DE102018210696A1

DE102018210696A1 - Device and method for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid

Info

Publication number: DE102018210696A1
Application number: DE102018210696.7A
Authority: DE
Inventors: Christoph Faigle
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-01-02

Abstract

Eine Vorrichtung (10) ist zur dielektrophoretischen Separierung von Zielpartikeln in einer Flüssigkeit vorgesehen, wobei die Zielpartikel eine andere crossover-Frequenz als andere Partikel in der Flüssigkeit aufweisen. Die Vorrichtung umfasst einen Verbund aus wenigstens zwei sich in die Länge erstreckenden elektrischen Leitern (100), wobei die elektrischen Leiter (100) jeweils von einer Isolatorschicht (101) umhüllt sind.A device (10) is provided for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid, the target particles having a different crossover frequency than other particles in the liquid. The device comprises a composite of at least two electrical conductors (100) extending in length, the electrical conductors (100) each being encased by an insulator layer (101).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur dielektrophoretischen Separierung von Zielpartikeln in einer Flüssigkeit, wobei die Zielpartikel eine andere crossover-Frequenz als andere Partikel in der Flüssigkeit aufweisen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur dielektrophoretischen Separierung von Zielpartikeln in einer Flüssigkeit.The present invention relates to a device for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid, the target particles having a different crossover frequency than other particles in the liquid. The invention further relates to a method for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid.

Stand der TechnikState of the art

Die Analyse von flüssigen Proben, beispielsweise Blut oder Urin, zur Detektion von Krankheiten ist bekannt. Beispielsweise kann eine Blutanalyse in der Diagnostik von Krebserkrankungen eingesetzt werden. Man spricht hierbei auch von flüssiger Biopsie (Liquid Biopsy), wobei dem Patienten eine Gewebebiopsie erspart wird. Die Krebsdiagnostik konzentriert sich hierbei auf den Nachweis von DNA von Tumorzellen im Blut oder auch direkt auf den Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). Um bestimmte Zielzellen, also beispielsweise CTCs, isolieren und nachweisen zu können, ist es bisher in der Regel notwendig, einen spezifischen Marker einzusetzen, mit dem sich die Zielzellen gewissermaßen aus der Probe herausfangen lassen bzw. isoliert werden können. Derartige Marker sind allerdings oft sehr spezifisch und können nur an eine ganz bestimmte Gruppe von Subpopulationen binden, weshalb dieser Ansatz weniger für einen möglichst „universellen“ Krebstest geeignet ist.The analysis of liquid samples, for example blood or urine, for the detection of diseases is known. For example, a blood analysis can be used in the diagnosis of cancer. This is also referred to as liquid biopsy, whereby the patient is spared a tissue biopsy. Cancer diagnostics focus on the detection of DNA from tumor cells in the blood or directly on the detection of circulating tumor cells (CTCs). In order to be able to isolate and detect certain target cells, for example CTCs, it has hitherto generally been necessary to use a specific marker with which the target cells can to a certain extent be extracted from the sample or can be isolated. However, such markers are often very specific and can only bind to a very specific group of subpopulations, which is why this approach is less suitable for a “universal” cancer test.

Ein weiterer Ansatz in dieser Richtung arbeitet mit den unterschiedlichen dielektrophoretischen Eigenschaften von Krebszellen bzw. CTCs im Gegensatz zu normalen zellulären Blutbestandteilen. Die Polarisierbarkeit von Zellen ist abhängig von der Frequenz eines angelegten elektrischen Wechselfelds und kann bei gewissen Frequenzen (crossover frequency) von positiv zu negativ springen. Da es sich gezeigt hat, dass Tumorzellen geringere crossover-Frequenzen als normale Blutzellen besitzen ( Gascoyne et al. IEEE Trans Ind Appl. 1997; 33(3): 670-678 ), kann dies prinzipiell genutzt werden, um CTCs mit geeigneten elektrischen Feldern aus einer Blutprobe zu isolieren. Hierbei werden bei Wahl einer Frequenz zwischen den beiden Werten, also der crossover-Frequenz für normale Blutzellen und der crossover-Frequenz für Tumorzellen, gesunde Zellen dielektrophoretisch von Bereichen mit hohen Feldstärken abgestoßen (negative Dielektrophorese) und Krebszellen von Bereichen mit hohen Feldstärken angezogen (positive Dielektrophorese). So beschreibt beispielsweise die US 2016/0209299 A1 eine Flusszelle, mit der durch geeignete Wahl der crossover-Frequenz Tumorzellen von gesunden Zellen separiert werden sollen. Hierbei werden ineinander verschränkte metallische Elektroden eingesetzt, um den dielektrophoretischen Effekt zu erzeugen. Die WO 2010/104856 A2 beschreibt ebenfalls eine Flusszelle, wobei die Elektroden für die Dielektrophorese durch eine dünne Isolatorschicht von der Probenflüssigkeit getrennt sind.Another approach in this direction works with the different dielectrophoretic properties of cancer cells or CTCs in contrast to normal cellular blood components. The polarizability of cells depends on the frequency of an applied alternating electrical field and can jump from positive to negative at certain frequencies (crossover frequency). Since it has been shown that tumor cells have lower crossover frequencies than normal blood cells ( Gascoyne et al. IEEE Trans Ind Appl. 1997; 33 (3): 670-678 ), this can be used in principle to isolate CTCs with suitable electrical fields from a blood sample. When choosing a frequency between the two values, i.e. the crossover frequency for normal blood cells and the crossover frequency for tumor cells, healthy cells are dielectrophoretically rejected from areas with high field strengths (negative dielectrophoresis) and cancer cells are attracted to areas with high field strengths (positive dielectrophoresis). For example, the US 2016/0209299 A1 a flow cell with which tumor cells are to be separated from healthy cells by suitable selection of the crossover frequency. Interlaced metallic electrodes are used to create the dielectrophoretic effect. The WO 2010/104856 A2 also describes a flow cell, the electrodes for dielectrophoresis being separated from the sample liquid by a thin insulator layer.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention

Die Erfindung stellte eine Vorrichtung zur dielektrophoretischen Separierung von Zielpartikeln in einer Flüssigkeit bereit. Die Funktionsweise dieser Vorrichtung basiert darauf, dass die Zielpartikel eine andere crossover-Frequenz als andere Partikel in der Flüssigkeit aufweisen. Die Eigenschaft wird genutzt, um die Zielpartikel von anderen Partikeln in der Flüssigkeit dielektrophoretisch zu trennen bzw. aus der Flüssigkeit zu separieren und/oder zu isolieren. Dies wird durch Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes erreicht, wobei eine Frequenz gewählt wird, die zwischen den jeweiligen crossover-Frequenzen für die Zielpartikel (beispielsweise Krebszellen, insbesondere CTCs) und für die übrigen Partikel (beispielsweise gesunde Blutzellen) liegt, so dass auf die übrigen Partikel negative dielektrophoretische Kräfte wirken und auf die Zielpartikel positive dielektrophoretische Kräfte wirken. Die Vorrichtung umfasst dabei einen Verbund aus wenigstens zwei, beispielsweise zylinderförmigen, sich in die Länge erstreckenden elektrischen Leitern. Beide elektrischen Leiter sind jeweils von einer Isolatorschicht umhüllt, wobei die Leiter in Längsrichtung fest miteinander verbunden sind, beispielsweise durch Plasmabonding. Hierbei wird vorzugsweise oberhalb und unterhalb der Verbindung (Bondstelle) eine Vertiefung in Längsrichtung geformt, gewissermaßen ein Graben, wobei in dieser Vertiefung ein Bereich mit hoher Feldstärke ausbildbar ist, wenn an die elektrischen Leiter ein elektrisches Wechselfeld angelegt wird. Zur Ausbildung dieser Vertiefung können die elektrischen Leiter im Querschnitt beispielsweise oval oder kreisrund sein, so dass sich oberhalb und unterhalb der Verbindung der elektrischen Leiter eine derartige Vertiefung (Graben) ausbildet. Es können aber auch andere Querschnittsformen der elektrischen Leiter gewählt werden. Bei Anlegen einer Wechselspannung mit einer geeigneten Frequenz werden sich die Zielzellen zu den Bereichen mit hohen Feldstärken in den Vertiefungen hinbewegen, während andere Partikel abgestoßen werden. Die Vertiefungsbereiche oder Gräben wirken hierbei als Zell-Festhaltebereiche. Auf diese Weise können die Zielpartikel separiert bzw. isoliert werden. Hierbei wird die crossover-Frequenz der Zielpartikel gewissermaßen als Marker oder Separierungsmerkmal genutzt, um die Zielpartikel zu isolieren. Der besondere Vorteil hierbei ist, dass die Zielpartikel nicht aufgrund spezifischer Oberflächenproteine oder Ähnlichem separiert werden, sondern dass mit diesem Ansatz eine wesentlich universellere Methode realisiert wird, die beispielsweise für einen allgemeinen Krebstest verwendbar ist. Dadurch, dass die elektrischen Leiter selbst jeweils von einer Isolatorschicht umhüllt sind, bei der es sich insbesondere um ein inertes, biokompatibles Material handelt, kommt es nicht zu einer Verunreinigung oder Kontamination der elektrischen Leiter selbst mit der Probe, so dass die Vorrichtung ohne Weiteres wieder verwendbar ist.The invention provides an apparatus for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid. The functioning of this device is based on the fact that the target particles have a different crossover frequency than other particles in the liquid. The property is used to dielectrophoretically separate the target particles from other particles in the liquid or to separate and / or isolate them from the liquid. This is achieved by applying an alternating electrical field, a frequency being selected which lies between the respective crossover frequencies for the target particles (for example cancer cells, in particular CTCs) and for the other particles (for example healthy blood cells), so that the remaining particles negative dielectrophoretic forces act and positive dielectrophoretic forces act on the target particles. The device comprises a composite of at least two, for example cylindrical, electrical conductors that extend in length. Both electrical conductors are each covered by an insulator layer, the conductors being firmly connected to one another in the longitudinal direction, for example by plasma bonding. In this case, a depression is preferably formed in the longitudinal direction above and below the connection (bond point), to a certain extent a trench, an area with high field strength being able to be formed in this depression when an alternating electrical field is applied to the electrical conductors. To form this recess, the electrical conductors can be oval or circular in cross section, for example, so that such a recess (trench) is formed above and below the connection of the electrical conductors. However, other cross-sectional shapes of the electrical conductors can also be selected. When an AC voltage is applied at a suitable frequency, the target cells will move to the areas with high field strengths in the wells while other particles are rejected. The recessed areas or trenches act as cell retention areas. In this way, the target particles can be separated or isolated. The crossover frequency of the target particles is used to a certain extent as a marker or separation feature in order to isolate the target particles. The particular advantage here is that the target particles are not separated on the basis of specific surface proteins or the like, but that this approach realizes a much more universal method, for example for a general cancer test can be used. The fact that the electrical conductors themselves are each covered by an insulator layer, which is in particular an inert, biocompatible material, does not result in the electrical conductors themselves being contaminated or contaminated with the sample, so that the device can easily be used again is usable.

Bei der Flüssigkeit oder Probe selbst handelt es sich vorzugsweise um menschliches oder tierisches Blut. Bei den Zielpartikeln handelt es sich vorzugsweise um Zellen, insbesondere um zirkulierende Tumorzellen (CTCs), so dass die Vorrichtung im Rahmen einer Krebsdiagnostik einsetzbar ist. Aber auch andere biologische Zellen können mit der Vorrichtung separiert und/oder isoliert werden. Prinzipiell eignet sich die Vorrichtung für eine Separierung von jeder Art von Zielpartikeln in einer Flüssigkeit, die von anderen Partikeln getrennt werden sollen, wobei die Voraussetzung für die Funktion der Vorrichtung ist, dass die Zielpartikel und die übrigen Partikel sich in ihrer crossover-Frequenz unterscheiden.The liquid or sample itself is preferably human or animal blood. The target particles are preferably cells, in particular circulating tumor cells (CTCs), so that the device can be used in the context of cancer diagnosis. However, other biological cells can also be separated and / or isolated using the device. In principle, the device is suitable for separating any type of target particles in a liquid which are to be separated from other particles, the prerequisite for the function of the device being that the target particles and the other particles differ in their crossover frequency.

Ein besonderer Vorteil der Vorrichtung ist, dass die Vorrichtung in fließenden Proben bzw. Flüssigkeiten eingesetzt werden kann, also gewissermaßen in kontinuierlichen Proben. Dabei ist die Vorrichtung selbst in die Flüssigkeit, also beispielsweise in Blut, einbringbar. So ist es möglich, dass die Vorrichtung direkt in den Blutkreislauf einer Person oder auch eines Tieres eingebracht wird, um dort in einem Blutgefäß zu verweilen und über einen gewissen Zeitraum eine Anreicherung bzw. Separierung von Tumorzellen in den Vertiefungsbereichen (Gräben) des Leiterverbundes zu erreichen. Durch das Verweilen der Vorrichtung im Körper bzw. im Blutkreislauf ist das Probenvolumen, das die Vorrichtung umspült, sehr groß. Dies ist ein besonderer Vorteil der vorliegenden Vorrichtung, da der Anteil von CTCs in der Regel sehr gering ist, beispielsweise eine Zelle pro Milliliter. Daher ist für eine Analytik bzw. Diagnostik ein großes Probenvolumen nötig, um eine genügend hohe Anzahl von CTCs zu isolieren. Eine Blutentnahme in einer Größenordnung von beispielsweise 500 ml, die für eine entsprechende Diagnostik außerhalb des Körpers erforderlich wäre, verbietet sich aus medizinischen Gründen. Die hier beschriebene Vorrichtung löst dieses Problem, indem die Vorrichtung zur Separierung der Zielpartikel bzw. der Tumorzellen direkt in den Blutkreislauf eingebracht werden kann. Da sich die elektrischen Leiter bzw. die Elektroden, die den Verbund bilden, nahe beieinander befinden, ist die benötigte Spannung für die Erzeugung des elektrischen Wechselfeldes für die Dielektrophorese nur gering, so dass dieser Ansatz ohne Gefahr für den Patienten in vivo eingesetzt werden kann. Gleichwohl kann die Vorrichtung auch außerhalb des Körpers eines Patienten verwendet werden und für die Analyse von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten eingesetzt werden.A particular advantage of the device is that the device can be used in flowing samples or liquids, that is to say in continuous samples. The device itself can be introduced into the liquid, for example into blood. It is thus possible for the device to be introduced directly into the blood circulation of a person or an animal, in order to remain there in a blood vessel and to accumulate or separate tumor cells in the deep areas (trenches) of the conductor network over a certain period of time , Because the device remains in the body or in the bloodstream, the sample volume that flows around the device is very large. This is a particular advantage of the present device, since the proportion of CTCs is usually very small, for example one cell per milliliter. A large sample volume is therefore required for analysis or diagnostics in order to isolate a sufficiently high number of CTCs. A blood sample of the order of 500 ml, for example, which would be required for a corresponding diagnosis outside the body, is prohibited for medical reasons. The device described here solves this problem in that the device for separating the target particles or the tumor cells can be introduced directly into the bloodstream. Since the electrical conductors or the electrodes that form the composite are located close to one another, the voltage required for generating the alternating electrical field for the dielectrophoresis is only low, so that this approach can be used in vivo without risk to the patient. Nevertheless, the device can also be used outside of a patient's body and used for the analysis of blood or other body fluids.

Zur Einbringung der Vorrichtung in den Blutkreislauf kann beispielsweise eine Hohlnadel oder Kanüle verwendet werden. Hierfür kann beispielsweise zunächst ein Zugang mit einer Hohlnadel gelegt werden, bevor anschließend die Vorrichtung, also insbesondere der Verbund mit den elektrischen Leitern, in die Hohlnadel eingeschoben wird. Dies ist für den Patienten nicht wesentlich unangenehmer als beispielsweise eine Blutentnahme oder eine Verabreichung von Medikamenten über einen solchen Zugang. Zudem wird dem Patienten auf diese Weise das Entnehmen einer großen Blutprobe oder sogar eine Gewebebiopsie erspart.For example, a hollow needle or cannula can be used to introduce the device into the bloodstream. For this purpose, for example, an access can first be made with a hollow needle, before the device, that is to say in particular the assembly with the electrical conductors, is then inserted into the hollow needle. This is not significantly more uncomfortable for the patient than, for example, taking a blood sample or administering medication via such an access. It also saves the patient from having to take a large blood sample or even a tissue biopsy.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung kann der Verbund aus den elektrischen Leitern an einem Ende des Verbundes, und zwar an dem Ende, das nicht zur Verbindung mit einer Spannungsquelle vorgesehen ist, eine zusätzliche Schicht oder einen Verdickungsbereich aus einem flexiblen und/oder weichen Material aufweisen, beispielsweise aus weichem Isoliermaterial. Diese zusätzliche Schicht kann beispielsweise in Form eines Tropfens realisiert sein und hat den besonderen Vorteil, dass hierdurch die Gefahr von Verletzungen eines Blutgefäßes beim Einsetzen der Vorrichtung in die Blutbahn des Patienten minimiert wird. Weiterhin kann an wenigstens einer Stelle des Verbundes, insbesondere um den Verbund herum, ein Abstandshalter, insbesondere ein isolierender Abstandshalter, vorgesehen sein. Dieser Abstandshalter dient zur Begrenzung des Vorschubs des Verbundes innerhalb einer Hohlnadel, mittels derer die Vorrichtung in den Blutkreislauf eingeführt werden kann. Hierdurch wird vermieden, dass der Verbund, der durch die Hohlnadel eingeführt wird, zu weit in das Blutgefäß geschoben werden kann. Dafür ist zweckmäßigerweise der Durchmesser dieses Abstandshalters größer als der Durchmesser des Zugangs, also der Hohlnadel.In a preferred embodiment of the device, the composite of the electrical conductors can have an additional layer or a thickening region made of a flexible and / or soft material at one end of the composite, namely at the end that is not intended for connection to a voltage source , for example made of soft insulating material. This additional layer can be implemented in the form of a drop, for example, and has the particular advantage that it minimizes the risk of injury to a blood vessel when the device is inserted into the patient's bloodstream. Furthermore, a spacer, in particular an insulating spacer, can be provided at at least one point in the composite, in particular around the composite. This spacer serves to limit the advance of the composite within a hollow needle, by means of which the device can be inserted into the bloodstream. This prevents the compound that is inserted through the hollow needle from being pushed too far into the blood vessel. For this purpose, the diameter of this spacer is expediently larger than the diameter of the access, that is to say the hollow needle.

In besonders bevorzugter Weise ist der Verbund aus den elektrischen Leitern aufgedreht, wodurch die Vorrichtung kleine und sehr platzsparend realisiert werden kann. Beispielsweise kann der Verbund in eine Spiral-, Schnecken-, Schrauben- oder helikale Form gedreht werden. Hierbei wird zum einen die Länge der Vertiefung bzw. die Grabenlänge zwischen den Leitern, die für die Separierung und/oder Isolierung der Zielpartikel zur Verfügung steht, erhöht. Gleichzeitig können durch die eingerollte Form und die geringe Größe der Vorrichtung die Unannehmlichkeiten für den Patienten während des Einsatzes der Vorrichtung noch weiter verringert werden.In a particularly preferred manner, the composite of the electrical conductors is turned on, as a result of which the device can be realized in a small and very space-saving manner. For example, the composite can be turned into a spiral, screw, screw or helical shape. On the one hand, the length of the depression or the trench length between the conductors, which is available for the separation and / or isolation of the target particles, is increased. At the same time, the inconvenience for the patient during use of the device can be reduced even further by the rolled-up shape and the small size of the device.

In einer Ausgestaltung der Vorrichtung wird der Verbund von zwei miteinander verbundenen elektrischen Leitern gebildet. Es können jedoch auch durchaus mehr als zwei Leiter miteinander verbunden sein. Beispielsweise kann der Verbund aus vier miteinander verbundenen elektrischen Leitern bestehen, wobei die einzelnen Leiter zweckmäßigerweise über Kreuz mit einer Spannungsquelle verbindbar sind. Die Erhöhung der Anzahl der elektrischen Leiter des Verbundes hat den Vorteil, dass die Vertiefungsbereiche bzw. Gräben zwischen den miteinander verbundenen Leitern in ihrer Gesamtlänge beispielsweise verdoppelt werden. So sind bei zwei miteinander verbundenen Leitern über die Länge des Verbundes zwei Gräben vorhanden, wohingegen bei vier miteinander verbundenen Leitern vier nach außen weisende Gräben vorhanden sind. Die Erhöhung der Anzahl der Leiter ist daher mit einer Erhöhung der Effektivität der Vorrichtung bei gleicher Länge des Verbundes verbunden. Durch eine Erhöhung der Anzahl der Leiter im Verbund wird weiterhin die Stabilität des Gesamtverbundes erhöht. Auch ein Verbund aus vier oder mehr elektrischen Leitern kann aufgedreht werden, um die äußeren Abmessungen der Vorrichtung zu verringern.In one configuration of the device, the assembly of two is connected to one another electrical conductors formed. However, more than two conductors can also be connected to one another. For example, the composite can consist of four interconnected electrical conductors, the individual conductors expediently being connectable crosswise to a voltage source. Increasing the number of electrical conductors in the assembly has the advantage that the total length of the recess areas or trenches between the interconnected conductors is doubled, for example. In the case of two conductors connected to one another, there are two trenches along the length of the composite, whereas with four conductors connected to one another there are four trenches pointing outwards. The increase in the number of conductors is therefore associated with an increase in the effectiveness of the device with the same length of the composite. Increasing the number of conductors in the network further increases the stability of the overall network. A composite of four or more electrical conductors can also be opened in order to reduce the external dimensions of the device.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung ist die Isolatorschicht der einzelnen, den Verbund bildenden Leiter zumindest teilweise mit einer unspezifisch zellaffinen Beschichtung versehen, beispielsweise mit Fibronektin und/oder Kollagen. Somit wird sichergestellt, dass auch nach dem Ausschalten der angelegten Spannung bereits eingefangene Zielpartikel bzw. Zielzellen weiter am Verbund adhärieren, so dass die Vorrichtung auch nach Ausschalten der Spannung aus dem Blutkreislauf einfach entnommen werden kann, ohne dass sich die adhärierten Zielzellen von der Vorrichtung lösen. Die Nicht-Zielpartikel bzw. Nicht-Zielzellen werden von der unspezifisch zellaffinen Beschichtung in der Regel nicht beeinflusst, da während des angelegten elektrischen Wechselfeldes die Nicht-Zielpartikel durch die wirkenden negativen dielektrophoretischen Kräfte abgestoßen werden.In a particularly preferred embodiment of the device, the insulator layer of the individual conductors forming the composite is at least partially provided with an unspecific cell-affine coating, for example with fibronectin and / or collagen. This ensures that target particles or target cells that have already been captured continue to adhere to the composite even after the applied voltage has been switched off, so that the device can be easily removed from the blood circulation even after the voltage has been switched off without the adhered target cells detaching from the device , The non-target particles or non-target cells are generally not influenced by the non-specific cell-affine coating, since the non-target particles are repelled by the acting negative dielectrophoretic forces during the applied electrical alternating field.

Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur dielektrophoretischen Separierung von Zielpartikeln in einer Flüssigkeit, wobei die Zielpartikel eine andere crossover-Frequenz als andere Partikel in der Flüssigkeit aufweisen. Für dieses Verfahren wird eine Vorrichtung wie oben beschrieben in die Flüssigkeit eingebracht, wobei die Vorrichtung einen Verbund aus wenigstens zwei in Längsrichtung miteinander verbundenen elektrischen Leitern umfasst. An den Verbund der Vorrichtung wird eine Wechselspannung mit geeigneter Frequenz angelegt, so dass sich die Zielpartikel gemäß ihren dielektrophoretischen Eigenschaften durch die auf sie wirkenden positiven dielektrophoretischen Kräfte in den Vertiefungen bzw. Gräben des Verbundes anlagern. Je nach Konzentration und Anzahl der Zielpartikel in der jeweiligen Flüssigkeit bzw. Probe kann das Verfahren über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden, bis sich ausreichend Zielpartikel angelagert haben. Anschließend kann die Vorrichtung aus der Flüssigkeit entnommen werden, wobei die in den Vertiefungen des Verbundes angelagerten Zielpartikel isoliert und weiter analysiert werden können. Hierbei kann beispielsweise eine einfache Zählung oder eine nähere Analyse beispielsweise mit molekularbiologischen immunbiologischen Methoden erfolgen. Die Vorrichtung kann in vitro, also außerhalb eines Körpers, oder in vivo eingesetzt werden. Wenn es sich bei den Zielpartikeln um bestimmte Blutzellen, beispielsweise um zirkulierende Tumorzellen, handelt, kann die Vorrichtung beispielsweise direkt in den Blutkreislauf eines Patienten eingeführt werden. Hierfür wird vorzugsweise zunächst ein Zugang mit einer Hohlnadel oder Kanüle gelegt, bevor anschließend die Vorrichtung bzw. der Verbund in die Hohlnadel eingeschoben wird und so in den Blutkreislauf des Patienten gelangt. Der Verbund kann über einen längeren Zeitraum, beispielsweise 30 bis 60 min, im Blutkreislauf verbleiben, um ausreichend Zielzellen anreichern zu können. Vorzugsweise kann bereits während des Einschiebens der Vorrichtung bzw. des Verbundes in die Hohlnadel eine geeignete Wechselspannung angelegt werden, so dass eine unspezifische Adhäsion von Nicht-Zielpartikeln bzw. Nicht-Zielzellen vermieden wird.The invention further comprises a method for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid, the target particles having a different crossover frequency than other particles in the liquid. For this method, a device is introduced into the liquid as described above, the device comprising a composite of at least two electrical conductors connected to one another in the longitudinal direction. An alternating voltage with a suitable frequency is applied to the composite of the device, so that the target particles accumulate in the depressions or trenches of the composite according to their dielectrophoretic properties due to the positive dielectrophoretic forces acting on them. Depending on the concentration and number of target particles in the respective liquid or sample, the method can be carried out over a longer period of time until sufficient target particles have accumulated. The device can then be removed from the liquid, the target particles deposited in the depressions of the composite being isolated and further analyzed. Here, for example, a simple counting or a more detailed analysis can be carried out, for example, using molecular biological immunobiological methods. The device can be used in vitro, ie outside a body, or in vivo. If the target particles are certain blood cells, for example circulating tumor cells, the device can be inserted directly into the bloodstream of a patient, for example. For this purpose, an access is preferably first made with a hollow needle or cannula before the device or the composite is then inserted into the hollow needle and thus enters the patient's bloodstream. The compound can remain in the bloodstream over a longer period of time, for example 30 to 60 minutes, in order to be able to accumulate sufficient target cells. A suitable alternating voltage can preferably be applied during the insertion of the device or the composite into the hollow needle, so that non-specific adhesion of non-target particles or non-target cells is avoided.

Als elektrischer Leiter eignet sich beispielsweise ein Metalldraht, der beispielsweise einen Durchmesser von etwa 50 µm bis etwa 200 µm aufweisen kann. Geeignete Längen für den Verbund aus zwei oder mehr elektrischen Leitern sind beispielsweise 5 bis 15 cm. Wenn der Verbund der elektrischen Leiter aufgedreht wird, kann die Länge auch deutlich länger sein. Bei der Isolatorschicht handelt es sich insbesondere um eine elektrisch isolierende Schicht aus beispielsweise Polymeren. Beispielsweise ist PDMS (Polydimethylsiloxan) geeignet, welches ungiftig und chemisch inert ist. PDMS zeichnet sich damit durch eine hohe Biokompatibilität aus. Für die Spannungsversorgung wird ein Wechselstrom angelegt, beispielsweise in einem Bereich zwischen 10 und 20 V. Geeignete Frequenzen liegen insbesondere im Bereich zwischen 10 und 200 kHz, wobei die jeweilig angelegte Frequenz abhängig von den crossover-Frequenzen der Zielpartikel und der Nicht-Zielpartikel ist. Beispielsweise können gesunde Zellen als Nicht-Zielpartikel, beispielsweise mononukleäre Blutzellen, eine Crossover-Frequenz von mehr als 120 Kilohertz aufweisen, während die CTCs als Zielpartikel beispielsweise Crossover-Frequenzen zwischen 20 und 100 Kilohertz haben.A suitable metal conductor is, for example, a metal wire which can have a diameter of approximately 50 μm to approximately 200 μm, for example. Suitable lengths for the composite of two or more electrical conductors are, for example, 5 to 15 cm. If the connection of the electrical conductors is opened, the length can also be significantly longer. The insulator layer is, in particular, an electrically insulating layer made of, for example, polymers. For example, PDMS (polydimethylsiloxane), which is non-toxic and chemically inert, is suitable. PDMS is characterized by a high level of biocompatibility. An alternating current is applied for the voltage supply, for example in a range between 10 and 20 V. Suitable frequencies are in particular in the range between 10 and 200 kHz, the frequency applied in each case being dependent on the crossover frequencies of the target particles and the non-target particles. For example, healthy cells as non-target particles, for example mononuclear blood cells, can have a crossover frequency of more than 120 kilohertz, while the CTCs as target particles have, for example, crossover frequencies between 20 and 100 kilohertz.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.Further features and advantages of the invention result from the following description of exemplary embodiments in conjunction with the drawings. Here the individual Features can be realized individually or in combination with each other.

In den Zeichnungen zeigen:

1A, B schematischer Querschnitt durch einen Leiterverbund mit zwei Leitern (A) mit Ausschnittsvergrößerung (B);
2 schematischer Querschnitt durch einen Leiterverbund mit vier elektrischen Leitern und
3 schematische Seitenansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung.

The drawings show:

1A, B schematic cross section through a conductor assembly with two conductors (A) with enlarged detail (B);
2 schematic cross section through a conductor assembly with four electrical conductors and
3 schematic side view of an embodiment of the device.

Beschreibung von AusführungsbeispielenDescription of exemplary embodiments

1A, B zeigt im Querschnitt eine Ausführungsform der Vorrichtung 10, die im Wesentlichen von einem Verbund aus zwei elektrischen Leitern 100 gebildet ist. Die elektrischen Leiter werden beispielsweise jeweils von einem Metalldraht gebildet. Beide elektrischen Leiter 100 sind jeweils von einer Isolatorschicht 101 umschlossen. Die Isolatorschicht kann beispielsweise von einem Polymer gebildet sein, beispielsweise PDMS. Die elektrischen Leiter 100 sind im Querschnitt in diesem Beispiel etwa kreisförmig und damit insgesamt in der Länge zylinderförmig. Beide elektrischen Leiter 100 sind der Länge nach durchgängig miteinander fest verbunden. Die entsprechende Bondstelle 102 kann beispielsweise durch Plasmabonding hergestellt werden. Hierdurch bildet sich ein fester Verbund der beiden elektrischen Leiter 100, wobei sich zwischen den beiden Leitern 100 oberhalb und unterhalb der Bondstelle 102 eine längsverlaufende Vertiefung bzw. ein Graben 103 bildet. Durch Anlegen einer Spannung U_AC zwischen den Leitern 100 entsteht ein elektrisches Feld E, wobei die Feldstärke in den Vertiefungsbereichen 103 ober- und unterhalb der Bondstelle 102 am stärksten ist. Durch geeignete Wahl der Anregungsfrequenz der Spannung werden die Zielpartikel durch positiv wirkende dielektrophoretische Kräfte in Richtung der Vertiefungen 103 gezogen und dort festgehalten, wohingegen Nicht-Zielpartikel durch negative Dielektrophorese abgestoßen werden. 1B zeigt einen vergrößerten Ausschnitt aus 1A, wobei der Vertiefungsbereich 103 oberhalb der Bondstelle 102 zwischen den beiden Leitern 100 mit der jeweiligen Isolatorschicht 101 gezeigt ist. Im Bereich 103 sind die Feldlinien des elektrischen Feldes angedeutet, wobei sich im schraffierten Bereich 104 der Bereich mit der größten Feldstärke befindet. Insbesondere in diesem Bereich 104 werden die Zielpartikel durch die wirkenden positiven dielektrophoretischen Kräfte festgehalten. Mit dieser Vorrichtung 10 können beispielsweise zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in einer kontinuierlich fließenden Blutprobe, beispielsweise direkt im Blutkreislauf eines Patienten, separiert und nachgewiesen werden, indem die CTCs im Bereich 104 gefangen und angereichert werden. Hierfür kann die Vorrichtung beispielsweise mittels einer Hohlnadel in eine Armvene eines Patienten eingebracht werden (Blutgeschwindigkeit: ca. 10 cm/s, Durchmesser: ca. 4 mm, Durchfluss: ca. 1 ml/s) und dort für einen gewissen Zeitraum mit angelegter Spannung, beispielsweise für 30 bis 60 min, verbleiben. Anschließend kann der Verbund aus den elektrischen Leitern 100 aus der Vene herausgezogen werden, sodass die adhärierten Zellen untersucht werden können. 1A, B shows in cross section an embodiment of the device 10 , which is essentially a composite of two electrical conductors 100 is formed. The electrical conductors are each formed, for example, by a metal wire. Both electrical conductors 100 are each from an insulator layer 101 enclosed. The insulator layer can be formed, for example, by a polymer, for example PDMS. The electrical conductors 100 are approximately circular in cross section in this example and are therefore cylindrical in length overall. Both electrical conductors 100 are permanently connected to each other along the length. The corresponding bond site 102 can be made, for example, by plasma bonding. This forms a firm bond between the two electrical conductors 100 , being between the two conductors 100 above and below the bond site 102 a longitudinal depression or a trench 103 forms. By applying a voltage U _AC between the ladders 100 creates an electric field E, the field strength in the recessed areas 103 above and below the bond point 102 is strongest. By a suitable choice of the excitation frequency of the voltage, the target particles are caused by positive dielectrophoretic forces in the direction of the depressions 103 drawn and held there, whereas non-target particles are rejected by negative dielectrophoresis. 1B shows an enlarged section 1A , the recess area 103 above the bond site 102 between the two heads 100 with the respective insulator layer 101 is shown. In the area 103 the field lines of the electric field are indicated, with the shaded area 104 the area with the greatest field strength is located. Especially in this area 104 the target particles are held by the positive dielectrophoretic forces. With this device 10 For example, circulating tumor cells (CTCs) can be separated and detected in a continuously flowing blood sample, for example directly in the bloodstream of a patient, by the CTCs in the area 104 caught and enriched. For this purpose, the device can be inserted, for example, into a patient's arm vein using a hollow needle (blood speed: approx. 10 cm / s, diameter: approx. 4 mm, flow rate: approx. 1 ml / s) and there for a certain period of time with the voltage applied , for example for 30 to 60 min, remain. The composite can then be made from the electrical conductors 100 withdrawn from the vein so that the adhered cells can be examined.

2 illustriert eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung 20, bei der vier elektrische Leiter 100, jeweils mit einer Isolatorschicht 101, einen Verbund bilden. Die einzelnen elektrischen Leiter 100 sind über insgesamt vier Bondstellen 102 fest miteinander verbunden, so dass vier sich in Längsrichtung erstreckende Vertiefungen (Gräben) 103 gebildet werden. Die einzelnen elektrischen Leiter 100 sind jeweils über Kreuz mit einer Spannungsquelle (U_AC ) verbunden. In dieser Ausführungsform ist zum einen die Stabilität des Gesamtverbundes erhöht. Zum anderen ist die verfügbare Gesamtlänge der Vertiefungen 103 als Zell-Festhaltebereich gegenüber einer Ausgestaltung mit zwei verbundenen elektrischen Leitern verdoppelt. 2 illustrates another embodiment of a device 20 , with four electrical conductors 100 , each with an insulator layer 101 to form a network. The individual electrical conductors 100 are across a total of four bond points 102 firmly connected to each other so that four longitudinally extending depressions (trenches) 103 be formed. The individual electrical conductors 100 are each crossed with a voltage source ( U _AC ) connected. In this embodiment, on the one hand, the stability of the overall assembly is increased. The other is the total length of the wells available 103 doubled as a cell retention area compared to an embodiment with two connected electrical conductors.

3 zeigt eine Längsansicht einer Vorrichtung 30 gemäß der Erfindung, wobei in dieser Ansicht ein Verbund aus zwei elektrischen Leitern 100, jeweils mit umgebender Isolatorschicht 101, zu erkennen ist. Die Vorrichtung 30 kann jedoch auch einen Verbund mit mehr als zwei elektrischen Leitern 100, beispielsweise mit vier oder mehr elektrischen Leitern, umfassen. Die elektrischen Leiter 100 erstrecken sich über die Länge a und sind an einem Ende mit einer Spannungsquelle U_AC verbunden. Am gegenüberliegenden Ende befindet sich ein Tropfen 301 bzw. eine Schicht aus einem weichen Material, insbesondere einem weichen Isoliermaterial, mit dem das Verletzungsrisiko beim Einsetzen in ein Blutgefäß minimiert wird. Mit einem gewissen Abstand zu dem Ende des Verbundes mit dem weichem Material 301, insbesondere im Bereich des Anschlusses der Spannungsquelle U_AC , befindet sich ein Abstandshalter 302, beispielsweise ebenfalls aus einem weichen Isoliermaterial. Die Position des Abstandshalters 302 wird so gewählt, dass der Abstandshalter 302 vermeidet, dass der Verbund aus den elektrischen Leitern 100 zu weit in ein Blutgefäß eingeschoben werden kann. Hierfür ist der Abstandshalter 302 zweckmäßigerweise größer als der Durchmesser einer Hohlnadel, die den Zugang für das Einführen der Vorrichtung 30 in ein Blutgefäß eines Patienten bilden kann. Der Verbund aus den elektrischen Leitern 100 wird dabei zweckmäßigerweise so weit in ein Blutgefäß eingeschoben, dass sich eine gewisse Länge des Verbundes außerhalb der Hohlnadel befindet, also frei im Blutgefäß befindet und von dem umgebenden Blut umspült wird. Für die Anwendung wird hierzu zunächst ein Zugang mit einer Hohlnadel gelegt, insbesondere ein steriler Zugang, der idealerweise isolierend ist. Nach der Punktion wird der Leiterverbund durch die Hohlnadel, beispielsweise bis zum Anschlag des Abstandshalters 302, eingeschoben. Um eine unspezifische Adhäsion von Nicht-Zielzellen zu vermeiden, wird die Spannungsquelle vorzugsweise bereits schon beim Einführen angeschaltet. Der Verbund aus den elektrischen Leitern 100 verbleibt anschließend über einen gewissen Zeitraum, beispielsweise 30 bis 60 Minuten, im Blutstrom bei angelegtem elektrischem Wechselfeld. Gemäß dem dielektrophoretischen Prinzip werden ggf. vorhandene CTCs in den Vertiefungen 103 zwischen den elektrischen Leitern 100 eingefangen. Anschließend kann der Verbund aus dem Blutgefäß extrahiert werden, indem er wieder durch die Hohlnadel hindurch herausgezogen wird. Zweckmäßigerweise wird der herausgezogene Verbund sogleich in ein geeignetes Aufbewahrungsgefäß mit Puffermedium oder einer anderen Lösung gegeben, damit die adhärierten Zellen nicht austrocknen. Ein geeignetes Puffermedium ist beispielsweise ein typisches Zellmedium wie z. B. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Anschließend können die adhärierten Zellen weiter analysiert werden. 3 shows a longitudinal view of a device 30 according to the invention, in this view a composite of two electrical conductors 100 , each with a surrounding insulator layer 101 , can be seen. The device 30 However, it can also be a composite with more than two electrical conductors 100 , for example with four or more electrical conductors. The electrical conductors 100 extend over length a and are at one end with a voltage source U _AC connected. There is a drop at the opposite end 301 or a layer of a soft material, in particular a soft insulating material, with which the risk of injury when inserted into a blood vessel is minimized. At a certain distance from the end of the bond with the soft material 301 , especially in the area of the connection of the voltage source U _AC , there is a spacer 302 , for example also made of a soft insulating material. The position of the spacer 302 is chosen so that the spacer 302 avoids the composite from the electrical conductors 100 can be inserted too far into a blood vessel. The spacer is for this 302 expediently larger than the diameter of a hollow needle which gives access for the insertion of the device 30 into a patient's blood vessel. The combination of the electrical conductors 100 is expediently inserted so far into a blood vessel that a certain length of the composite is outside the hollow needle, that is to say it is freely in the blood vessel and is surrounded by the surrounding blood. For the application, an access is first made with a hollow needle, especially a sterile access, which is ideally isolating. After the puncture, the composite conductor is through the hollow needle, for example up to the stop of the spacer 302 , inserted. In order to avoid non-specific adhesion of non-target cells, the voltage source is preferably switched on as soon as it is inserted. The combination of the electrical conductors 100 then remains in the blood stream for a certain period of time, for example 30 to 60 minutes, with an alternating electrical field applied. According to the dielectrophoretic principle, any CTCs that are present in the wells 103 between the electrical conductors 100 captured. The composite can then be extracted from the blood vessel by pulling it out again through the hollow needle. The pulled-out composite is expediently immediately placed in a suitable storage vessel with buffer medium or another solution so that the adhered cells do not dry out. A suitable buffer medium is, for example, a typical cell medium such as e.g. B. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). The adherent cells can then be analyzed further.

Die Isolatorschicht kann mit Vorteil mit einer zusätzlichen Beschichtung 110 versehen sein, an die die Zellen unspezifisch adhärieren. Hierfür geeignet ist beispielsweise Fibronektin oder Kollagen. Hierdurch kann sichergestellt werden, dass nach einer Extraktion des Verbundes aus dem Blutgefäß, wenn die Spannung ausgeschaltet wird, schon eingefangene Zielzellen weiter im Vertiefungsbereich 103 verbleiben. Da die Nicht-Zielzellen durch die negative Dielektrophorese abgestoßen werden, werden nur Zielzellen an der Beschichtung 110 adhärieren, auch wenn es sich hierbei um ein unspezifisches Affinitätsmaterial handelt.The insulator layer can advantageously be provided with an additional coating 110 be provided to which the cells adhere non-specifically. Fibronectin or collagen, for example, is suitable for this. In this way it can be ensured that after extraction of the composite from the blood vessel, when the voltage is switched off, target cells that have already been captured continue in the deepening area 103 remain. Since the non-target cells are rejected by the negative dielectrophoresis, only target cells are on the coating 110 adhere, even if this is an unspecific affinity material.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturPatent literature cited

US 2016/0209299 A1 [0003]
WO 2010/104856 A2 [0003]

Zitierte Nicht-PatentliteraturNon-patent literature cited

Gascoyne et al. IEEE Trans Ind Appl. 1997; 33 (3): 670-678 [0003]

Claims

Device (10; 20; 30) for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid, the target particles having a different crossover frequency than other particles in the liquid, characterized in that the device is a composite of at least two electrical electrodes which extend in length Includes conductors (100) and wherein the electrical conductors (100) are each surrounded by an insulator layer (101).

Device after Claim 1 , characterized in that a depression (103) is formed in the longitudinal direction between the interconnected electrical conductors (100), an area with a high field strength (104) being able to be formed in the depression (103).

Device after Claim 1 or Claim 2 , characterized in that the at least two electrical conductors (100) are connected to one another in the longitudinal direction by plasma bonding.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the liquid is human or animal blood.

Device after Claim 4 , characterized in that the device can be introduced into the blood circulation of a person or an animal by means of a hollow needle.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that an additional layer (301) made of flexible material is provided at one end of the composite.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that a spacer (302) is provided at at least one point of the composite for limiting the advance of the composite within a hollow needle.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the composite is turned on.

Device (10) according to one of the preceding claims, characterized in that the composite consists of two interconnected conductors (100).

Device (20) according to one of the Claims 1 to 8th , characterized in that the composite consists of four interconnected conductors (100), the individual conductors (100) being connectable crosswise to a voltage source.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the insulator layer (101) at least partially has an unspecific cell-affine coating (110).

Method for the dielectrophoretic separation of target particles in a liquid, the target particles having a different crossover frequency than other particles in the liquid, characterized in that a device (10; 20; 30) according to one of the Claims 1 to 11 is introduced into the liquid with a composite of at least two electrical conductors (100) extending in length and an AC voltage is applied to the composite to deposit the target particles.