DE102017116436A1

DE102017116436A1 - Anordnung zur Einkopplung von Beleuchtungsstrahlung und Auskopplung von einer Probe zurückkommender Strahlung in einen Mikroskopstrahlengang

Info

Publication number: DE102017116436A1
Application number: DE102017116436.7A
Authority: DE
Inventors: Wibke Hellmich; Gerhard Krampert; Matthias Wald; Ralf Netz
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2019-01-24

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Einkopplung von Beleuchtungsstrahlung und Auskopplung von einer Probe zurückkommender Lichtstrahlung in einen Mikroskopstrahlengang.
Die Aufgabe, eine neue Möglichkeit zur Einkopplung bzw. Auskopplung von Beleuchtungsstrahlung und von einer Probe zurückkommender Strahlung zu finden, die eine achromatische räumliche Strahlteilung ohne streifenförmige Bildartefakte gestattet, wird erfindungsgemäß gelöst, indem im Mikroskopstrahlengang zwischen Probe (5) und einer Detektionseinheit (67) in einer Pupillenebene ein Strahlteiler (3) mit räumlich achromatischer Strahlteilung mit transparentem Träger (33) und reflektierendem erstem Bereich (31) vorhanden ist, wobei der erste Bereich (31) symmetrisch zur optischen Achse (7) des Beleuchtungs- und des Mikroskopstrahlengangs (2; 4) und zur Detektionseinheit (67) positioniert ist, und der Strahlteiler (3) Scanmittel aufweist, die eine Schwingungsbewegung des Trägers (33) um wenigstens eine zur optischen Achse (7) orthogonale Achse gestattet.

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Einkopplung von Beleuchtungsstrahlung und Auskopplung von einer Probe zurückkommender Strahlung in einen Mikroskopstrahlengang mit simultaner Beleuchtung und Beobachtung der Probe bei räumlicher und/oder zeitlicher Überlagerung von Frequenzspektren der von der Probe kommenden Strahlung, insbesondere in der Laser-Scanning-Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und Scanning-Nahfeldmikroskopie.
Die Forschung in der modernen Zellbiologie möchte in zunehmenden Maße auf qualitativ hochwertige und lichtstarke Bilder zurückgreifen können. Die in der Fluoreszenzmikroskopie häufig anzutreffenden Intensitäts- und dichroitischen Strahlteilungsprinzipien für die Ein- bzw. Auskopplung von Beleuchtungs- und Auswertungsstrahlengang sind entweder mit Intensitätsverlust verbunden oder aber spektral sehr eng beschränkt. Bei den Spektralteilern ist vor allem nachteilig, dass Simultanuntersuchungen von Proben mit Mehrfachfluorophoren für die Echtzeitauswertung (z.B. High Throughput Screening) faktisch anwendungsspezifische Strahlteiler erfordern, wodurch die multivalente Anwendung des betreffenden Mikroskops stark eingeschränkt wäre.
Deshalb ist man zu anderen Teilungsverfahren, der sog. achromatischen Teilung übergegangen. So ist es z.B. aus der DE 102 57 237 B4 bekannt, zur Probenbeleuchtung bei der Anwendung von Linienscannern in der Pupille des Mikroskopstrahlengangs einen zentrierten reflektierenden Strich zur Beleuchtung der Probe einzusetzen, der die Beleuchtung auf die optische Achse des nachfolgenden optischen Systems einspiegelt. Im restlichen Pupillenbereich außerhalb des Striches wird die von der Probe kommende Strahlung, z.B. Fluoreszenzstrahlung, vollständig durchgelassen. Diese Vorgehensweise der Lichteinkopplung und Lichttrennung wird in Fachkreisen „Achromatic Gate“ oder auch kurz „Achrogate“ genannt. Alternativ kann es sich beim eben erwähnten „Achrogate“ um die dazu inverse Struktur handeln - Beleuchtung wird linienförmig hindurch gelassen, Fluoreszenz wird weitestgehend vollständig reflektiert.
Bei den achromatischen Methoden der Strahlkopplung treten aber häufig störende Bildartefakte auf, wie beispielsweise Streifen im Bild, die in der modernen Mikroskopie nicht mehr zu den geduldeten Nebeneffekten gehören. Die Bildfehler können u.a. dadurch entstehen, dass optische Systeme homogene Bildinformationen nicht vollständig übertragen, d.h. es können Raumfrequenzen verloren gehen, sodass eingangsseitig einwandfreie Bilder dann fehlerbehaftet sind. Mitunter lässt sich bei der Anwendung eines anderen optischen Effektes die Veränderung des Raumfrequenzspektrums nicht vermeiden.
So geschieht es beispielsweise bei der Anwendung des achromatischen räumlichen Teilens zwischen Beleuchtungs- und Detektionslicht bei einem Linien-Scanner, dass geringfügig Anteile von Raumfrequenzen in der Pupille verloren gehen und folglich leichte, aber störende Modulationen vom Beleuchtungslichtprofil im Zwischenbild entstehen. Der hierbei verwendete schmale, in der Pupille zentrierte reflektierende Bereich, der die Beleuchtung auf die optische Achse des nachfolgenden optischen Systems zur Probe einspiegelt und im restlichen Pupillenbereich außerhalb des reflektierenden Bereichs die von der Probe kommende Strahlung als „Achrogate“ vollständig durchlässt, ist durch die Ausblendung des zentralen Bereichs der Pupille genau für solche Bildstörungen anfällig. Die dabei auftretenden Modulationen stören nicht nur den visuellen Betrachter, sie können auch zur Fehlinterpretation von Bilddaten führen und sind deshalb nicht zu tolerieren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Möglichkeit zur Einkopplung von Anregungsstrahlung und Auskopplung von einer Probe zurückkommender Lichtstrahlung in einen Mikroskopstrahlengang zu finden, die das achromatische räumliche Teilen beim Ein- und Auskoppeln von Anregungs- und Probenstrahlung ohne die üblicherweise streifenförmigen Bildartefakte gestattet.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einer Anordnung zur Einkopplung von Beleuchtungsstrahlung und Auskopplung von einer Probe zurückkommender Strahlung in der Mikroskopie, bei der die Beleuchtungsstrahlung in eine Pupillenebene eines Objektivs oder eine dazu konjugierte Ebene im Mikroskopstrahlengang zwischen Probe und einer Detektionseinheit fokussiert ist und in dieser Pupillenebene ein Strahlteiler mit räumlich achromatischer Strahlteilung vorhanden ist, wobei der Strahlteiler einen kleinflächigen reflektierenden ersten Bereich und einen großflächigen transparenten, zum reflektierenden ersten Bereich komplementären zweiten Bereich aufweist, sodass die Beleuchtungsstrahlung über den ersten Bereich reflektierend von der Lichtquelle zur Probe einkoppelbar ist und die von der Probe zurückkommende Strahlung durch den transparenten zweiten Bereich des Strahlteilers auf die Detektionseinheit gerichtet ist, dadurch gelöst, dass der Strahlteiler mit einem transparenten Träger und mit einem reflektierenden kleinen ersten Bereich ausgestattet ist, der symmetrisch zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs und des Mikroskopstrahlengangs zur Detektionseinheit positioniert ist und dass der Strahlteiler mit Scanmitteln ausgestattet ist, die eine Schwingungsbewegung des planparallelen Trägers um wenigstens eine zur optischen Achse orthogonale Achse gestattet.
Vorteilhaft ist der reflektierende erste Bereich des Strahlteilers als schmaler Streifen ausgebildet und die Schwingungsbewegung um die Mittenachse parallel zu einer langen Kante des ersten Bereiches ausführbar. Dabei ist der schmale Streifen vorzugsweise als Beschichtung auf einer transparenten Trägerplatte aufgebracht. In einer anderen zweckmäßigen Ausführung kann der reflektierende erste Bereich des Strahlteilers als schmaler, polierter metallischer Streifen in einem transparenten Trägerrahmen eingespannt sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist der reflektierende erste Bereich des Strahlteilers als kleine punktförmige Kreisfläche ausgebildet und die Schwingungsbewegung um die Mitte der Kreisfläche in zwei orthogonalen Richtungen gegenüber der Flächennormale des transparenten Trägers ausführbar. Dabei ist die kleine punktähnliche Kreisfläche vorzugsweise als Beschichtung auf einer transparenten Trägerplatte aufgebracht. Alternativ kann die kleine punktähnliche Kreisfläche als metallisches poliertes Plättchen über Spannfäden oder Speichen in einem transparenten Rahmen eingespannt sein.
Der Strahlteiler ist bevorzugt zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um ein Mehrfaches größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme anregbar. Falls keine Scanbewegung zur Bildaufnahme vorgesehen ist, wie z.B. bei einem Weitfeldmikroskop, wird der Strahlteiler zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H angeregt, die bevorzugt um ein Mehrfaches größer als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit ist. Dabei erweist es sich als besonders vorteilhaft, wenn der Strahlteiler zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um mindestens das Fünffache größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme oder als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit angeregt wird.
In einer andersartigen Ausführung der Erfindung zur Realisierung der schnellen Schwingungsbewegung des am Strahlteiler reflektierten Strahlenbündels ist zweckmäßig ein schneller Strahlshifter, der für eine Bündelquerverschiebung unmittelbar vor dem Strahlteiler im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist, zu einer Schwingungsbewegung um eine zu einer Mittelachse des reflektierenden Bereichs parallele Achse anregbar, wobei der Strahlteiler dabei fixiert ist.
Dabei ist der schnelle Strahlshifter vorzugsweise mit einer Modulationsfrequenz ω_H um ein Mehrfaches größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme oder als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit (Kamera) anregbar. Bevorzugt ist der schnelle Strahlshifter zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um mindestens das Fünffache größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme oder als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit anregbar.
Die Erfindung basiert auf der Grundüberlegung, dass die Modulationen, die das „Achrogate“ im Objektraum bewirken kann, daraus resultieren können, dass nicht alle Raumfrequenzen, die in einem homogenen Beleuchtungsmuster enthalten sind, vom „Achrogate“ in Richtung der Probe übertragen werden. Wird nämlich ein schmaler reflektierender Streifen in der Pupille als „Achrogate“ zur Erzeugung einer Linienbeleuchtung verwendet (wie beispielsweise auch in 1 gezeigt), so ist die elektrische Lichtamplitude unmittelbar hinter dem so konstruierten „Achrogate“ in erster Näherung durch das Produkt der Reflexionsfunktion R(x₁) des Streifens mit der Amplitude der Beleuchtungslinie (2. Term in der folgenden Formel) unmittelbar vor dem Achrogate gegeben: $A m p_{A c h r o} (x_{1}) = R (x_{1}) \cdot (\frac{sin (\frac{2 π}{λ} \cdot b_{1} \frac{x_{1}}{f_{1}})}{\frac{2 π}{λ} \cdot b_{1} \frac{x_{1}}{f_{1}}}),$
wobei b₁ eine Art effektive Spaltbreite ist, die im Beleuchtungsstrahlengang vor der Fokussierung mittels einer Zylinderlinse der Brennweite f₁ des Beleuchtungslichtes auf das Achrogate vorhanden ist. Die Beleuchtungsamplitude des Anregungsstrahlengangs in einer auf die Pupille folgenden Zwischenbildebene, die schlussendlich mit der Probe in Wechselwirkung tritt und damit die eigentliche Bedeutung für die Beleuchtung/ Anregung der Probe besitzt, ist durch die Faltungs-Gleichung gegeben: $A m p_{Z B} (x_{2}) = (\frac{sin (\frac{2 π}{λ} \cdot b_{A c h r o} \frac{x_{s a m p l e}}{f_{o b j}})}{\frac{2 π}{λ} \cdot b_{A c h r o} \frac{x_{s a m p l e}}{f_{o b j}}}) \otimes t (x_{s a m p l e})$
Der Einfachheit und Direktheit wegen, sind die Objektkoordinate x_sample, die Objektivbrennweite f_obj und die halbe Achrogatebreite b_Achro verwendet worden. t(x_sample) ist die Fouriertransformierte der Beleuchtungslinie in der Pupille (in der Achrogate-Ebene) ohne Achrogate-Filterung und ist durch eine Art Rechteckfunktion definiert.
Die Modulation auf der Beleuchtungslinie wird vor allem durch das Achrogate verursacht und besitzt die Modulationsperiode $T = \frac{λ \cdot f_{o b j}}{b_{A c h r o}} = \frac{λ}{N A}$
Die numerische Apertur NA bezieht sich auf den Anteil der NA des Objektivs, der nach der Achrogate-Spalt-Filterung genutzt werden kann. Man erkennt, dass die Achrogate-Spaltbreite b_Achro die Modulationsperiode bestimmt. Die Achrogate-Spaltbreite b_Achro bestimmt aber auch den linearen Lichtleitwert, der übertragen werden kann. Der Lichtleitwert ist dabei näherungsweise die Spaltbreite b_Achro multipliziert mit der numerischen Apertur.
Bei den bisherigen Ausführungen ist stets angenommen worden, dass als Beleuchtungslicht kohärentes Laserlicht verwendet wird. Die kohärente Laserlichtquelle bringt dabei selbst einen Lichtleitwert von λ/2 mit. Prinzipiell ist nun vorstellbar, dass in die Achrogate-Spaltbreite b_Achro der genannte Lichtleitwert N-fach hinein passt, d.h. der übertragbare Lichtleitwert ist $N A \cdot b_{A c h r o} = N \cdot λ / 2.$
Die Zahl N repräsentiert einen eine Lichtquelle charakterisierenden M² - Wert: $M^{2} \propto N A \cdot b_{A c h r o} / λ .$
Quellen mit größerem M² - Wert überstrahlen das Achrogate (Lichtverlust), Quellen mit kleinerem M² - Wert sind zu kohärent. Die andere Achse spielt hier keine Rolle, dort sollte das M² eher klein sein, damit die Linie dünn bleibt.
Der erfindungsgemäße Lösungsansatz in einem Scanning-Mikroskop liegt nun darin, dass In dem räumlichen Bereich der Modulationsperiode mindestens die Beleuchtungslinie bewegt werden muss, bevor der nächste Zeilenvorschub orthogonal dazu erfolgen kann. Die Homogenisierung der Beleuchtungslinie kann in einfacher Weise dadurch bewirkt werden, indem das „Achrogate“ um eine Rotationsachse parallel zur reflektierenden Linie periodisch hin und her bewegt wird. Es ist zu beachten, dass diese Art „Homogenisierungsbewegung“ den Detektionsstrahlengang nicht beeinflusst, Homogenisierungsbewegung und ScanBewegung zur Erzeugung des Bildes sollten deshalb orthogonal aufeinander stehen.
Die Orthogonalität der beiden Bewegungen bzw. die Rotation um eine Drehachse die parallel zum reflektierenden Bereich oder gar in dem reflektierenden Bereich liegt, stellt ein Wesensmerkmal der Erfindung dar, denn bisher wurde das Achrogate lediglich stationär genutzt oder zum Zweck des Abscannens der Probe um eine Achse rechtwinklig zum reflektierenden Bereich periodisch hin und her bewegt.
Die Geschwindigkeit der Homogenisierungsbewegung, beschrieben durch die Modulationsfrequenz ω_H, sollte deutlich höher sein, als die Frequenz der Scan-Bewegung zur Erzeugung des Bildes, definiert als Modulationsfrequenz ω_S. Das Verhältnis der beiden Frequenzen sollte die folgende Bedingung erfüllen: ω_H ≥ 5ω_S.
Die Modulationsfrequenz ω_H kann bevorzugt mit einem Resonanz-Scanner verwirklicht werden. Weitere Optionen für Umsetzung der hohen Modulationsfrequenz ω_H, sind elektrooptische Modulatoren, die eine schnell variierende lineare Phase in einer zum Achrogate konjugierten Ebene erzeugen, oder aber die bekannte planparallele Platte, (sog. „Wackelplatte“), die im Strahlengang vor der Fokussierung des Beleuchtungsstrahlengangs auf den Streifen des Achrogate mit schneller periodischer Bewegung um eine zur Mittellinie des reflektierenden Streifens des Achrogate hin und her bewegt wird und dem Achrogate“ im Fokus eine lineare Phase aufprägen kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liegt in der Anwendung des Achrogates in einem Weitfeldmikroskop. Beim Weitfeldmikroskop mit Laserbeleuchtung wird das Achrogate abgewandelt in einen punktförmigen reflektierenden Bereich, der in einer Pupille des Mikroskops zur Vereinigung des Beleuchtungsstrahlengangs mit dem Auswertestrahlengang angeordnet ist. Das gewählte Beugungsmuster eines ausgedehnten 2D-Beleuchtungsflecks ist im Allgemeinen rotationssymmetrisch und weist ebenfalls periodische Strukturen auf.
Zum Zwecke der Homogenisierung der Beleuchtung kann es sich als günstig erweisen, den Beleuchtungsfleck mehrfach in definierten Richtungen schnell zu verschieben, d.h. aus der Normallage auszulenken und anschließend um die optische Achse kreisen lassen. Dabei sollten möglichst viele Scan-Zyklen pro Kameraintegrationszeit erfolgen.
Mit der Erfindung wird ein verbessertes achromatisches Teilen von Strahlengängen, d.h. Ein- und Auskoppeln von Beleuchtungs- und Auswertestrahlengang beispielsweise von einer Mikroskopstrahlengang, ein verbessertes sog. Achrogate, realisiert, mit dem beim achromatisch räumlichen Teilen und Vereinigen der Strahlengänge die üblicherweise auftretenden streifenförmigen Bildartefakte unterdrückt bzw. kompensiert sind.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Dabei zeigen die Zeichnungen:

1: eine Darstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops mit einer Beleuchtungslinie, die über einen streifenförmigen reflektierenden Bereich des Achrogates eingekoppelt wird;
2: eine Detaildarstellung einer ersten Variante der Erfindung, bei der das im Achrogate eingekoppelte Beleuchtungsmuster, hier als Beleuchtungslinie (bzw. Beleuchtungsspalt), quer zur Spaltrichtung bewegt wird, indem ein Streifenträger um die Streifenlängsachse schwenkbar angeordnet ist,
3: eine vergrößerte Detaildarstellung einer zweiten Variante der Erfindung, bei der das im Achrogate eingekoppelte Beleuchtungsmuster, hier als Beleuchtungsstreifen (oder Beleuchtungsspalt), quer zur Spaltrichtung bewegt wird, indem eine planparallele Platte vor der Zylinderlinse zur Streifenfokussierung auf den Achrogatestreifen um eine zum Achrogatestreifen parallele Achse schwenkbar angeordnet ist,
4: eine Darstellung der Intensitätsverteilung des vom Achrogate eingekoppelten Beleuchtungsbündels in einer Zwischenbild- oder Objektebene a) ohne Homogenisierung und b) mit Homogenisierung durch erfindungsgemäße Bewegung des eingekoppelten Beleuchtungsbündels;
5: eine schematische Darstellung eines Weitfeld-Mikroskops mit kohärenter oder teilkohärenter Beleuchtung unter Verwendung eines Achrogates mit einem „punktförmigen“ Bereiches zur Beleuchtungseinkopplung, und
6: eine vergrößerte Detaildarstellung einer dritten Variante der Erfindung, bei der das im Achrogate eingekoppelte Beleuchtungsmuster als „punktförmiger“ Beleuchtungsfleck (bzw. Beleuchtungskreis) in mindestens zwei Richtungen gegenüber der optischen Achse ausgelenkt wird, wobei der Träger des kreisförmigen reflektierenden Bereichs des Achrogate um wenigstens zwei unabhängige Achsen rechtwinklig zur optischen Achse schwenkbar angeordnet ist.

Die Erfindung ist in einem ersten Grundaufbau in 1 dargestellt. Ein Mikroskop 1 - hier für die Anwendung in einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop 11 mit Linienscanner adaptiert - weist einen durch eine Strich-Punkt-Linie markierten Beleuchtungsstrahlengang 2 auf, mit dem das Licht einer Lichtquelle 21 über eine Kollimatorlinse 22 aufgeweitet und mittels einer Zylinderlinse 23 fokussiert als eine Lichtstreifen 24 auf einen reflektierenden Bereich 31 eines räumlichen achromatischen Strahlteilers 3 (nachfolgend kurz Achrogate 3) mit einem räumlich erheblich größeren transparenten Bereich 32 (mindestens das zehn- bis hundertfache des reflektierenden Bereichs 31) gerichtet ist und vom reflektierenden Bereich 31 des Achrogate 3 in den üblichen Mikroskopstrahlengang 4 aus Scannerspiegel 41, Scanobjektiv 42, Tubuslinse 43 und Mikroskopobjektiv 44 eingekoppelt wird. Von der mit dem Beleuchtungsstrahlengang 2 angeregten Probe 5 wird eine Sekundärstrahlung, wie z.B. Fluoreszenz, Lumineszenz, rückgestreutes Beleuchtungslicht, SHG-Signale (Second Harmonic Generation), CARS-Strahlung (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) o.Ä., in den Mikroskopstrahlengang 4 und durch den transparenten Bereich 32 des Achrogate 3 in den Detektionsstrahlengang 6 übertragen. Der Detektionsstrahlengang 6 enthält Relayoptik 61, Strahlverschiebungs-Kompensator 62, Konfokalschlitzblende 63 und Spektralfilter 64 zur Selektion bestimmter Spektralbereiche der von der Probe 5 kommenden Sekundärstrahlung sowie mindestens ein Detektionsobjektiv 65 und eine Kamera 67 als Detektionseinheit. Des Weiteren enthält der Detektionsstrahlengang 6 nach dem Achrogate 3 - für den Fall, dass das Achrogate 3 aus einem reflektierenden Bereich 31, der auf einer transparenten planparallelen Trägerplatte 33 (z.B. aus Glas, Quartz, Kalziumfluorid) aufgetragen ist - optional eine entgegengesetzt orientierte planparallele Kompensationsplatte 66 gleichen Materials und gleicher Dicke, die den Strahlversatz der Trägerplatte 33 des Achrogates 3 rückgängig macht. Falls der Strahlversatz infolge der planparallelen Trägerplatte 33 im weiteren Strahlverlauf des Detektionsstrahlengangs 6 berücksichtigt wird oder das Achrogate 3 lediglich aus einem in einem Rahmen gehaltenen metallischen Streifen gebildet sein sollte, entfällt die Kompensationsplatte 66 ersatzlos.
Mittels des Achrogates 3 wird bei dem Lichtmuster des Beleuchtungsstrahlengangs 2, das in diesem Beispiel als fokussierter Lichtstreifen 24 (Lichtspalt) auf den reflektierenden Bereich 31 des Achrogate 3 ausgebildet ist, die Amplitude der Lichtintensität gegenüber der optischen Achse 7 um kleine Winkel α verschwenkt und damit das eingehende Beleuchtungsmuster „verschmiert“, d.h. homogenisiert.
Diese Homogenisierung kann auf zweierlei Wegen realisiert werden.
2 zeigt eine stilisierte erste Ausführung des Achrogates 3, bei der die Trägerplatte 33, die zentriert mit dem reflektierenden Bereich 31 beschichtet ist, um die Mittelachse 311 des streifenförmigen reflektierenden Bereichs 31 hin und her geschwenkt wird.
3 stellt eine alternative Ausführung dar, bei der das reflektierte Beleuchtungsbündel 26 die gleiche Bewegung wie in 2 ausführt, jedoch das Achrogate 3 unbewegt (fixiert) ist. Stattdessen wird ein vor dem Achrogate 3 befindlicher schneller Strahlshifter 25 verwendet, der vorzugsweise als optische „Wackelplatte“ (eine um eine parallele Achse 251 zur Mittellachse 311 des reflektierenden Streifens 31 des Achrogates 3 schwingende planparallele Platte) ausgeführt ist.
Der schnelle Strahlshifter 25 (Wackelplatte) kann auch durch einen elektrooptischen Modulator (nicht gezeichnet) realisiert werden.
Die Geschwindigkeiten der Schwingungsbewegung zur Homogenisierung des Beleuchtungsmusters sind bei den Ausführungen von 2 und 3 als gleich anzusetzen. Sie werden als Modulationsfrequenz ω_H, deutlich größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bilderzeugung gewählt. Das Verhältnis sollte die Bedingung erfüllen: $ω_{H} \geq 5 ω_{S}$
und kann durch Einsatz eines Resonanzscanners (nicht gezeichnet) oder eines elektrooptischen Modulators (nicht gezeichnet) als Schwinger für das Achrogate 3 oder den schnellen Strahlshifter 25 realisiert werden.
Die Anregung der Probe 5 erfolgt - wie vorstehend zu 1 beschrieben - mittels eines verschwenkten (homogenisierten) und zur Probe 5 entlang x-Richtung erstreckten Lichtstreifens 24, der quer dazu in y-Richtung bewegt wird, um die Probe 5 (zweidimensional) abzutasten.
Hierbei sind zwei (oder mehr) Wellenlängenbereiche λ₁ , λ₂ , ... detektierbar, wenn ein zwischen Konfokalschlitzblende 63 und Detektionsobjektiv 65 angeordnetes Spektralfilter 64 wechselbar ausgebildet ist. Über eine Relayoptik 61 kann die mittels des Scannerspiegels 41 zur Bildabtastung mit der Modulationsfrequenz ω_S bewegte Scanlinie 45 in die Bildebene mit der Kamera 67 abgebildet und kann dort farblich separat ausgewertet werden. Es sind alternativ - bei Verwendung eines gewöhnlichen Strahlteilers (nicht gezeichnet) nach dem Achrogate 3 - auch separate Spektralfilter 64 in jeweils separaten Spektralkanälen mit Relayoptik 61, Strahlverschiebungs-Kompensator 62, Konfokalschlitzblende 63, Detektionsoptik 65 und Kamera 67 einsetzbar, um zwei verschiedene Spektralbilder simultan zu erhalten, oder anstelle der Spektralfilter 64 unterschiedlich spektralempfindliche Kameras 67 verwendbar. In jedem dieser Spektralkanäle sind anpassbare spektrale Bildaufnahmen schmal- oder breitbandig realisierbar. Nachteilig an dieser Verfahrensweise ist die Schwächung der Lichtausbeute der von der Probe 5 kommenden Sekundärstrahlung durch die (konventionelle) Strahlteilung.
4 zeigt eine Gegenüberstellung eines Beleuchtungslinienprofils eines herkömmlichen Scanning-Mikroskops 1 ohne Homogenisierung (durchgezogene Linie) oder mit Homogenisierung (gestrichelte Linie) gemäß der insbesondere nach 1 und 2 aufgezeigten Variante des Achrogates 3.
Wie nach dem Prinzip eines Laser-Scanning-Mikroskops 11 üblich, wird durch eine Lichtquelle 21 im Beleuchtungsstrahlengang 2 ein mindestens teilkohärenter Beleuchtungsstrahl generiert, der in diesem Beispiel durch das Einkoppeln einer Laserlinie 211 mittels des in den Mikroskopstrahlengang 4 als ein transversal ausgedehntes Beleuchtungsbündel 26 gebildet ist. Die Laserlinie 211 sorgt bei der Scanbewegung des Scannerspiegels 41 um eine quer zum in x-Richtung orientierten Lichtstreifen 24 (Lichtspalt) ausgerichtete Scanachse des Scannerspiegels 41 für eine in x-Richtung bewegte Scanbewegung im Beleuchtungsfeld 28 und erzeugt innerhalb eines definierten Probenbereichs 51 der Probe 5 eine flächige Anregung, die innerhalb der Probe 5, die mit der Objektebene 441 des Mikroskopobjektivs 44 übereinstimmt, liegt.
In dem räumlichen Bereich der Modulationsperiode des Achrogates 3 muss mindestens der Lichtstreifen 24 in der Pupille einmal hin- und herbewegt werden, bevor der nächste Zeilenvorschub durch den Scannerspiegel 41 orthogonal dazu erfolgen kann. Die Homogenisierung des Beleuchtungs-Lichtstreifens 24 kann in einfacher Weise bewirkt werden, indem das Achrogate 3 um eine innerhalb des reflektierenden Bereichs 31 liegende Rotationsachse, die parallel zur Längsausdehnung des reflektierenden Lichtstreifens 24 ausgerichtet ist, periodisch hin und her bewegt wird (2). Es ist zu beachten, dass die Homogenisierungsbewegung den Strahlverlauf im Mikroskopstrahlengang 4 und im Detektionsstrahlengang 6 nicht beeinflusst; Homogenisierungsbewegung und Scan-Bewegung zur Erzeugung des Abbildes des Probenbereichs 51 sollten deshalb orthogonal zueinander stehen. Insofern ist die in 1 stilisierte Kennzeichnung der Rotationsrichtungen von Achrogate-Schwingung und Scanbewegung nur symbolisch dargestellt.
Die Objektebene 441, in der das Beleuchtungsfeld 28 die Probe 5 mit Beleuchtungslicht der Lichtquelle 21 anregt, wird über das Mikroskopobjektiv 44, die Tubuslinse 43, das Scanobjektiv 42 und den Scannerspiegel 41 entlang der optischen Achse 7 durch den transparenten Bereich 32 des Achrogate 3 hindurch in den Detektionsstrahlengang 6 übertragen. Infolge der Scanbewegung des Scannerspiegels 41 in y-Richtung wird die in dem (bewegten) Beleuchtungsfeld 28 erzeugte Sekundärstrahlung zeilenweise sukzessiv über die Relayoptik 61, den Strahlverschiebungs-Kompensator 62, die Konfokalschlitzblende 63 und das Detektionsobjektiv 65 auf die Kamera 67 als Abbild der in die Probe 5 fokussierten Objektebene 441 erzeugt. Die in einer Zwischenbildebene angeordnete Konfokalschlitzblende 63 ist orthogonal zur Position der vom Scannerspiegel 41 abgetasteten Scanlinie 45 ausgerichtet und lässt von der im Probenbereich 51 erzeugten Sekundärstrahlung ausschließlich konfokale Lichtanteile aus der in z-Richtung in der Tiefe der Probe 5 gewählten Objektebene 441 passieren, sodass die Konfokalschlitzblende 63 als konfokale Aperturblende des Laser-Scanning-Mikroskops 11 für in der Probe 5 angeregte Florophore ein Sectioning in Abhängigkeit von der Lage der Objektebene 441 ermöglicht.
In einem weiteren Beispiel gemäß 5 ist das Mikroskop 1 als Weitfeldmikroskop 12 ausgebildet. Das durch die Lichtquelle 21 spektral festgelegte Beleuchtungslicht wird im Beleuchtungsstrahlengang 2 nach der Aufweitung durch das Kollimationsobjektiv 22, einen Umlenkspiegel und eine sphärische Optik 27 in einen Lichtfleck 29 auf einen in diesem Beispiel „punktförmigen“ reflektierenden Bereich 31 des Achrogates 3 fokussiert. Das Achrogate 3 kann, wie im vorherigen Beispiel, aus einer planparallelen transparenten Trägerplatte 33 und dem darauf aufgebrachten reflektierenden Bereich 31 bestehen, in diesem Fall „punktförmig“, d.h. kreisförmig ist, oder als ein Rahmen, in dem ein kreisrundes metallisches Plättchen durch Spannfäden bzw. dünne Speichen (nicht gezeichnet) gehalten wird, ausgebildet sein. Unter Verwendung des „punktförmigen“ reflektierenden Bereichs 31 des Achrogates 3, angeordnet in einer Systempupille des Weitfeldmikroskops 12, erfolgt die Vereinigung des Beleuchtungsstrahlenganges 2 mit dem Mikroskopstrahlengang 4 sowie die Auskopplung des Detektionsstrahlengangs 6 zur Detektion der in der Probe 5 generierten Sekundärstrahlung. Das Beugungsmuster des im Wesentlichen nur 2D-ausgedehnten Beleuchtungsflecks 29 ist i.a. rotationssymmetrisch und weist ebenfalls periodische Strukturen auf.
Die Homogenisierung des reflektierten Beleuchtungsbündels 26 erfolgt auch hier durch eine Schwingungsbewegung mit der oben genannten Modulationsfrequenz ω_H , die in diesem Fall, wenn der Spiegel 41 keine Scanbewegung ausführt, mindestens fünfmal größer als die Bildaufnahmefrequenz (1/Belichtungsdauer) zur Bildaufnahme mit der Kamera 67 ist, wobei die Schwingungsbewegung des Achrogates 3 in diesem Beispiel mindestens um eine erste Achse, vorzugsweise in x-Richtung gewählt und um einen Winkel α schwingend, und zusätzlich um eine dazu orthogonale zweite Achse (in y-Richtung und um einen Winkel β schwingend) ausgeführt wird, wie im vergrößerten Detailausschnitt von 6 schematisch gezeichnet. Für die Homogenisierung des Beleuchtungsmusters im reflektierten Beleuchtungsbündel 26 kann es sich als günstig erweisen, dass der reflektierende Bereich 31 des Achrogates 3 eine Art kreiselnde Bewegung ausführt, d.h. dass der Beleuchtungsfleck 29 mehrfach in einer definierten Richtung schnell verschwenkt wird und jeweils anschließend um die optische Achse 7 rotiert wird. Dabei sollten möglichst viele derartig gestaltete Modulationszyklen pro Integrationsintervall der Kamera 67 erfolgen. Dadurch entsteht eine „Verschmierung“ des Lichtflecks 29, d.h. eine Homogenisierung des auf das Achrogate 3 gerichteten Lichtmusters in ein zweidimensional homogenisiertes Beleuchtungsmuster des Beleuchtungsbündels 26 nach der Reflexion am reflektierenden Bereich 31 des Achrogates 3.
Die Geschwindigkeit der Homogenisierungsbewegung, charakterisiert durch die Modulationsfrequenz ω_H, soll wiederum deutlich höher sein als die Bildaufnahmefrequenz (1/Belichtungsdauer) der Kamera 67 zur Erzeugung des Bildes der Objektebene 441 in der Probe 5. Die Modulationsfrequenz ω_H sollte deutlich größer sein und wenigstens das Fünffache der Bildaufnahmefrequenz betragen ω_H ≥ ω_B. Solche Schwingungsbewegungen mit der Modulationsfrequenz ω_H können bevorzugt mit einem Resonanz-Scanner verwirklicht werden. Es sind aber auch schnelle elektrooptische Modulatoren geeignet, die eine schnell variierende lineare Phase in einer zum Achrogate 3 konjugierten Ebene erzeugen.
Die mikroskopische Bildaufnahme gemäß der schematischen Darstellung von 5 erfolgt in grundsätzlich sehr ähnlicher Weise, wie zu 1 beschrieben. Im Beleuchtungsstrahlengang 2 wird die von der Lichtquelle 21 bereitgestellte Laserstrahlung wiederum über ein Kollimationsobjektiv 22, einen Umlenkspiegel, soweit Platzeinsparung dies erforderlich macht, und eine sphärische Optik 27 in diesem Falle auf einen kleinen kreisförmigen reflektierenden Bereich 31 des Achrogates 3 auf einen Beleuchtungsfleck 29 fokussiert. Das Achrogate 3 lenkt die Laserstrahlung in den Mikroskopstrahlengang 4 im Wesentlichen entlang der optischen Achse 7 um, wobei die oben beschriebene Schwingungsbewegung des reflektierenden Bereichs 31 des Achrogates 3 in x- und y-Richtung für die Homogenisierung des Beleuchtungsmusters im reflektierten Beleuchtungsbündel 26 sorgt.
Das homogenisierte Beleuchtungsbündel 26 wird dann über den Spiegel 41 und im Mikroskopstrahlengang 4 über Scanobjektiv 42, Tubuslinse 43 und Mikroskopobjektiv 44 auf die Probe 5 gerichtet und erzeugt dort eine der gewünschten Sekundärstrahlungen in einem angeregten Probenbereich 51. Mit dem Mikroskopobjektiv 44 wird aus der eingestellten Objektebene 441 die gewünschte Sekundärstrahlung zweidimensional mit der Kamera 67 aufgenommen, indem diese über Tubuslinse 43, Scanobjektiv 42 und umgelenkt durch den Spiegel 41 durch den transparenten Bereich 32 des Achrogates 3 in den Detektionsstrahlengang 6 gerichtet wird. Durch den transparenten Bereich 32 des Achrogates 3 wird die Sekundärstrahlung - aufgrund fehlender Intensitätsteilung nahezu ohne Verluste - in den Detektionsstrahlengang 6 übertragen und mit der Kamera 67 pixelweise (gescannt) aufgenommen, wobei lediglich der „punktförmige“ reflektierende Bereich 31 des Achrogates 3 eine kleinflächige Störung verursacht.
Des Weiteren ist in 6 noch eine andere Variante des Achrogates 3 mit dem punktförmigen reflektierenden Bereich 31 gezeigt, bei der für den reflektierenden Bereich 31 ein Träger 33 vorhanden ist, der als fester Rahmen ausgebildet ist und in dem der reflektierende Bereich 31 durch dünne Speichen 34 gehalten wird, die auch als Spannfäden 34 oder Drähte ausgebildet sein können. Selbstverständlich kann der punktförmige reflektierende Bereich 31 des Achrogates 3 auch auf einer planparallelen transparenten Glasplatte als Träger 33 aufgetragen sein, wie es für den reflektierenden Streifen in 2 gezeigt ist. Diese Halterung des punktförmigen Bereichs 31 steht also in gleicher Weise für das Weitfeldmikroskop 12 zur Verfügung.
Die für Bildartefakte (z.B. Bildstreifen) verantwortlichen Beugungs- und Interferenzeffekte im Beleuchtungsmuster und daraus im Bereich der räumlichen Fehlstellen des reflektierenden Bereichs 31 des Achrogates 3 auftretende Störungen infolge fehlender Ortsfrequenzen werden durch die im Beleuchtungsmuster wechselnde Position (Homogenisierung durch Lichtmischung) kompensiert bzw. weitestgehend unterdrückt.
Diese Art der Achrogate-Beleuchtung kann günstig bei Mikroskopen für TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) und/oder SIM (Structured Illumination Microscopy) eingesetzt werden. Dabei ist es sinnvoll, dass man die Homogenisierungsbewegung durchführt, bevor die eigentliche TIRF- oder SIM-Beleuchtung ausgebildet wird.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskop
11: (konfokales) Laser-Scanning-Mikroskop
12: Weitfeldmikroskop
2: Beleuchtungsstrahlengang
21: Lichtquelle
211: Laserlinie
22: Kollimatorlinse
23: Zylinderlinse
24: Lichtstreifen
25: (schneller) Strahlshifter
251: parallele Achse (zum Lichtstreifen)
26: reflektierte Beleuchtungsbündel 2
27: Scannerspiegels
28: Beleuchtungsfeld
29: Lichtfleck
3: räumlich achromatischer Strahlteiler (kurz: Achrogate)
31: reflektierenden Bereich
311: Mittelachse (des streifenförmigen reflektierenden Bereichs 31)
32: transparenter Bereich
33: Trägerplatte
34: Speichen, Spannfäden
4: Mikroskopstrahlengang
41: (Scanner-) Spiegel
42: Scanobjektiv
43: Tubuslinse
44: Mikroskopobjektiv
441: Objektebene (des Mikroskopobjektiv)
45: Scanlinie
5: Probe
51: Probenbereich
6: Auswertungsstrahlengang
61: Relayoptik
62: Strahlverschiebungs-Kompensator
63: Konfokalschlitzblende
64: Spektralfilter
65: Detektionsobjektiv
66: Kompensationsplatte
67: Kamera (Detektionseinheit)
7: optische Achse
α: Winkel (der Verschwenkung des reflektierenden Bereichs 31 um x-Richtung)
β: Winkel (der Verschwenkung des reflektierenden Bereichs 31 um y-Richtung)
λ₁, λ₂: Wellenlängenbereich
ω_H: Modulationsfrequenz (der Homogenisierung)
ω_S: Modulationsfrequenz (des Scanners zur Bildaufnahme)
ω_B: Bildaufnahmefrequenz (1/Belichtungsdauer)
x, y, z: Koordinaten

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 10257237 B4 [0003]

Claims

Anordnung zur Einkopplung von Beleuchtungsstrahlung und Auskopplung von einer Probe zurückkommender Strahlung in der Mikroskopie, bei der die Beleuchtungsstrahlung in eine Pupillenebene eines Objektivs oder eine dazu konjugierte Ebene im Mikroskopstrahlengang (4) zwischen Probe (5) und einer Detektionseinheit (67) fokussiert ist und in dieser Pupillenebene ein Strahlteiler (3) mit räumlich achromatischer Strahlteilung vorhanden ist, wobei der Strahlteiler (3) einen kleinflächigen reflektierenden ersten Bereich (31) und einen großflächigen transparenten, zum reflektierenden ersten Bereich (31) komplementären zweiten Bereich (32) aufweist, sodass die Beleuchtungsstrahlung über den ersten Bereich (31) reflektierend von der Lichtquelle (21) zur Probe (5) einkoppelbar ist und die von der Probe (5) zurückkommende Strahlung durch den transparenten zweiten Bereich (32) des Strahlteilers (3) auf die Detektionseinheit (67) gerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, dass - der Strahlteiler (3) mit einem transparenten Träger (33) und mit einem reflektierenden kleinen ersten Bereich (31) ausgestattet ist, der symmetrisch zur optischen Achse (7) des Beleuchtungsstrahlengangs (2) und des Mikroskopstrahlengangs (4) zur Detektionseinheit (67) positioniert ist und - der Strahlteiler (3) mit Scanmitteln ausgestattet ist, die eine Schwingungsbewegung des transparenten Trägers (33) um wenigstens eine zur optischen Achse (7) orthogonale Achse gestattet.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reflektierende erste Bereich (31) des Strahlteilers (3) als schmaler Streifen ausgebildet und die Schwingungsbewegung um die Mittenachse parallel zu einer langen Kante des ersten Bereiches (31) ausführbar ist.
Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der schmale Streifen als Beschichtung auf einer transparenten Trägerplatte (33) aufgebracht ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reflektierende erste Bereich (31) des Strahlteilers (3) als schmaler, polierter metallischer Streifen in einem transparenten Trägerrahmen eingespannt ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reflektierende erste Bereich (31) des Strahlteilers (3) als kleine punktförmiger Kreisfläche ausgebildet und die Schwingungsbewegung um die Mitte der Kreisfläche in zwei orthogonalen Richtungen gegenüber der Flächennormale des transparenten Trägers (33) ausführbar ist.
Anordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die kleine punktähnliche Kreisfläche als Beschichtung auf einer transparenten Trägerplatte (33) aufgebracht ist.
Anordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die kleine punktähnliche Kreisfläche als metallisches poliertes Plättchen über Spannfäden oder Speichen in einem transparenten Rahmen eingespannt ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (3) zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um ein Mehrfaches größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme anregbar ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (3) zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um ein Mehrfaches größer als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit (67) zur Bildaufnahme anregbar ist.
Anordnung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (3) zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um mindestens das Fünffache größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme oder die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit (67) anregbar ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein schneller Strahlshifter (25), der unmittelbar vor dem Strahlteiler (3) im Beleuchtungsstrahlengang (2) angeordnet ist, zu einer Schwingungsbewegung um eine zu einer Mittelachse des reflektierenden Bereichs (31) parallele Achse (251) anregbar ist und der Strahlteiler (3) fixiert ist.
Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der schnelle Strahlshifter (25) zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um ein Mehrfaches größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme oder als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit (67) anregbar ist.
Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der schnelle Strahlshifter (25) zu einer Schwingungsbewegung mit einer Modulationsfrequenz ω_H um mindestens das Fünffache größer als die Modulationsfrequenz ω_S der Scanbewegung zur Bildaufnahme oder als die Bildaufnahmefrequenz ω_B der Detektionseinheit (67) anregbar ist.