DE102015200643A1

DE102015200643A1 - Verfahren zur herstellung von neuronalen zellen enthaltenden strangförmigen kapseln und strangförmige kapseln

Info

Publication number: DE102015200643A1
Application number: DE102015200643.3A
Authority: DE
Inventors: Andreas Winkler; Anne K. Meyer
Original assignee: Leibniz Institut fuer Festkorper und Werkstofforschung Dresden eV
Current assignee: Leibniz Institut fuer Festkorper und Werkstofforschung Dresden eV
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2016-07-21
Anticipated expiration: 2035-01-17
Also published as: DE102015200643B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Mikrofluidik und betrifft ein Verfahren zur Herstellung von strangförmigen Kapseln, wie es beispielsweise für die Kultivierung von neuronalen Zellen realisiert werden kann. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von strangförmigen Kapseln anzugeben, mit dem ein kontrolliertes und zielgerichtetes Wachstum von Neuriten von neuronalen Zellen realisiert wird. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, bei dem mit einem Mikrofluidiksystem eine koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamisch fokussierte, unidirektionale, laminare Flüssigkeitsströmung realisiert wird, mit einer ersten Flüssigkeitsströmung mit neuronalen Zellen in einer Nährlösung, einer zweiten Flüssigkeitsströmung mit Wachstumsfaktor, einer dritten Flüssigkeitsströmung mit extrazellulärem Matrix-Material (ECM), einer vierten Flüssigkeitsströmung mit vernetzbarem Material und einer fünften Flüssigkeitsströmung mit einer Hüllflüssigkeit, die umeinander angeordnet werden, nachfolgend die Flüssigkeitsströmung aus dem Mikrofluidiksystem entfernt und mindestens das vernetzbare Material vernetzt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Biologie, der Bioverfahrenstechnik und Mikrofluidik und betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuronale Zellen enthaltenden strangförmigen Kapseln, wie es beispielsweise für die Kultivierung von neuronalen Zellen und deren Transplantation in einem Organismus realisiert werden kann.
Die Ursachen vieler Erkrankungen liegen in Fehlfunktionen von Körperzellen oder in deren Absterben begründet. Aus diesem Grund ist das Ersetzen abgestorbener oder fehlagierender Zellen durch gesunde Zellen ein viel versprechender Ansatz, der beispielsweise heute erfolgreich zur Behandlung von Leukämie angewandt wird. Dabei werden die malignen Zellen durch Chemotherapie abgetötet und anschließend durch Knochenmarktransplantation mit Stammzellen ersetzt.
Für neurodegenerative Erkrankungen, also für Erkrankungen des Nervensystems, können Stammzellen eine ideale Therapieform darstellen. Hierbei sollen Nervenzellen, deren spezifische Funktion in der Reizweiterleitung über die Neuriten liegt, durch neue Nervenzellen ersetzt werden. Dabei wird unter einem Neurit, das auch synonym als Axon bezeichnet wird, ein einziger Fortsatz eines Neurons, also einer Nervenzelle, verstanden, mit dem es eine Erregung vom Zellkörper fort an die ausgewählte Zelle weiterleiten kann. Diese Nervenfortsätze mit variierender Länge verbinden immer unterschiedliche Areale im zentralen und auch im peripheren Nervensystem miteinander und sind entscheidend für eine funktionierende Kommunikation und damit für die Grundfunktionen des Gehirns. Ein Ersatz der Nervenzellen bei neurodegenerativen Erkrankungen bedeutet, dass Nervenzellen in die entsprechenden Areale eingebracht werden müssen. Daneben müssen lokale Bedingungen geschaffen werden, die das Auswachsen der Neuriten zu den notwendigen Orten ermöglicht und die Neuronen und Neuriten während der Wachstumsphase und auch danach dauerhaft vor ungünstigen Wechselwirkungen mit umliegendem Gewebe schützen.
Eine direkte Transplantation von Nervenzellen in das erwachsene, menschliche, erkrankte Gehirn wird in Freeman, T.B. et al, Ann. Neurol. 38, 379, 1995, vorgestellt. Dabei wird für die Zellersatztherapie bei einer Parkinsonschen Erkrankung fötales Gewebe in das Gehirn transplantiert. Nachteilig ist allerdings dabei, dass das erwachsene Gehirn aus festem, dicht mit Zellen gepacktem Gewebe besteht, sodass die transplantierten Zellen nicht die Wachstumsfaktoren (Lockstoffe) aufspüren können, die notwendig sind, um eine Entwicklung für die Richtung des Wachstum von Neuriten vorzugeben. Auch ist nachteilig bei diesem Transplantationsverfahren, dass die Transplantation der Nervenzellen an den falschen Ort, nämlich in das Striatum des Gehirns erfolgt. Daher konnte keine Verbindung zur Substantia nigra geschaffen werden, wodurch die korrekte Signalweiterleitung nicht wiederhergestellt wurde und keine symptomatische Heilung vollzogen wurde. Die Überlebensrate der Stammzellen im Striatum war zudem gering.
Die Kultivierung von Stammzellen erfolgte bisher vorwiegend ex vivo, das heißt außerhalb des lebenden Organismus auf zweidimensionalen Substraten.
Bekannt aus McKinnon et al: Biomat. Science, 289, 93, 2013 sind Versuche von 3D-Kultivierungen von Stammzellen auf Hydrogelen. Nachteilig bei der vorgestellten 3D-Kultivierung von Stammzellen ist jedoch, dass ein gerichtetes Auswachsen von Zellfortsätzen aus den Stammzellen nicht realisiert werden konnte.
Ebenfalls bekannt ist die Ausrichtung wachsender Neuriten entlang vorhandener Strukturen auf mikrostrukturierten Polymerfasern (Naganuma, Y. et.al.: MEMS 2012, pp. 953, 2012). Nachteilig dabei ist, dass die Anordnung der neuronalen Zellen nicht gezielt erfolgt und die Neuriten ungeschützt auf der Außenseite der Fasern vorliegen.
Auch bekannt ist das Einbringen von neuronalen Stammzellen mit funktionalisierten selbstaufbauenden Peptidhydrogelen in das Gehirn, um Nervenzellen bei einer Verletzung des Gehirns zu regenerieren (Cheng, T.Y. et al.: Lab Chip 4, 576, 2004). Bei diesem Verfahren überlebten, proliferierten und differenzierten sich zwar die eingebrachten neuronalen Stammzellen. Nachteilig ist, dass die Möglichkeit des direktionalen Wachstums der Neuriten ausgeschlossen ist, da das Hydrogel keinerlei mechanischen Halt oder Schutz vor dem umliegenden Gewebe gibt.
Die kontinuierliche Herstellung von bioaktiven Polymerröhren in Mikrofluidiksystemen ist aus Jeong, W. et al: Lab Chip 4, 2004, bekannt. Das Verfahren umfasst die hydrodynamische Fokussierung von Flüssigkeitsströmen in einer rotationssymmetrischen Düsenanordnung, basierend auf dem Effekt der laminaren Flüssigkeitsströmung bei kleinen Reynoldszahlen. Für sehr kleine Reynoldszahlen, wie sie in nahezu allen mikrofluidischen Systemen vorherrschen, bildet sich eine laminare Strömung aus, bei der ein Materialtransport quer zur Strömungsrichtung nur durch Diffusion erfolgt. Durch Auslegung des Mikrofluidiksystems können unter Nutzung einer laminaren Strömung mehrphasige Flüssigkeitsströme in koaxialer Anordnung mit höchster Präzision erzeugt und gesteuert werden. Die Flüssigkeitströme mischen sich im laminaren Strömungsbereich nur durch den langsamen Mechanismus der Diffusion untereinander, wodurch die Flüssigkeiten über eine Wegstrecke von mehreren Zentimetern ohne nennenswerte Vermischung, getrennt voneinander, strömen.
Weiterhin bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von Polymerröhren mit einer inneren, einer mittleren und einer äußeren strömenden Flüssigkeitsphase (Lan, W.J. et al.: Ind. Eng. Chem. Res. 52, 6770, 2013). Während die inneren und äußeren Flüssigkeitsphasen lediglich zur Fokussierung der mittleren Phase dienen, enthält die mittlere Phase eine polymerisierbare Substanz. Diese Substanz polymerisiert noch während des Durchströmens durch den Mikrokanal und formt dabei eine dünne Polymerröhre um die innere Flüssigkeitsphase. Die Härtung des Polymers erfolgt dabei beispielsweise durch Polyaddition, thermische oder radikalische Polymerisation, Lösungsmittelextraktion, Redox-Reaktionen, Selbstassemblierung, Bioconjugat-Chemie, Phasenumwandlung oder UV-Photopolymerisation.
Nachteilig bei dem bekannten Stand der Technik ist, dass bisher das Wachstum von Neuriten aus neuronalen Zellen nicht zielgerichtet und nur ex vivo realisiert werden konnte. Die dazu angegebenen Verfahren sind mit hohem Aufwand und Kosten verbunden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von eine oder mehrere neuronale Zellen enthaltenden strangförmigen Kapseln anzugeben, mit dem ein kontrolliertes und zielgerichtetes Wachstum von Neuriten von neuronalen Zellen realisiert wird, sowie in der Angabe von strangförmigen Kapseln, die das Wachstum der Neuriten von neuronalen Zellen fördern, diesen mechanischen Schutz bieten und für die Transplantation in einen Organismus einsetzbar sind.
Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von eine oder mehrere neuronale Zellen enthaltende strangförmige Kapseln, bei dem mit einem Mikrofluidiksystem eine koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamisch fokussierte, unidirektionale, laminare Flüssigkeitsströmung aus mehreren sich ganz oder teilweise ummantelnden Flüssigkeitsströmungen über mehrere in Reihe angeordnete Zuführeinrichtungen realisiert wird, wobei eine erste Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer neuronalen Zelle mindestens in einer Nährlösung realisiert wird, anschließend eine zweite Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer Flüssigkeit mit mindestens einem Wachstumsfaktor vollständig oder teilweise ummantelnd um die erste Flüssigkeitsströmung realisiert wird, wobei der mindestens eine Wachstumsfaktor in Bereichen räumlich unterschiedlich zum Bereich der mindestens einen neuronalen Zelle in Strömungsrichtung angeordnet ist, danach eine dritte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einem extrazellulären Matrix-Material (ECM) um die erste und/oder zweite Flüssigkeitsströmung vollständig oder teilweise umhüllend angeordnet wird, danach eine vierte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einem vernetzbaren Material um die erste und/oder zweite und/oder dritte Flüssigkeitsströmung vollständig oder teilweise umhüllend angeordnet wird, und anschließend eine fünfte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer Hüllflüssigkeit vollständig oder teilweise umhüllend um alle Flüssigkeitsströmungen angeordnet wird, nachfolgend die gesamte Flüssigkeitsströmung aus dem Mikrofluidiksystem entfernt und mindestens das vernetzbare Material vernetzt wird.
Vorteilhafterweise werden als Wachstumsfaktor Proteine, Peptide, und/oder Antikörper, vorzugsweise VEGF, FGF-2, FGF-8, Neurotrophin-3 und/oder Sonic Hedgehog, eingesetzt.
Ebenfalls vorteilhafterweise werden als ECM Collagen, Fibrin, Chemoattractants und/oder Chemorepellents eingesetzt.
Weiterhin vorteilhafterweise werden als vernetzbare Materialien Polymere, vorzugsweise supramolekulare Hydrogele, Ca-Alginat, Gelatine, Polydimethylsiloxan, Polyethylenglycol, Chitosan, Alginat-Agarose, Polyacrylamide, Polyacrylate, Polyvinyle, Polyethersulfone, Epoxydharze und/oder Acrylharze, eingesetzt.
Und auch vorteilhafterweise wird die Vernetzung durch Polyaddition, thermische Polymerisation, radikalische Polymerisation, Polykondensation, Lösungsmittelextraktion, Komplexbildung, Selbstassemblierung, Redox-Reaktion, Bioconjugat-Chemie, Phasenumwandlung, Gelbildung und/oder UV-Photopolymerisation realisiert. Es ist auch vorteilhaft, wenn als Zuführeinrichtungen Pumpen, und/oder Ventile, vorteilhafterweise mit Steuereinheiten versehen, eingesetzt werden.
Ebenfalls ist es vorteilhaft, wenn nach Entfernung der gesamten Flüssigkeitsströmung aus dem Mikrofluidiksystem die Hüllflüssigkeit entfernt wird.
Weiterhin vorteilhaft ist es, wenn durch Steuerung der Zuführeinrichtungen des Mikrofluidiksystems bezogen auf das Medium eine nicht-kontinuierlichen Flüssigkeitsströmung realisiert wird.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch eine strangförmige Kapsel mindestens bestehend aus mindestens zwei übereinander angeordneten rotationssymmetrischen Hüllen, die mindestens eine oder mehrere neuronale Zellen in mindestens einer Nährlösung und mindestens einen, räumlich von den neuronalen Zellen getrennt angeordneten Wachstumsfaktor aufweisen, wobei die unmittelbar in Kontakt mit der Nährlösung und dem Wachstumsfaktor befindliche Umhüllung aus mindestens eine ECM-Flüssigkeit gebildet ist, und die mindestens zweite Hülle aus einem vernetzten Material besteht.
Vorteilhafterweise weist die Zone der Kapsel, in der sich der mindestens eine Wachstumsfaktor befindet, eine gradierte Konzentration an Wachstumsfaktor mit abnehmender Konzentration in abnehmender Entfernung zur einen oder mehreren neuronalen Zellen auf.
Ebenfalls vorteilhafterweise ist die Hülle aus dem vernetzen Material stoffdurchlässig für Nähr- und Signalstoffe.
Weiterhin vorteilhafterweise sind die Hüllen der Kapseln an mindestens einem Ende, vorteilhafterweise an beiden Enden, geschlossen ausgeführt.
Und auch vorteilhafterweise besitzt die Kapsel eine Länge und einen Durchmesser, welche direkt an die geometrischen Abmaße der zu ersetzenden neuronalen Zellen im Zielorganismus angepasst sind und im Bereich von 1 mm bis 50 mm Länge und 50 µm bis 10 mm Durchmesser liegen.
Vorteilhaft ist es auch, wenn eine Zone der Kapsel, in der die eine oder mehreren neuronalen Zellen angeordnet sind, eine Länge und einen Durchmesser von 100 µm bis 5 mm, vorteilhafterweise von 200 µm bis 2 mm, aufweist.
Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn eine Zone der Kapsel, in der die eine oder mehreren Wachstumsfaktoren angeordnet sind, eine Länge von 500 µm bis 10 mm, vorteilhafterweise 1 bis 5 mm, und einen Durchmesser von 100 µm bis 3mm, vorteilhafterweise 100 µm bis 1 mm, aufweist.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird es erstmals möglich, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von eine oder mehrere neuronale Zellen enthaltenden strangförmigen Kapseln anzugeben, mit dem ein kontrolliertes und zielgerichtetes Wachstum von Neuriten von neuronalen Zellen realisiert wird. Weiterhin fördern die strangförmigen Kapseln das Wachstum der Neuriten von neuronalen Zellen, bieten diesen mechanischen Schutz und sind für die Transplantation in einen Organismus einsetzbar.
Erreicht wird dies durch ein Verfahren zur Herstellung von eine oder mehrere neuronale Zellen enthaltende strangförmige Kapseln, bei dem mit einem Mikrofluidiksystem eine koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamisch fokussierte, unidirektionale, laminare Flüssigkeitsströmung aus mehreren sich ganz oder teilweise ummantelnden Flüssigkeitsströmungen über mehrere in Reihe angeordnete Zuführeinrichtungen realisiert wird. Ein derartiges Mikrofluidiksystem beinhaltet vorteilhafterweise Pumpen, Ventile und Steuereinheiten, mit denen beispielsweise sowohl der Durchmesser der einzelnen Flüssigkeitsströmungen, deren Wandungsdicke, deren Länge gesteuert werden kann, ebenso wie auch der konkrete Aufbau der strangförmigen Kapseln im Hinblick auf die Anordnung der einzelnen Flüssigkeitsströmungen übereinander als auch, ob die Kapseln an beiden Enden offen, nur auf einer oder auf beiden Seiten geschlossen sind.
Die Herstellung der strangförmigen Kapseln erfolgt, indem eine erste (innere/zentrische) Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer neuronalen Zelle mindestens in einer Nährlösung realisiert wird. Vorteilhafterweise werden eine Vielzahl an neuronalen Zellen, beispielsweise 10⁵ neuronale Zellen, z.B. fötale Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen oder aus induzierten pluripotenten Stammzellen hergestellte neurale Stammzellen, in die erste Flüssigkeitsströmung eingebracht. Die Nährlösung kann eine allgemeine Nährlösung sein, oder vorteilhafterweise eine direkt auf die neuronalen Zellen abgestimmte Nährlösung, die insbesondere das Wachstum der Neuriten fördert.
Anschließend wird eine zweite Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer Flüssigkeit mit mindestens einen Wachstumsfaktor mindestens teilweise ummantelnd um die erste Flüssigkeitsströmung realisiert wird, wobei der mindestens ein Wachstumsfaktor in Bereichen räumlich unterschiedlich zum Bereich der mindestens einen neuronalen Zelle in Strömungsrichtung angeordnet ist. Dabei sind vorteilhafterweise die neuronalen Zellen an einem Ende der Kapsel angeordnet und in Strömungsrichtung der Wachstumsfaktor außerhalb des Bereichs der neuronalen Zellen, wobei die Menge an Wachstumsfaktor entlang der Kapsel gleich sein kann, oder sich kontinuierlich oder gradiert verändert. Durch diese räumlich getrennte Anordnung in Strömungsrichtung kann einerseits die Länge der Neuriten bestimmt werden, da der Wachstumsfaktor als Lockstoff wirkt und das kontrollierte und gerichtete Wachstum der Neuriten in eine Richtung ermöglicht.
Weiterhin wird danach eine dritte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einem extrazellulären Matrix-Material (ECM) um die erste und/oder zweite Flüssigkeitsströmung vollständig umhüllend angeordnet. Die ECM dient ebenfalls dem Wachstum sowohl der neuronalen Zellen als auch der Neuriten und kann hinsichtlich seiner Zusammensetzung und Anordnung in Bereichen der Kapsel in Strömungsrichtung unterschiedlich sein, so dass das Wachstum der Zellen an dem jeweiligen Ort gefördert werden kann.
Vorteilhafterweise kann die zweite Flüssigkeitsschicht mit dem Wachstumsfaktor auch die Funktion der dritten Flüssigkeitsschicht mit dem extrazellulären Matrix-Material übernehmen, so dass die dritte Flüssigkeitsschicht auch eingespart werden kann.
Danach wird eine vierte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einem vernetzbaren Material um die erste und/oder zweite und/oder dritte Flüssigkeitsströmung vollständig umhüllend angeordnet. Diese Flüssigkeitsströmung realisiert nach dem Abschluss des Verfahrens die feste Hülle der Kapseln. Diese feste, vorteilhafterweise polymerisierte, Hülle ist dabei vorteilhafterweise so dünn wie möglich und zum umgebenden Gewebe biologisch kompatibel, weist aber gleichzeitig auch eine gute mechanischer Stabilität auf. Als charakteristische Größe für die mechanische Stabilität kann dabei das Elastizitätsmodul angesehen werden, welches angepasst an das umgebende Zellgewebe vorteilhafterweise zwischen 10 und 1000 Pa beträgt, wodurch gleichzeitig das Kapselinnere geschützt und das umgebende Gewebe durch die Kapsel nicht beschädigt wird. Das vernetzbare Material wird innerhalb des Mikrofluidsystems, beispielsweise durch Polyadditionsreaktionen, thermische und/oder radikalische Polymerisationsreaktionen, Lösungskapselextraktion, Selbstassemblierung, Redoxreaktionen, Phasenumwandlungsreaktionen und/oder UV-Photopolymerisationsreaktionen vernetzt.
Zum Ausbringen der gesamten Flüssigkeitsströmung wird eine fünfte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer Hüllflüssigkeit vollständig umhüllend um alle Flüssigkeitsströmungen angeordnet, da sonst ein reibungsloses gerichtetes und kontrolliertes Ausbringen durch beispielsweise Verkleben an der Wandung des Mikrofluidsystems nicht realisiert werden kann. Als Hüllflüssigkeit kann beispielsweise Wasser, eine Glukoselösung mit Vitaminen und Aminosäuren oder eine Flüssigkeit, welche die Polymerisation der polymerisierbaren Flüssigkeitsströmung begünstigt (z.B. Ca²⁺-haltiges Wasser bei Verwendung von Alginat als polymerisierbare Substanz), verwendet werden. Die Vernetzung des Kapselhüllenmaterials wird innerhalb des Mikrofluidiksystems und während der laminaren Flüssigkeitsströmung realisiert. Die Hüllflüssigkeit als fünfte Flüssigkeitsströmung verhindert die Berührung des vernetzbaren Materials mit der Wandung des Mikrofluidiksystems.
Weiterhin erreicht wird die Realisierung eines Wachstums von Neuriten von neuronalen Zellen, die für die Transplantation in einen Organismus einsetzbar sind, durch strangförmige Kapseln, die mindestens aus mindestens zwei übereinander angeordneten rotationssymmetrischen Hüllen bestehen, die mindestens eine oder mehrere neuronale Zellen in mindestens einer Nährlösung und mindestens einen, räumlich in Richtung der größten Abmessung der Kapsel von den neuronalen Zellen getrennt angeordneten Wachstumsfaktor aufweisen. Dabei ist die unmittelbar in Kontakt mit der Nährlösung und dem Wachstumsfaktor befindliche Umhüllung aus mindestens einer ECM-Flüssigkeit gebildet, und die mindestens zweite Hülle besteht aus einem vernetzten Material.
Die Erfindung stellt einen neuen und vielversprechenden Therapieansatz für neurodegenerative Erkrankungen dar. Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird es erstmals möglich, neuronale Zellen zum Zweck der Transplantation in einen Organismus in strangförmigen Kapseln zu kultivieren, wobei die neuronalen Zellen zielgerichtet Neuriten mit an den Anwendungsfall angepasster Länge und Richtung in der strangförmigen Kapsel, die vorteilhafterweise eine Mikrokapillare ist, ausbilden. Das Auswachsen von Neuriten aus der neuronalen Zelle wird dadurch realisiert, dass die strangförmige Kapsel in verschiedene Zonen aufgeteilt und selektiv funktionalisiert ist. So ist in der ersten Zone der strangförmigen Kapsel mindestens eine neuronale Zelle in einer Flüssigkeit, welches eine Nährlösung ist, vorhanden, wobei in der zweiten Zone der strangförmigen Kapsel eine Flüssigkeit, welche ebenfalls eine Nährlösung ist, mit einem Wachstumsfaktor vorhanden ist. Durch den Wachstumsfaktor, der als Lockstoff eingesetzt wird, werden die neuronalen Zellen angeregt, Neuriten in Richtung des Wachstumsfaktors zielgerichtet auszubilden. Die vollständig mindestens eine verkapselte neuronale Zelle in der strangförmigen Kapsel kann einerseits ex vivo einer mikrobiologisch idealen Umgebung für neuronale Zellen ausgesetzt werden, bei denen günstige Wachstumsbedingungen für die Neuriten vorherrschen. Möglich ist auch, dass die strangförmige Kapsel mit der mindestens einen neuronalen Zelle direkt ins Zielgewebe transplantiert wird, um dort krankhafte Nervenzellen zu ersetzen und Neuriten in vivo zu bilden.
Die Wandung der strangförmigen Kapsel besteht vorteilhafterweise aus mindestens einem vernetzten Polymer, wodurch die neuronalen Zellen und wachsenden Neuriten während der Wachstumsphase vor schädlichen Umgebungseinflüssen (z.B. mechanischer Einwirkung oder biochemischen Reaktionen) geschützt werden. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass die strangförmige Kapsel aus einem Material gebildet ist, dass nach Abschluss des Neuritenwachstums vom Organismus vollständig resorbiert wird, und auch welches für Nähr- und Signalstoffe stoffdurchlässig ist.
Darüber hinaus ermöglicht die erfindungsgemäße strangförmige Kapsel eine Kommunikation der Nervenzellen mit der Umgebung und umgekehrt an räumlich definierten Bereichen. Durch die erfindungsgemäße Lösung kann damit gezielt Einfluss auf das Wachstum der neuronalen Zellen und/oder der Neuriten und die Einstellung idealer Umgebungsbedingungen für die Kultivierung von Zellen genommen werden. Die Kommunikation wird dadurch realisiert, dass mindestens eine Zone der strangförmigen Kapsel eine oder mehrere Funktionsschichten aufweist, die lokal selektiv stoffdurchlässig sind. Unter lokal selektiv stoffdurchlässig wird dabei verstanden, dass nur eine Zone der strangförmigen Kapsel eine Stoffdurchlässigkeit aufweist oder auch nur ein bestimmter Bereich einer Zone stoffdurchlässig ist. Möglich ist aber auch, dass alle Zonen der strangförmigen Kapsel eine Stoffdurchlässigkeit aufweisen.
Des Weiteren können bei der erfindungsgemäßen strangförmigen Kapsel die beiden Enden offen oder geschlossen, oder auch nur ein Ende der strangförmigen Kapsel offen sein. Dadurch wird ermöglicht, dass sich die über die vollständige Länge der strangförmigen Kapsel und in vivo gebildeten Neuriten mit den gewünschten Arealen beispielsweise im zentralen oder peripheren Nervensystem verbinden.
Mit der erfindungsgemäßen strangförmigen Kapsel lässt sich auch eine vorteilhafte Kultivierung von neuronalen Zellen in vitro realisieren, da in der strangförmigen Kapsel die neuronalen Zellen eine 3D-Umgebung mit idealen Bedingungen vorfinden, die in einer Kulturschale allein nicht ausreichend imitiert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch die Anwendung der Prinzipien der Mikrofluidik eine einfache, kostengünstige und kontinuierliche Herstellung der strukturiert aufgebauten strangförmigen Kapseln.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist eine gezielte Einstellung der Kapselgeometrie (Länge, Durchmesser, Flüssigkeitsschichtdicken) und deren Zusammensetzung (Stoffkonzentration), sowie der Einteilung der Kapsel in unterschiedliche Bereiche möglich. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird das gezielte Aussäen von neuronalen Zellen in einer erste Zone der strangförmigen Kapsel und die Einbringung von Wachstumsfaktoren in einer zweiten Zone für die Bildung von Neuriten möglich. Dazu werden je nach Anwendung spezifische Wachstumsfaktoren, Peptide oder Antikörper einsetzbar, die die Kultivierung, das Überleben der Zellen oder auch das Neuritenwachstum begünstigen.
Durch die koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamische Fokussierung der einzelnen Flüssigkeitsströme und die in Reihe geschalteten Zuführungen der Zellflüssigkeit, der nachfolgend zugeführten Wachstumsfaktoren, der anschließenden Zuführung der Monomerflüssigkeiten und abschließend der Hüllflüssigkeit in der rotationssymmetrischen Düsenanordnung wird basierend auf der laminaren Flüssigkeitsströmung ein mehrfach koaxialer Aufbau der strangförmigen Kapsel erreicht.
Durch die sequentielle Zuführung des Monomers wird die Voraussetzung geschaffen, die Flüssigkeiten, die neuronalen Zellen und den Wachstumsfaktor in der Form der strangförmigen Kapsel zu verkapseln. Aufgrund des technologischen Prinzips der koaxialen Flüssigkeitsanordnung mischen sich die Flüssigkeitsströme im laminaren Strömungsbereich nur sehr langsam durch Diffusion, wodurch die Monomerflüssigkeit und die bereits zuvor zugeführte Zellflüssigkeit und der Wachstumsfaktor ohne nennenswerte Vermischung voneinander getrennt strömen.
Erfindungsgemäß können die strangförmigen Kapseln hinsichtlich ihrer Länge bereits im Herstellungsverfahren auf die spätere Anwendung abgestimmt werden. Unter Kenntnis des späteren Einsatzbereiches der neuronalen Zellen kann die Länge der sich anschließend ausbildenden Neuriten durch die Abmessungen der strangförmigen Kapsel bestimmt werden. Die genaue Auslegung der strangförmigen Kapseln wird durch die Zuführbedingungen der Hüllflüssigkeit bestimmt. Die Zuführung kann entweder kontinuierlich oder gepulst mit Hilfe von Regeleinrichtungen erfolgen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können schnell und kostengünstig strangförmige Kapseln hergestellt und eine hohe Reproduzierbarkeit der strangförmigen Kapseln ermöglicht werden. Eine Prozessteuerung durch den möglichen Einsatz von Regeleinrichtungen lässt eine schnelle Änderung der Umgebungsbedingungen sowie eine gezielte Einstellung der Herstellungsparameter zu, mit denen optimale Kultivierungsbedingungen und eine kontrollierte Auslegung der Eigenschaften der strangförmigen Kapseln erreicht werden. Damit wird es möglich, die Wanddicken der strangförmigen Kapseln, deren Länge und die Funktionseigenschaften gezielt einzustellen. Auch wird es möglich, die Anzahl der in die strangförmigen Kapseln einzubringenden Zellen und deren Position in der strangförmigen Kapsel genau festzulegen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Dabei zeigt
1 ein Mikrofluidiksystem mit einer koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamisch fokussierten, unidirektionalen, laminaren Flüssigkeitsströmung aus sechs Flüssigkeitsströmungen
2 eine erfindungsgemäße strangförmige Kapsel aus Polymer
Beispiel 1
Für den Einsatz einer strangförmigen Kapsel zur Transplantation in das zentrale Nervensystem von Ratten wird eine strangförmige Kapsel mit den Abmessungen 12 mm (Länge) × 1 mm (Durchmesser) hergestellt. Dabei besteht die strangförmige Kapsel aus rotationssymmetrischen Hüllen und ist an einer Seite am Ende verschlossen und an der anderen Seite am Ende offen.
In einem Mikrofluidsystem mit einem rohrförmigen Teil mit 1.5 mm Innendurchmesser für die Ausbildung der koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamisch fokussierten, unidirektionalen, laminaren Flüssigkeitsströmung aus sechs Flüssigkeitsströmungen sind sechs Flüssigkeitszuführungen mit Pumpen in 4 Fokussierungsstufen hintereinander angeordnet (1). Die Ansteuerung der Ventile V1 und V2, sowie V3 und V4 erfolgt programmgesteuert wechselseitig. Dabei werden die Ventile V1 und V3 für jeweils 100 ms und anschließend die Ventile V2 und V4 für jeweils 900 ms aktiviert. Die Ventile V5 und V6 werden kontinuierlich angesteuert. Die Volumenströme der Pumpen werden wie folgt festgelegt: Pumpe(F1, F2)-51 µl/min, Pumpe(F3, F4)-311 µl/min und Pumpe(F5)-204 µl/min.
Durch die Variation der Volumenströme wird gewährleistet, dass alle Flüssigkeiten im Mikrosystem einen festgelegten Durchmesser und eine festgelegte Wanddicke aufweisen und mit der gleichen Geschwindigkeit strömen. Dadurch werden Scherkräfte an den Flüssigkeitsgrenzflächen vermieden.
Die Flüssigkeitsströmungen F1 bis F4 beinhalten Flüssigkeiten, welche auf Dulbecco‘s Modified Eagle Medium (DMEM) mit Aminosäuren, Vitaminen und Salzen basieren und zusätzlich enthalten:

(F1): Zellflüssigkeit A mit 10⁶ Stück neuronalen Stammzellen und dem Epidermal Growth Factor (EGF) und dem Fibroblast Growth Factor (FGF);
(F2): Zellflüssigkeit B mit dem differenzierenden Faktor Sonic Hedgehog (SHH) und den Neuritenlockstoff Netrin zur Förderung des richtungsabhängigen Wachstum der Neuriten;
(F3): ECM-Flüssigkeit A mit zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP);
(F4): ECM-Flüssigkeit B mit dem Wachstumsfaktor Adenosinmonophosphat (cAMP) zur Unterstützung der Differenzierung und des Überlebens der Zellen.

Die Flüssigkeit (F5) ist eine Monomerflüssigkeit aus Alginat zur Ausbildung der Kapselhülle. Die Flüssigkeit (F6) ist eine Hüllflüssigkeit bestehend aus einer wässrigen CaCl₂-Lösung.
Vom Zeitpunkt des Kontakts der Flüssigkeiten (F5) und (F6) in dem rohrförmigen Teil tritt die Vernetzung des Alginats ein und es bildet sich eine feste Hülle um die inneren Flüssigkeiten. Nach 1 s werden für die Dauer von 100 ms alle Ventile außer V6 geschlossen. Dadurch wird der Abschluss der Kapillare ermöglicht. Anschließend beginnt der Takt von vorn.
Die fertige strangförmige Kapsel wird dann aus dem röhrenförmigen System ausgetrieben und kann nun in das zentrale Nervensystem einer Ratte implantiert werden. Durch die strangförmige Ausrichtung der Kapsel und die Anordnung der neuronalen Zellen in einem Bereich der Kapsel und des von diesem Bereich entfernt angeordneten Lockstoffes erfolgt ein kontrolliertes und zielgerichtetes Wachstum von Neuriten der neuronalen Zellen. Die vernetzte Hülle bietet einen guten mechanischen Schutz für die Transplantation und weiterhin ist eine gute Ausrichtung der Kapsel durch ihre Form bei der Transplantation gegeben.
Beispiel 2
Eine Ausführungsart der strangförmigen Kapsel zur Transplantation in das zentrale Nervensystem von Ratten besitzt die Dimensionen 12mm (Länge) × 1mm (Durchmesser). Dabei ist das Endstück an Zone 1 verschlossen und an Zone 2 offen (2).
Das Wandmaterial besteht aus Alginat bei einer Wandstärke von 100 µm. Den Zellflüssigkeiten A und B und den extrazellulären Matrix-Bereichen (ECM) A und B liegen ein Dulbecco‘s Modified Eagle Medium (DMEM) mit zusätzlichen Aminosäuren, Vitaminen und Salzen zu Grunde. In der Zone 1 sind als Zellflüssigkeit A die Zellen (neuronale Stammzellen, 1·10⁶ Stück) in DMEM enthalten, zusammen mit den Wachstumsfaktoren Epidermal Growth Factor (EGF) und Fibroblast Growth Factor (FGF). Die ECM A in Zone 1 enthält Faktoren, welche die Differenzierung und das Überleben der Zellen unterstützen. Hier wird dies durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) gewährleistet. Die Zellflüssigkeit B in Zone 2 enthält den differenzierenden Faktor Sonic Hedgehog (SHH). Die ECM B in Zone 2 enthält den Neuritenlockstoff Netrin.
Der Durchmesser der Zellflüssigkeiten A und B in Zone 1 und 2 beträgt 300 µm. Die ECM-Flüssigkeiten haben eine Wanddicke von 250 µm. Die Länge der Zone 1 beträgt 1200 µm, die der Zone 2 10800 µm.
Bezugszeichenliste

1: Mikrofluidiksystem
2: Wand der röhrenförmigen Kammer
3: Pumpe zur Flüssigkeitszufuhr
4: Flussrichtung
5: Polymerisationszone
6: fertige strangförmige Kapsel
7: Stufe 1
8: Stufe 2
9: Stufe 3
10: Stufe 4
11: Zwischenraum zwischen 2 aufeinanderfolgenden Kapseln
12: Zone 1
13: Zone 2
14: Hülle
F1: Zellflüssigkeit A
F2: Zellflüssigkeit B
F3: ECM-Flüssigkeit A
F4: ECM-Flüssigkeit B
F5: Monomerflüssigkeit
F6: Hüllflüssigkeit
V1–V4: Ventil V1 bis V4
D1: Innendurchmesser der rohrförmigen Kammer im Bereich der Flüssigkeitszuführung
D2: Innendurchmesser der rohrförmigen Kammer im Bereich des Kapselaustritts

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Freeman, T.B. et al, Ann. Neurol. 38, 379, 1995 [0004]
McKinnon et al: Biomat. Science, 289, 93, 2013 [0006]
Naganuma, Y. et.al.: MEMS 2012, pp. 953, 2012 [0007]
Cheng, T.Y. et al.: Lab Chip 4, 576, 2004 [0008]
Jeong, W. et al: Lab Chip 4, 2004 [0009]
Lan, W.J. et al.: Ind. Eng. Chem. Res. 52, 6770, 2013 [0010]

Claims

Verfahren zur Herstellung von eine oder mehrere neuronale Zellen enthaltende strangförmige Kapseln, bei dem mit einem Mikrofluidiksystem eine koaxial rotationssymmetrisch hydrodynamisch fokussierte, unidirektionale, laminare Flüssigkeitsströmung aus mehreren sich ganz oder teilweise ummantelnden Flüssigkeitsströmungen über mehrere in Reihe angeordnete Zuführeinrichtungen realisiert wird, wobei eine erste Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer neuronalen Zelle mindestens in einer Nährlösung realisiert wird, anschließend eine zweite Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer Flüssigkeit mit mindestens einem Wachstumsfaktor vollständig oder teilweise ummantelnd um die erste Flüssigkeitsströmung realisiert wird, wobei der mindestens eine Wachstumsfaktor in Bereichen räumlich unterschiedlich zum Bereich der mindestens einen neuronalen Zelle in Strömungsrichtung angeordnet ist, danach eine dritte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einem extrazellulären Matrix-Material (ECM) um die erste und/oder zweite Flüssigkeitsströmung vollständig oder teilweise umhüllend angeordnet wird, danach eine vierte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einem vernetzbaren Material um die erste und/oder zweite und/oder dritte Flüssigkeitsströmung vollständig oder teilweise umhüllend angeordnet wird, und anschließend eine fünfte Flüssigkeitsströmung mit mindestens einer Hüllflüssigkeit vollständig oder teilweise umhüllend um alle Flüssigkeitsströmungen angeordnet wird, nachfolgend die gesamte Flüssigkeitsströmung aus dem Mikrofluidiksystem entfernt und mindestens das vernetzbare Material vernetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als Wachstumsfaktor Proteine, Peptide, und/oder Antikörper, vorzugsweise VEGF, FGF-2, FGF-8, Neurotrophin-3 und/oder Sonic Hedgehog, eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als ECM Collagen, Fibrin, Chemoattractants und/oder Chemorepellents eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als vernetzbare Materialien Polymere, vorzugsweise supramolekulare Hydrogele, Ca-Alginat, Gelatine, Polydimethylsiloxan, Polyethylenglycol, Chitosan, Alginat-Agarose, Polyacrylamide, Polyacrylate, Polyvinyle, Polyethersulfone, Epoxydharze und/oder Acrylharze, eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Vernetzung durch Polyaddition, thermische Polymerisation, radikalische Polymerisation, Polykondensation, Lösungsmittelextraktion, Komplexbildung, Selbstassemblierung, Redox-Reaktion, Bioconjugat-Chemie, Phasenumwandlung, Gelbildung und/oder UV-Photopolymerisation realisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als Zuführeinrichtungen Pumpen, und/oder Ventile, vorteilhafterweise mit Steuereinheiten versehen, eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem nach Entfernung der gesamten Flüssigkeitsströmung aus dem Mikrofluidiksystem die Hüllflüssigkeit entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem durch Steuerung der Zuführeinrichtungen des Mikrofluidiksystems bezogen auf das Medium eine nicht-kontinuierlichen Flüssigkeitsströmung realisiert wird.
Strangförmige Kapsel mindestens bestehend aus mindestens zwei übereinander angeordneten rotationssymmetrischen Hüllen, die mindestens eine oder mehrere neuronale Zellen in mindestens einer Nährlösung und mindestens einen, räumlich von den neuronalen Zellen getrennt angeordneten Wachstumsfaktor aufweisen, wobei die unmittelbar in Kontakt mit der Nährlösung und dem Wachstumsfaktor befindliche Umhüllung aus mindestens eine ECM-Flüssigkeit gebildet ist, und die mindestens zweite Hülle aus einem vernetzten Material besteht.
Strangförmige Kapsel nach Anspruch 9, bei der die Zone der Kapsel, in der sich der mindestens eine Wachstumsfaktor befindet, eine gradierte Konzentration an Wachstumsfaktor mit abnehmender Konzentration in abnehmender Entfernung zur einen oder mehreren neuronalen Zellen aufweist.
Strangförmige Kapsel nach Anspruch 9, bei der die Hülle aus dem vernetzen Material stoffdurchlässig für Nähr- und Signalstoffe ist.
Strangförmige Kapsel nach Anspruch 9, bei der die Hüllen der Kapseln an mindestens einem Ende, vorteilhafterweise an beiden Enden, geschlossen ausgeführt sind.
Strangförmige Kapsel nach Anspruch 9, bei der die Kapsel eine Länge und einen Durchmesser besitzt, welche direkt an die geometrischen Abmaße der zu ersetzenden neuronalen Zellen im Zielorganismus angepasst sind und im Bereich von 1 mm bis 50 mm Länge und 50 µm bis 10 mm Durchmesser liegen.
Strangförmige Kapselnach Anspruch 9, bei der eine Zone der Kapsel, in der die eine oder mehreren neuronalen Zellen angeordnet sind, eine Länge und einen Durchmesser von 100 µm bis 5 mm, vorteilhafterweise von 200 µm bis 2 mm, aufweist.
Strangförmige Kapsel nach Anspruch 9, bei der eine Zone der Kapsel, in der die eine oder mehreren Wachstumsfaktoren angeordnet sind, eine Länge von 500 µm bis 10 mm, vorteilhafterweise 1 bis 5 mm, und einen Durchmesser von 100 µm bis 3mm, vorteilhafterweise 100 µm bis 1 mm, aufweist.