and thus the enhancement of the phase contrast in the result image can be achieved.

In den Beispielen der 9 und 10 ist außerdem noch ein innerer Bereich 801 angrenzend an die optische Achse 309 und ein äußerer Bereich 802, der den inneren Bereich 801 in lateraler Richtung versetzt umgibt, dargestellt. Die Absorptionsrate 810 ist im äußeren Bereich 802 größer als im inneren Bereich 801. Dabei wurde in verschiedenen Tests beobachtet, dass ein vergleichsweise großer Unterschied zwischen der Absorptionsrate 810 im äußeren Bereich 802 und der Absorptionsrate 810 im inneren Bereich 801 erstrebenswert sein kann. Zum Beispiel wäre es möglich, dass die Absorptionsrate 810 im inneren Bereich 801 nicht größer als 10 % ist, und die Absorptionsrate im äußeren Bereich >50 % ist. Dadurch kann erreicht werden, dass Licht, welches nahe der optischen Achse 309 durch die Abbildungsoptik 112 und insbesondere die Pupillenebene verläuft, nicht oder nicht signifikant abgeschwächt wird, sodass die Bilder ein starkes Signal aufweisen. Andererseits kann durch die Dimensionierung der Absorptionsrate 810 im äußeren Bereich 802 von größer 0 %, zum Beispiel im Bereich von 10 % bis 50 %, erreicht werden, dass das Ergebnisbild einen Phasenkontrast aufweist, gleichzeitig, aber auch eine hohe Auflösung.In the examples of 9 and 10th is also an inner area 801 adjacent to the optical axis 309 and an outer area 802 which is the inner area 801 surrounds offset in the lateral direction, shown. The absorption rate 810 is in the outer area 802 larger than in the inner area 801 . It was observed in various tests that there was a comparatively large difference between the absorption rate 810 in the outer area 802 and the absorption rate 810 in the inner area 801 can be desirable. For example, it would be possible that the absorption rate 810 in the inner area 801 is not greater than 10%, and the absorption rate in the outer region is> 50%. This can achieve that light that is close to the optical axis 309 through the imaging optics 112 and in particular the pupil plane runs, is not or not significantly attenuated, so that the images have a strong signal. On the other hand, by dimensioning the absorption rate 810 in the outer area 802 greater than 0%, for example in the range from 10% to 50%, that the result image has a phase contrast, but at the same time also a high resolution.

Beispielsweise könnte bei einer Dimensionierung der Absorptionsrate 810 im äußeren Bereich 802 im Bereich von 10% bis 20% auch eine Kombination mit Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht werden (wo typischerweise vergleichsweise geringe Lichtintensität vorliegt). Bei zu großen Absorptionsraten besteht eine Tendenz hin zu sinkenden Auflösungen.For example, when dimensioning the absorption rate 810 in the outer area 802 in the range from 10% to 20%, a combination with fluorescence imaging is also possible (where there is typically comparatively low light intensity). If the absorption rates are too high, there is a tendency towards falling resolutions.

In der Pupillenebene entsprechen Lichtstrahlen, die einen großen Abstand zur optischen Achse 309 aufweisen, hohen Ortsfrequenzen. Durch die begrenzte Dämpfung der hohen Ortsfrequenzen durch die wie oben stehend dimensionierte Absorptionsrate 810 wird die Gesamtqualität der verschiedenen erfassten Bilder nicht oder nicht signifikant eingeschränkt.In the pupil plane, light rays correspond to a large distance from the optical axis 309 have high spatial frequencies. Due to the limited attenuation of the high spatial frequencies by the absorption rate dimensioned as above 810 the overall quality of the various captured images is not or not significantly restricted.

In den 9 und 10 ist außerdem auch noch der Durchmesser 305 bzw. der Durchmesser 315 dargestellt. Dies ermöglicht, eine relative quantitative Dimensionierung der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 anzugeben. Aus 9 und 10 ist beispielsweise ersichtlich, dass der innere Bereich 801 einen Durchmesser aufweist, der etwa gleich groß ist, wie der Durchmesser 305. Im Allgemeinen wäre es möglich, dass der innere Bereich 801 einen Durchmesser aufweist, der im Bereich von 80 % bis 120 % des Durchmessers 305 des Beleuchtungsmoduls 111 liegt, optional im Bereich von 80 % bis 100 %. Außerdem ist im Zusammenhang mit den 9 und 10 auch ersichtlich, dass sowohl der innere Bereich 801, als auch der äußere Bereich 802 jeweils einen Durchmesser aufweisen, der kleiner ist als der Durchmesser 315.In the 9 and 10th is also the diameter 305 or the diameter 315 shown. This enables a relative quantitative dimensioning of the location dependence of the absorption rate 810 specify. Out 9 and 10th it can be seen, for example, that the inner area 801 has a diameter that is approximately the same size as the diameter 305 . In general, it would be possible for the inner area 801 has a diameter that is in the range of 80% to 120% of the diameter 305 of the lighting module 111 is optionally in the range of 80% to 100%. It is also related to the 9 and 10th also seen that both the inner area 801 , as well as the outer area 802 each have a diameter that is smaller than the diameter 315 .

Dadurch wird, wie obenstehend bereits beschrieben, ermöglicht, dass die numerische Beleuchtungsapertur 301 des Beleuchtungsmoduls 111 kleiner dimensioniert ist, als die numerische Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112; gleichzeitig kann trotzdem ein Ergebnisbild mit Phasenkontrast erhalten werden. As already described above, this enables the numerical illumination aperture 301 of the lighting module 111 is dimensioned smaller than the numerical detector aperture 319 the imaging optics 112 ; at the same time, a result image with phase contrast can still be obtained.

Zusammenfassend wurden voranstehend Techniken beschrieben, die es ermöglichen, auch kleine Phaseninformation (beispielsweise Phasengradienteninformation) bei der Beleuchtung mittels winkelvariabler Beleuchtung zu übertragen. Dadurch kann ein Ergebnisbild mit besonders großem Phasenkontrast durch Kombination der Einzelbilder erhalten werden. In den verschiedenen hierin beschriebenen Techniken wird dies dadurch erreicht, dass die Differenz zwischen zwei Bildern, die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien entsprechen, bereits bei kleinen Ablenkungen durch einen Phasengradienten ungleich Null maximiert werden. Dies wird insbesondere durch die Abschwächung eines Lichtstrahls erreicht, der durch das Phasenobjekt von der optischen Achse weggelenkt wird. Dazu wird ein Absorptionsfilter verwendet, der die Lichtintensität dieses Lichtstrahls reduziert. Der Absorptionsfilter kann z.B. ein Verlaufsfilter sein oder ein stufenartig ausgeführter Absorptionsfilter. Durch die Verwendung des Absorptionsfilters ergeben sich Differenzen ungleich 0 auch für einen kleinen Phasenversatz. Diese Differenzen sind (mindestens stückweise) proportional zum Gradienten der Phase.In summary, techniques have been described above which make it possible to transmit even small phase information (for example phase gradient information) during the illumination by means of angle-variable illumination. As a result, a result image with a particularly large phase contrast can be obtained by combining the individual images. In the various techniques described herein, this is accomplished by maximizing the difference between two images that correspond to different lighting geometries even with small deflections by a non-zero phase gradient. This is achieved in particular by weakening a light beam which is deflected away from the optical axis by the phase object. For this purpose, an absorption filter is used, which reduces the light intensity of this light beam. The absorption filter can e.g. be a gradient filter or a step-like absorption filter. By using the absorption filter there are differences not equal to 0 even for a small phase shift. These differences are (at least piece by piece) proportional to the gradient of the phase.

Selbstverständlich können die Merkmale der vorab beschriebenen Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung miteinander kombiniert werden. Insbesondere können die Merkmale nicht nur in den beschriebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder für sich genommen verwendet werden, ohne das Gebiet der Erfindung zu verlassen.Of course, the features of the previously described embodiments and aspects of the invention can be combined with one another. In particular, the features can be used not only in the combinations described, but also in other combinations or on their own, without leaving the field of the invention.

Beispielsweise wurden voranstehend Techniken beschrieben, in denen die erfassten (Roh-)Bilder kombiniert werden, um das Ergebnisbild zu erhalten. Dabei ist es im Allgemeinen möglich, dass die erfassten Bilder nachbearbeitet werden, beispielsweise durch Anwendung von Filtern im Frequenzraum. Diese digitalen Filter können in Abhängigkeit vom verwendeten Absorptionsfilter ausgewählt werden. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass bei schwachen Absorptionsraten des Filters die niedrigen Ortsfrequenzen bzw. die kleinen Phasengradienten nur schwach übertragen werden. Es ist dann möglich, (digitale) Frequenzfilter zu verwenden, die den Frequenzbereich der ein oder mehreren Roh-bildes und/oder des Ergebnisbildes, der der Zone der Abschwächung entspricht, verstärkt. Z.B. kann der Bereich der Frequenzen mit einem Faktor multipliziert werden, während alle Frequenzen außerhalb des Bereichs unverändert bleiben.For example, techniques have been described above in which the captured (raw) images are combined in order to obtain the result image. It is generally possible for the captured images to be post-processed, for example by using filters in the frequency domain. These digital filters can be selected depending on the absorption filter used. This is based on the knowledge that the low spatial frequencies or the small phase gradients are only weakly transmitted when the filter has low absorption rates. It is then possible to use (digital) frequency filters which amplify the frequency range of the one or more raw images and / or the result image, which corresponds to the zone of the attenuation. E.g. the range of frequencies can be multiplied by a factor while all frequencies outside the range remain unchanged.

Es wären auch andere klassische Bildverarbeitungstechniken anwendbar.Other classic image processing techniques would also be applicable.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturPatent literature cited

DE 102014112242 A1 [0006, 0013, 0040]
DE 102017108873 A1 [0013, 0040]

Claims

System (90) that includes: a microscope (100) with an illumination module (111), a sample holder (113), a detector (114) and an imaging optics (112) arranged between the sample holder (113) and the detector (114), - at least one computing unit (115) which is set up to control the lighting module (111) in order to illuminate a sample object (390) on the sample holder (113) with light from a plurality of lighting directions (700-703, 381, 382), and in order to control the detector (114) in order to acquire images which each correspond to one of the plurality of illumination directions (700-703, 381, 382), - An absorption filter (800) which is arranged in the imaging optics (112) and which has a location-dependent absorption rate (810).

System (90) according to Claim 1 , wherein the absorption rate (810) assumes larger values for larger distances to an optical axis (309) of the microscope (100).

System (90) according to Claim 1 or 2nd , wherein the absorption rate (810) has a radial course which is gradual or step-shaped.

System (90) according to one of the preceding claims, wherein the absorption filter (800) has an inner region (801) which has a first absorption rate (810), wherein the absorption filter (800) has an outer region (802) surrounding the inner region, which has a second absorption rate (810), wherein the second absorption rate (810) is greater than the first absorption rate (810).

System (90) according to Claim 4 , wherein the absorption rate (810) of the inner region (801) is not greater than 10%, and / or wherein the absorption rate (810) of the outer region (802) is greater than 50%.

System (90) according to Claim 4 or 5 , wherein the inner region (801) has a diameter which is in the range from 80% to 120% of a diameter (305) of an exit pupil, the exit pupil being associated with an illumination aperture (301) of the illumination module (111).

System (90) according to one of the Claims 4 to 6 , wherein the inner region (801) and the outer region (802) each have a diameter which is smaller than a diameter (315) of an entrance pupil which is associated with a detector aperture (319) of the imaging optics (112).

System (90) according to one of the preceding claims, wherein a numerical illumination aperture (301) of the illumination module (111) is smaller than a numerical detector aperture (319) of the imaging optics (112).

System (90) according to one of the preceding claims, wherein the absorption filter (800) is arranged in a pupil plane of the imaging optics (112).

System (90) according to one of the preceding claims, wherein the at least one computing unit (115) is further configured to combine the images to obtain a result image, the result image having a phase contrast.

Process that includes: - Controlling an illumination module (111) of a microscope (100) in order to illuminate a sample object (390) on a sample holder (113) of the microscope (100) with light from several illumination directions (700-703, 381, 382), - Controlling a detector (114) of the microscope (100) in order to capture images, each of which corresponds to one of the plurality of illumination directions (700-703, 381, 382), an absorption filter (800) with a location-dependent absorption rate (810) in one Imaging optics (112) of the microscope is arranged.

Procedure according to Claim 11 , the method being carried out by the computing unit (115) of the system (90) according to one of the Claims 1 to 10th is performed.