DE102017204268A1

DE102017204268A1 - Biomarker for endocrine, autoimmune-related dysfunction

Info

Publication number: DE102017204268A1
Application number: DE102017204268.0A
Authority: DE
Inventors: Lutz Schomburg; Jörg Johannes; Theresa Porst
Original assignee: Nautilos Ventures Ug (haftungsbeschrankt); Nautilos Ventures Ug Haftungsbeschraenkt
Current assignee: Nautilos Ventures Ug (haftungsbeschrankt); Nautilos Ventures Ug Haftungsbeschraenkt
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-09-20
Also published as: EP3596466A1; WO2018167118A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose des Vorliegens oder des Risikos der Entwicklung oder zur Verlaufskontrolle einer thyroidhormon-abhängigen endokrinen Autoimmunfunktionsstörung (THREAD) eines Subjekts, wobei das Vorliegen von Autoantikörpern gegen den Monocarboxylat-Transporter 8 (MCT8) in einer von einem Subjekt erhaltenen biologischen Probe analysiert wird, ein Kit zum Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren und die Verwendung des MCT8 in der Diagnose von THREAD sowie der Identifizierung einer Verbindung, die bei der Komplexbildung von MCT8 und Autoantikörpern gegen MCT8 interferiert.

The present invention relates to methods of diagnosing the presence or risk of developing or sequencing a thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction (THREAD) of a subject, wherein the presence of autoantibodies to the monocarboxylate transporter 8 (MCT8) in a subject biological Sample, a kit for carrying out the methods of the invention, and the use of MCT8 in the diagnosis of THREAD, as well as the identification of a compound that interferes with complex formation of MCT8 and autoantibodies to MCT8.

Description

STAND DER TECHNIK DER ERFINDUNGState of the art of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose des Vorliegens oder des Risikos der Entwicklung oder zur Verlaufskontrolle einer thyroidhormon-abhängigen endokrinen Autoimmunfunktionsstörung (THREAD) eines Subjekts, wobei das Vorliegen von Autoantikörpern gegen den Monocarboxylat-Transporter 8 (MCT8) in einer von einem Subjekt erhaltenen biologischen Probe analysiert wird, ein Kit zum Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren und die Verwendung des MCT8 in der Diagnose von THREAD sowie der Identifizierung einer Verbindung, die bei der Komplexbildung von MCT8 und Autoantikörpern gegen MCT8 interferiert.The present invention relates to methods of diagnosing the presence or risk of developing or sequencing a thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction (THREAD) of a subject, wherein the presence of autoantibodies to the monocarboxylate transporter 8 (MCT8) in a subject biological Sample, a kit for carrying out the methods of the invention, and the use of MCT8 in the diagnosis of THREAD, as well as the identification of a compound that interferes with complex formation of MCT8 and autoantibodies to MCT8.

Die meisten im Blut zirkulieren Thyroidhormone (TH) sind an die TH-bindenden Proteine Albumin, Thyroxin-bindendes Globulin bzw. Transthyretin gebunden. Um ihre Signalwirkung über den nukleären TH-Rezeptor zu entfalten, müssen TH die Zellmembran passieren. Jedoch können die TH nicht durch die Zellmembran diffundieren und benötigen Transmembrantransporter. Unter einer wachsenden Zahl gut charakterisierter TH-Transporter ist die Familie der Monocarboxylat-Transporter (MCT) von besonderem Interesse. MCT8 war der erste TH-Transporter, von dem beschrieben wurde, dass er mit einer genetischen Erkrankung, d.h. dem Allan-Herndon-Dudley-Syndrom (AHDS) (Friesema et al. 2004) zusammenhängt. MCT8 befindet sich auf dem X-Chromosom und transportstörende Mutationen von MCT8 beeinträchtigen erheblich die neuronale und intellektuelle Entwicklung eines Individuums und verursachen außerdem Probleme bezüglich der Muskelkontrolle, Koordination und Bewegung. MCT10 ist bekannterweise eng verwandt mit MCT8, sowohl bezüglich der Struktur als auch der Transporteigenschaften (Roef et al., 2013).Most circulating in the blood Thyroid hormones (TH) are bound to the TH-binding proteins albumin, thyroxine-binding globulin and transthyretin. In order to develop their signaling via the nuclear TH receptor, TH must pass through the cell membrane. However, the TH can not diffuse through the cell membrane and require transmembrane transporters. Among a growing number of well-characterized TH transporters, the monocarboxylate transporter (MCT) family is of particular interest. MCT8 was the first TH transporter that was described as having a genetic disease, i. Allan-Herndon-Dudley syndrome (AHDS) (Friesema et al., 2004). MCT8 is located on the X chromosome and transport-disrupting mutations of MCT8 significantly affect the neuronal and intellectual development of an individual and also cause problems in terms of muscle control, coordination and movement. MCT10 is known to be closely related to MCT8, both in structure and in transport properties (Roef et al., 2013).

TH sind essentielle Hormone, die sowohl bezüglich des Wachstums und der Entwicklung als auch bei der Steuerung des Stoffwechsels und des Energieverbrauchs eine Rolle spielen. Ein Mangel oder Überschuss an TH-Signalgebung verursacht eine Anzahl von Krankheiten, die insgesamt mit Entwicklungs- oder Stoffwechselsymptomen verbunden sind. Die meisten bekannten Beispiele stehen in Zusammenhang mit Mutationen in zentralen Genen, die mit TH-assoziierter Signalgebung verbunden sind, wie den TH-Rezeptoren, Enzymen, die in der TH-Biosynthese involviert sind, TH-Bindungsproteinen oder jüngst, TH-Transportern (z.B. Medici et al. 2015). Neben genetischen Ursachen können sich Autoimmunwechselwirkungen ebenfalls sehr stark auf die TH-Signalgebung auswirken, was am besten im Fall des Unterdrückens, Neutralisierens oder Aktivierens von (TRAK) Autoantikörpern für den TSH-Rezeptor bekannt ist, jedoch auch für andere Autoantigene (McLachlan & Rapoport, 2015) beschrieben worden ist. Insgesamt können diese Erkrankungen als mit TH-verbundene endokrine Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“) zusammengefasst werden. THREAD können verschiedene Organe betreffen, die in der TH-Regulierung, -Biosynthese oder -Wirkung involviert sind, einschließlich des Hypothalamus, der Hirnanhangdrüse, der Schilddrüse oder auf TH ansprechende Gewebe. THREAD der Hirnanhangdrüse wird autoimmune Hypophysitis genannt und stellt eine relativ seltene Krankheit dar mit einer Prävalenz von etwa 5/1.000.000. Es wurde angenommen, dass autoimmune Zerstörung bis zu 40 Jahre benötigen kann, bis klinische Symptome auftreten (Strömberg et al, 1998). Jedoch wurde von Fällen berichtet, bei denen deutlich schnellere gravierende Attacken aufgrund von Arzneimittelreaktionen oder während oder nach einer Schwangerschaft auftraten (Weston et al, 2000). Aufgrund der aktuellen Schwierigkeiten bei der Erkennung und Diagnose wird jedoch angenommen, dass die Prävalenz von autoimmuner Hypophysitis viel höher sein könnte.TH are essential hormones involved in growth and development as well as in the control of metabolism and energy expenditure. A deficiency or excess of TH signaling causes a number of diseases, all of which are associated with developmental or metabolic symptoms. Most known examples are related to mutations in central genes associated with TH-associated signaling, such as the TH receptors, enzymes involved in TH biosynthesis, TH binding proteins, or more recently, TH transporters (eg Medici et al., 2015). In addition to genetic causes, autoimmune interactions may also have a strong effect on TH signaling, which is best known in the case of suppressing, neutralizing or activating (TRAK) autoantibodies for the TSH receptor, but also for other autoantigens (McLachlan & Rapoport, 2015) has been described. Overall, these disorders can be grouped together as TH-associated endocrine autoimmune dysfunction ("THREAD"). THREAD may involve various organs involved in TH regulation, biosynthesis or action, including the hypothalamus, pituitary gland, thyroid or TH-responsive tissues. THREAD of the pituitary gland is called autoimmune hypophysitis and is a relatively rare disease with a prevalence of about 5 / 1,000,000. It has been hypothesized that autoimmune destruction may take up to 40 years to develop clinical symptoms (Strömberg et al, 1998). However, cases have been reported where significantly more rapid serious attacks occurred due to drug reactions or during or after pregnancy (Weston et al, 2000). However, due to the current difficulties in detection and diagnosis, it is believed that the prevalence of autoimmune hypophysitis could be much higher.

Gegenwärtig basiert die Diagnose von Hypophysitis im Wesentlichen auf der Tatsache, dass andere Krankheiten ausgeschlossen werden können. Da Marker für den Hormonspiegel nicht immer zufriedenstellende Ergebnisse liefern, können Patienten einer Operation unterzogen werden, um einen Tumor der Hirnanhangdrüse auszuschließen, wobei die Biopsie der Hirnanhangdrüse aufgrund ihrer Position nicht einfach und sicher ausgeführt werden kann. Das gegenwärtig verfügbare bevorzugteste Diagnoseverfahren dürfte die Magnetresonanztomographie (MRT) sein, um irgendwelche sichtbaren Anomalitäten im Sella turcica-Bereich zu identifizieren (Caturegli, 2007, Crock et al, 2006) mit dem Nachteil, dass nur schwere Schäden an der Drüse visualisierbar sind und eine Differentialdiagnose, z.B. eines Tumors der Hirnanhangdrüse gegenüber einer Hypophysitis, problematisch bleibt.At present, the diagnosis of hypophysitis is essentially based on the fact that other diseases can be excluded. Since hormone level markers do not always provide satisfactory results, patients may be subjected to surgery to exclude a pituitary tumor, and biopsy of the pituitary gland can not be easily and safely performed because of their position. The most currently available diagnostic technique is likely to be magnetic resonance imaging (MRI) to identify any visible abnormalities in the sella turcica area (Caturegli, 2007, Crock et al, 2006) with the disadvantage that only severe damage to the gland can be visualized and Differential diagnosis, eg a tumor of the pituitary gland against hypophysitis remains problematic.

Offensichtlich ist die Diagnose einer Hypophysitis schwierig, jedoch ist eine frühe Diagnose sehr wichtig, um den weiteren Fortschritt der Erkrankung zu verhindern und eine Behandlung der Symptome zu ermöglichen. Aufgrund des gegenwärtig begrenzten Verständnisses des involvierten Mechanismus ist die Behandlung von Hypophysitis auf die Verabreichung von Immunsuppressiva wie Kortikosteroiden, Azatiorpin oder Methotrexat beschränkt. Eine maßgebliche Reduktion der Masse der Hirnanhangdrüse kann durch einen neurochirurgischen Eingriff erreicht werden, jedoch können die Langzeitnebenwirkungen erheblich sein und können Panhypopituitarismus mit oder ohne Diabetes insipidus (Falorni et al., 2014) einschließen. Ferner kann Bromocriptin verabreicht werden, um die Symptome der Sehbeeinträchtigung zu reduzieren und den Prolactinspiegel zu senken.Obviously, the diagnosis of hypophysitis is difficult, but early diagnosis is very important to prevent further progression of the disease and to enable treatment of the symptoms. Due to the present limited understanding of the mechanism involved, the treatment of hypophysitis is limited to the administration of immunosuppressants such as corticosteroids, azatiorpine or methotrexate. A significant reduction in the mass of the pituitary gland can by a However, the long-term side effects may be significant and may include panhypopituitarism with or without diabetes insipidus (Falorni et al., 2014). In addition, bromocriptine may be administered to reduce the symptoms of visual impairment and reduce prolactin levels.

Somit besteht ein Bedarf für einen verbesserten diagnostischen Test für Autoimmunstörungen der Hirnanhangdrüse, der sicher und leicht durchführbar ist. Außerdem könnte ein besseres Verständnis des Mechanismus, der bei der Entwicklung von Hypophysitis involviert ist, zu neuen therapeutischen Ansätzen führen.Thus, there is a need for an improved diagnostic test for pituitary autoimmune disorders that is safe and easy to perform. In addition, a better understanding of the mechanism involved in the development of hypophysitis could lead to new therapeutic approaches.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION

Überraschenderweise wurde gefunden, dass Autoantikörper gegen MCT8-Polypeptide Biomarker zum Nachweis des Einsetzens und/oder des Vorliegens einer thyroidhormon-abhängigen endokrinen Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“) in einem Subjekt sind. Wie nachfolgend beschrieben, lehrt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose derartiger autoimmun-bezogener Funktionsstörungen in einem Subjekt.Surprisingly, it has been found that autoantibodies to MCT8 polypeptides are biomarkers for detecting the onset and / or presence of thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction ("THREAD") in a subject. As described below, the present invention teaches methods for diagnosing such autoimmune-related disorders in a subject.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose des Vorliegens oder des Risikos der Entwicklung oder zur Verlaufskontrolle einer thyroidhormon-abhängigen endokrinen Autoimmun- („THREAD“) Funktionsstörung in einem Subjekt, vorzugsweise autoimmunvermittelter Hypophysitis, wobei das Verfahren das Analysieren einer biologischen Probe umfasst, die von dem Subjekt erhalten wurde, auf das Vorliegen von Autoantikörpern gegen den Monocarboxylat-Transporter 8 (MCT8), wobei vorzugsweise das Vorliegen der Autoantikörper auf das Vorliegen oder das Risiko der Entwicklung, oder zur Therapiekontrolle der Funktionsstörung in dem Subjekt hinweist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Konzentration der Autoantikörper gegen MCT8 auf das Vorliegen einer Funktionsstörung oder eines Risikos hin, wobei das Vorliegen von Autoantikörpern bei einem Wert, der über einem Grenzwert liegt, für die Funktionsstörung oder das Risiko charakteristisch ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird markierter MCT8 in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die biologische Probe in einem Immunoassay mit einem MCT8, insbesondere mit markiertem MCT8, kontaktiert.Therefore, the present invention relates to a method of diagnosing the presence or risk of developing or monitoring a thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune ("THREAD") disorder in a subject, preferably autoimmune-mediated hypophysitis, the method comprising analyzing a biological sample, obtained from the subject for the presence of autoantibodies to the monocarboxylate transporter 8 (MCT8), preferably the presence of the autoantibodies indicating the presence or risk of development or therapy control of the disorder in the subject. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the concentration of the autoantibodies to MCT8 indicates the presence of a dysfunction or a risk, wherein the presence of autoantibodies at a level above a threshold is characteristic of the dysfunction or the risk. In another preferred embodiment, labeled MCT8 is used in the method of the invention. In another preferred embodiment of the method according to the invention, the biological sample is contacted in an immunoassay with an MCT8, in particular with labeled MCT8.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose des Vorliegens oder des Risikos der Entwicklung oder zur Verlaufskontrolle einer autoimmun-bezogenen Funktionsstörung („ARD“), vorzugsweise einer endokrinen, autoimmun-bezogenen Funktionsstörung („EARD“) in einem Subjekt, wobei das Verfahren das Analysieren einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde, auf das Vorliegen von Autoantikörpern gegen den Monocarboxylat-Transporter 8 (MCT8) hin umfasst, wobei insbesondere die Anwesenheit von Autoantikörpern auf das Vorliegen oder das Risiko der Entwicklung der Funktionsstörung in dem Subjekt hinweist.Another embodiment of the invention is a method of diagnosing the presence or risk of development or follow-up of an autoimmune-related disorder ("ARD"), preferably an endocrine autoimmune-related disorder ("EARD") in a subject A method of analyzing a biological sample obtained from the subject for the presence of autoantibodies to the monocarboxylate transporter 8 (MCT8), in particular the presence of autoantibodies for the presence or risk of developing the disorder in the subject points.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird die biologische Probe in einem Immunoassay zusammengebracht, der MCT8-Polypeptid umfasst, vorzugsweise markiertes MCT8. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der MCT8 menschlichen Ursprungs.In one embodiment of the invention, the biological sample is assembled in an immunoassay comprising MCT8 polypeptide, preferably labeled MCT8. In a particularly preferred embodiment, the MCT8 is of human origin.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die biologische Probe vorher aus einer Körperflüssigkeit des Subjekts gewonnen, z.B. peripherem Blut, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit.In a preferred embodiment of the invention, the biological sample is previously obtained from a body fluid of the subject, e.g. peripheral blood, serum, cerebrospinal fluid.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von ARD, vorzugsweise von EARD und besonders bevorzugt von THREAD in einem Subjekt durch Bestimmen des Vorliegens der Anwesenheit von Autoantikörpern, die für MCT8 spezifisch sind, umfassend die Schritte: a) Ausführen eines Immunoassays durch Kontaktieren einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde, mit MCT8; b) Feststellen des Vorliegens von Autoantikörpern, die MCT8 binden, in der Probe; wobei das Vorliegen von Autoantikörpern, die MCT8-Protein binden, auf die Funktionsstörung hinweist.Another embodiment of the invention is a method of diagnosing ARD, preferably EARD, and more preferably THREAD in a subject by determining the presence of the autoantibodies specific for MCT8, comprising the steps of: a) performing an immunoassay by contacting a biological sample obtained from the subject with MCT8; b) detecting the presence of autoantibodies that bind MCT8 in the sample; the presence of autoantibodies that bind MCT8 protein indicates malfunction.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung gestatten die Diagnose des Vorliegens oder Risikos der Entwicklung von THREAD oder anderer Arten einer ARD bei der MCT8-Autoantikörper, wie hier definiert, involviert sind. Außerdem gestattet das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Stratifikation des therapeutischen Behandlungsplans für ein Subjekt, das an THREAD oder anderen Arten einer ARD leidet, bei der MCT8-Autoantikörpern wie hier definiert involviert sind, oder dem Risiko der Entwicklung einer THREAD oder anderer Arten einer ARD ausgesetzt ist, bei der MCT8-Autoantikörpern wie hier definiert involviert sind. Außerdem gestatten die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung die Identifikation der Stratifizierung der Funktionsstörung, insbesondere der Aktivität der Funktionsstörung und des Subjekts, das an THREAD oder anderen Arten einer ARD leidet, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind. Auf Basis der erhaltenen Ergebnisse wird der medizinische Behandler die Therapie stratifizieren, d.h. bezüglich der geeigneten Art einer Therapie entscheiden und diese entsprechend anwenden.The methods of the present invention allow the diagnosis of the presence or risk of developing THREAD or other types of ARD involving MCT8 autoantibodies as defined herein. In addition, the method of the present invention permits stratification of the therapeutic regimen for a subject suffering from THREAD or other types of ARD who are involved in MCT8 autoantibodies as defined herein or at risk of developing THREAD or other types of ARD in which MCT8 autoantibodies are involved as defined herein. Moreover, the methods of the present invention permit the identification of the stratification of dysfunction, in particular the dysfunction and the subject's activity associated with THREAD or other types of dysfunction ARD suffers from autoantibodies to MCT8. On the basis of the results obtained, the medical practitioner will stratify the therapy, ie decide on the appropriate type of therapy and apply it accordingly.

In einer weiteren Ausführungsform gestatten die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Stratifikation des therapeutischen Behandlungsplans für ein Subjekt, das an einer THREAD oder anderen Arten einer ARD leidet, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind, oder dem Risiko der Entwicklung einer THREAD oder anderer Arten einer ARD unterliegt, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind. Das heißt, die vorliegende Erfindung gestattet es den Status der Funktionsstörung zu identifizieren, insbesondere den aktiven Status der Funktionsstörung in einem Subjekt, das an einer THREAD oder anderen Arten einer ARD leidet, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind, wodurch es möglich wird, eine Entscheidung bezüglich geeigneter weiterer therapeutischer Schritte zu treffen, die die Verabreichung geeigneter pharmazeutisch wirksamer Verbindungen umfassen.In another embodiment, the methods of the present invention allow the stratification of the therapeutic regimen for a subject suffering from a THREAD or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8, or the risk of developing a THREAD or other types of ARD in which autoantibodies are involved against MCT8. That is, the present invention allows the status of the malfunction to be identified, in particular the active status of the malfunction in a subject suffering from a THREAD or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8, thereby making it possible to obtain a To make a decision regarding appropriate further therapeutic steps involving the administration of suitable pharmaceutically active compounds.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Testkits oder diagnostische Kits zum Ausführen eines Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt. Insbesondere die Verwendung immunologischer Kits zum Nachweis von Autoantikörpern in biologischen Proben erlauben die Diagnose einer THREAD oder anderer Arten einer ARD, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind. Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Testkits oder eines diagnostischen Kits zur Verwendung in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bereit, zur Diagnose des Vorliegens oder des Risikos einer Entwicklung sowie der Therapiekontrolle von THREAD oder anderer Arten einer ARD, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind, in einem Subjekt, umfassend Mittel für das Bestimmen von Autoantikörpern gegen MCT8 in einer biologischen Probe eines zu testenden Subjekts und Anweisungen, wie das Test- oder diagnostische Kit anzuwenden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Testkit ein Immunpräzipitationsassay oder ein Brückenassay, der die Bindungswechselwirkung von Autoantikörpern mit MCT8-Protein oder davon abgeleiteten Fragmenten einbezieht.In another embodiment of the present invention, test kits or diagnostic kits for carrying out a method according to the present invention are provided. In particular, the use of immunological kits to detect autoantibodies in biological samples allows the diagnosis of a THREAD or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8. That is, the present invention provides the use of a test kit or diagnostic kit for use in a method of the present invention for diagnosing the presence or risk of development as well as therapy control of THREAD or other types of ARD in autoantibodies to MCT8 involved in a subject comprising means for determining autoantibodies to MCT8 in a biological sample of a subject under test and instructions on how to apply the test or diagnostic kit. In a preferred embodiment, the test kit is an immunoprecipitation assay or bridge assay involving the binding interaction of autoantibodies with MCT8 protein or fragments derived therefrom.

Derartige Kits können generell ein oder mehrere Antigene umfassen, nämlich Oligo- oder Polypeptide von MCT8, die mit den Autoantikörpern immunreagieren. Üblicherweise umfassen die Kits der Erfindung in geeigneten Behältnisse(n) ein oder mehrere mit Autoantikörpern immunreaktive MCT8-Polypeptidantigene. Diese Antigene, die in den Verfahren und Testkits der Erfindung nützlich sind, können die vollständigen MCT8-Proteine oder daraus abgeleitete immunreaktive Polypeptide sein.Such kits may generally include one or more antigens, namely oligo- or polypeptides of MCT8, which immunoreact with the autoantibodies. Typically, the kits of the invention comprise one or more autoantibody immunoreactive MCT8 polypeptide antigens in suitable containers. These antigens useful in the methods and kits of the invention may be the complete MCT8 proteins or immunoreactive polypeptides derived therefrom.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Kit ein oder mehrere Detektionsmittel umfassen und umfasst gegebenenfalls ferner ein Substrat und andere Mittel zum Ausführen der Reaktion, um den Autoantikörper-Antigen-Komplex nachzuweisen. Die Immundetektionsmittel des Kits können nachweisbare Marker umfassen, die mit dem gegebenen Detektionsmittel assoziiert oder verbunden sind. Nachweisbare Marker, die mit dem Antigen assoziiert oder an einen sekundären Bindungsliganden gebunden sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Nachweisbare Marker schliessen Farbstoffe, chemilumineszierende oder fluoreszierende Moleküle, Biotin, radioaktive Marker oder Enzyme ein. Typische Beispiele geeigneter Marker schliessen allgemein bekannte chemilumineszierende Moleküle wie Acridiniumester, fluoreszierende Moleküle wie Rhodamin, Fluorescein, grün fluoreszierendes Protein, Luciferase oder alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase, als Beispiele geeigneter Enzyme ein.In another embodiment of the invention, the kit may comprise one or more detection means and optionally further comprises a substrate and other means for carrying out the reaction to detect the autoantibody-antigen complex. The kit immunodetection agents may comprise detectable markers associated or associated with the given detection means. Detectable markers associated with the antigen or bound to a secondary binding ligand are also contemplated. Detectable markers include dyes, chemiluminescent or fluorescent molecules, biotin, radioactive markers or enzymes. Typical examples of suitable labels include well-known chemiluminescent molecules such as acridinium esters, fluorescent molecules such as rhodamine, fluorescein, green fluorescent protein, luciferase or alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, as examples of suitable enzymes.

Gegebenenfalls umfassen die Kits ferner positive und negative Kontrollen zur Verifizierung der erhaltenen Ergebnisse, die durch Benutzen des Kits als auch der Kalibrierungsstandards gewonnen werden. Die Komponenten der Kits können entweder in wässrigem Medium oder in lyophilisierter Form verpackt sein, und außerdem umfassen die Kits einen oder mehrere Behältnisse zur Durchführung des Nachweises. Außerdem umfasst das Testkit Anleitungen zur Verwendung des Kits. Beispielsweise ist das immunreaktive Peptid mindestens ein Peptid ausgewählt von einem Peptid nach SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 2.Optionally, the kits further include positive and negative controls for verifying the results obtained using the kit as well as the calibration standards. The components of the kits may be packaged either in aqueous medium or in lyophilized form and, in addition, the kits comprise one or more containers for carrying out the detection. The kit also includes instructions for using the kit. For example, the immunoreactive peptide is at least one peptide selected from a peptide according to SEQ ID No: 1 and SEQ ID No: 2.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung eines isolierten MCT8 zur Identifikation einer therapeutisch wirksamen Verbindung in der Behandlung einer thyroidhormon-abhängigen, endokrinen Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“) oder anderer Arten einer ARD, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind, wobei besagte Verbindung die Bindung von MCT8-Autoantikörpern an MCT8-Protein hemmt.Another object of the invention is the use of an isolated MCT8 to identify a therapeutically active compound in the treatment of a thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction ("THREAD") or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8, said compound having the Inhibits binding of MCT8 autoantibodies to MCT8 protein.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines isolierten MCT8 in der Diagnose, der Risikoabschätzung oder Therapiekontrolle von einer thyroidhormon-abhängigen, endokrinen Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“) oder anderer Arten einer ARD, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind.In addition, the present invention relates to the use of isolated MCT8 in the diagnosis, risk assessment, or therapy control of thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction ("THREAD") or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8.

Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in der Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation einer therapeutisch wirksamen Verbindung in der Behandlung einer thyroidhormon-abhängigen, endokrinen Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“) oder anderer Arten einer ARD, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind, wobei besagte Verbindung die Bindung von MCT8-Autoantikörpern an MCT8-Protein hemmt. Another object of the invention is the use of a method of the invention for identifying a therapeutically active compound in the treatment of a thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction ("THREAD") or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8, said compound inhibits the binding of MCT8 autoantibodies to MCT8 protein.

Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in der Verwendung eines isolierten MCT8 in einem Testverfahren zur Identifikation einer Verbindung, die in der Komplexbildung von MCT8 und Autoantikörpern gegen MCT8 interferiert, vorzugsweise eines markierten oder humanen MCT8, insbesondere eines markierten humanen MCT8.Another object of the invention is to use an isolated MCT8 in a test method for identifying a compound that interferes in the complex formation of MCT8 and autoantibodies to MCT8, preferably a labeled or human MCT8, in particular a labeled human MCT8.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in der Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits zur Identifikation einer therapeutisch wirksamen Verbindung in der Behandlung einer thyroidhormon-abhängigen endokrinen Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“) oder anderer Arten einer ARD, bei der Autoantikörper gegen MCT8 involviert sind, wobei besagte Verbindung die Bindung von MCT8-Autoantikörpern an MCT8-Protein hemmt.Yet another object of the invention is the use of a kit according to the invention for identifying a therapeutically active compound in the treatment of thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction ("THREAD") or other types of ARD involving autoantibodies to MCT8, said compound inhibits the binding of MCT8 autoantibodies to MCT8 protein.

DEFINITIONENDEFINITIONS

Die nachfolgenden Definitionen sollen das bevorzugte Verständnis eines jeden Begriffs im spezifischen Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung liefern. Soweit nichts anderes definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verstanden wird, zu der der hier offenbarte Erfindungsgegenstand gehört.The following definitions are intended to provide the preferred understanding of each term in the specific context of the present invention. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the subject matter disclosed herein belongs.

Gemäß vorliegender Erfindung umfasst der Begriff „umfasst“ oder „umfassend“ die Ausführungsform von „besteht aus“ oder „bestehend aus“In the present invention, the term "comprises" or "comprising" includes the embodiment of "consists of" or "consisting of"

Üblicherweise sind alle Verfahren gemäß vorliegender Erfindung in-vitro-Verfahren.Usually, all methods of the present invention are in vitro methods.

Der Begriff „ARD“ gemäß vorliegender Erfindung bedeutet vorzugsweise eine autoimmun-bezogene Funktionsstörung, insbesondere eine endokrine autoimmun-bezogene Funktionsstörung („EARD“), insbesondere eine mit dem Schilddrüsenhormon verbundene endokrine Autoimmunfunktionsstörung („THREAD“), wobei der Begriff „Funktionsstörung“ vorzugsweise irgendein Leiden, eine Krankheit oder eine anormale Funktion bedeutet, die mit einem klinischen Symptom bei einem Individuum verbunden ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „THREAD“ eine Hypophysenfunktionsstörung und insbesondere eine autoimmune Hypophysitis.The term "ARD" according to the present invention preferably means an autoimmune-related disorder, in particular an endocrine autoimmune-related disorder ("EARD"), in particular an endocrine autoimmune disorder associated with the thyroid hormone ("THREAD"), the term "disorder" preferably any condition, disease or abnormal function associated with a clinical symptom in an individual. In one embodiment of the present invention, the term "THREAD" means a pituitary dysfunction and in particular an autoimmune hypophysitis.

Gemäß vorliegender Erfindung ist der Begriff „Autoantigen“ mit dem Begriff „MCT8“ synonym. Der Begriff „Monocarboxylat-Transporter 8“ ist mit „MCT8“ synonym und bedeutet vorzugsweise gemäß vorliegender Erfindung ein Polypeptid, das zu der Monocarboxylat-Transporterfamilie gehört, die im Stand der Technik bekannt ist (siehe Roef et al. 2013) und beim Transport von Schilddrüsenhormonen in oder aus einer empfänglichen Zelle, vorzugsweise einer empfänglichen Schilddrüsenhormonzelle, unter physiologischen Bedingungen involviert ist, z.B. MCT8, MCT10 und Fragmente davon, insbesondere MCT8 und MCT10, d.h. NCBI Ref: NP 006508.2 für MCT8 und NP 061063.2 für MCT10.In the present invention, the term "autoantigen" is synonymous with the term "MCT8". The term "monocarboxylate transporter 8" is synonymous with "MCT8" and preferably means according to the present invention a polypeptide belonging to the monocarboxylate transporter family known in the art (see Roef et al., 2013) and in the transport of Thyroid hormone in or from a susceptible cell, preferably a susceptible thyroid hormone cell, under physiological conditions, eg MCT8, MCT10 and fragments thereof, in particular MCT8 and MCT10, i. NCBI Ref: NP 006508.2 for MCT8 and NP 061063.2 for MCT10.

Eine beispielhafte MCT8-Polypeptidsequenz ist durch SEQ ID NO: 1 definiert. Eine beispielhafte MCT10-Polypeptidsequenz ist durch SEQ ID NO: 2 definiert.An exemplary MCT8 polypeptide sequence is defined by SEQ ID NO: 1. An exemplary MCT10 polypeptide sequence is defined by SEQ ID NO: 2.

Der Begriff „Fragment von MCT8“ gemäß vorliegender Erfindung bedeutet vorzugsweise einen Teil des MCT8-Polypeptids, der mindestens etwa 75 %, insbesondere 85 % und ganz bevorzugt 95 % Aminosäuresequenzidentität mit NCBI Ref: NP 006508.2 (MCT8) oder 061063.2 (MCT10) aufweist und vorzugsweise mindestens 10 %, mindestens 20 %, mindestens 30 %, mindestens 40 %, mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % der gesamten Länge mindestens eines der besagten Polypeptide enthält.The term "fragment of MCT8" according to the invention preferably means part of the MCT8 polypeptide having at least about 75%, more preferably 85% and most preferably 95% amino acid sequence identity with NCBI Ref: NP 006508.2 (MCT8) or 061063.2 (MCT10) and preferably at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or at least 90% of the total length of at least one of said polypeptides.

Mit dem Begriff „Identität“ ist die Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen gemeint, die im Vergleich miteinander innerhalb der entsprechenden Sequenzregion ungefähr dieselbe Menge an Aminosäuren aufweisen. Beispielsweise kann die Identität der gesamten Länge von zwei Aminosäuresequenzen verglichen werden. Die Aminosäuresequenzen der beiden Moleküle, die verglichen werden, können in einer oder mehreren Positionen verschieden sein, was jedoch die biologische Funktion oder Struktur der Moleküle nicht ändert. Solche Variationen können auf natürliche Weise vorkommen wegen verschiedener, jedoch ähnlicher Aminosäuren oder wegen Mutationen/Polymorphismen in dem Gen, das die Aminosäuresequenz definiert, oder sie können durch spezifische Mutagenese erreicht werden. Die Variationen können aus der Deletion, Substitution, Insertion, Addition oder Kombination einer oder mehrerer Positionen in der Aminosäuresequenz resultieren. Die Identität der Sequenzen wird unter Anwendung der ClustalW-Ausrichtung (z.B. in www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw) bestimmt. Die verwendete Matrix ist wie folgt: BLOSUM, Gap pen:10, Gap extension: 0,5.By "identity" is meant the identity between two amino acid sequences that have approximately the same amount of amino acids as compared to each other within the corresponding sequence region. For example, the identity of the entire length of two amino acid sequences can be compared. The amino acid sequences of the two molecules being compared may be different in one or more positions, but this does not alter the biological function or structure of the molecules. Such variations may occur naturally because of different but similar amino acids, or because of mutations / polymorphisms in the gene that defines the amino acid sequence, or they may be achieved by specific mutagenesis. The variations may result from the deletion, substitution, insertion, addition or combination of one or more positions in the amino acid sequence. The identity of the sequences is determined using the ClustalW alignment (eg in www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw). The matrix used is as follows: BLOSUM, Gap pen: 10, Gap extension: 0.5.

Der Begriff „identisch“ bedeutet im Zusammenhang mit zwei Aminosäuresequenzen, dass die Sequenzen, sofern optimal ausgerichtet, wie beispielsweise durch die Programme GAP oder BEST-FIT bei Anwendung der Standardabstandsgewichtung mindestens etwa 50 % Sequenzidentität aufweisen. Üblicherweise weisen gemäß vorliegender Erfindung identische Sequenzen mindestens etwa 60 %, mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 80 %, mindestens etwa 90 %, mindestens etwa 95 %, mindestens etwa 98 % oder mindestens etwa 99 % Prozent Sequenzidentität mit mindestens einem der besagten MCT-Polypeptide auf.The term "identical" in the context of two amino acid sequences means that the sequences, if aligned optimally, such as by the GAP or BEST-FIT programs using the standard distance weighting, have at least about 50% sequence identity. Typically, identical sequences according to the present invention have at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 98%, or at least about 99% percent sequence identity with at least one of said MCTs. Polypeptides on.

Die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen kann z.B. unter Anwendung des Needleman und Wunsch-Algorithmus ( J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970) ) bestimmt werden, welcher im GAP-Programm des GCG-Softwarepakets (erhältlich unter http://www.gcg.com) implementiert ist, durch Nutzung entweder einer Blossum 62-Matrix oder einer PAM250-Matrix und einer Abstands-Gewichtung von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einer Längen-Gewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6. Polypeptidsequenzen können auch unter Anwendung von FASTA, unter Nutzung der Parameterwertvorgaben oder empfohlener Parameter verglichen werden. Ein Programm in der GCG-Version 6.1., FASTA (z.B. FASTA2 und FASTA3) bietet Angleichungen und prozentuale Sequenzidentität der Regionen mit der besten Überlappung zwischen der Eingabe- und Suchsequenz ( Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132:185-219 ). Die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen kann auch unter Anwendung des Algorithmus von Meyers & Miller (Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17) bestimmt werden, der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) implementiert ist unter Anwendung einer PAM120-Restgewichtungstabelle, einer Spaltlänge von 12 und einem Spaltfehler von 4. Ein anderer Algorithmus zum Vergleich von einer Sequenz mit einer anderen, die in einer Database enthalten ist, ist das Computerprogramm BLAST, insbesondere blastp, unter Anwendung der Standardparametervorgaben. Siehe z.B. Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410 ; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25:3389-402 (1997) . Die Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können dort als „Eingabesequenz“ verwendet werden, um eine Suche in öffentlichen Datenbanken auszuführen, z.B. zur Identifikation verwandter Sequenzen. Derartige Suchen können unter Anwendung des XBLAST-Programms (Version 2.0) von Altschul, et al. 1990 (s.o.) ausgeführt werden. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm, score=50, Wortlänge=3 ausgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu MCT-Polypeptiden homolog sind. Um Angleichungen mit Lücken zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie von Altschul et al., 1997 (siehe oben) beschrieben. Bei Verwenden von BLAST- und Gapped BLAST-Programmen können die Standardparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) benutzt werden. Siehe http://www. ncbi.nlm.nih.gov.The percent identity between two amino acid sequences can be determined, for example, using the Needleman and Wunsch algorithm ( Biol. 48: 444-453 (1970). ) implemented in the GAP program of the GCG software package (available at http://www.gcg.com) using either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix and a distance weighting of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weighting of 1, 2, 3, 4, 5, or 6. Polypeptide sequences can also be compared using FASTA, using parameter default values or recommended parameters. A program in the GCG version 6.1., FASTA (eg FASTA2 and FASTA3) provides approximations and percentage sequence identity of the regions with the best overlap between the input and search sequence ( Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132: 185-219 ). The percent identity between two amino acid sequences can also be determined using the algorithm of Meyers & Miller (Comput. Appl. Biosci., 1988; 11-17) which is implemented in the ALIGN program (version 2.0) using a PAM120 remainder weighting table, a gap length of 12, and a gap error of 4. Another algorithm for comparing one sequence with another contained in a database , the computer program is BLAST, in particular blastp, using the default parameter specifications. See eg Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410 ; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-402 (1997) , The protein sequences of the present invention can be used there as an "input sequence" to perform a search in public databases, eg, to identify related sequences. Such searches may be performed using the XBLAST program (version 2.0) of Altschul, et al. 1990 (see above). BLAST protein searches can be performed with the XBLAST program, score = 50, wordlength = 3, to obtain amino acid sequences homologous to MCT polypeptides. To obtain fits with gaps for comparison purposes, Gapped BLAST can be used as described by Altschul et al., 1997 (supra). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of the respective programs (eg XBLAST and NBLAST) can be used. See http: // www. ncbi.nlm.nih.gov.

Der Begriff „Autoantikörper“ bedeutet einen Antikörper, der gegen ein Autoantigen, d.h. ein endogenes Antigen in einem Subjekt, gerichtet ist. Der Begriff „Autoantikörper gegen einen MCT8“ gemäß vorliegender Erfindung bedeutet vorzugsweise ein endogenes MCT8, ganz bevorzugt humanen Ursprungs.The term "autoantibody" means an antibody which is resistant to an autoantigen, i. an endogenous antigen in a subject. The term "autoantibody against an MCT8" according to the present invention preferably means an endogenous MCT8, most preferably of human origin.

Die Begriffe „diagnostizieren“ oder „Diagnose“, wie hier verwendet, beziehen sich auf Verfahren, durch die ein Fachmann abschätzen und sogar bestimmen kann, ob ein Subjekt an einer vorgegebenen Funktionsstörung, Krankheit, einem Leiden oder einem Zustand leidet, oder nicht. Der Fachmann führt die Diagnose auf der Basis eines oder mehrerer diagnostischer Indikatoren aus, nämlich den Autoantikörpern, die gemäß vorliegender Erfindung detektierbar sind, der Menge (einschließlich des Vorliegens oder der Abwesenheit), die für das Vorliegen, die Schwere oder die Abwesenheit des Zustands indikativ ist, gegebenenfalls zusammen mit den alternativen diagnostischen Markern oder Indikatoren.The terms "diagnose" or "diagnosis" as used herein refer to methods by which a skilled person can estimate and even determine whether or not a subject suffers from a given disorder, disease, condition, or condition. One skilled in the art will make the diagnosis on the basis of one or more diagnostic indicators, namely, the autoantibodies detectable in accordance with the present invention, the amount (including presence or absence) indicative of the presence, severity, or absence of the condition if appropriate together with the alternative diagnostic markers or indicators.

Daher kann „Erstellen einer Diagnose“ oder „Diagnostizieren“, wie hier verwendet, zudem das Ausführen einer Prognose beinhalten, zur Vorhersage eines klinischen Ergebnisses, zur Auswahl einer geeigneten Behandlung oder zur Verlaufskontrolle einer aktuellen Behandlung und potentiell zur Änderung der Behandlung auf Basis der Messung der diagnostischen Autoantikörper. Der Begriff „Verlaufskontrolle“ gemäß vorliegender Erfindung bedeutet vorzugsweise die begleitende Diagnose, um den Erfolg von therapeutischen Maßnahmen („therapeutische Verlaufskontrolle“) während der Behandlung der Funktionsstörung zu beobachten.Therefore, as used herein, "making a diagnosis" or "diagnosing" may also include making a prognosis, predicting a clinical outcome, selecting an appropriate treatment or monitoring a current treatment, and potentially changing the treatment based on the measurement the diagnostic autoantibody. The term "follow-up" in the present invention preferably means the attendant diagnosis to monitor the success of therapeutic measures ("therapeutic follow-up") during treatment of the disorder.

Die Begriffe „Bestimmung“ oder „Analysieren“, wie hier verwendet, beziehen sich auf die Bewertung des Vorliegens, der Abwesenheit, der Quantität, des Grades oder der Menge der jeweiligen Autoantikörper innerhalb der von dem Subjekt erhaltenen Probe, einschließlich qualitative oder quantitative Konzentrationsniveaus besagter Substanzen. Insbesondere umfassen die Begriffe die physikalische Detektion bzw. Analyse. Gemäß vorliegender Erfindung wurde festgestellt, dass Autoantikörper gegen ein MCT8-Genprodukt mit dem Vorliegen oder dem Risiko der Entwicklung einer ARD, insbesondere einer EARD und ganz besonders einer THREAD korreliert werden können.The terms "determination" or "analyzing" as used herein refer to the assessment of the presence, absence, quantity, degree or amount of the respective autoantibodies within the sample obtained from the subject, including qualitative or quantitative concentration levels of said substances. In particular, the terms include physical detection and analysis, respectively. In accordance with the present invention, it has been found that autoantibodies to an MCT8 gene product can be correlated with the presence or risk of developing ARD, particularly EARD, and more particularly, THREAD.

Der Fachmann kennt geeignete Immundetektionsverfahren, die das Analysieren einer Probe bezüglich des Vorliegens oder der Abwesenheit von Autoantikörpern gegen MCT8 gestatten. Z.B. wird die von einem Subjekt erhaltene biologische Probe in Kontakt mit einem Antigen gebracht, nämlich MCT8, welches die immunreaktiven antigenen Epitope der Autoantikörper aufweist, und somit das Binden der Autoantikörper an das Polypeptid erlaubt. In diesem Zusammenhang beziehen sich die Begriffe Polypeptid oder Protein, die hier austauschbar verwendet werden, auf ein Aminosäurepolymer mit einer Länge von mindestens 50 Aminosäuren. Der Begriff „Oligopeptid“ bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Länge von 5 bis 49 Aminosäuren.One skilled in the art will recognize suitable immunodetection procedures that allow the analysis of a sample for the presence or absence of autoantibodies to MCT8. For example, For example, the biological sample obtained from a subject is placed in contact with an antigen, namely MCT8, which has the immunoreactive antigenic epitopes of the autoantibodies, thus allowing binding of the autoantibodies to the polypeptide. In this context, the terms polypeptide or protein, which are used interchangeably herein, refer to an amino acid polymer of at least 50 amino acids in length. The term "oligopeptide" refers to a polypeptide of 5 to 49 amino acids in length.

Vorzugsweise kann ein Autoantikörper in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch einen Immunoassay detektiert werden, welche z.B. aus Immunausfällung, Brückenassay, enzymgekoppeltem Immunsorbenstest (ELISA), fluoreszierendem Immunsorbenstest (FIA), Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-(FRET-)Assay, chemisch gekoppeltem Immunsorbenstest (CLIA), Radioimmunoassay (RIA), Immunoblotting, immunometrischem Assay, Durchflusszytometrie, Western Blot und Immunhistochemie oder einem anderen, dem Fachmann bekannten Verfahren ausgewählt werden kann. Die Autoantikörper, die durch das erfindungsgemäße Verfahren detektiert werden sollen, können vom IgG- oder IgM-Typ sein, wobei diese Immunglobulinsubtypen zusätzlich die Verwendung spezifischer Detektionsreagenzien erlauben, die dem Fachmann bekannt sind.Preferably, an autoantibody can be detected in the method of the invention by an immunoassay which is e.g. from immunoprecipitation, bridge assay, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescent immunosorbent assay (FIA), fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay, chemically coupled immunosorbent assay (CLIA), radioimmunoassay (RIA), immunoblotting, immunometric assay, flow cytometry, Western blot and immunohistochemistry or another method known to those skilled in the art. The autoantibodies to be detected by the method of the invention may be of the IgG or IgM type, which immunoglobulin subtypes additionally allow the use of specific detection reagents known to those skilled in the art.

Das Kontaktieren der gewählten biologischen Probe, die das Antigen umfasst, unter geeigneten Bedingungen und ausreichender Zeit, um die Bildung von Immunkomplexen zu gestatten, wird üblicherweise durch Zugabe der Zusammensetzung zur Probe und Inkubieren der Mischung für eine genügende Zeit erreicht, um Immunkomplexe zu bilden. Die Antigen-Antikörper-Komplexe können durch bekannte Mittel und Verfahren, wie oben erwähnt, detektiert werden. Das bedeutet, dass die Detektion der Immunkomplexbildung der Antigen-Autoantikörper auf vielerlei Weise erreicht werden kann. Diese Verfahren basieren im Allgemeinen auf der Detektion eines Markers oder eines Labels direkt am Autoantigen, wie beispielsweise irgendwelchen radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder enzymatischen Markierungen oder Markern, die üblicherweise in der Technik verwendet werden. Zusätzliche Vorteile können durch den Einsatz von sekundären Bindungsliganden erreicht werden, wie einem zweiten Antikörper oder einer Bindungsanordnung von Biotin-/Avidin-(Streptavidin-)Liganden, wie in der Technik bekannt.Contacting the selected biological sample comprising the antigen, under conditions and time sufficient to allow the formation of immune complexes, is usually accomplished by adding the composition to the sample and incubating the mixture for a time sufficient to form immune complexes. The antigen-antibody complexes can be detected by known means and methods as mentioned above. This means that the detection of immune complex formation of the antigen autoantibodies can be achieved in many ways. These methods are generally based on the detection of a label or label directly on the autoantigen, such as any radioactive, fluorescent, biological or enzymatic labels or labels commonly used in the art. Additional benefits can be achieved through the use of secondary binding ligands, such as a second antibody or a binding assembly of biotin / avidin (streptavidin) ligands, as known in the art.

In einigen Ausführungsformen kann der primäre Immunkomplex durch einen sekundären Bindungsliganden detektiert werden, der eine Bindungsaffinität für das in der Probe vorhandene Antigen oder den Autoantikörper aufweist, beispielsweise die Reaktivität für die Fc-Region der Autoantikörper oder Reaktivität für eine Region des Antigens, die von der Bindungsregion des Autoantikörpers verschieden ist. In diesen Fällen kann der sekundäre Bindungsligand mit einem detektierbaren Marker- oder Markierungsmolekül verknüpft sein. Der sekundäre Bindungsligand ist oft selbst ein Antikörper, der daher sekundärer Antikörper genannt werden kann. Üblicherweise werden die primären Immunkomplexe mit dem markierten, sekundären Bindungsliganden oder Antikörper unter geeigneten Bedingungen und ausreichend lange kontaktiert. Die sekundären Immunkomplexe werden dann im Allgemeinen gewaschen, überschüssigen, ungebundenen markierten sekundären Antikörper oder Liganden zu entfernen und der verbleibende Marker in dem sekundären Immunkomplex wird dann detektiert. Alternativ können vergleichbare Immundetektionsverfahren verwendet werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.In some embodiments, the primary immune complex may be detected by a secondary binding ligand having binding affinity for the antigen or autoantibody present in the sample, for example, the reactivity for the Fc region of the autoantibodies or reactivity for a region of the antigen derived from the Binding region of the autoantibody is different. In these cases, the secondary binding ligand may be linked to a detectable marker or label molecule. The secondary binding ligand is often itself an antibody, which can therefore be called a secondary antibody. Usually, the primary immune complexes are contacted with the labeled secondary binding ligand or antibody under appropriate conditions and for a sufficient time. The secondary immune complexes are then generally washed to remove excess, unbound labeled secondary antibody or ligand, and the remaining marker in the secondary immune complex is then detected. Alternatively, comparable immunodetection techniques well known to those skilled in the art may be used.

Gemäß vorliegender Erfindung werden die Begriffe „Individuum“, „Patient“ und „Subjekt“ austauschbar verwendet und bedeuten vorzugsweise ein Säugerindividuum, insbesondere einen Menschen. In einer Ausführungsform der Erfindung bedeutet der Begriff „Subjekt“ ein Individuum, von dem angenommen wird, dass es an THREAD, insbesondere einer Hypophysitis, leidet. Jedoch soll „Patient“ so verstanden werden, dass nicht offensichtlich Symptome vorliegen.In the present invention, the terms "individual", "patient" and "subject" are used interchangeably and preferably mean a mammalian subject, especially a human. In one embodiment of the invention, the term "subject" means an individual believed to be suffering from THREAD, especially hypophysitis. However, "patient" should be understood as not having obvious symptoms.

Der Begriff „biologische Probe“ bedeutet erfindungsgemäß vorzugsweise eine im Voraus von einem Subjekt erhaltene Probe, die extrahiert, unbehandelt, behandelt, isoliert oder konzentriert sein kann. Bedeutsam ist, dass das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung den Schritt des Abnehmens der Probe von dem Subjekt nicht einschließt. Stattdessen ist die Probe eine isolierte Probe, die weiter verarbeitet werden kann. Die biologische Probe wird von irgendeinem Teil des Körpers des Patienten ausgewählt, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Haar, Haut, Nägeln, Geweben oder Körperflüssigkeiten wie Speichel, Gelenkflüssigkeit und Blut sowie Cerebrospinalflüssigkeit (Liquor), vorzugsweise Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum, Blut, Plasma oder Liquor und ganz bevorzugt Serum.The term "biological sample" according to the invention preferably means a sample obtained in advance from a subject which may be extracted, untreated, treated, isolated or concentrated. Significantly, the method of the present invention does not include the step of removing the sample from the subject. Instead, the sample is an isolated sample that can be processed further. The biological sample is selected from any part of the patient's body, including, but not limited to, hair, skin, nails, tissues or body fluids such as saliva, Synovial fluid and blood, and cerebrospinal fluid (CSF), preferably body fluids, especially serum, blood, plasma or cerebrospinal fluid, and most preferably serum.

Der Begriff „markiert“ gemäß vorliegender Erfindung bedeutet vorzugsweise direkt oder indirekt markiert, gegebenenfalls über einen Träger, der das Antigen in immobilisierter Form umfasst. Anders ausgedrückt kann der immobilisierte Träger den Marker umfassen, um entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens die Detektion des Autoantikörper-Antigen-Komplexes zu gestatten. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das bereitgestellte Antigen an einen festen Trägerstoff, wie z.B. das Trägermaterial einer Säulenmatrix oder die Oberfläche eines Behältnisses oder einer Mikrotiterplatte, einer Membran, Kügelchen, Messstäbe oder dergleichen gebunden. Alternativ kann eine derartige feste Trägersubstanz als zusätzliches Element in dem Kit der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. In noch einer alternativen Ausführungsform der Erfindung können beide Möglichkeiten des Vorlegens des Antigens kombiniert werden, d.h. als immobilisiertes Antigen und eines in Lösung, was die Detektion und Quantifizierung der Autoantikörper in einem Brückenassayformat gestattet.The term "labeled" according to the present invention preferably means directly or indirectly labeled, optionally via a carrier which comprises the antigen in immobilized form. In other words, the immobilized carrier may comprise the label to allow detection of the autoantibody-antigen complex according to the method of the invention. In another embodiment of the invention, the antigen provided is bound to a solid carrier, e.g. the support material of a column matrix or the surface of a container or a microtiter plate, a membrane, beads, dipsticks or the like bound. Alternatively, such a solid support may be provided as an additional element in the kit of the present invention. In yet an alternative embodiment of the invention, both ways of presenting the antigen can be combined, i. as an immobilized antigen and one in solution, allowing the detection and quantification of autoantibodies in a bridge assay format.

Figurenlistelist of figures

1A shows the presence of a signal associated with MCT8 autoantibody interaction in a cohort of healthy, adult humans (n = 200).
1B shows the presence of a signal associated with MCT10 autoantibody interaction in a cohort of healthy, adult humans (n = 200).
2A shows the presence of a signal associated with MCT8 autoantibody interaction in a cohort of adult humans suffering from hypophysitis (n = 18).
2 B shows the presence of a signal associated with MCT10 autoantibody interaction in a cohort of adult humans suffering from hypophysitis (n = 18).

Bindungsindex bedeutet den Wert des Quotienten der Signale der Probe/Negativkontrolle (Puffer).Binding index means the value of the quotient of the signals of the sample / negative control (buffer).

Soweit nicht etwas anderes angegeben, werden bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung konventionelle Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie verwendet, die innerhalb der Kenntnisse des Fachmanns liegen. Solche Techniken sind in der Literatur vollumfänglich beschrieben, wie z.B. in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2. Ausgabe (Sambrook, 1989) ; „Oligonucleotide Synthesis“ (Gait, 1984) ; „Animal Cell Culture“ (Freshney, 1987) ; „Methods in Enzymology“ „Handbook of Experimental Immunology“ (Weir, 1996) ; „Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells“ (Miller und Calos, 1987) ; „Current Protocols in Molecular Biology“ (Ausubel, 1987) ; „PCR: The Polymerase Chain Reaction“, (Mullis, 1994) ; „Current Protocols in Immunology“ (Coligan, 1991) . Im Allgemeinen sind diese Techniken zur Herstellung von Polynukleotiden und Polypeptiden zur Anwendung der Erfindung einsetzbar und können als solche für das Ausüben und Ausführen der Erfindung betrachtet werden. Besonders nützliche Techniken für spezifische Ausführungsformen werden in den Beispielen besprochen.Unless otherwise specified, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques), microbiology, cell biology, biochemistry and immunology are used in the practice of the present invention, which are within the skill of the art. Such techniques are fully described in the literature, such as in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition (Sambrook, 1989) ; "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984) ; "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987) ; "Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996) ; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987) ; "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987) ; "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994) ; "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991) , In general, these techniques for producing polynucleotides and polypeptides are useful in the practice of the invention and may be considered as such for practicing and practicing the invention. Particularly useful techniques for specific embodiments are discussed in the examples.

SEQUENZEN:SEQUENCES:

SEQ. ID NO: 1 amino acid sequence ( 539 aa) from hMCT8
SEQ. ID NO: 2 amino acid sequence ( 515 aa) from hMCT10
SEQ. ID NO: 3 Primer P1 (27mer)
SEQ. ID NO: 4 primer P2 (27mer)
SEQ. ID NO: 5 DNA ( 1656 bp) encoding firefly luciferase
SEQ. ID NO: 6 amino acid sequence ( 550 aa) of firefly luciferase
SEQ. ID NO: 7 DNA ( 1620 bp) encoding hMCT8
SEQ. ID NO: 8 primer P3 (32mer)
SEQ. ID NO: 9 primer P4 (33mer)
SEQ. ID NO: 10 DNA (3276bp) encoding a fusion protein of hMCT8 luciferase
SEQ. ID NO: 11 amino acid sequence ( 1091 aa) of the fusion protein hMCT8-luc
SEQ. ID NO: 12 DNA ( 1548 bp) encoding hMCT10
SEQ. ID NO: 13 primer P5 (32mer)
SEQ. ID NO: 14 primer P6 (43mer)
SEQ. ID NO: 15 DNA (3204bp) encoding a fusion protein of hMCT10 luciferase
SEQ. ID NO: 16 amino acid sequence ( 1067 aa) of the fusion protein hMCT8-luc

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und bieten dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung, wie die erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt und verwendet werden kann. Der Fachmann wird verstehen, dass die folgenden Beispiele nur beispielhaft sind und zahlreiche Änderungen, Abweichungen und Variationen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.The following examples illustrate the invention and provide a full disclosure and description to those skilled in the art of how the inventive methods can be practiced and used. It will be understood by those skilled in the art that the following examples are exemplary only and various changes, modifications and variations may be made without departing from the scope of the present invention.

BEISPIELEEXAMPLES

DNA-Primer wurden von BioTeZ Berlin Buch GmbH (Berlin, Bundesrepublik Deutschland) bezogen; Vektor pSP-luc+NF wurde von Promega GmbH (Mannheim, Bundesrepublik Deutschland), bezogen; Vektor pIRESneo wurde von Clontech (Palo Alto, CA, USA) bezogen; Ziegen-anti-human-IgG (SIGMA) wurde mit Acridinium NHS-Ester markiert (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA); das CellTiter-Glo®-Assay-Kit zum Testen der Lebensfähigkeit lumineszierender Zellen wurde von Promega GmbH bezogen.DNA primers were purchased from BioTeZ Berlin Buch GmbH (Berlin, Federal Republic of Germany); Vector pSP-luc + NF was purchased from Promega GmbH (Mannheim, Federal Republic of Germany); Vector pIRESneo was purchased from Clontech (Palo Alto, CA, USA); Goat anti-human IgG (SIGMA) was labeled with acridinium NHS ester (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA); the CellTiter-Glo® assay kit for luminescent cell viability testing was purchased from Promega GmbH.

Falls nicht anders angegeben, wurden alle anderen Reagenzien und Chemikalien von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, Deutschland) oder Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen; Enzyme wurden von Promega oder New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) bezogen. „PBS“ bedeutet im Folgenden 10 mM PO₄ ^3-, 137 mM NaCl und 2,7mM KCl, pH 7,4; „Raumtemperatur“ ist eine Temperatur im Bereich von 20-24°C.Unless otherwise stated, all other reagents and chemicals were purchased from Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Munich, Germany) or Merck KGaA (Darmstadt, Germany); Enzymes were purchased from Promega or New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). "PBS" means below 10 mM PO ₄ ^3-, 137mM NaCl and 2.7 mm KCl, pH 7.4; "Room temperature" is a temperature in the range of 20-24 ° C.

Beispiel 1: Konstruktion der FusionsproteineExample 1: Construction of fusion proteins

Beispiel 1A: Konstruktion eines MCT8-Luciferase-FusionsproteinsExample 1A: Construction of an MCT8 luciferase fusion protein

DNA (SEQ. ID NO: 5), kodierend für Glühwürmchen-Luciferase (SEQ. ID NO: 6) in pSP-luc+NF wurde durch PCR amplifiziert mittels der Primer P1 (SEQ. ID NO: 3) und P2 (SEQ. ID NO: 4), welche EcoRI- bzw. BamHI-Restriktionsstellen enthalten. pIRESneo wurde mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonukleasen gespalten und das erhaltene Fragment wurde durch die DNA ersetzt, die für die Glühwürmchen-Luciferase kodiert und die durch die oben erwähnte PCR erhalten wurde, was in Plasmid-pIRESneo-Luc resultierte.DNA (SEQ ID NO: 5) encoding firefly luciferase (SEQ ID NO: 6) in pSP-luc + NF was amplified by PCR using primers P1 (SEQ ID NO: 3) and P2 (SEQ. ID NO: 4) containing EcoRI and BamHI restriction sites, respectively. pIRESneo was cleaved with EcoRI and BamHI restriction endonucleases and the resulting fragment was replaced with the DNA encoding the firefly luciferase obtained by the above-mentioned PCR, resulting in plasmid pIRESneo-Luc.

Die DNA (SEQ. ID NO: 7) kodierend für humanes MCT8 (SEQ. ID NO: 1) wurde durch PCR amplifiziert mittels der Primer P3 (SEQ. ID NO: 8) und P4 (SEQ. ID NO: 9), welche Notl- bzw. EcoRI-Restriktionsstellen enthalten. pIRESneo-Luc wurde mit Notl- und EcoRI-Restriktionsendonukleasen gespalten und das erhaltene Fragment wurde durch die DNA-Sequenz ersetzt, die für hMCT8 kodiert und die durch die oben erwähnte PCR erhalten wurde, was zu dem Vektor pIRESneo-hMCT8-Luc führte, der SEQ. ID NO: 10 enthält und das MCT8-Luc-Fusionspolypeptid nach SEQ. ID NO: 11 kodiert.The DNA (SEQ ID NO: 7) encoding human MCT8 (SEQ ID NO: 1) was amplified by PCR using primers P3 (SEQ ID NO: 8) and P4 (SEQ ID NO: 9) Notl or EcoRI restriction sites included. pIRESneo-Luc was cleaved with NotI and EcoRI restriction endonucleases, and the resulting fragment was replaced with the DNA sequence encoding hMCT8 obtained by the above-mentioned PCR, resulting in the vector pIRESneo-hMCT8-Luc, which SEQ. ID NO: 10 and the MCT8-Luc fusion polypeptide according to SEQ. ID NO: 11 encoded.

Beispiel 1B: Konstruktion eines MCT10-Luciferase-FusionsproteinsExample 1B: Construction of an MCT10 luciferase fusion protein

Das Plasmid pIRESneo-Luc wurde wie in Beispiel 1A beschrieben erhalten Die DNA (SEQ. ID NO: 12), kodierend für humanes MCT10 (SEQ. ID NO: 2) wurde durch PCR amplifiziert mittels der Primer P5 (SEQ. ID NO: 13) und P6 (SEQ. ID NO: 14), welche Notl- bzw. EcoRI-Restriktionsstellen enthalten. pIRESneo-Luc wurde mit Notl- und EcoRI-Restriktionsendonukleasen gespalten und das erhaltene Fragment wurde durch die DNA-Sequenz ersetzt, die für hMCT10 kodiert und die durch die oben erwähnte PCR erhalten wurde, was zu dem Vektor pIRESneo-hMCT8-Luc führte, der SEQ. ID NO: 15 enthält und das hMCT10-Luc-Fusionspolypeptid nach SEQ. ID NO: 16 kodiert.The plasmid pIRESneo-Luc was obtained as described in Example 1A The DNA (SEQ ID NO: 12) encoding human MCT10 (SEQ ID NO: 2) was amplified by PCR using primer P5 (SEQ ID NO: 13 ) and P6 (SEQ ID NO: 14) containing Notl and EcoRI restriction sites, respectively. pIRESneo-Luc was cleaved with NotI and EcoRI restriction endonucleases, and the resulting fragment was replaced with the DNA sequence encoding hMCT10 obtained by the above-mentioned PCR, resulting in the vector pIRESneo-hMCT8-Luc, which SEQ. ID NO: 15 contains and the hMCT10-Luc fusion polypeptide according to SEQ. ID NO: 16 coded.

Beispiel 2: Herstellung von Zellen, die hMCT-Luc-Fusionsprotein produzieren Example 2: Preparation of cells producing hMCT-Luc fusion protein

Beispiel 2A: Herstellung von HEK293-Zellen, die hMCT8-Luc oder hMCT10-Luc produzierenExample 2A: Preparation of HEK293 cells producing hMCT8-Luc or hMCT10-Luc

HEK 293-Zellen wuchsen in DMEM, supplementiert mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum. Die Zellen wurden in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Die HEK 293-Zellen wurden mit Vektor pIRESneo-hMCT8-Luc bzw. pIRESneo-hMCT10-Luc transfiziert unter Verwendung von FuGENE6-Transfektionsreagenz (von Roche Deutschland Holding GmbH, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) erhalten, den Anweisungen des Herstellers entsprechend. 48 Stunden nach der Transfektion wurde die Selektion mit 0,8 mg/ml G418 (Gibco™ BRL, Invitrogen) begonnen. Es wurden stabile Klone mit hohen Expressionslevels an Fusionsprotein selektiert.HEK 293 cells grew in DMEM supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum. The cells were cultured in an atmosphere of 5% CO ₂ at 37 ° C. The HEK 293 cells were transfected with vector pIRESneo-hMCT8-Luc or pIRESneo-hMCT10-Luc using FuGENE6 transfection reagent (from Roche Deutschland Holding GmbH, Grenzach-Wyhlen, Germany), according to the manufacturer's instructions. 48 hours after transfection, selection was started with 0.8 mg / ml G418 (Gibco ™ BRL, Invitrogen). Stable clones were selected with high expression levels of fusion protein.

Beispiel 3: Herstellung von MCT-Luciferase-FusionsproteinExample 3: Preparation of MCT-luciferase fusion protein

Beispiel 3A: Konfluente HEK 293-Zellen (entweder hMCT8-Luc oder hMCT10-Luc herstellend), wurde bis zur Konfluenz in einer Platte von 75 cm² angezogen, wurden durch Zusammenschaben in PBS-Puffer resuspendiert und in demselben Puffer durch Zentrifugieren bei 2.000g bei 4°C 5 Minuten lang gewaschen. Die resultierenden Zellpellets wurden in 0,5 ml Lysepuffer enthaltend 50 mM Tris-HCI, 100 mM NaCl, 2% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) Glycerin bei pH 7,5 lysiert. Die Suspension wurde bei 2.000g bei 4°C 15 min lang zentrifugiert und der Überstand wurde aufgenommen und bei -80°C bis zur Verwendung gelagert.Example 3A: Confluent HEK 293 cells (producing either hMCT8-Luc or hMCT10-Luc) were grown to confluency in a 75 cm ² plate, resuspended by scraping in PBS buffer, and centrifuged at 2,000 g in the same buffer washed at 4 ° C for 5 minutes. The resulting cell pellets were lysed in 0.5 ml lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2% (v / v) Triton X-100, 10% (v / v) glycerol at pH 7.5. The suspension was centrifuged at 2,000g at 4 ° C for 15 minutes and the supernatant was collected and stored at -80 ° C until use.

Beispiel 4: Isolierung von humanem IgGExample 4: Isolation of human IgG

0,3 ml humanes Serum wurde mit 0,3 ml PBS verdünnt und mit 0,3 ml 10% (v/v) POROS-Protein A-Suspension gemischt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C unter ständiger Bewegung inkubiert. Die Kügelchen wurden bei 2.000g pelletiert und 6x mit PBS gewaschen. Gebundenes IgG wurde mit 25 mM Zitronensäure eluiert und der pH mit 1M Hepes-NaOH (pH 8,0) auf 7,0 eingestellt. Eluiertes IgG wurde mittels Centricon-Filtern bei 4°C und 1.000g auf 300 µl konzentriert.0.3 ml of human serum was diluted with 0.3 ml of PBS and mixed with 0.3 ml of 10% (v / v) POROS Protein A suspension. The mixture was incubated overnight at 4 ° C with constant agitation. The beads were pelleted at 2,000g and washed 6x with PBS. Bound IgG was eluted with 25 mM citric acid and the pH adjusted to 7.0 with 1M Hepes-NaOH (pH 8.0). Eluted IgG was concentrated by Centricon filters at 4 ° C and 1,000 g to 300 μl.

Beispiel 5: Immunpräzipitationsassay für hMCT8-AutoantikörperExample 5: Immunoprecipitation assay for hMCT8 autoantibodies

Der hMCT8-Luc-Zellextrakt wurde mit Verdünnungspuffer verdünnt, enthaltend 50 mM KH₂PO₄/ K₂HPO₄ (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10% (v/v) Glycerin, 1% (v/v) Triton X-100 und 5 mg/ml BSA. Zur Immunpräzipitation wurden 100 µl des verdünnten Extrakts (etwa 1,0e07 RLU) mit 10 µl Probe gemischt und über Nacht bei 4°C unter ständiger Bewegung inkubiert. Immunkomplexe wurden durch Zugabe von 100 µl 10 %iger (v/v) POROS Protein A-Suspension für 1,5 h bei Raumtemperatur unter konstanter Bewegung gefällt. POROS Protein A wurde bei 2.000g, 5 min lang bei 4°C pelletiert und 3 Mal mit 1 ml Waschpuffer (50 mM KH₂PO₄/ K₂HPO₄ (pH 7,5), 100 mM NaCl und 0,1 % Triton X-100) gewaschen. Die Luciferaseaktivität wurde in einem Berthold LB 953-Luminometer für 5 Sekunden gemessen und die Ergebnisse als gebundene RLU angegeben.The hMCT8-Luc cell extract was diluted with dilution buffer containing 50 mM KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10% (v / v) glycerol, 1% (v / v). Triton X-100 and 5 mg / ml BSA. For immunoprecipitation, 100 μl of the diluted extract (about 1.0e07 RLU) was mixed with 10 μl of sample and incubated overnight at 4 ° C with constant agitation. Immune complexes were precipitated by adding 100 μl of 10% (v / v) POROS Protein A suspension for 1.5 h at room temperature with constant agitation. POROS Protein A was pelleted at 2,000 g for 5 min at 4 ° C and washed 3 times with 1 ml of washing buffer ( 50 mM KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ (pH 7.5), 100 mM NaCl and 0.1% Triton X-100). The luciferase activity was measured in a Berthold LB 953 luminometer for 5 seconds and the results reported as bound RLU.

Beispiel 6: MCT8-Autoantigen ist ein Biomarker für THREADExample 6: MCT8 autoantigen is a biomarker for THREAD

Patientensera wurden auf das Vorliegen von Autoantikörpern gegen MCT8 und MCT10 analysiert. Die Ergebnisse sind in den folgenden Figuren und Tabellen gezeigt, wobei „SA“ Standardabweichung, „IQR“ Interquartilbereich, „PT“ positiver Grenzwert, d.h. der Grenzwert für positive Proben, die das Vorliegen oder Einsetzen einer THREAD anzeigen, bedeutet. Tabelle 1: hMCT8-Autoantikörperspiegel im Serum einer gesunden Kohorte männlicher und weiblicher Erwachsener (jeweils n=100) (vgl. Fig. 1A) Anzahl von Werten 100 weiblich 100 männlich Minimum 0,710 0,560 25 % Perzentil P25 1,030 0,990 Mittelwert 1,150 1,105 75 % Perzentil P75 1,268 1,273 Maximum 2,120 2,020 Durchschnitt 1,198 1,157 Standardabweichung 0,2531 0,2621 PT > Durchschnitt + 2*SA 1,70 1,70 PT > P75 + 1,5*IQR 1,63 1,69 Tabelle 2: hMCT10-Autoantikörperspiegel im Serum einer gesunden Kohorte männlicher und weiblicher Erwachsener (jeweils n=100) (vgl. Fig. 1B) Anzahl von Werten 100 weiblich 100 männlich Minimum 0,620 0,480 25 % Perzentil P25 1,060 0,975 Mittelwert 1,170 1,175 75 % Perzentil P75 1,490 1,420 Maximum 11,55 7,490 Durchschnitt 1,527 1,369 Standardabweichung SA 1,343 0,883 PT > Durchschnitt + 2*SA 4,21 3,13 PT > P75 + 1,5*IQR 2,78 2,75 Tabelle 3: hMCT8-Autoantikörperspiegel im Serum einer Kohorte von Patienten, die an Hypophysitis leiden (n=18) im Vergleich zu einer Negativkontrolle gesunder Individuen (n=10) (vgl. Fig. 2A) Anzahl von Werten 18 Minimum 2,140 25 % Perzentil P25 3,408 Mittelwert 4,345 75 % Perzentil P75 6,593 Maximum 11,98 Durchschnitt 5,019 Standardabweichung SA 2,324 PT > Durchschnitt + 2*SA 9,67 PT > P75 + 1,5*IQR 11,37 Tabelle 4: hMCT10-Autoantikörperspiegel im Serum einer Kohorte von Patienten, die an Hypophysitis leiden (n=18) im Vergleich zu einer Negativkontrolle gesunder Individuen (n=10) (vgl. Fig. 2B) Anzahl von Werten 18 Minimum 1,240 25 % Perzentil P25 2,040 Mittelwert 3,005 75 % Perzentil P75 4,640 Maximum 15,95 Durchschnitt 4,277 Standardabweichung SA 3,693 PT > Durchschnitt + 2*SA 11,66 PT > P75 + 1,5*IQR 8,54 Patient sera were analyzed for the presence of autoantibodies to MCT8 and MCT10. The results are shown in the following figures and tables, where "SA" is standard deviation, "IQR" is interquartile range, "PT" is positive limit, ie, the limit for positive samples indicating the presence or onset of a THREAD. Table 1: hMCT8 autoantibody levels in the serum of a healthy cohort of male and female adults (n = 100, respectively) (see Fig. 1A) Number of values 100 female 100 male minimum 0,710 0.560 25% percentile P25 1,030 0.990 Average 1,150 1,105 75% percentile P75 1,268 1,273 maximum 2,120 2,020 average 1,198 1,157 standard deviation .2531 .2621 PT> Average + 2 * SA 1.70 1.70 PT> P75 + 1.5 * IQR 1.63 1.69 Table 2: hMCT10 autoantibody levels in the serum of a healthy cohort of male and female adults (n = 100, respectively) (see Fig. 1B) Number of values 100 female 100 male minimum 0,620 0,480 25% percentile P25 1,060 0,975 Average 1,170 1,175 75% percentile P75 1,490 1,420 maximum 11.55 7,490 average 1,527 1,369 Standard deviation SA 1,343 0.883 PT> Average + 2 * SA 4.21 3.13 PT> P75 + 1.5 * IQR 2.78 2.75 Table 3: hMCT8 autoantibody serum level in a cohort of patients suffering from hypophysitis (n = 18) compared to a negative control of healthy individuals (n = 10) (see Fig. 2A) Number of values 18 minimum 2,140 25% percentile P25 3,408 Average 4,345 75% percentile P75 6,593 maximum 11.98 average 5,019 Standard deviation SA 2,324 PT> Average + 2 * SA 9.67 PT> P75 + 1.5 * IQR 11.37 Table 4: hMCT10 autoantibody serum level in a cohort of patients suffering from hypophysitis (n = 18) compared to a negative control of healthy individuals (n = 10) (see Fig. 2B) Number of values 18 minimum 1,240 25% percentile P25 2,040 Average 3,005 75% percentile P75 4,640 maximum 15,95 average 4,277 Standard deviation SA 3,693 PT> Average + 2 * SA 11.66 PT> P75 + 1.5 * IQR 8.54

Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Vorliegen von Autoantikörpern gegen hMCT8 oder hMCT10 im Serum eines Individuums in einer Menge, die höher als der definierte Grenzwert ist, das Vorliegen oder Einsetzen einer THREAD anzeigen. The results indicate that the presence of autoantibodies to hMCT8 or hMCT10 in an individual's serum in an amount greater than the defined threshold indicates the presence or onset of THREAD.

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

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"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991) [0046]

Claims

An in vitro method of diagnosing the presence or risk of development or follow-up of a thyroid hormone dependent endocrine autoimmune disorder (THREAD) in a subject, the method comprising analyzing a biological sample obtained from the subject for the presence of Autoantibodies to monocarboxylate transporter 8 (MCT8).

Method according to Claim 1 in which the concentration of an autoantibody against MCT8 is determined.

Method according to one of Claims 1 or 2 in which the concentration of an autoantibody against MCT8 is determined by means of a labeled MCT8.

Method according to one of Claims 1 - 3 wherein the autoantibody concentration in the sample is compared to one or more reference values, wherein a concentration of the autoantibody against MCT8 that is higher than a threshold indicates the presence of a dysfunction.

Method according to one of Claims 1 - 4 , where the MCT8 is human.

A kit for the diagnosis and / or follow-up of a thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction (THREAD) by determining the presence or concentration of an MCT8 autoantibody in a sample of a subject, wherein the kit comprises an aliquot of one or more labeled MCT8.

Kit after Claim 6 wherein the MCT8 is derived from human MCT8.

Use of a human-derived MCT8 in a method of diagnosis, risk assessment or therapy control of thyroid hormone-dependent endocrine autoimmune dysfunction.

Use of an isolated MCT8 in a test to identify a compound that interferes with the complex formation between MCT8 and autoantibodies to MCT8.