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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von Misteln und die Verwendung eines die Folat-Biosynthese inhibierenden Wirkstoffs zur Bekämpfung von Misteln, insbesondere der Zwergmistel (Arceuthobium spp.).
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Pflanzen, einschließlich parasitärer Pflanzen, produzieren neben Primärmetaboliten wie Kohlenhydraten, Aminosäuren und Nukleinsäuren eine Vielzahl sogenannter sekundärer Pflanzenmetabolite in zahlreichen Stoffwechselwegen. Bei Parasiten sind manche dieser Stoffwechselwege nur teilweise oder gar nicht vorhanden. Die für ihn notwendigen Metabolite und weitere Nährstoffe, wie Mineralien und Wasser, bezieht der Parasit vom Wirt. Langfristig führt dieser kontinuierliche Nährstoff- und Metabolitabzug durch den Parasiten zur Schwächung des Wirtsorganismus. Bei Wirtsbäumen lässt sich eine Verdünnung der Baumkrone und erhöhte Anfälligkeit für weitere Schädlinge, wie beispielsweise den Borkenkäfer feststellen. Im Extremfall führt dies letztendlich zum Absterben des Wirts.
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Zwergmisteln (Arceuthobium spp.) sind in Mittel- und Nordamerika, Europa, Asien und Nordafrika weit verbreitet. Im Norden der USA und in Kanada stellen Zwergmisteln eines der bedeutendsten forstwirtschaftlichen Probleme dar. Der epiphytisch wachsende diözische Parasit befällt vor allem Nadelhölzer. Im Westen der USA führen Zwergmistelinfektionen zu einem jährlichen Verlust von 11,3 Mio m3 Holz, in West-Kanada zu einem jährlichen Verlust von 3,8 Mio m3 Holz. Der Verlust des Volumenzuwachses kann besonders bei Infektionen von jungen Beständen enorm sein und über 80 % ausmachen.
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Charakteristisch für die Zwergmistel ist ihr langer Lebenszyklus, der im Regelfall zwischen fünf und acht Jahren dauert. Im ersten Jahr keimen die Samen, die überwintert haben, und dringen in das Gefäßsystem der sprießenden Zweige ihres Wirts ein. Im zweiten Jahr führt dies zu einem Anschwellen des befallenen Zweigs und zu einem buschigen Wachstum. Erst im dritten Jahr sind erste Lufttriebe der Mistel auf den buschigen Ästen sichtbar. Im Alter von 4 Jahren blüht die Zwergmistel erstmals und bildet im Folgejahr reife Früchte aus. Die reifen Samen können mit Geschwindigkeiten von bis zu 97 km/h und einer maximalen Wurfweite von 18 m ausgeworfen werden.
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Bislang gibt es keine effiziente Möglichkeit, um die Zwergmistel langfristig und dauerhaft zu bekämpfen. Bisher bekannte Methoden schließen die sanitäre Ausdünnung, Beschneidung, kontrolliertes Abbrennen, Einrichten von Pufferzonen oder chemische Kontrolle ein.
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Die sanitäre Ausdünnung kann nur bei leicht infizierten vorkommerziellen Beständen angewendet werden. Ebenso kann die Beschneidung nur bei jungen und leicht infizierten Bäumen genutzt werden, aber auch nur dann, wenn es sich um einen Befall von weniger als 50 % der Krone handelt. Oftmals entwickeln solche Bäume eine erneute Infektion durch die Zwergmistel, da nicht alle Mistelteile und/oder Keimlinge entdeckt und entfernt werden können. Kontrolliertes Abbrennen kann die Ausbreitung der Zwergmistel zunächst eingrenzen. Scheint aber auch keinen nachhaltigen Erfolg zu haben.
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Um die Zwergmistel-Infektion örtlich zu begrenzen, werden sogenannte Pufferzonen aus Nicht-Wirtsbäumen oder vegetationsfreien Bereichen angelegt. Die Zwergmistel infiziert nur bestimmte Arten, sodass in einem Bereich von 10 bis 20 m um die infizierten Bäume andere Arten angesiedelt werden können, um eine Ausbreitung der Zwergmistel zu verhindern. Auch natürliche Barrieren wie Seen können als Pufferzonen genutzt werden.
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Alle diese Verfahren sind sehr arbeitsintensiv, langwierig, teilweise gefährlich und mit hohen Holzverlusten verbunden und daher auch kostenintensiv.
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US 6,579,830 beschreibt eine Methode, bei der eine physikalische Barriere auf die Mistel aufgebracht wird. Sie besteht aus einem viskosen Pflanzenöl, das durch Sprühen aufgetragen wird und eine deckende Schicht auf der Mistel für mehrere Monate bildet, um das Öffnen der Stomata und somit die Aufnahme von CO
2 und Wasser zu verhindern. Das führt schließlich zum Zusammenbruch des Metabolismus der Mistel. Dies ist aber nur möglich, wenn die Auftragung des Öls während der Phase des geringsten Wachstums des befallenen Baumes, also im Winter, erfolgt. Auch müssen die Blätter der Mistel bei der Applikation trocken sein, damit das Öl anhaften kann. Es sind also sehr spezielle wetterabhängige Behandlungsbedingungen notwendig.
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Eine weitere Möglichkeit besteht in der chemischen Kontrolle der Zwergmistel. So wurden die Hormonherbizide 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure gegen Zwergmistelbefall eingesetzt. Dies führt allerdings auch zur Schädigung des Wirtsbaumes.
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Um die Schädigung des Wirtsbaumes gering zu halten, schlägt
FR 2023267 vor, Hormonherbizide, wie die bereits genannten Derivate der Phenoxyessigsäure oder höheren Phenoxyalkancarbonsäuren, in Form von Bestäubungspräparaten mit Hilfe einer Schußwaffe lokal begrenzt zu applizieren. Laut
FR 2023267 eignet sich diese Behandlung für den Mistel-Befall auf Laubbäumen. Laubbäume werfen im Gegensatz zu Nadelbäumen im Winter ihre Belaubung ab. Eine gezielte Applikation mittels einer Schußwaffe scheint auf unbelaubten Bäumen möglich. Es ist leicht vorstellbar, dass bei unbelaubten Bäumen die genaue Stelle des Mistelbefalls von unten eindeutig identifizierbar und auch erreichbar ist. Ob dieses Vorgehen bei dicht stehenden und dauerhaft benadelten Nadelbäumen zum Erfolg führt, ist allerdings fraglich.
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In
US 2014/0357488 ist eine Zusammensetzung aus Ethephon und einem Fettsäureester beschrieben, die besonders gut auf dem Parasiten haftet und dadurch eine verlängerte Wirksamkeit zeigt. Ethephon kann als Ethylen-freisetzendes Agens die Wasser- und Zuckerzufuhr für den Parasiten unterbrechen. Es hat als Hormonwirkstoff auch Nebenwirkungen auf die Wirtspflanze. Ethephon ist kommerziell unter dem Namen „Florel“ (Bayer) erhältlich.
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In
US 2004/0172671 werden genetisch veränderte Pflanzen vorgeschlagen, die ein lytisches Toxin am Ort des parasitischen Befalls herstellen, um den Befall abzuwehren. Die Funktion des Toxins zur Abwehr von Orobanche-Infektionen wurde in transgenen Tomaten, Tabak und Kartoffeln erfolgreich getestet. Tomaten, Tabak und Kartoffeln sind allerdings einjährige Wirtspezies. Ob auf diese Art bei mehrjährigen transgenen Bäumen eine Resistenz gegen Zwergmistel erreicht werden kann, bliebt offen. Zudem sind Verfahren zur Herstellung transgener Bäume aufwendig und teuer. Transgene Pflanzen finden zudem zumindest in Europa in der Bevölkerung wenig Akzeptanz.
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Die genannten Patentanmeldungen offenbaren das Bekämpfen von Misteln auf Bäumen und Kulturpflanzen mit forstwirtschaftlichen, physikalischen, gentechnischen und chemischen Mitteln. Die Bekämpfung mit chemischen Mitteln hat den Vorteil, dass sie auf einfache wenig arbeitsintensive Weise auf großen Anbauflächen angewendet werden kann. Eine einfache arbeitskraft- und zeitsparende Anwendung ist vor allem in der Forstwirtschaft mit sehr großen zusammenhängenden Anbauflächen von besonderer Wichtigkeit. Die bekannten chemischen Bekämpfungsmittel basieren auf Phytohormonwirkstoffen und haben den Nachteil, dass sie nur kurzfristige und wenig spezifische Wirkung zeigen und somit auch die Wirtspflanze maßgeblich schädigen.
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Es besteht also weiterhin großer Bedarf an effizienten Mitteln für die Bekämpfung von Misteln, vor allem Zwergmisteln, aber auch anderen Misteln. Insbesondere besteht ein Bedarf an Mitteln und Verfahren zur Bekämpfung von Misteln auf Nadelbäumen.
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Um eine möglichst effiziente Bekämpfung der Mistel zu erreichen, ist ein gezielter Eingriff in die Stoffwechselwege der Mistel denkbar. Voraussetzung dafür ist die genaue Kenntnis der Stoffwechselprozesse der Mistel. Als Angriffspunkt eignen sich die Stoffwechselwege, die die Mistel vollständig oder zumindest teilweise selbst ausführt.
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Die Zahl natürlich vorkommender pflanzlicher Stoffwechselprodukte ist riesig. Nur ein geringer Bruchteil, nämlich ungefähr 200.000 der sekundären Pflanzenmetabolite sind bis heute überhaupt isoliert und beschrieben worden. Die chemische Zusammensetzung sekundärer Pflanzenmetabolite ist strukturell sehr vielfältig und deren Zweck oder Nutzen für den pflanzlichen Organismus ist oftmals noch vollständig ungeklärt. Die zugehörigen Stoffwechselwege in den Pflanzen sind häufig komplex und verzweigt und auch nicht immer vollständig bekannt.
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Zudem besitzen parasitäre Pflanzen aufgrund ihrer heterotrophen Lebensweise besondere Stoffwechselvorgänge, die autotrophe Pflanzen, wie z. B. ihre Wirtspflanzen, nicht aufweisen. Dies kann einen (teilweisen) Verlust mancher Stoffwechselmöglichkeiten oder auch eine Erweiterung der Stoffwechselvorgänge und die Bildung besonderer Enzyme und Metabolite umfassen (Kuijt and Hansen, 2014; The families and genera of vascular plants; Flowering Plants, Eudicots: Santalales, Balanophorales; volume XII, pp. 213).
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Bisher bekannt ist, dass Misteln, insbesondere Zwergmisteln, aber auch andere parasitäre Pflanzen, ihren Wasserbedarf fast vollständig über den Wirt decken aber auch einige der Mineralien und Kohlenhydrate von ihrem Wirt beziehen.
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Die Mistel, insbesondere die Zwergmistel, etabliert über ein weitverzweigtes wurzelähnliches Haustoriensystem eine enge Verbindung zum Gefäßsystem, dem Xylem, der Wirtspflanze. So können, außer den genannten Nährstoffen, noch zahlreiche weitere Metabolite aus dem Wirt abgezogen werden.
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Es ist bislang nicht gelungen, einen Angriffspunkt in einem der vielen Stoffwechselwege der Mistel zu finden, der für eine effiziente und nachhaltige Bekämpfung der Mistel, insbesondere der Zwergmistel geeignet wäre. Insbesondere ist es bisher nicht gelungen, einen Stoffwechselweg in der Mistel zu identifizieren, der eine selektive Bekämpfung der Mistel erlaubt und somit die Bekämpfung nur geringe bis keine Auswirkungen auf den Wirt hat.
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Die vorliegende Erfindung hat zur Aufgabe, eine effiziente Bekämpfungsmethode von Misteln, insbesondere Zwergmisteln, bereitzustellen. Weiterhin hat die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Mitteln zur Aufgabe, die zur spezifischen und effizienten Bekämpfung von oben genannten Misteln geeignet sind.
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Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Verwendung gelöst.
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In der vorliegenden Erfindung wurde mit Hilfe von aufwendigen und langwierigen Genexpressionsanalysen erstmals herausgefunden, dass bestimmte Enzyme des Folsäure-Stoffwechsels bei der Samenentwicklung bzw. -reifung der Mistel eine wichtige Rolle spielen. Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass die Mistel einige der Enzymgene des Folsäure-Stoffwechsels unmittelbar vor Ort, in situ, exprimiert. Insbesondere werden sechs von sieben Enzymgenen des Folsäure-Stoffwechsels während der Samenreifung erhöht exprimiert, was für deren besondere Bedeutung bei der Samenreifung spricht. Zwei der genannten Enzymgene, 7,8-Dihydro-neopterinaldolase und 5-Formyltetrahdrofolat-Cycloligase, zeigen eine mehr als zweifache Erhöhung der Expression (Tabelle 1).
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Daraus kann geschlossen werden, dass die Mistel Folsäure wider Erwarten nicht von ihrer Wirtspflanze beziehen kann, sondern diese mittels der entsprechenden Enzyme selbst synthetisiert. Somit ist die Folsäure-Biosynthese ein vielversprechender Angriffspunkt zur Bekämpfung der Mistel.
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Bisher wurde die chemische Behandlung basierend auf die Folat-Biosynthese inhibierenden Wirkstoffen (Antifolate) noch nicht gegen die Mistel genutzt. Ohne die in der vorliegenden Erfindung erlangten Erkenntnisse, dass die Mistel Folat selbst herstellt und nicht über den Wirt bezieht, musste ein solches Vorgehen auch als wenig vielversprechend angesehen werden.
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Wie die Erfinder der vorliegenden Anmeldung herausgefunden haben, kann eine Behandlung mit Wirkstoffen, die die genannten Enzyme inhibieren oder die Folsäure-Biosynthese auf andere Weise hemmen, zum Absterben der Embryonen der Mistel führen. Dadurch wird die Entwicklung reifer Samen verhindert. Eine Ausbreitung der Mistel kann somit effizient verhindert werden. Eine gleichzeitige Wirkung der Wirkstoffe auf die Samenentwicklung des Wirtsbaums kann gegebenenfalls nicht immer vollständig vermieden werden. Jedoch beeinträchtigt eine verminderte oder ausbleibende Samenbildung an einem behandelten Nadelbaum nicht dessen Fortbestehen als Holzlieferant innerhalb eines Forsts. Diese Nebenwirkungen auf die Wirtspflanze sind demnach akzeptabel.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein effizientes Verfahren zur Bekämpfung von Misteln, insbesondere der Zwergmistel bereit.
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Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Misteln umfassend die Inhibition des Folat-Biosynthesewegs der Mistel, und die Verwendung eines die Folat-Biosynthese inhibierenden Wirkstoffs zur Bekämpfung von Misteln.
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Bevorzugt stellt die Erfindung ein Verfahren zur chemischen Bekämpfung von Misteln bereit. Unter „chemischer Bekämpfung“ wird die Bekämpfung des Parasiten, also der Mistel, mit einem chemischen Wirkstoff verstanden, der einen toxischen Effekt auf den Parasiten ausübt. Insbesondere umfasst die erfindungsgemäße chemische Bekämpfung Wirkstoffe, die in die Folat-Biosynthese eingreifen. Die Bekämpfung von Misteln kann jedoch auch biotechnologisch erfolgen.
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Unter „biotechnologische Bekämpfung“ wird die Bekämpfung der Mistel mit biotechnologischen Mitteln verstanden. Solche Mittel schließen insbesondere Gene-Silencing-Mittel wie RNAi, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA und weitere ein, wie z. B. in
WO 2004/029212 und
WO 2013/184768 beschrieben.
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Die Begriffe „Bekämpfung“ und „Kontrolle“ werden synonym verstanden. Die Begriffe „parasitär“ und „Parasit“ im Sinne der vorliegenden Anmeldung bezeichnen holoparasitäre und hemiparasitäre Lebensformen. Die Begriffe „Folsäure“ und „Folat“ werden synonym verstanden.
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Bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung die Bekämpfung von hemiparasitären Pflanzen, inbesondere die Bekämpfung von Misteln aus den Familien der Loranthaceae, Misodendraceae und Viscaceae.
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Ganz besonders betrifft die vorliegenden Erfindung die Bekämpfung von Zwergmisteln der Gattung Arceuthobium spp.. Diese schließen insbesondere die folgenden Arten ein: Arceuthobium juniperi-procerae, Arceuthobium oxycedri, Arceuthobium tibetense, Arceuthobium chinense, Arceuthobium minutissimum, Arceuthobium sicuanense, Arceuthobium pini, Arceuthobium azoricum Arceuthobium abietis-religiosae, Arceuthobium americanum, Arceuthobium verticilliflorum, Arceuthobium guatemalense, Arceuthobium pendens, Arceuthobium globosum, Arceuthobium globosum subsp. grandicaule, Arceuthobium aureum subsp. aureum, Arceuthobium aureum subsp. Petersonii, Arceuthobium bicarinatum, Arceuthobium pusillum, Arceuthobium gillii, Arceuthobium nigrum, Arceuthobium rubrum, Arceuthobium oaxacanum, Arceuthobium yecorense, Arceuthobium hondurense, Arceuthobium hawksworthii, Arceuthobium strictum, Arceuthobium vaginatum, Arceuthobium vaginatum subsp. Cryptopodum, Arceuthobium durangense, Arceuthobium divaricatum, Arceuthobium douglasii, Arceuthobium blumeri, Arceuthobium campylopodum, Arceuthobium abietinum, Arceuthobium apachecum, Arceuthobium californicum, Arceuthobium cyanocarpum, Arceuthobium laricis, Arceuthobium littorum, Arceuthobium microcarpum, Arceuthobium monticola, Arceuthobium occidentale, Arceuthobium siskiyouense.
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Die vorliegende Erfindung betrifft besonders bevorzugt die Bekämpfung von Arceuthobium Arten ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Arceuthobium americanum, Arceuthobium verticilliflorum, Arceuthobium abietis-religiosae, Arceuthobium pusillum, Arceuthobium bicarinatum, Arceuthobium oxycedri, Arceuthobium siskiyouense, Arceuthobium campylopodum, Arceuthobium minutissimum.
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Zwergmisteln befallen insbesondere Kieferngewächse, Pinaceae, und Zypressengewächse, Cupressaceae. Am meisten bevorzugt ist die Bekämpfung von Arceuthobium americanum, einem Parasiten der Drehkiefer, Pinus contorta, und der Bank-Kiefer, Pinus banksiana, und die Bekämpfung von Arceuthobium pusillum, einem Parasiten verschiedender Lärchen-, Fichten-, Tannen und Kiefernarten, einschliesslich Abies balsamea, Larix laricina, Picea abies, Picea glauca, Picea mariana, Picea pungens, Picea rubens, Pinus banksiana, Pinus resinosa, Pinus strobus, sowie die Bekämpfung von Arceuthobium campylopodum, einem Parasiten der Gelb-Kiefer, Pinus ponderosa; Arceuthobium oxycedri, einem Parasiten des Griechischen Wacholders, Juniperus excelsa; Arceuthobium siskiyouense, einem Parasiten der Höcker-Kiefer, Pinus attenuata, und der Jeffrey-Kiefer, Pinus jeffreyi; und Arceuthobium minutissimum, einem Parasiten der Tränen-Kiefer, Pinus wallichiana.
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Das vorliegende Verfahren betrifft bevorzugt die Bekämpfung des Parasiten auf seinem Wirt. Mehr bevorzugt betrifft das vorliegende Verfahren die Bekämpfung von Misteln auf ihren Wirtsbäumen, insbesondere auf Nadelbäumen. Noch weiter bevorzugt bezieht sich das vorliegende Verfahren auf die Bekämpfung von Misteln auf Kiefern- und Zypressengehölzern. Am meisten bevorzugt ist ein Verfahren zur Bekämpfung der Zwergmisteln Arceuthobium americanum und Arceuthobium pusillum auf ihren jeweiligen Wirtsbäumen.
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Die forstwirtschaftlichen Schäden durch die genannten Zwergmistelarten in Kanada und Nordamerika sind enorm. Durch den kontinuierlichen Entzug von Zuckern und Wasser aus dem Gefäßsystem des Wirtsbaums wird dieser geschwächt und ist somit anfälliger für den Befall von weiteren Baumschädlingen wie Pilzen oder Insekten, beispielsweise Borkenkäfern. Eine spezifische Bekämpfung von Arceuthobium spp. auf ihren jeweiligen Wirtsbäumen kann somit vorteilhafterweise zu einer Verbesserung der Waldgesundheit und des Holzertrags sowie der Holzqualität beitragen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiterhin bevorzugt das Applizieren mindestens eines die Folat-Biosynthese inhibierenden Wirkstoffs auf den Parasiten. Misteln müssen, wie die untenstehende Genexpressionsanalyse zeigt, ihren Folsäurebedarf durch eigenständige Biosynthese decken. Im Gegensatz zu vielen anderen Stoffwechselprodukten, kann die Mistel Folsäure nicht vom Wirt beziehen. Daher bietet ein Eingriff in den Folsäurestoffwechsel der Misteleine gute Angriffsmöglichkeit, um die Mistel möglichst selektiv zu schädigen.
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Mit einem „die Folat-Biosynthese inhibierenden Wirkstoff“ sind alle Substanzen gemeint, die in irgendeiner Weise direkt oder indirekt in den Folat-Stoffwechsel oder den Stoffwechsel von Folat-Vorläufern wie Tetrahydrofolat (THF) eingreifen und so die Entstehung von Folat in der Mistel negativ beeinflussen. Dem Fachmann ist eine sehr große Anzahl solcher Wirkstoffe bekannt.
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Besonders geeignete Wirkstoffe sind Inhibitoren der Enzyme des Folat-Stoffwechsels und des THF-Stoffwechsels. Solche Inhibitoren umfassen beispielsweise Inhibitoren der 5-Formyltetrahydrofolat-Cycloligase, der 7,8-Dihydroneopterin-Aldolase/Epimerase, der Thymidilat-Synthase, der Dihydrofolat-Reduktase, der Dihydroneopterin-Aldolase, der Folylpolyglutamat-Synthase, der Dihydropteroat-Synthase, der 4-Amino-4-Deoxychorismat-Lyase, der Amino-Deoxychorismat-Synthase, der Glutaminamidotransferase/Aminodeoxychorismat-Synthase oder der Gamma-Glutamyl-Hydrolase oder Kombinationen daraus sowie Mischungen davon. Besonders bevorzugt sind Inhibitoren der 5-Formyltetrahydrofolat-Cycloligase, der Glutaminamidotransferase/Aminodeoxychorismate-Synthase und der 7,8-Dihydroneopterin-Aldolase/Epimerase. Dem Fachmann sind derartige Wirkstoffe bekannt.
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Besonders geeignete Wirkstoffe werden bereits in der Humanmedizin verwendet und gehören zu den Klassen der Antibiotika, Antiprotozoa, Antineoplastika, Immunsuppressiva, Gentherapeutika und Antimalaria-Wirkstoffe.
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Weiterhin besonders geeignet sind Wirkstoffe ausgewählt aus Carbamat-Verbindungen, Quinazolon-Verbindungen, Pteridin- und Pterin Analoga, Diaminopyridine, Sulfonamiden und Mischungen daraus. Davon besonders bevorzugt sind Wirkstoffe ausgewählt aus Raltitrexed, Pralatrexat, Pyrimethamin, Trimethoprim, Iclaprim, Rubreserin, Methotrexat, Pemetrexed, Aminopterin, 2,4-Diaminopyrimidin und Kombinationen davon.
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Zudem kann es sich bei einem geeigneten Wirkstoff um einen biotechnologischen Wirkstoff handeln. Dieser kann beispielsweise ein Gene-Silencing-Mittel sein, das Transkripte der oben genannten Enzyme des Folat-Stoffwechsels und des THF-Stoffwechsels zum Ziel hat und abbaut. Der gezielte Transkriptabbau führt dann zum Verlust des Enzyms und somit zur Inhibition des Folat-Stoffwechsels. Solche Mittel sind bekannt und umfassen beispielsweise Nukleinsäure-basierte Mittel der RNAi, dsRNA, siRNA, miRNA, und shRNA-Technologien und weitere, wie z. B. in
WO 2004/029212 und
WO 2013/184768 beschrieben.
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Der Wirkstoff liegt bevorzugt in einer agronomisch verträglichen Form vor.
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Der Wirkstoff kann bevorzugt verkapselt beispielsweise in einer Mikrokapsel vorliegen. Agronomisch geeignete Mikrokapseln sind beispielsweise aus
WO 99/11122 ,
WO 2004/054362 ,
WO 2010/093970 und der Veröffentlichung „Microencapsulation of pesticides by interfacial polymerization utilizing isocyanate or aminoplast chemistry“, Pesticide Science 1998, 54 (4), S. 394-400, seit langem bekannt. Die Verkapselung verringert die Toxizität für den Menschen, erhöht also die Sicherheit des Wirkstoffs für den Forstwirt, insbesondere bei der Applikation. Die Kapsel oder Mikrokapsel löst sich erst nach dem Applizieren langsam auf und setzt den Wirkstoff frei. Somit wird auch die Aktivität des Wirkstoffs verlängert.
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Weiterhin bevorzugt kann der Wirkstoff in einer für die Wirtspflanze nicht giftigen, inaktiven Form vorliegen. Die inaktive Form wird durch ein Enzym des Parasiten beispielsweise bei der Aufnahme in den Parasiten oder bei Kontakt mit dem Parasiten aktiviert. Bevorzugt wird die inaktive Form durch ein Enzym aktiviert, das der Parasit sekretiert oder bildet und das der Wirt nicht sekretiert oder bildet. Mehr bevorzugt wird die inaktive Form durch eine sekretierte Pektinmethylesterase des Parasiten aktiviert.
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Bevorzugt wird der Wirkstoff zusammen mit einem agronomisch verträglichen Träger oder Formulierungshilfsmittel in einer Formulierung appliziert.
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Unter einem „agronomisch verträglichen Träger“ oder „Formulierungshilfsmittel“ wird jede Substanz verstanden, die verwendet werden kann, um den Wirkstoff aufzulösen, zu dispergieren oder zu diffundieren, ohne dass die Wirkung des Wirkstoffs beeinträchtigt wird und ohne dass die Substanz selbst einen wesentlichen schädigenden Effekt auf den Boden, die landwirtschaftliche Ausrüstung, die Nutzpflanzen oder die agronomische Umwelt hat.
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Die genannten Träger oder Formulierungshilfsmittel umfassen beispielsweise Inertmaterialien, Tenside, Lösungsmittel, Benetzungsmittel, Verteilungsmittel, Dispergiermittel, Klebstoffe, Bindemittel, Streckmittel und weitere Zusatzstoffe.
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Besonders geeignete Formulierungshilfsmittel umfassen mineralische Substanzen wie Kaolinit, Bentonit, Pyrophillite, Talkum, Kieselerde, Silicagel, Kalziumkarbonat, pflanzliche Substanzen wie Stärke, Gummi arabicum, und organische Lösungsmittel wie Alkohol, Benzol, Ketone, Kerosin, Toluol, Xylol, Cyclohexan, Methylnaphthalen, Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Maisöl, o-Chlorobenzol, Isophoron und Wasser.
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Der Wirkstoff kann auf verschiedene Art formuliert werden, je nachdem welche biologischen, chemischen und/oder physikalischen Parameter vorgegeben sind. Als allgemeine Formulierungsmöglichkeiten kommen beispielsweise in Frage: Spritzpulver, wasserlösliche Konzentrate, emulgierbare Konzentrate, wässrige Lösungen, Emulsionen wie Öl-in-Wasser- und Wasser-in-Öl-Emulsionen, versprühbare Lösungen, Aerosole oder Emulsionen, Suspensionskonzentrate, Dispersionen auf Öl- oder Wasserbasis, Suspoemulsionen, Stäubemittel, Beizmittel, wasserdispergierbare Pulver oder Granulate, ULV-Formulierungen, Mikrokapseln oder Wachse. Diese einzelnen Formulierungstypen sind bekannt und werden vom Fachmann in Ansehung des Wirkstoffs und der geplanten Applikation ausgewählt.
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Auf der Basis von Formulierungen lassen sich auch Kombinationen mit anderen agrochemischen Wirkstoffen, wie anderen Herbiziden, Fungiziden, Insektiziden, sowie Safenern, Düngemitteln und/oder Wachstumsregulatoren herstellen, z.B. in Form einer Fertigformulierung oder als Tankmix.
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Spritzpulver (benetzbare Pulver) sind in Wasser gleichmäßig dispergierbare Präparate, die neben dem Wirkstoff außer einem Verdünnungs- oder Inertstoff noch Tenside ionischer oder nichtionischer Art (Netzmittel, Dispergiermittel), z.B. polyoxethylierte Alkylphenole, polyethoxylierte Fettalkohole oder -Fettamine, Alkansulfonate oder Alkylbenzolsulfonate, ligninsulfonsaures Natrium, 2,2'-dinaphthylmethan-6,6'-disulfonsaures Natrium, dibutylnaphthalin-sulfonsaures Natrium oder auch oleoylmethyltaurinsaures Natrium enthalten.
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Emulgierbare Konzentrate werden durch Auflösen des Wirkstoffs in einem organischen Lösungsmittel, z.B. Butanol, Cyclohexanon, Dimethylformamid, Xylol oder auch höhersiedenden Aromaten oder Kohlenwasserstoffe unter Zusatz von einem oder mehreren ionischen oder nichtionischen Tensiden (Emulgatoren) hergestellt. Als Emulgatoren können beispielsweise verwendet werden: alkylarylsulfonsaure Calcium-Salze wie Ca-Dodecylbenzolsulfonat oder nichtionische Emulgatoren wie Fettsäurepolyglykolester, Alkylarylpolyglykolether, Fettalkoholpolyglykolether, Propylenoxid-Ethylenoxid-Kondensationsprodukte, Alkylpolyether, Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester oder Polyoxethylensorbitester.
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Stäubemittel erhält man durch Vermahlen des Wirkstoffs mit fein verteilten festen Stoffen, z.B. Talkum, natürlichen Tonen, wie Kaolin, Bentonit und Pyrophyllit, oder Diatomeenerde.
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Suspensionskonzentrate können auf Wasser- oder Ölbasis sein. Sie können beispielsweise durch Nassvermahlung mittels handelsüblicher Perlmühlen und gegebenenfalls Zusatz von weiteren Tensiden, wie sie z.B. oben bei den anderen Formulierungstypen bereits aufgeführt sind, hergestellt werden.
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Emulsionen, z.B. Öl-in-Wasser-Emulsionen, lassen sich beispielsweise mittels Rührern, Kolloidmühlen und/oder statischen Mischern unter Verwendung von wässrigen organischen Lösungsmitteln und gegebenenfalls von weiteren Tensiden, wie sie z.B. oben bei den anderen Formulierungstypen bereits aufgeführt sind, herstellen.
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Granulate können beispielsweise durch Verdüsen des Wirkstoffs auf adsorptionsfähiges, granuliertes Inertmaterial hergestellt werden oder durch Aufbringen von Wirkstoffkonzentraten mittels Klebemitteln, z.B. Polyvinylalkohol, polyacrylsaurem Natrium oder auch Mineralölen, auf die Oberfläche von Trägerstoffen wie Sand, Kaolinite oder von granuliertem Inertmaterial. Wasserdispergierbare Granulate werden in der Regel nach den üblichen Verfahren wie Sprühtrocknung, Wirbelbett-Granulierung, Teller-Granulierung, Mischung mit Hochgeschwindigkeitsmischern und Extrusion ohne festes Inertmaterial hergestellt.
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Die Formulierungen enthalten bevorzugt 0,1 bis 99 Gewichtsprozent, insbesondere 2 bis 95 Gew.-%, Wirkstoff, wobei je nach Formulierungsart folgende Konzentrationen üblich sind: In Spritzpulvern beträgt die Wirkstoffkonzentration z.B. etwa 10 bis 95 Gew.-%, der Rest zu 100 Gew.-% besteht aus weiteren Formulierungsbestandteilen. Bei emulgierbaren Konzentraten kann die Wirkstoffkonzentration z.B. 5 bis 80 Gew.-% betragen. Staubförmige Formulierungen enthalten meistens 5 bis 20 Gew.-% an Wirkstoff, versprühbare Lösungen etwa 0,2 bis 25 Gew.-% Wirkstoff. Bei Granulaten wie dispergierbaren Granulaten hängt der Wirkstoffgehalt zum Teil davon ab, ob die wirksame Verbindung flüssig oder fest vorliegt und welche Granulierhilfsmittel und Füllstoffe verwendet werden. In der Regel liegt der Gehalt bei den in Wasser dispergierbaren Granulaten zwischen 10 und 90 Gew.-%.
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Daneben enthalten die genannten Wirkstofformulierungen gegebenenfalls die jeweils üblichen Haft-, Netz-, Dispergier-, Emulgier-, Konservierungs-, Frostschutz- und Lösungsmittel, Füll-, Farb- und Trägerstoffe, Entschäumer, Verdunstungshemmer und Mittel, die den pH-Wert oder die Viskosität beeinflussen.
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Die Wirkung der erfindungsgemäßen Formulierung kann vorzugsweise. durch oberflächenaktive Substanzen verbessert werden, z.B durch Netzmittel aus der Reihe der Fettalkohol-Polyglykolether.
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Bevorzugt umfassen die Formulierungen von erfindungsgemäßen biotechnologischen Wirkstoffen dem Fachmann bekannte an den jeweiligen biotechnologischen Wirkstoff angepasste Formulierungen. Für dsRNA-Wirkstoffe besonders geeignete Formulierungen umfassen bevorzugt RNAse-freie wässrige Lösungen mit einer dsRNA-Wirkstoffkonzentration im ppm Bereich.
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Zur Applikation werden die in handelsüblicher Form vorliegenden Formulierungen gegebenenfalls in üblicher Weise verdünnt, z.B. bei Spritzpulvern, emulgierbaren Konzentraten, Dispersionen und wasserdispergierbaren Granulaten mittels Wasser. Staubförmige Zubereitungen, Streugranulate, sowie versprühbare Lösungen werden vor der Anwendung üblicherweise nicht mehr mit weiteren inerten Stoffen verdünnt.
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Der Wirkstoff wird auf die befallenen Wirtspflanzen ausgebracht. Eine Möglichkeit der Applikation des Wirkstoffs ist das Ausbringen in Form von Tankmischungen. Dabei wird die Formulierung im Tank bevorzugt mit Wasser gemischt und die erhaltene Spritzbrühe ausgebracht. Dies hat den Vorteil, dass der Wirkstoff flüssig vorliegt und somit versprüht werden kann. Dies erlaubt eine Behandlung von großen forstwirtschaftlichen Flächen in relativ kurzer Zeit.
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Bevorzugt findet das Applizieren in Form von Tankmischungen durch Besprühen der befallenen Wirtspflanzen aus der Luft statt. Dies kann beispielsweise durch Flugzeuge oder Drohnen geschehen.
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Das Applizieren aus der Luft ist vorteilhaft, da eine schnelle und gute Verteilung über eine große Fläche erreicht werden kann. Außerdem wachsen die Misteln im Regelfall auf Ästen des Wirtsbaums. Diese können je nach Alter des Baumes vom Boden aus schwierig erreichbar sind. Nachteilig an einer Applikation aus der Luft ist allerdings, dass durch das großflächige Besprühen auch nicht befallene Bäume behandelt werden. Dies kann die gesunden Bäume unnötig beeinträchtigen und erhöht zudem den Verbrauch des Wirkstoffs.
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Drohnen sind vorteilhaft, da sie z.B. über Kameras in der Lage sind, Mistelbefall zu erkennen. Somit kann eine gezielte Behandlung nur der befallenen Bäume erfolgen. Weiterhin haben Drohnen den Vorteil, dass sie unbemannt sind und keine Vorkehrungen zum Schutz des Piloten bei der Applikation getroffen werden müssen.
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Das Applizieren auf die Mistel-befallenen Bäume findet bevorzugt in den Frühlings- und Sommermonaten, von April bis September, also während der Blüte der Mistel und der darauffolgenden Samenentwicklung statt. Folat ist für die Samenentwicklung essentiell. Eine Inhibition der Folat-Biosynthese während der Samenentwicklung führt zur Unterversorgung des Embryos mit Folat und führt letztendlich zum Abbruch der Samenentwicklung und Embryolethalität. Dies verhindert die weitere Ausbreitung der Mistel. Die Wirtspflanze kann zwar auch in der Samenentwicklung beeinträchtigt werden, jedoch ist dies für den Fortbestand des einzelnen Baumes und des Forstes bedeutungslos.
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Der Wirkstoff wird bevorzugt in einer agronomisch wirksamen Konzentration appliziert. Bevorzugte Applikationsmengen des Wirkstoffs umfassen beispielsweise 0,01 bis 2000 g/ha, bevorzugt 0,5 bis 1000 g/ha.
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Für die Applikation von biotechnologischen Wirkstoffen stehen bevorzugt spezielle Methoden zur Verfügung. Methoden zur Applikation von Gene-Silencing-Wirkstoffen einschließlich dsRNA, sind beispielsweise aus
WO 2013/025670 bekannt. Dort wird das hormonvermittelte Eindringen einer dsRNA durch die Blattoberfläche in Pflanzenzellen offenbart.
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Die Applikation von biotechnologischen Wirkstoffen umfasst bevorzugt die Transformation der behandelten Mistelzellen. Es sind daher bevorzugt auch gängige Transformationsmethoden zur Einführung des Gene-Silencing-Wirkstoffs in die Mistel denkbar.
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Diese umfassen beispielsweise die Bakterien-vermittelte Transformation, Transformation mittels Partikel-Bombadierung, Kalziumphosphat-, Cyclodextrin-, Polyethylenglycol-, Nanopartikel-, Liposomen-, Polymer-, Virus-, oder Whisker- vermittelte Transformation, Elektroporation, Mikroinjektion, Ultraschall, Infiltration, und andere chemische, physikalische und/oder biologische Mechanismen, die zur Einbringung einer Nukleinsäure in eine Pflanzenzelle geeignet sind.
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Die Bakterien-vermittelte Transformation über Agrobakterien ist beispielsweise eine bekannte und vielfach verwendete Methode zur Pflanzentransformation. Diese kann bevorzugt bei der Applikation der genannten erfindungsgemäßen biotechnologischen Wirkstoffe zum Einsatz kommen.
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Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des oben beschriebenen Folat-Biosynthese-inhibierenden Wirkstoffs zur Bekämpfung von Misteln. Bevorzugt eignen sich die oben beschriebenen Wirkstoffe zur Verwendung der oben genannten Zwergmistelarten.
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Die erfindungsgemäße Verwendung schließt die Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein, insbesondere die Verwendung der oben genannten Wirkstoffformulierungen.
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Beispiel
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Probennahme
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Zur Identifikation von differentiell exprimierten Genen der Zwergmistel wurden zu zwei unterschiedlichen Entwicklungszeiträumen während der Samenentwicklung und -reifung Proben von A. americanum genommen. Die Probennahme erfolgte im Mai und im September. Es wurden Zwergmisteln beprobt und Samen geerntet.
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Statistische Auswertung
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Eine Visualisierung der Rohdaten zur Qualitätskontrolle wurde durchgeführt. Die Rohdaten wurden mittels RMA (Robust Multiarray Average) Algorithmus normalisiert. Als differentiell exprimiert werden Gene bezeichnet, die einen FDR (false discovery rate) korrigierten P-Wert von P kleiner als 0,05 aufweisen.
Tabelle 1: Differentielle Genexpression (DEG) während der Samenentwicklung und -reifung
| Locus Name | Expression im Sept (log2 Wert) | FDR korrigierter p -Wert | Genfunktion |
| AT1G10310 | 0,525 | 0,050 | NADPH-abhängige Pterin-Aldehvd-Reduktase |
| AT2G16370 | 0,615 | 0,022 | THY-1 // bifunktionale Dihydrofolat-Reduktate-Thymidilat-Synthase 1 |
| AT2G32040 | 0,776 | 0,025 | Das AT2G32040 Genprodukt vermittelt den Folat-Monoglutamat-Transport, der in der Tetrahydrofolat-Biosynthese eine Rolle spielt. Es ermöglicht auch den Transport von Antifolaten wie Methotrexat und Aminopterin. Das Gen wird in Chloroplasten und nicht-grünen Plastiden exprimiert. |
| AT3G10160 | -0,665 | 0,026 | DFC // Folylpolyglutamat-Synthase |
| AT3G11750 | 1,069 | 0,016 | Das Gen codiert für ein Enzym das als Aldolase oder Epimerase für 7,8-Dihydroneopterin and 7,8-Dihydromonapterin in vitro fungiert. Es wird vermutet, dass es in vivo für die Tetrahydrofolat-Biosynthese von Bedeutung ist. |
| AT5G13050 | 2,458 | 0,002 | 5-FCL, 5-Formyltetrahydrofolat-Cycloligase |
| AT5G57850 | 0,902 | 0,043 | ADCL codiert für ein Protein, das als 4-Amino-4-deoxychorismat-Lyase wirkt. Es katalysiert die 4-Aminobenzoat-Produktion, die für die Folat-Biosynthese wichtig ist. Das Enzym ist mit Chloroplasten assoziiert, was mittels Import assay und GFP-Lokalisationsexperimenten ermittelt wurde. |
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 6579830 [0009]
- FR 2023267 [0011]
- US 2014/0357488 [0012]
- US 2004/0172671 [0013]
- WO 2004/029212 [0031, 0044]
- WO 2013/184768 [0031, 0044]
- WO 9911122 [0046]
- WO 2004/054362 [0046]
- WO 2010/093970 [0046]
- WO 2013/025670 [0071]