DE102017011013A1 - Process for the production of biofunctional polymer particles - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln, umfassend die folgenden Schritte: (i) Herstellung einer Lösung, enthaltend mindestens ein Polymer, wobei es sich bei dem Polymer um ein Copolymer mit eingebauten Vernetzergruppen handelt, und mindestens ein Biomolekül; (ii) Eintragung der in Schritt (i) hergestellten Lösung in ein Trägerfluid unter gleichzeitiger Bildung räumlich getrennter Tröpfchen; (iii) Verfestigung der in Schritt (ii) erhaltenen Tröpfchen durch Aktivierung der Vernetzergruppen mittels eines Auslösers und darauf folgende Vernetzung der Copolymere unter Bindung der Biomoleküle.The present invention relates to a process for producing biofunctional polymer particles comprising the steps of: (i) preparing a solution containing at least one polymer, wherein the polymer is a copolymer having incorporated crosslinker groups, and at least one biomolecule; (ii) introducing the solution prepared in step (i) into a carrier fluid with simultaneous formation of spatially separated droplets; (Iii) solidification of the droplets obtained in step (ii) by activating the crosslinker groups by means of a trigger and subsequent crosslinking of the copolymers with binding of the biomolecules.
Description
Die spezifische Anreicherung biologisch relevanter Substanzen aus einer Probe, beispielsweise zur späteren Analyse, kann u.a. durch biofunktionalisierte Partikel erfolgen. Für die Herstellung solcher Partikel sind viele verschiedene Methoden bekannt.The specific accumulation of biologically relevant substances from a sample, for example, for later analysis, can i.a. done by biofunctionalized particles. Many different methods are known for the production of such particles.
Ein Problem bei bekannten Methoden ist jedoch, dass eine Biofunktionalisierung in einem oder mehreren Reaktionsschritten nach der eigentlichen Partikelherstellung erfolgen muss.A problem with known methods, however, is that biofunctionalization must take place in one or more reaction steps after the actual particle preparation.
Die Synthese von Janus Partikeln, die mittels Klick-Chemie biofunktionalisiert werden können, ist beispielsweise beschrieben in
Die Synthese von biofunktionalisierten Acrylat-PEG Partikeln ist beschrieben in
Wenn die Partikel erst nach ihrer eigentlichen Herstellung mit Biomolekülen funktionalisiert werden können, wie in den obigen Literaturstellen beschrieben, macht dies die Herstellung von Partikeln mit verschiedenartiger Biofunktionalität arbeits- und zeitintensiv. Zudem erschwert die Durchführung von mehreren Oberflächenreaktionen die Reproduzierbarkeit der Oberflächendichte der biofunktionellen Bindestellen. Eine schnelle, unkomplizierte, universelle und kostengünstige Herstellung solcher biofunktionaler Partikel ist wünschenswert.If the particles can only be functionalized with biomolecules after their actual preparation, as described in the above references, this makes the production of particles with different biofunctionality laborious and time-consuming. In addition, the performance of several surface reactions makes it difficult to reproduce the surface density of the biofunctional binding sites. A fast, straightforward, universal and inexpensive production of such biofunctional particles is desirable.
Eine Alternative zur nachträglichen Modifikation (Funktionalisierung) der Polymerpartikel mit Biomolekülen, wie in den obigen Literaturstellen beschrieben, ist die Modifikation von Biomolekülen vor der eigentlichen Partikelherstellung. So offenbart die
Bisher ist es unmöglich, biofunktionale Festphasen herzustellen, ohne die feste Phase nachträglich und/oder die funktionsbestimmenden Biomoleküle im Vorlauf der Reaktion zu modifizieren. Eine solche Partikelfunktionalisierung umfasst, wie oben gezeigt, mehrere zusätzliche Reaktionsschritte. Der Erfolg dieser Oberflächenreaktionen ist dabei zum Teil nicht einfach zu quantifizieren. Erschwerend kommt hinzu, dass typischerweise für jede einzelne Biofunktionalität ein spezifischer Reaktionsweg entwickelt werden muss. Dies bedeutet, dass für jede analytische Aufgabe neue Partikel entwickelt und hergestellt werden müssen. Zudem beruht die Herstellung der Polymerpartikel typischerweise auf Polymerisationsprozessen, was häufig aufgrund unvollständiger Reaktionen und eventuell benötigter Lösemittel Verunreinigungen mit sich bringt.So far, it is impossible to produce biofunctional solid phases without subsequently modifying the solid phase and / or the function-determining biomolecules in the course of the reaction. Such particle functionalization, as shown above, involves several additional reaction steps. The success of these surface reactions is sometimes not easy to quantify. To make matters worse, typically a specific reaction path has to be developed for each individual biofunctionality. This means that new particles have to be developed and produced for each analytical task. In addition, the production of the polymer particles is typically based on polymerization processes, which often causes impurities due to incomplete reactions and possibly required solvents.
Zur Überwindung dieser Probleme schlägt die vorliegende Erfindung nunmehr ein bequemes, einstufiges Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln vor, welches lediglich einen chemischen Reaktionsschritt umfasst, und verunreinigende Lösungsmittel oder sonstige Nebenprodukte vermeidet. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln umfasst dabei gemäß Anspruch 1 die folgenden Teilschritte:
- (i) Herstellung einer Lösung, enthaltend mindestens ein Polymer, wobei es sich bei dem Polymer um ein Copolymer mit eingebauten Vernetzergruppen handelt, und mindestens ein Biomolekül,
- (ii) Eintragung der in Schritt (i) hergestellten Lösung in ein Trägerfluid unter gleichzeitiger Bildung räumlich getrennter Tröpfchen,
- (iii) Verfestigung der in Schritt (ii) erhaltenen Tröpfchen durch Aktivierung der Vernetzergruppen mittels eines Auslösers und darauf folgende Vernetzung der Copolymere unter Bindung der Biomoleküle.
- (i) preparing a solution containing at least one polymer, wherein the polymer is a copolymer having built-in crosslinker groups, and at least one biomolecule,
- (ii) introducing the solution prepared in step (i) into a carrier fluid with simultaneous formation of spatially separated droplets,
- (Iii) solidification of the droplets obtained in step (ii) by activating the crosslinker groups by means of a trigger and subsequent crosslinking of the copolymers with binding of the biomolecules.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen definiert. Die Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.Preferred embodiments of the method according to the invention are defined in the subclaims. The invention will be described in detail below.
Bei „biofunktionalen Polymerpartikeln“ handelt es sich um Polymerpartikel, an die ein Biomolekül chemisch, insbesondere kovalent, gebunden ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den biofunktionalen Polymerpartikeln insbesondere um das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches nachfolgend im Detail beschrieben wird. Wenn also in dem erfindungsgemäßen Verfahren Copolymere zur Herstellung der biofunktionalen Polymerpartikel verwendet werden, so ist der Begriff „biofunktionalen Polymerpartikeln“ gleichbedeutend mit „biofunktionalen Copolymerpartikeln“."Biofunctional polymer particles" are polymer particles to which a biomolecule is bound chemically, in particular covalently. in the In the context of the present invention, the biofunctional polymer particles are, in particular, the product of the process according to the invention, which will be described in detail below. Thus, if copolymers are used in the process according to the invention for the preparation of the biofunctional polymer particles, the term "biofunctional polymer particles" is synonymous with "biofunctional copolymer particles".
Bei einem „Biomolekül“ im Sinne der hierin beschriebenen Erfindung handelt es sich um eine biologische relevante Substanz, also um eine Substanz, welche eine biologische Funktion in einem Organismus erfüllt.A "biomolecule" in the sense of the invention described herein is a biologically relevant substance, ie a substance which fulfills a biological function in an organism.
Insbesondere werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung „nicht-modifizierte Biomoleküle“ verwendet. Bei einem „nicht-modifizierten Biomolekül“ handelt es sich um ein Biomolekül, welches nicht in einer Weise chemisch verändert wurde, um Kupplungsfähigkeit in einer Polymerisierungsreaktion zu erreichen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere verwendeten Biomoleküle sind also nicht dahingehend modifiziert (funktionalisiert), dass sie sich als Monomer in einer Polymerisierungsreaktion eignen.In particular, "non-modified biomolecules" are used in the context of the present invention. An "unmodified biomolecule" is a biomolecule that has not been chemically altered in a manner to achieve coupling ability in a polymerization reaction. The biomolecules used in particular in the context of the process according to the invention are therefore not modified (functionalized) in such a way that they are suitable as monomer in a polymerization reaction.
Bei dem „Copolymer“ im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Polymer, das aus mindestens zwei (chemisch) verschiedenartigen Wiederholungseinheiten aufgebaut ist. Typischerweise enthält eine dieser Wiederholungseinheiten die Vernetzergruppe, welche demnach in das Copolymer im Zuge der Copolymerisierungsreaktion eingebaut wird.The "copolymer" in the context of the present invention is a polymer which is composed of at least two (chemically) different repeating units. Typically, one of these repeating units contains the crosslinker group, which is thus incorporated into the copolymer in the course of the copolymerization reaction.
Bei den „Vernetzergruppen“, die in dem Copolymer eingebaut sind, handelt es sich um eine mehrfach im Copolymer vorhandene Struktureinheit, welche durch einen (externen) Auslöser unter Bildung von reaktiven Zwischenstufen wie zum Beispiel Radikalen, Nitren- oder Carbengruppen aktiviert werden kann. Durch die Aktivierung der Vernetzergruppen wird eine Reaktion initiiert, die eine Insertion in C-H Bindungen, die sich in dem Copolymer als auch in den Biomolekülen befinden, ermöglicht. Die Insertionsreaktion kann in einem konzertierten oder nicht konzertierten Mechanismus erfolgen. Bei Radikalen erfolgt zunächst eine Wasserstoffabstraktion. Durch Rekombination erfolgt die Knüpfung kovalenter Bindungen, insbesondere zwischen benachbarten Polymerketten und benachbarten Biomolekülen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Vernetzergruppen um photoaktive Vernetzergruppen, welche durch Licht, insbesondere durch UV-Licht, unter Bildung reaktiver Zwischenstufen angeregt werden können. Die Vernetzergruppen sind typischerweise bereits in einer Wiederholungseinheit des Copolymers vorhanden und werden im Zuge der Herstellung des Copolymers, welche durch Polymerisierung von mindestens zwei verschiedenartigen Wiederholungseinheiten erfolgt, in das Copolymer eingebaut.The "crosslinker groups" incorporated in the copolymer are a multicomponent structural unit which can be activated by an (external) trigger to form reactive intermediates such as radicals, nitrene or carbene groups. Activation of the crosslinker groups initiates a reaction that allows insertion into C-H bonds located in the copolymer as well as in the biomolecules. The insertion reaction can take place in a concerted or non-concerted mechanism. Radicals are initially hydrogen abstraction. Recombination leads to the formation of covalent bonds, in particular between adjacent polymer chains and adjacent biomolecules. The crosslinker groups are preferably photoactive crosslinker groups which can be excited by light, in particular by UV light, to form reactive intermediates. The crosslinker groups are typically already present in one repeat unit of the copolymer and are incorporated into the copolymer in the course of the preparation of the copolymer, which is accomplished by polymerizing at least two different repeat units.
Die Aktivierung der Vernetzergruppen unter Radikalbildung erfolgt durch einen „Auslöser“. Bei dem Auslöser handelt es sich somit um ein (externes) Mittel zur Aktivierung der Vernetzergruppen, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu einer dreidimensionalen Vernetzung von Polymerketten und Biomolekülen führt. Vorzugsweise bildet sich dabei ein Hydrogelnetzwerk, in das jedes in der Lösung vorhandene Biomolekül während der Vernetzung kovalent eingebunden wird.The activation of the crosslinker groups under radical formation takes place by means of a "trigger". The trigger is thus an (external) means for activating the crosslinker groups, which leads to a three-dimensional crosslinking of polymer chains and biomolecules in the context of the method according to the invention. Preferably, a hydrogel network is formed in which each biomolecule present in the solution is covalently bound during crosslinking.
In Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung, enthaltend ein Copolymer mit eingebauten Vernetzergruppen und ein nicht-modifiziertes Biomolekül, hergestellt. Zur Herstellung dieser Lösung (kurz: „Copolymer/Biomolekül-Lösung“) können wässrige Lösungsmittel wie auch organische Lösungsmittel verwendet werden. Es funktionieren alle dem Fachmann bekannten Lösungsmittel, die das eingesetzte Copolymer und das Biomolekül lösen. Beispiele für Lösungsmittel, die zur Herstellung der Lösung aus Copolymer und nicht-modifiziertes Biomolekül verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Wasser, wässrige Pufferlösungen, Mischungen aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol, Isopropanol, Aceton, Essigsäure oder Ethylacetat. Voraussetzung für die Verwendung dieser Lösungsmittel ist natürlich, dass das Lösungsmittel die Aktivität der Biomoleküle nicht zerstört oder mindert. Vorzugsweise werden Copolymer und nicht-modifiziertes Biomolekül in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung gelöst.In step (i) of the process according to the invention, a solution containing a copolymer with incorporated crosslinker groups and a non-modified biomolecule is prepared. For the preparation of this solution (in short: "copolymer / biomolecule solution"), aqueous solvents as well as organic solvents can be used. All solvents known to those skilled in the art which dissolve the copolymer used and the biomolecule function. Examples of solvents that may be used to prepare the copolymer / unmodified biomolecule solution include, but are not limited to, water, aqueous buffer solutions, mixtures of water and a water-miscible organic solvent such as ethanol, isopropanol, acetone , Acetic acid or ethyl acetate. Of course, the prerequisite for the use of these solvents is that the solvent does not destroy or reduce the activity of the biomolecules. Preferably, copolymer and unmodified biomolecule are dissolved in step (i) of the method according to the invention in water or an aqueous buffer solution.
Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Copolymer umfasst eine Hauptwiederholungseinheit sowie mindestens eine weitere Wiederholungseinheit, welche mit der Vernetzergruppe funktionalisiert ist. Die Hauptwiederholungseinheit ist dabei die Wiederholungseinheit, welche prozentual am stärksten im Copolymer vertreten ist.The copolymer used in the process according to the invention comprises a main repeat unit and at least one further repeat unit which is functionalized with the crosslinker group. The main repeating unit is the repeating unit, which represents the percentage of the strongest in the copolymer.
Beispiele für Monomere, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Bildung der Hauptwiederholungseinheit in dem Copolymer verwendet werden können umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Hydroxyethyl methacrylat (HEMA), Hydroxyethoxyethylmethacrylat (HEEMA), Hydroxydiethoxyethylmethacrylat (HDEEMA), Methoxyethyl methacrylat (MEMA), Methoxyethoxyethylmethacrylat (MEEMA), Methoxydiethoxyethylmethacrylat (MDEEMA), Ethylene glycol dimethacrylat (EGDMA), Acrylsäure (AA), N-vinyl-2-pyrrolidon (NVP), N-isopropyl AAm (NIPAAm), Vinyl acetat (VAc), N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA), Ethylenglycol (EG), PEG acrylat (PEGA), PEG methacrylat (PEGMA), PEG diacrylat (PEGDA), PEG dimethacrylat (PEGDMA) (wobei PEG = Polyethylenglycol).Examples of monomers that can be used in the present invention to form the main repeating unit in the copolymer include, but are not limited to, hydroxyethyl methacrylate (HEMA), hydroxyethoxyethyl methacrylate (HEEMA), hydroxy diethoxyethyl methacrylate (HDEEMA), methoxyethyl methacrylate (MEMA), Methoxyethoxyethyl methacrylate (MEEMA), methoxy diethoxyethyl methacrylate (MDEEMA), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA), acrylic acid (AA), N-vinyl-2-pyrrolidone (NVP), N-isopropyl AAm (NIPAAm), vinyl acetate (VAc), N- ( 2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA), ethylene glycol (EG), PEG acrylate (PEGA), PEG methacrylate (PEGMA), PEG diacrylate (PEGDA), PEG dimethacrylate (PEGDMA) (where PEG = polyethylene glycol).
Wie oben bereits bemerkt, bildet sich im Rahmen des erfindunsggemäßen Verfahrens im Vernetzungsschritt (iii) vorzugsweise ein Hydrogelnetzwerk, in das die Biomoleküle eingebaut werden. Hydrogele werden aus Polymeren gebildet, die eine große Menge an Wasser absorbieren können oder mit Wasser ein wassergequollenes Polymernetzwerk bildet. Polymere, die mit Wasser ein Hydrogel bilden, sind zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet und bevorzugt. Beispiele für Polymere, die mit Wasser ein Hydrogel bilden, ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen: Polyethylenglycole (PEG), Polyacrylsäuren, Polydimethylacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyhydroxyethylmethacrylate, Polyvinylpyrrolidone, Alginate. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung leiten sich die entsprechenden Copolymere also von den (zum Teil formalen) Monomeren Ethylenglycol, Acrylsäure, Dimethylacrylamid, Vinylalkohol, Hydroxyethylmethacrylat, Vinylpyrrolidone, und α-L-Guluronsäure/β-D-Mannuronsäure zur Bildung der Hauptwiederholungseinheit des Copolymers ab.As already mentioned above, in the context of the process according to the invention, crosslinking step (iii) preferably forms a hydrogel network into which the biomolecules are incorporated. Hydrogels are formed from polymers that can absorb a large amount of water or form a water-swollen polymer network with water. Polymers which form a hydrogel with water are suitable and preferred for use in the present invention. Examples of polymers which form a hydrogel with water include but are not limited to: polyethylene glycols (PEG), polyacrylic acids, polydimethylacrylamides, polyvinyl alcohols, polyhydroxyethyl methacrylates, polyvinylpyrrolidones, alginates. In the context of the present invention, the corresponding copolymers are thus derived from the (partly formal) monomers ethylene glycol, acrylic acid, dimethylacrylamide, vinyl alcohol, hydroxyethyl methacrylate, vinylpyrrolidones, and α-L-guluronic acid / β-D-mannuronic acid to form the main repeating unit of the copolymer ,
Der Anteil der prozentual am stärksten im Copolymer vertretenden Wiederholungseinheit beträgt typischerweise 50-99 Mol-%, bezogen auf die Stoffmenge aller im Copolymers vorhandenen Wiederholungseinheiten, wobei ein Anteil von 60-98 Mol-% bevorzugt ist und ein Anteil von 70-95 Mol-% noch stärker bevorzugt ist.The proportion of the repeating unit representing the percentage in the copolymer is typically 50-99 mol%, based on the molar amount of all repeating units present in the copolymer, with a proportion of 60-98 mol% being preferred and a proportion of 70-95 mol%. % is even more preferred.
Bei den Vernetzergruppen des Copolymers handelt es sich beispielsweise um Benzophenon-Gruppen, Diazocarbonyl-Gruppen wie beispielsweise Diazoester-Gruppen und Antrachinon-Gruppen, sowie Azid-Gruppen, wobei Benzophenon-Gruppen im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Bei Anregung durch den Auslöser gemäß Schritt (iii) des erfindunsggemäßen Verfahrens reagieren die Benzophenon- und Antrachinon-Gruppen radikalisch, die Diazocarbonyl-Gruppen reagieren über Carbene, die Azide über Nitrene. Allen Vernetzergruppen gemein ist die Vernetzung über C,H-Insertionsreaktionen.The crosslinker groups of the copolymer are, for example, benzophenone groups, diazocarbonyl groups such as, for example, diazoester groups and anthraquinone groups, and azide groups, benzophenone groups being preferred in the context of the present invention. Upon excitation by the trigger according to step (iii) of the process according to the invention, the benzophenone and anthraquinone groups react radically, the diazocarbonyl groups react via carbenes, the azides via nitrenes. Common to all crosslinker groups is the crosslinking via C, H insertion reactions.
Die Vernetzergruppen werden im Zuge der Herstellung des Copolymers eingebaut, indem das Copolymer aus mindestens zwei verschiedenen Monomeren hergestellt wird, wobei mindestens ein Monomer die Vernetzergruppe enthält. Zur Herstellung solcher Copolymere greift der Fachmann auf bekannte Polymerisierungsverfahren zurück, beispielsweise auf die Polykondensation, die Polyaddition, die anionische Polymerisation, auf die kationische Polymerisation oder die radikalische Polymerisation. Die Herstellung eines Copolymers mit N,N-Dimethylacrylamid als Hauptmonomerkomponente und Methacryloyloxybenzophenon als Monomer, welches die Vernetzergruppe in das Copolymer einführt, ist in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindungsbeschreibung offenbart. Weitere Beispiele für Monomere mit Vernetzergruppe sind Acrylamid-3-hydroxy-2-anthrachinon (doi 10.1002/adma.201703469) und Diazomalonsäureester-Monomer (doi 10.1002/anie.201704486).The crosslinker groups are incorporated in the course of the preparation of the copolymer by preparing the copolymer from at least two different monomers, wherein at least one monomer contains the crosslinker group. For the preparation of such copolymers, those skilled in the art rely on known polymerization processes, for example polycondensation, polyaddition, anionic polymerization, cationic polymerization or free-radical polymerization. The preparation of a copolymer having N, N-dimethylacrylamide as a main monomer component and methacryloyloxybenzophenone as a monomer which introduces the crosslinker group into the copolymer is disclosed in Example 1 of the present invention description. Further examples of monomers with crosslinker group are acrylamide-3-hydroxy-2-anthraquinone (doi 10.1002 / adma.201703469) and diazomalonic acid ester monomer (doi 10.1002 / anie.201704486).
Der typische Anteil an Wiederholungseinheiten mit Vernetzergruppe in dem Copolymer beträgt 1-20 Mol-%, bezogen auf die Stoffmenge aller im Copolymer vorhandenen Wiederholungseinheiten, wobei ein Anteil von 2-15 Mol-% stärker bevorzugt ist und ein Anteil von 5-10 Mol-% noch stärker bevorzugt ist.The typical proportion of repeat units with crosslinker group in the copolymer is 1-20 mol%, based on the molar amount of all repeating units present in the copolymer, with a proportion of 2-15 mol% being more preferred and a proportion of 5-10 mol%. % is even more preferred.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Copolymers können im Zuge der Herstellung des Copolymers optional auch weitere hydrophile Gruppen eingeführt werden durch Copolymerisierung mit Monomeren, die entsprechende hydrophile Gruppen, beispielsweise Hydroxy-, Sulfonsäure- oder Carbonsäure-Gruppen enthalten. Das in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindungsbeschreibung hergestellte Copolymer enthält neben N,N-Dimethylacrylamid (Hauptkomponente) und Methacryloyloxybenzophenon (Vernetzungsgruppenkomponente), auch Na-4-Styrolsulfonat, welches der Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Copolymers dient.To improve the water-solubility of the copolymer, in the course of the preparation of the copolymer, it is optionally also possible to introduce further hydrophilic groups by copolymerization with monomers which contain corresponding hydrophilic groups, for example hydroxyl, sulfonic or carboxylic acid groups. The copolymer prepared in Example 1 of the present invention contains, in addition to N, N-dimethylacrylamide (main component) and methacryloyloxybenzophenone (crosslinking group component), also Na-4-styrenesulfonate, which serves to improve the water solubility of the copolymer.
Der Anteil an Wiederholungseinheiten mit weiterer hydrophiler Gruppe in dem Copolymer beträgt bis zu 10 Mol-%, bezogen auf die Stoffmenge aller im Copolymers vorhandenen Wiederholungseinheiten, ein Anteil von bis zu 5 Mol-% bevorzugt ist. Wenn in dem Copolymer vorhanden, ist ein Mindestanteil der Wiederholungseinheit mit weiterer hydrophiler Gruppe mindestens 0.5 Mol-%, vorzugsweise mindestens 1 Mol-%, noch stärker bevorzugt mindestens 2 Mol-%.The proportion of repeating units having a further hydrophilic group in the copolymer is up to 10 mol%, based on the molar amount of all repeating units present in the copolymer, a proportion of up to 5 mol% is preferred. When present in the copolymer, a minimum proportion of the repeating unit having another hydrophilic group is at least 0.5 mol%, preferably at least 1 mol%, even more preferably at least 2 mol%.
Typische Molekulargewichte des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Copolymers liegen im Bereich von 100 000 g/mol bis 1 000 000 g/mol, wobei Molekulargewichte zwischen 200 000 und 500 000 g/mol bevorzugt sind.Typical molecular weights of the copolymer used in the process according to the invention are in the range of 100,000 g / mol to 1,000,000 g / mol, molecular weights of between 200,000 and 500,000 g / mol being preferred.
Wie bereits oben erwähnt, handelt es sich bei dem Lösungsmittel zur Herstellung der Lösung in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise um Wasser oder um eine wässrige Pufferlösung. Die wässrige Pufferlösung dient dazu, einen bestimmten pH Wert einzustellen, bei dem das Biomolekül in Lösung geht. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren pH Bereiche werden damit letztlich durch das Biomolekül selbst bestimmt. Solange dieses bei einem bestimmten pH Wert nicht denaturiert, ist der pH Wert, bei dem das Biomolekül in Lösung geht, auch verwendbar. Typischerweise liegt der pH Wert der Lösung im Bereich von 2 bis 12, stärker bevorzugt zwischen 3 und 11. Als Puffer können dem Fachmann bekannte Puffersystem verwendet werden, beispielsweise Natriumacetat, HEPES, Natriumcitrat, Natriumsuccinat, Na-K-Phoshpat, TRIS, TRIS-maleat, Imidazol maleat, Bistrispropan, CAPSO, CHAPS, MES, Imidazol, DI-H20, PBS, PBS-T, NaPi-Tween (0.1), TNE oder RiPa. Dabei kann die Pufferphase durchaus an der Vernetzungsreaktion teilnehmen, das erfindungsgemäße Verfahren ist trotzdem durchführbar.As already mentioned above, the solvent for preparing the solution in step (i) of the process according to the invention is preferably water or an aqueous buffer solution. The aqueous buffer solution serves to set a certain pH at which the biomolecule goes into solution. The pH ranges which can be used within the scope of the present invention are thus ultimately determined by the biomolecule itself. As long as this does not denature at a certain pH value, the pH value at which the Biomolecule goes into solution, also usable. Typically, the pH of the solution is in the range of from 2 to 12, more preferably between 3 and 11. As the buffer, buffer systems known to those skilled in the art may be used, for example, sodium acetate, HEPES, sodium citrate, sodium succinate, Na-K-Phoshpat, TRIS, TRIS. maleate, imidazole maleate, bistrispropane, CAPSO, CHAPS, MES, imidazole, DI-H20, PBS, PBS-T, NaPi-Tween (0.1), TNE or RiPa. The buffer phase can definitely participate in the crosslinking reaction, but the process according to the invention can still be carried out.
Zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist jegliches Biomolekül, da jedes Biomolekül über C-H-Bindungen verfügt, welche zur Bildung der kovalenten Bindung mit der festen Phase herangezogen werden können. Beispiele für Biomoleküle, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Oligo- und Polynukleotide, synthetische Nukleotide, DNA (Desoxyribonukleinsäure), RNA (Ribonukleinsäure), einschließlich mRNA und microRNA (miRNA), Oligo- und Polypeptide, Proteine, Antikörper, Enzyme und Vitamine wie z.B. Biotin.Any biomolecule is suitable for use in the method of the invention because each biomolecule has C-H bonds which can be used to form the covalent bond with the solid phase. Examples of biomolecules that can be used in the process of the invention include, but are not limited to: oligo- and polynucleotides, synthetic nucleotides, DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), including mRNA and microRNA (miRNA), oligo- and polypeptides, proteins, antibodies, enzymes and vitamins such as Biotin.
Die Tröpfchen in Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mittels Zweiphasenmikrofluidik erzeugt. Hierzu wird die Lösung, die das nicht-modifizierte Biomolekül und das Copolymer in gelöster Form enthält, in ein Trägerfluid eingetragen.The droplets in step (ii) of the method according to the invention are produced by means of two-phase microfluidics. For this purpose, the solution containing the unmodified biomolecule and the copolymer in dissolved form is introduced into a carrier fluid.
Bei dem Trägerfluid handelt es sich generell um eine Flüssigkeit oder ein Gas, welches nicht mit der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Lösung mischbar ist, was bedeutet, dass ein Zweiphasensystem erhalten wird. Wenn es sich also bei der in Schritt (i) hergestellten Lösung um eine wässrige Lösung handelt (welche durch Lösen des Copolymers und des Biomoleküls in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung herstellbar ist), handelt es sich bei dem Trägerfluid beispielsweise um eine hydrophobe Flüssigkeit, insbesondere um Öl, wobei es sich bei dem Öl um fluoriertes Öl wie beispielsweise FC43 (Perfluortributylamin, C12F27N) ) oder um Silikonöle handeln kann. Auch Luft kann als Trägerfluid verwendet werden, da auch mit Luft ein Zweiphasensystem erhalten wird.The carrier fluid is generally a liquid or gas which is not miscible with the solution prepared in step (i) of the process of the invention, which means that a two-phase system is obtained. Thus, if the solution prepared in step (i) is an aqueous solution (which can be prepared by dissolving the copolymer and the biomolecule in water or an aqueous buffer solution), the carrier fluid is, for example, a hydrophobic liquid, in particular oil, wherein the oil may be fluorinated oil such as FC43 (perfluorotributylamine, C 12 F 27 N)) or silicone oils. Air can also be used as a carrier fluid, since a two-phase system is also obtained with air.
Durch Eintragung der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Copolymer/Biomolekül-Lösung, beispielsweise einer wässrigen Copolymer/Biomolekül-Lösung, in ein Trägerfluid, beispielsweise in eine hydrophobe Flüssigkeit, insbesondere in ein Öl, entsteht ein Zweiphasensystem. Mit der Eintragung werden gleichzeitig räumlich getrennte Tröpfchen erzeugt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Lösung, welche das Copolymer und das Biomolekül enthält, in einem mikrofluidischem Kanalsystem an einer T-Kreuzung mit dem Trägerfluid zusammengeführt wird, wobei die T-Kreuzung zu einem Zug von Tröpfchen der Copolymer/Biomolekül-Lösung in dem Trägerfluid führt.By introducing the copolymer / biomolecule solution prepared in step (i) of the process according to the invention, for example an aqueous copolymer / biomolecule solution, into a carrier fluid, for example into a hydrophobic liquid, in particular into an oil, a two-phase system is formed. With the entry spatially separated droplets are generated at the same time. This can be done, for example, by combining the solution containing the copolymer and the biomolecule in a microfluidic channel system at a T-junction with the carrier fluid, the T-junction resulting in a train of droplets of the copolymer / biomolecule solution in the carrier fluid leads.
Bisher konnten Polymere nur im trockenen / quasi lösungsmittelfreien und dadurch hoch konzentrierten Zustand vernetzt werden konnten. Es liegt auf der Hand, dass der Einsatz trockener Polymere in einem fluidischen System nicht möglich wäre. Überraschenderweise zeigte sich, dass ein gewisses Fenster für die Konzentration des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Copolymers zur Lösung in entsprechenden Puffern/Lösemitteln existiert, innerhalb dessen die Copolymerlösung ausreichend niederviskos ist, um in dem mikrofluidischen System die gewünschten Kompartimentierungseffekte zu erzielen und gleichzeitig noch ausreichend Polymerketten pro Volumen vorhanden sind, um intermolekulare Vernetzungen überwiegen zu lassen. Typische Konzentrationen für das Copolymer in der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten Lösung betragen 10-1000 mg/mL, stärker bevorzugt 40-500 mg/mL, noch stärker bevorzugt 70-300 mg/mL. Typische Konzentrationen für das Biomolekül in der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten Lösung betragen 0.2-2000 µM, stärker bevorzugt 0.5-1500 µM, noch stärker bevorzugt 1-1000 µM.So far, polymers could only be crosslinked in the dry / virtually solvent-free and therefore highly concentrated state. It is obvious that the use of dry polymers in a fluidic system would not be possible. Surprisingly, it has been found that a certain window exists for the concentration of the copolymer used in the process according to the invention for solution in corresponding buffers / solvents, within which the copolymer solution is sufficiently low-viscosity to achieve the desired compartmentation effects in the microfluidic system and at the same time still sufficient Polymer chains per volume are present to outweigh intermolecular crosslinks. Typical concentrations for the copolymer in the solution produced in step (i) of the method of the invention are 10-1000 mg / mL, more preferably 40-500 mg / mL, even more preferably 70-300 mg / mL. Typical concentrations for the biomolecule in the solution produced in step (i) of the method according to the invention are 0.2-2000 μM, more preferably 0.5-1500 μM, even more preferably 1-1000 μM.
In Schritt (iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Tröpfchen unter Bildung einer festen Phase gehärtet. Dies erfolgt durch Aktivierung der Vernetzergruppen mittels eines externen Auslösers, wie beispielsweise Licht. Dadurch wird eine Reaktion ausgelöst, die die Spaltung von C-H Bindungen in dem Copolymer und dem Biomolekül bewirkt und damit unter Neuknüpfung von kovalenten Bindungen zur dreidimensionalen Vernetzung von in Lösung befindlichen Copolymer und Biomolekülen führt. Die Biomoleküle werden damit kovalent in ein festes polymeres Netzwerk eingebaut, was die Abwanderung der Biomoleküle aus dem Partikel verhindert. Vorzugsweise wird dabei ein Hydrogelnetzwerk aufgebaut, in das die Biomoleküle eingebaut sind.In step (iii) of the process according to the invention, the droplets are hardened to form a solid phase. This is done by activating the crosslinker groups by means of an external trigger, such as light. This initiates a reaction that causes the cleavage of C-H bonds in the copolymer and biomolecule, thereby resulting in the rejoining of covalent bonds for three-dimensional cross-linking of copolymer and biomolecules in solution. The biomolecules are thus covalently incorporated into a solid polymeric network, which prevents the migration of biomolecules from the particle. Preferably, a hydrogel network is built, in which the biomolecules are incorporated.
Bei dem Auslöser handelt es sich beispielsweise um Licht, insbesondere um UV-Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 200 bis 400 nm, stärker bevorzugt 250 bis 385 nm, noch stärker bevorzugt 300 bis 370 nm. Durch die Bestrahlung durchlaufen die in dem Copolymer enthaltenen Vernetzergruppen im Falle der Benzophongruppen einen n-π*-Übergang in einen biradikalischen Triplettzustand, der nahezu jedes Wasserstoffatom aus benachbarten C-H-Gruppen in enger Nachbarschaft abstrahiert. Folglich bilden sich zwei Radikale, die sich rekombinieren können, um eine kovalente Bindung zu bilden, welche die beiden Ketten verbindet, was zu einer (formalen) C,H-Insertionsvernetzungsreaktion (CHic) führt. Ähnliche C,H-Insertionsreaktionen können auch über Nitren- oder Carbenzwischenstufen erreicht werden. Da grundsätzlich jedes Biomolekül C-H-Gruppen besitzt, wird jedes in der Lösung vorhandene Biomolekül während der Vernetzung kovalent an das Netzwerk gebunden. Wenn beispielsweise DNA, RNA, Polynukleotide, Oligonukleotide oder synthetische Nukleotide als Biomoleküle verwendet werden, erfolgt die Vernetzung über die Base Thymin. Wenn Proteine als Biomoleküle verwendet werden, erfolgt die Vernetzung über die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan, da diese Bausteine über C-H Gruppen mit vernetzenden Eigenschaften verfügen.The trigger is, for example, light, in particular UV light having a wavelength in the range of 200 to 400 nm, more preferably 250 to 385 nm, even more preferably 300 to 370 nm. The radiation passes through those contained in the copolymer Vernetzergruppen in the case of benzophone groups an n-π * transition to a biradical triplet state, which abstracts almost every hydrogen atom from adjacent CH groups in close proximity. Consequently, two radicals are formed which can recombine to form a covalent bond linking the two chains resulting in a (formal) C, H insertion crosslinking reaction (CHic) leads. Similar C, H insertion reactions can also be achieved via nitrene or carbene intermediates. As basically every biomolecule possesses CH groups, each biomolecule present in the solution is covalently bound to the network during crosslinking. If, for example, DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides or synthetic nucleotides are used as biomolecules, crosslinking takes place via the base thymine. When proteins are used as biomolecules, the crosslinking takes place via the amino acids tyrosine and tryptophan, since these building blocks have CH groups with crosslinking properties.
Alternativ kann die Vernetzungsreaktion unter Verfestigung der Partikel auch durch eine Erhöhung der Temperatur ausgelöst werden, wobei die Höhe der Temperatur wiederum von der Temperaturstabilität des Biomoleküls bestimmt wird. Ungeeignet sind Temperaturen, bei denen das Biomolekül denaturiert. Ein typisches Temperaturfenster zur Auslösung der Vernetzungsreaktion ist unter der vorherigen Prämisse 60-120°C. Bevorzugter Auslöser ist allerdings die Bestrahlung der Tröpfchen mit UV Licht.Alternatively, the crosslinking reaction can be initiated by solidification of the particles by increasing the temperature, wherein the height of the temperature is in turn determined by the temperature stability of the biomolecule. Unsuitable are temperatures at which the biomolecule denatures. A typical temperature window for initiating the crosslinking reaction is 60-120 ° C under the previous premise. However, the preferred trigger is the irradiation of the droplets with UV light.
Die aus der Verfestigungsreaktion hervorgehenden festen biofunktionalen Partikel haben typischerweise einen Durchmesser von 50 nm bis 5 mm. Die Größe der Partikel wird bestimmt durch die Größe der Kanäle im mikrofluidischen System, den Flussraten im System, dem Aufbau des mikrofluidischen Systems in dem Bereich, wo die beiden Phasen aufeinandertreffen. Die Messung der Teilchengröße kann optisch mittels Lichtmikroskop oder Rasterelektronenmikroskop erfolgen.The solid biofunctional particles resulting from the solidification reaction typically have a diameter of 50 nm to 5 mm. The size of the particles is determined by the size of the channels in the microfluidic system, the flow rates in the system, the structure of the microfluidic system in the area where the two phases meet. The particle size can be measured optically by light microscopy or scanning electron microscopy.
Das Trägerfluid wird nach der Verfestigungsreaktion ausgewaschen und recycelt. Da das Trägerfluid nicht mischbar ist, bildet sich eine saubere Phasentrennung aus und die hergestellten Partikel weisen keinerlei Rückstände auf.The carrier fluid is washed out and recycled after the solidification reaction. Since the carrier fluid is immiscible, a clean phase separation forms and the particles produced have no residues.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich also wie folgt zusammenfassen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die flexible Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln direkt in einer Stufe (d.h. in einem chemischen Schritt) aus Copolymer und Biomolekül, ohne dass eine Vor- und Nachbearbeitung der Biomoleküle bzw. der biofunktionalen Partikeln notwendig ist. Da sämtliche Biomoleküle über C-H-Bindungen verfügen, kann die Methode für eine Vielzahl von Biomolekülen herangezogen werden. Da die Biomoleküle zudem kovalent gebunden werden, wird eine Abwanderung der Biomoleküle verhindert. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, dass der Anwender auf technisch anspruchsvolle, zeitlich intensive, teure und mehrstufige Modifikationen zur Biofunktionalisierung und Aufreinigungsschritte verzichten kann. Die Biomoleküle werden durch die Herstellung von biofunktionalen Polymerpartikeln gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren angereichert und können auf diese Weise leichter analysiert bzw. nachgewiesen werden. Dies ist für den Nachweis klinisch relevanter Analyten von Bedeutung.The advantages of the method according to the invention can therefore be summarized as follows. The process of the present invention enables the flexible production of biofunctional polymer particles directly in one step (i.e., in one chemical step) from copolymer and biomolecule, without the need for pre- and post-processing of the biomolecules or biofunctional particles. Since all biomolecules have C-H bonds, the method can be used for a variety of biomolecules. Since the biomolecules are also covalently bound, migration of the biomolecules is prevented. The method according to the invention makes it possible for the user to dispense with technically demanding, time-intensive, expensive and multistage modifications to the biofunctionalization and purification steps. The biomolecules are enriched by the production of biofunctional polymer particles according to the method of the invention and can be easily analyzed or detected in this way. This is important for the detection of clinically relevant analytes.
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Das folgende Ausführungsbeispiel soll das erfindungsgemäße Verfahren illustrieren und weiter erläutern, ohne den erfindungsgemäßen Gegenstand einzuschränken.The following embodiment is intended to illustrate and further explain the method according to the invention without restricting the subject matter of the invention.
Beispiel 1: Herstellung eines N,N-Dimethylacrylamid-basierten Copolymers mit eingebauten Benzophenon-GruppenExample 1: Preparation of an N, N-dimethylacrylamide-based copolymer with incorporated benzophenone groups
Ein statistisches Copolymer, bestehend aus drei molekularen Bausteinen, wurde unter Verwendung eines radikalischen Polymerisationsverfahrens synthetisiert. In einem typischen Durchlauf wurden N,N-Dimethylacrylamid (DMAA, 92.5 Mol-%), Methacryloyloxybenzophenon (MaBP, 5 Mol-%), und Na-4-Styrolsulfonat (SSNa, 2.5 Mol-%) unter Stickstoff in Methanol mit einer Konzentration von 2 mol / l gelöst und 0.1 mol% a, α'-Azoisobutyronitril (AIBN) zugegeben. Nach fünf Einfrier- und Tauzyklen wurde die Lösung in ein vorgeheiztes Wasserbad gegeben und bei 60°C für 20 h gehalten. Nach Beendigung der Polymerisationsreaktion wurde das Polymer durch tropfenweise Zugabe der Lösung zu einem großen Überschuss an Diethylether ausgefällt, abfiltriert und durch Umfällung aus Methanol gereinigt. Nach dem Gefriertrocknen wurde das Copolymer als weißes Pulver mit einer typischen Ausbeute von 50% und Mw von etwa 300 000 g/mol erhalten.A random copolymer consisting of three molecular building blocks was synthesized using a radical polymerization method. In a typical run, N, N-dimethylacrylamide (DMAA, 92.5 mol%), methacryloyloxybenzophenone (MaBP, 5 mol%), and Na-4-styrenesulfonate (SSNa, 2.5 mol%) under nitrogen in methanol at one concentration of 2 mol / l dissolved and 0.1 mol% a, α'-azoisobutyronitrile (AIBN) was added. After five cycles of freezing and thawing, the solution was placed in a preheated water bath and held at 60 ° C for 20 hours. After completion of the polymerization reaction, the polymer was precipitated by dropwise addition of the solution to a large excess of diethyl ether, filtered off and purified by reprecipitation from methanol. After freeze-drying, the copolymer was obtained as a white powder with a typical yield of 50% and Mw of about 300,000 g / mol.
Die Hauptkomponente des Copolymers ist N,N-Dimethylacrylamid, welches als hydrophile Matrix dient, um unspezifische Wechselwirkungen mit der biologischen Umgebung zu verhindern (z.B. Proteinadsorption). 4-Methacryloxybenzophenon (MABP, 5 Mol-%) dient als zweiter Baustein und liefert dem Polymer photoreaktive Gruppen. Zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des fertigen Copolymers wird als dritte Komponente das Natriumsalz von 4-Styrolsulfonat (SSNa, 2.5 Mol-%) verwendet, sodass das resultierende Copolymer eine Löslichkeit von mehr als 300 g/L aufweist. The main component of the copolymer is N, N-dimethylacrylamide, which serves as a hydrophilic matrix to prevent nonspecific interactions with the biological environment (eg, protein adsorption). 4-methacryloxybenzophenone (MABP, 5 mol%) serves as a second building block and provides photoreactive groups to the polymer. To increase the water solubility of the final copolymer, the sodium salt of 4-styrenesulfonate (SSNa, 2.5 mol%) is used as the third component, so that the resulting copolymer has a solubility of more than 300 g / L.
Beispiel 2: Herstellung biofunktionaler PolymerpartikelExample 2: Preparation of biofunctional polymer particles
Das für das Ausführungsbeispiel gewählte System basiert auf der Photovernetzung einer wässrigen Lösung des in Beispiel 1 hergestellten Copolymers. Als Biomoleküle werden i) Biotin bzw. ii) DNA (HPV-Oligo 19, 36mer) verwendet.The system chosen for the embodiment is based on the photocrosslinking of an aqueous solution of the copolymer prepared in Example 1. As biomolecules i) biotin or ii) DNA (HPV oligo 19, 36mer) are used.
200 mg Copolymer (100 mg/mL) und 0.2 mg Biomolekül (0.1 mg/mL) werden in 2 mL in wässriger Phase gelöst. Bei der wässrigen Phase handelt es sich für das Biotin-Beispiel um einen PBS (0.25x) Puffersystem, für das DNA-Beispiel um ein NaPi (100 mM) Puffersystem.200 mg copolymer (100 mg / mL) and 0.2 mg biomolecule (0.1 mg / mL) are dissolved in 2 mL aqueous phase. The aqueous phase is a PBS (0.25x) buffer system for the biotin example, and a NaPi (100 mM) buffer system for the DNA example.
Mittels Mikrofluidik werden 20 µL der so erhaltenen wässrigen Lösungen an einer T-Kreuzung in FC 43 in einzelne Tröpfchen abgeschert. Die Photovernetzung der Tröpfchen erfolgt durch UV-Bestrahlung bei 365 nm in einer nachgestalteten UV-Kammer bei einer Dosis von 8 J/cm2. Dieser Partikelerzeugungsprozess mit integrierter Biofunktionalisierung ist in
Beispiel 3: Analyse der nach obigem Verfahren hergestellten biofunktionalen PolymerpartikelExample 3: Analysis of the biofunctional polymer particles prepared by the above method
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen biofunktionalen Polymerpartikel sowie unmodifizierte, d.h. nicht biofunktionalisierte, Polymerpartikel (hergestellt aus den Polymeren des Beispiels 1, wobei die Partikel analog dem obigen Verfahren gemäß Beispiel 2 ohne Biomolekül erhalten wurden), wurden mit einem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Gegenstück inkubiert. Für den Proteinassay war das fluoreszenzmarkierte Gegenstück Cyanin 5 markiertes Streptavidin und für den DNA Assay mit Cyanin 5 markiertes HPV-19-Antisense. Die hintergrundkorrigierten Lichtintensitäten der jeweiligen Partikel, die durch Fluoreszenzmikroskopie gemessen wurden, sowie eine schematische Darstellung des jeweiligen Bindungsprinzips sind in
Die jeweiligen modifizierten Partikel wirken als Positivkontrollen und die unmodifizierten Partikel als Negativkontrollen.The respective modified particles act as positive controls and the unmodified particles as negative controls.
Die Daten zeigen eine erfolgreiche Immobilisierung und homogene Anfärbung der Biomoleküle. Ein deutlich höheres Positivsignal verglichen mit dem Signal der unmodifizierten Polymerpartikel aus der Negativkontrolle weist auf die geringe unspezifische Adsorption des eingesetzten Polymers hin. Der Variationskoeffizient des Fluoreszenzsignals aus den funktionalisierten Partikeln beträgt für die mit Biotin funktionalisierten Partikel 5 % und für die DNA-funktionalisierten Partikel 3 %. Diese Werte können mit den beschriebenen Werten in der Literatur, in denen die Biofunktionalität über mehrere vor- oder nachgelagerte Schritte herbeigeführt wurde, gut konkurrieren. Die Nachweisgrenze des markierten Proteintargets Streptavidin-Cy5 der biotinylierten Hydrogelpartikel wurde durch allmähliche Verringerung der Konzentration des markierten Proteintargets Streptavidin-Cy5 in der Inkubationslösung untersucht. Dies ergibt eine Nachweisgrenze von 9 pM für den vorgestellten Assay. Zusätzlich zeigt das Fluoreszenzsignal die erwartete lineare Abhängigkeit von der Konzentration, wie in
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- WO 2010/138187 A1 [0006]WO 2010/138187 A1 [0006]
Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
- B. Li et al., „Synthesis of Biofunctional Janus Particles“, Macromol. Rapid Commun. 2015, 36, 1200-1204 [0003]Li et al., Synthesis of Biofunctional Janus Particles, Macromol. Rapid Commun. 2015, 36, 1200-1204 [0003]
- K. W. Bong, „Synthesis of Cell-Adhesive Anisotropic Multifunctional Particles by Stop Flow Lithography and Streptavidin-Biotin Interactions“, Langmuir 2015, 31, 13165-13171 [0004]K.W. Bong, "Synthesis of Cell-Adhesive Anisotropic Multifunctional Particles by Stop Flow Lithography and Streptavidin-Biotin Interactions", Langmuir 2015, 31, 13165-13171 [0004]
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Also Published As
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