DE102015115359A1

DE102015115359A1 - Biosensorchip

Info

Publication number: DE102015115359A1
Application number: DE102015115359.9A
Authority: DE
Inventors: Stefan Arnold; Christian Meyer
Original assignee: Bpc Arnold Biopharma Consulting GmbH
Current assignee: Bpc Arnold Biopharma Consulting GmbH
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2017-03-16
Anticipated expiration: 2035-09-12
Also published as: WO2017042262A1; DE102015115359B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensorchip, umfassend ein metallbeschichtetes Substrat, eine vernetzte Polymerschicht und mindestens einen Rest, der über die Bindungsstellen auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebracht ist, der einzelne definierte, räumlich getrennte Bereiche mit unterschiedlichem Derivatisierungsgrad als Messbereiche (Spots) umfasst. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Biosensorchips, die Verwendung des Biosensorchips zur Interaktionsanalyse, in Screeningverfahren oder als Microarray in der bildgebenden Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) sowie einen SPR-Imager, welcher den erfindungsgemäßen Biosensorchip enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensorchip, ein Verfahren zur Herstellung des Biosensorchips, die Verwendung des Biosensorchips zur Interaktionsanalyse, in Screeningverfahren oder als Microarray in der bildgebenden Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) sowie einen Surface Plasmon Resonance Imager, welcher den erfindungsgemäßen Biosensorchip enthält. Die Erfindung betriff darüber hinaus auch eine Chromatograpiphase, welche durch die Verwendung des Biosensorchips erhältlich ist.
Der Nachweis von beispielsweise bioorganischen Makromolekülen über Affinitätsreaktionen an Biosensoren ist weit verbreitet. Dies erfordert Substrat-Oberflächen, die mit einem Interaktionspartner der wechselwirkenden Biomoleküle beschichtet sind (Analyt-/Festphasen-Methode). Um diesen Reaktionspartner dauerhaft auf einer Substratoberfläche immobilisieren zu können, ist diese zuvor chemisch so zu modifizieren, dass reaktive Kupplungsgruppen zur Immobilisierung bereitgestellt werden. Bei diesen Kupplungsgruppen handelt es sich typischerweise um reaktive Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Acylhalogenid-, Aldehyd-, Isothiocyanat- oder Epoxygruppen, die über Spacer kovalent mit der Oberfläche verknüpft sind.
Die Bereitstellung von Kupplungsgruppen zur Immobilisierung kann z.B. über sog. Ankermoleküle erfolgen. In der WO 98/40739 A1 ist ein schrittweiser Aufbau einer verdünnten Bindeschicht beschrieben, bei der in einem ersten Schritt Cystamin auf eine Goldoberfläche aufgebracht wird und die Bereitstellung von Maleimid als Kupplungsgruppe durch eine zweite chemische Reaktion realisiert wird.
Eine häufig gewählt Strategie zur Immobilisierung eines Interaktionspartners geht von Filmen aus organischen Monolagen aus (Bain und Whitesides, Angew. Chem., 101, (1989), 522–528; Zhong und Porter, Anal. Chem. (1995), 709A–715A). Zur Erzeugung solcher Filme sind Verfahren bekannt, bei denen funktionalisierte Alkylthiole auf Gold chemisorbiert werden (Bardea, A.; Dagan, A.; Willner, I. Anal. Chim. Acta 385, (1998), 33–43). Die langkettigen Moleküle packen sich dabei als hochgeordnete Monoschicht (self-assembled monolayer, SAM) auf der Festphase.
Nach dem Stand der Technik finden auch häufig hydrophile Polymere als Substratbeschichtung Verwendung, um die Anzahl potentieller Bindungsstellen für Makromoleküle zu erhöhen. Hierzu zählen Polyether, wie z.B. Polyethylenglycol, Polysaccharide, wie z.B. Dextran, Polyalkohole, wie z.B. Polyvinylalkohol, oder auch Polyamide, wie z.B. Polyacrylamid. Für Biosensorische Zwecke ist aus dem US Patent 5,436,161 die Verwendung dünner Hydrogelschichten aus carboxylierten Polysacchariden, wie beispielsweise Carboxymethyldextran, bekannt.
In der DE 100 36 907 A1 ist eine biospezifische Beschichtung beschrieben, bei der eine hydrophile Polymerschicht auf ein goldbeschichtetes Glassubstrat aufgebracht wird. Die funktionalisierten Polymerketten der Polymerschicht sind bürstenartig, also senkrecht zur Substratoberfläche, ausgerichtet, und über diese Polymerschicht wird weiterhin eine Dextranschicht gelegt.
Bevorzugte Einsatzgebiete für derartige Analyt-/Festphasenkonjugate sind einerseits Reinigungsverfahren, bei welchen aus komplexen Gemischen zu isolierende Liganden an den immobilisierten Analyten gebunden werden können; andererseits werden solche Konjugate im analytisch/diagnostischen Bereich, insbesondere im Rahmen von Screening-Verfahren, verwendet, beispielsweise zum Nachweis bestimmter Liganden in biologischen Flüssigkeiten oder für diagnostische Verfahren im Bereich der DNA-Technologie. Bei Letzterem kommen Festphasenkonjugate in immer stärkerer Zahl als Biosensorchips zur Anwendung.
Die Interaktionsanalyse wird beispielsweise auch in der pharmazeutischen Industrie zur Suche nach Wirkstoffen eingesetzt. Hierbei gilt es, eine möglichst große Anzahl an unterschiedlichen Proben in einem möglichst kurzen Zeitraum zu analysieren, um schnellstmöglich beliebigen Prozessbedingungen simulieren zu können. Dabei besteht ein wachsendes Interesse daran, Testsysteme für Vorstudien oder „trouble shooting“-Studien, zu entwickeln, die in der Lage sind, eine große Anzahl an identischen und unterschiedlichen Molekülen gleichzeitig einer bestimmten Testmethode zur Quantifizierung biospezifischer Bindungseigenschaften zu unterziehen, und die einen direkten Vergleich mit anderen möglichen Varianten erlauben, um spezifisch wirkende Moleküle zu identifizieren, z.B. mittels High-Throughput-Screening (HTS). Ein häufig eingesetztes Verfahren zur Untersuchung von Bindungseigenschaften ist die Oberflächenplasmonenresonanz (surface plasmon resonance, SPR). Die SPR-Technologie ermöglicht eine hochsensible Messung der Masseveränderung, die während der Wechselwirkung des mobilen mit dem immobilisierten Bindungspartners auf der Oberfläche des Biosensorchips auftritt.
Mit einer solchen Parallelisierung eng verbunden sind die gleichzeitige Automatisierung der Testabläufe sowie die direkte Übertragbarkeit der Ergebnisse auf entsprechend aufgebaute Chromatographiephasen. Weiterhin finden derartige Interaktionsanalysen auch für das Genomstudium (Polymorphismen-(SNP) oder Expressionsmusteranalyse) oder auch in der agrochemischen Industrie sowie in der Lebensmittelanalytik Verwendung.
Neumann, et al. („SPR-based Fragment Screening: Advantages and Application", Current Topics in Medical Chemistry, 2007, 7, 1630–1642) beschreiben einen Biosensorchip für das Screening kleiner Molekülfragmente (100 bis 300 Dalton) mittels SPR-Technologie. Dabei werden markierte Fragmente mittels pintool spotting kovalent über Spacermoleküle an eine hochgeordnete Monoschicht (SAM), die auf eine Goldoberfläche aufgebracht ist, gebunden. Die derart präparierten Biosensorchips werden anschließend mittels high-throughput SPR (HT-SPR) auf Bindung bestimmter Zielmoleküle, z.B. Proteine, Enzyme, Rezeptoren, etc., gescreent werden. Dieses System weist jedoch den Nachteil auf, dass spezifische Bindungsumgebungen wie in/auf Chromatographiephasen nicht gegeben sind und somit keine repräsentativen Bindungsparameter erhalten werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Biosensorchips, insbesondere eines Biosensorchips zur Anwendung in der SPR-Technologie, der eine gegenüber dem Stand der Technik zur Identifizierung geeigneter Polymerbeschichtungen, verschiedener Restevariationen und -kombinationen bzw. eines geeigneten Derivatisierungsgrades der Chipoberfläche eine signifikante Vervielfachung des Durchsatzes ermöglicht. Dadurch können auch Vorstudien zur Prozessentwicklung mit Findung optimaler Binde-, Wasch- und Elutionsbedingungen sehr schnell durchgeführt werden. Eine weitere Aufgabe bestand in der Bereitstellung eines Biosensorchips, mit dem schnell beliebige Prozessbedingungen simuliert und das Bindungsverhalten untersucht werden können, um eine direkte Übertragung der erhaltenen Ergebnisse auf entsprechend aufgebaute Chromatographiephasen zu gewährleisten.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen Biosensorchip, umfassend

– ein metallbeschichtetes Substrat;
– eine Polymerschicht, die auf das metallbeschichtete Substrat aufgebracht ist und die auf ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen als Bindungsstellen aufweist;
– mindestens einen Rest, der über die Bindungsstellen auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebracht ist,

Ein Biosensorchip im Sinne der Erfindung ist ein Festphasenträger, der aus einem Substrat besteht und der erfindungsgemäß eine Polymerschicht umfasst, an welche Reste gebunden sind, die in der Lage sind, an bestimmte Zielmoleküle, z.B. Biomoleküle, zu binden. Die Zielmoleküle können auf diese Weise detektiert und/oder beeinflusst werden, so dass biochemische Nachweise oder markierungsfreie optische biomolekulare Interaktionsanalysen, insbesondere Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), ermöglicht werden.
Durch Kombination des erfindungsgemäßen Biosensorchips mit SPR-Imaging können Bindungskinetik und Bindungsaffinitäten der an die mit Resten oder Restekombinationen modifizierte Polymerbeschichtung auf der Oberfläche des erfindungsgemäßen Biosensorchip gebundenen Zielmolekülen in einem Messgang quantitativ bestimmt und miteinander verglichen werden, und die erhaltenen Ergebnisse direkt auf entsprechend aufgebaute Chromatographiephasen übertragen werden. Das System stellt somit ein ideales Modellsystem für eine Chromatographiephase dar und kann für „trouble shooting“-Studien eingesetzt werden. Zudem kann eine deutlich erhöhte Anzahl von Phasen- bzw. Restekombinationen gescreent werden, was eine Voraussetzung für die Lösung komplexer Bindungsaufgabenstellungen ist.
Die räumliche Ausgestaltung des Biosensorchips zum Einsatz im Rahmen der Erfindung ist nicht eingeschränkt, obwohl insbesondere für Sensoranwendungen bevorzugt planare, zweidimensional ausgedehnte Strukturen verwendet werden. Je nach Anwendungsbereich kommen aber gegebenenfalls auch dreidimensional gestaltete Formen, wie Kugeln oder Netzwerke in Frage.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden als Substrate solche Materialien ausgewählt, die für biotechnologische Problemstellungen oder Analysen an sensorischen Funktionsflächen in Frage kommen. Werden reflexionsoptische Verfahren, wie z.B. die Oberflächenplasmonresonanz, eingesetzt, besteht das Substrat vorzugsweise aus einem für einen Laserstrahl transparenten Material aus der Gruppe umfassend Kunststoffe, zum Beispiel Polymethylmethacrylat, Polyethylenterephthalat, Polycarbonat und Cycloolefinpolymer, Metalle, Metalloxide und Silikate, wie z.B. Glas, Quarz oder Keramiken.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, dass das Substrat mit einem Metall beschichtet ist. Vorzugsweise ist das Metall ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium und Aluminium sowie Kombinationen daraus. Gold ist besonders bevorzugt.
Erfindungsgemäß ist eine Polymerschicht auf das metallbeschichtete Substrat aufgebracht, in der die Polymere untereinander vernetzt vorliegen. Die vernetzte Polymerschicht kann kovalent an die metallbeschichtete Substratoberfläche gebunden sein, oder über nicht-kovalente Wechselwirkungen. Bevorzugt ist die Polymerschicht über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die metallbeschichtete Substratoberfläche gebunden.
Eine kovalente Bindung der Polymerschicht an das Substrat kann über Ankermoleküle erfolgen. Geeignete Ankermoleküle umfassen zumindest zwei funktionelle Einheiten, die an entgegengesetzten Enden des Ankers vorliegen, und die zum einen die Verknüpfung mit der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats, zum anderen die Anbindung der Polymerschicht ermöglichen. Die funktionelle Gruppe zur Bindung an das metallbeschichteten Substrats ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: -SH, -SS-, -SeH, -SeSe, and -COSH. Die funktionelle Gruppe zur Bindung an die Polymerschicht ist ausgewählt aus der Gruppe typischer Kopplungsreagenzien, zum Beispiel bestehend aus einer Epoxid-, einer Hydroxyl-, einer Carboxyl- einer Succinimidyl- oder einer Alkoxy-Gruppe. Bevorzugte Ankermoleküle sind Succinimidyl-Gruppen.
Als mögliche nicht kovalente Wechselwirkungen der Polymerschicht mit dem metallbeschichteten Substrat sind unter anderem zu nennen: Wasserstoffbrückenbindungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, van-der-Waals-Wechselwirkungen, Charge-Transfer-Wechselwirkungen, z.B. π-π-Wechselwirkungen, ionische Wechselwirkungen, koordinative Bindung, z.B. an Übergangsmetallen, und Kombinationen dieser Wechselwirkungen.
Die Polymerschicht umfasst vorzugsweise zumindest ein Polymer, das Aminogruppen enthält. Am meisten bevorzugt ist hierbei Polyvinylamin. Andere geeignete Polyamine sind beispielsweise Polyethylenimin, Polyallylamin und dergleichen. Aber auch Polymere, die andere funktionelle Gruppen als Aminogruppen aufweisen, wie zum Beispiel Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure bzw. deren Vorläuferpolymere, wie beispielsweise Polymaleinsäureanhydrid, Polyamide oder Polysaccharide (Cellulose, Dextran, Pullolan, usw.) sowie Copolymere hiervon sind geeignet.
Das zu vernetzende Polymer weist vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 1000000 g/mol, mehr bevorzugt von 7500 bis 250000 g/mol und am meisten bevorzugt von 10000 bis 100000 g/mol auf.
Das Polymer kann durch alle Beschichtungsverfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Polymerchemie bekannt sind, auf die metallbeschichtete Substratoberfläche aufgebracht werden, wie beispielsweise Gasphasenabscheidung, Adsorption, Polymerisation aus der Flüssig-, Gas- oder Plasmaphase, Spin-Coating, Oberflächenkondensation, Benetzung, Eintauchen, Sprühen, Einweichen, Bedampfen, Anlegen von elektrischen Feldern oder Druck, sowie Verfahren, die auf molekularer Selbstassemblierung basieren, wie beispielsweise Flüssigkristalle oder Langmuir-Blodgett-Schichtbildung. Das Polymer kann hierbei direkt als Einzelschicht oder Mehrfachschicht auf das Substrat aufgebracht werden, oder durch schrittweises wiederholtes Aufbringen von Einzelschichten.
Erfindungsgemäß sind die Polymere der Polymerschicht untereinander vernetzt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Vernetzungsgrad der vernetzten Polymerschicht mindestens 5 %, basierend auf der Anzahl der vernetzbaren Gruppen in der Polymerschicht. Weiterhin bevorzugt beträgt der Vernetzungsgrad 5 % bis 30 %, weiter bevorzugt 5 bis 20 % und am meisten bevorzugt 10 bis 15 %, basierend auf der Anzahl der vernetzbaren Gruppen in der Polymerschicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Polymere der Polymerschicht durch mindestens ein chemisches Vernetzungsreagenz kovalent miteinander vernetzt. Der Vernetzungsgrad kann durch die stöchiometrische Menge des mindestens einen zur Vernetzung des Polymers eingesetzten Vernetzungsreagenzes sehr leicht eingestellt werden, wobei davon ausgegangen wird, dass nahezu 100 Mol-% des Vernetzungsreagenzes Vernetzungen ausbilden. Dies kann durch analytische Verfahren nachgewiesen werden. Beispielsweise kann der Vernetzungsgrad durch MAS-NMR-Spektroskopie und quantitative Bestimmung der Menge des Vernetzungsreagenzes in Bezug auf die Menge an Polymer bestimmt werden. Dies stellt die bevorzugte Methode dar. Der Vernetzungsgrad kann auch durch IR-Spektroskopie bestimmt werden, zum Beispiel anhand der C-O-C- oder OH-Schwingung unter Verwendung einer Eichkurve. Beide Verfahren stellen analytische Standardmethoden für einen Fachmann dar.
Durch die erfindungsgemäße Vernetzung wird aus der oberflächenfixierten Polymerschicht eine makromolekulare Oberfläche aufgebaut, die im Vergleich zu gängigen linearen Linkersystemen mit bürstenartig ausgerichteten Polymerketten zwei entscheidende Vorteile aufweist. Durch die (kovalente) Vernetzung der Polymerschicht besitzt die Oberflächen zum einen eine erhöhte physikalisch-chemische Stabilität und ermöglicht damit die verlustfreie Regeneration der mit (bioorganischen) Makromolekülen beladenen Oberflächen (beispielsweise Biosensor-Oberflächen). Zum anderen weist die Polymerschicht jedoch immer noch eine hohe Flexibilität der Polymerketten auf, und die damit verbundenen Eigenschaften einer hohen Lösungsmittel-Aufnahmekapazität sowie einer hohen Diffusivität. Die Polymerschicht befindet sich folglich in einem homogenen, biokompatiblen, weichen und Gel-artigen Zustand, der es erlaubt, das die Zielmoleküle (Biomoleküle) komplett oder teilweise in die Polymerschicht eintauchen können. In Kombination mit der verwendeten Funktionalisierung der Polymerschicht, wie nachfolgend beschrieben, werden auf der gesamten Oberfläche des erfindungsgemäßen Biosensorchips quasi-dreidimensionale Wechselwirkungsbereiche geschaffen, die eine optimale und mehrfache Kontaktierung mit den Bindungsstellen der Zielmoleküle ermöglichen, wodurch sich eine hohe Sensitivität bei heterogenen Affinitätsreaktionen ergibt.
Das mindestens eine Vernetzungsreagenz zur Vernetzung der Polymerschicht ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dicarbonsäuren, Diaminen, Diolen und Bis-Epoxiden, zum Beispiel 1,10-Decandicarbonsäure, Ethylenglykoldiglycidylether (EGDGE) oder 4,4'-Biphenylbicarbonsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Vernetzungsreagenz ein lineares, konformativ flexibles Molekül mit einer Länge zwischen 1 bis 20 Atomen.
Der erfindungsgemäße Polymerfilm weist trotz Vernetzung immer noch die Fähigkeit zu Schwellen oder zu Schrumpfen auf, wobei die tatsächliche Dicke des Films stark von dem verwendeten Lösungsmittel abhängig ist.
Erfindungsgemäß weist das vernetzte Polymer funktionelle Gruppen auf. Unter dem Begriff „funktionelle Gruppen“, wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, werden Atomgruppen verstanden, die zu dem vernetzten Polymer auf der Oberfläche des Substrats gehören, oder zu dem vernetzbaren Polymer während der Herstellung der Polymerschicht auf der Oberfläche des Substrats. Die funktionellen Gruppen enthalten vorzugsweise mindestens eine schwache Bindung und/oder ein Heteroatom, mehr bevorzugt eine Gruppe, die nukleophile oder elektrophile Eigenschaften zeigt. Demgemäß umfasst der Begriff „funktionelle Gruppe“ sämtliche chemische Strukturen, die an der Bildung kovalenter Bindungen aber auch nicht-kovalenter Wechselwirkungen beteiligt sein können. Erfindungsgemäß stellen die funktionellen Gruppen somit auch chemische Bindungsstellen auf der Oberfläche der Polymerschicht dar.
Bevorzugte funktionelle Gruppen sind primäre und sekundäre Amino-Gruppen sowie Hydroxyl-, Carboxy- oder Estergruppen. In Abhängigkeit von der Acidität/Basizität des sie umgebenden Mediums können Aminogruppen als protonierte Ammoniumionen vorliegen, und Carboxygruppen als deprotonierte Carboxylat-Ionen.
Erfindungsgemäß liegen die funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der vernetzten Polymerschicht, die als Bindungsstellen dienen, zumindest teilweise substituiert/derivatisiert mit mindestens einem Rest vor. Die Reste haben die Aufgabe, bestimmte Zielmoleküle, z.B. Biomoleküle, durch eine chemische Wechselwirkung zu binden. Die chemische Wechselwirkung ist hierbei ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hydrophoben Wechselwirkungen, hydrophilen Wechselwirkungen, Kationenaustausch, Anionenaustausch, Größenausschluss und/oder Metallionen-Chelatbildung.
Der Begriff "Derivatisierung" umfasst jede chemische Reaktion, die dazu geeignet ist, einen spezifischen Rest auf der Oberfläche der Polymerschicht aufzubringen, insbesondere durch Reaktion der funktionellen Gruppen, die als Bindungsstellen auf der Oberfläche der Polymerschicht dienen, mit einem Derivatisierungsreagenz, welches den gewünschten Rest oder eine Vorläuferverbindung hiervon enthält. Die Umsetzung einer funktionellen Gruppe zu einer anderen, reaktiven funktionellen Gruppe soll ebenso durch den Begriff "Derivatisierung" abgedeckt sein.
Unter dem Begriff "Rest" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede eindeutig definierbare chemische Einheit oder eine eindeutig identifizierbare, für gewöhnlich wiederholt auftretende Anordnung chemischer Einheiten gleicher oder unterschiedlicher Natur verstanden, die sich im Nanomaßstab zu einem Komplex oder einem Bereich mit hoher und/oder selektiver Affinität gegenüber zumindest einer komplementären Struktur oder Oberflächenregion zumindest eines Zielmoleküls assemblieren können, vorausgesetzt, die Affinität ist stärker als eine van-der-Waals-Wechselwirkung mit CH- oder CH₂-Einheiten der Polymerketten der Polymerschicht auf der Oberfläche des Biosensorchips. Der Rest kann vollständig synthetisch oder natürlich sein, oder eine Kombination hiervon. Zudem kann der Rest mehr als eine eindeutig definierbare chemische Einheit umfassen, einschließlich solche chemischen Einheiten, die vergleichsweise unreaktiv sind, wie beispielsweise Alkyl- oder Alkenyl-Einheiten, die aber dennoch zur Ausbildung hydrophober oder dispersiver Wechselwirkungen geeignet sind.
Erfindungsgemäß wird jeweils nur ein bestimmter Anteil der funktionellen Gruppen derivatisiert, wodurch die Oberfläche des Biosensorchips einzelne definierte, räumlich begrenzte Bereiche aufweist, auf denen der mindestens eine Rest so aufgebracht ist, dass auf den Bereichen jeweils ein vorgegebener unterschiedlicher Derivatisierungsgrad durch eine unterschiedliche Sättigung der Bindungsstellen mit dem mindestens einen Rest eingestellt ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Derivatisierungsgrad", dass ein bestimmter Prozentsatz der vorhandenen funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der Polymerschicht gezielt mit dem entsprechend ausgewählten mindestens einen Rest umgesetzt wird. Eine vollständige Derivatisierung (Derivatisierungsgrad = 100 %) würde bedeuten, dass 100 % der funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der Polymerschicht durch einen Rest substituiert/derivatisiert vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Sättigung der Bindungsstellen mit dem einen Rest von > 0 % bis 100 Dabei kann die Sättigung der Bindungsstellen mit dem mindestens einen Rest, und damit der Derivatisierungsgrad, in einzeln definierten Bereichen auf der Oberfläche der des Biosensorchips unterschiedlich sein, so dass räumlich begrenzte Messbereiche (Spots) mit gewünschten unterschiedlichen Derivatisierungsgraden auf der Oberfläche des Biosensorchips ausgebildet sind.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind ein erster Rest und ein zweiter Rest, der verschieden von dem ersten Rest ist, auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebracht, wobei die beiden unterschiedlichen Reste in den einzeln definierten, räumlich getrennten Bereichen des Biosensorchips jeweils in unterschiedlichen Verhältnissen bzw. Konzentrationen zueinander aufgebracht sein können. Auf diese Weise können mehrere Reste mit gewünschten Derivatisierungsgraden auf dem Biosensorchip vorliegen.
Erfindungsgemäß sind auf der Oberfläche des Biosensorchips wenigstens zwei Einzelbereiche mit der gleichen Derivatisierung und dem gleichen Derivatisierungsgrad vorhanden, um wenigstens eine Zweifachbestimmung zur Erhöhung der Messgenauigkeit zu ermöglichen.
Die zwei Einzelbereiche mit gleicher Derivatisierung und gleichem Derivatisierungsgrad sind auf der Oberfläche des Biosensorchips bevorzugt nicht benachbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform, sind auf der Oberfläche des Biosensorchips wenigstens drei Einzelbereiche mit der gleichen Derivatisierung und dem gleichen Derivatisierungsgrad vorhanden, um wenigstens eine Dreifachbestimmung zu ermöglichen, wodurch die Messgenauigkeit weiter erhöht werden kann.
Der aufzubringende Rest kann in Abhängigkeit des Zielmoleküls frei gewählt werden. Der Rest kann eine geradkettige, verzweigte oder zyklische aliphatische Gruppe, oder eine aromatische oder heteroaromatische Gruppe, die substituiert oder unsubstituiert vorliegen kann. Bevorzugt enthält der Rest Heteroatome, zum Beispiel N, O, P, S Atome und dergleichen, die zur Wechselwirkung mit dem zu bindenden Zielmolekül geeignet sind.
Insbesondere kann der Rest eine monovalente lineare aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen sein, oder eine verzweigte oder zyklische aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 3 bis 40 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere CH₂-Einheiten in dieser Gruppe durch O, S, -S(O)₂-, -C(O)NH- oder -C(S)NH-substituiert sein können, ein oder mehrere Wasserstoffatome durch F, Cl, Br, -CN oder -NC substituiert sein können und besagte Gruppen eine oder mehrere Doppelbindungen zwischen zwei Kohlenstoffatomen enthalten können.
Besonders bevorzugte monovalente lineare aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen, oder verzweigte oder zyklische aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 3 bis 40 Kohlenstoffatomen sind ausgewählt aus der Gruppe: Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec-Butyl (1-Methylpropyl), tert-Butyl, iso-Pentyl, n-Pentyl, tert-Pentyl (1,1-Dimethylpropyl), 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl (Neopentyl), 1-Ethylpropyl, 2-Methylbutyl, n-Hexyl, iso-Hexyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethylbutyl, 1-Methylbutyl, 1,1-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Tridecyl, n-Tetradecyl, n-Pentadecyl, 1-Hexylnonyl, n-Hexadecyl, 1-Hexyl-decyl, n-Heptadecyl, n-Octadecyl, n-Nonadecyl, -(CH₂)₂₀CH₃, -(CH₂)₂₁CH₃, -(CH₂)₂₂CH₃, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2-Ethylhexyl, Trifluormethyl, Pentafluorethyl, 2,2,2-Trifluorethyl, Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Pentenyl, Cyclopentenyl, Hexenyl, Cyclohexenyl, Heptenyl, Cycloheptenyl, Octenyl oder Cyclooctenyl, wobei eine oder mehrere, vorzugsweise eine, CH₂-Einheit in besagter Gruppe durch O, S, -S(O)₂-, -C(O)NH- or -C(S)NH- substituiert sein kann, und wobei ein oder mehrere Wasserstoffatome durch F, Cl, Br, -CN oder -NC, substituiert sein können, wobei F und -CN bevorzugt sind.
Weitere als Reste geeignete aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen oder verzweigte oder zyklische aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 3 bis 40 Kohlenstoffatomen sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 2570183 A1 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Offenbarungsgehalt hiermit vollständig Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Rest ein monovalentes mono- oder polyzyklisches aromatisches Ringsystem mit 6 bis 28 aromatischen Ringatomen sein, wobei ein oder mehrere Wasserstoffatome durch D, F, Cl, OH, C₁- bis C₆-Alkyl, C₁- bis C₆-Alkoxy, NH₂, -NO₂, -B(OH)₂, -CN oder -NC substituiert sein können.
Besonders bevorzuge aromatische Ringsysteme sind: Biphenyl, Triphenyl, Naphthyl, Anthryl, Binaphthyl, Phenanthryl, Dihydrophenanthryl, Pyren, Dihydropyren, Chrysen, Perylen, Tetracen, Pentacen, Benzpyren, Fluorin, Inden und Ferrocenyl.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Rest ein monovalentes mono- oder polyzyklisches heteroaromatisches Ringsystem mit 5 bis 28 aromatischen Ringatomen, wobei das heteroaromatische Ringsystem mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus N, O, S und Se (die übrigen Atome sind Kohlenstoffatome) enthält.
Besonders bevorzugte heteroaromatische Ringsysteme sind beispielsweise 5-gliedrigen Ringe, wie z.B. Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Tetrazol, Furan, Thiophen, Selenophen, Oxazol, Isoxazol, 1,2-Diazol, 1,3-Diazol, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol und 1,3,4-Thiadiazol, 6-gliedrige Ringe, wie z.B. Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, 1,3,5-Triazin, 1,2,4-Triazin, 1,2,3-Triazin, 1,2,4,5-Tetrazin, 1,2,3,4-Tetrazin, 1,2,3,5-Tetrazin, oder kondensierte Gruppen, wie beispielsweise Indol, Isoindol, Indolizin, Indazol, Benzimidazol, Benzotriazol, Purine, Naphthimidazol, Phenanthrimidazol, Pyridimidazol, Pyrazinimidazol, Chinoxalinimidazol, Benzoxazol, Naphthoxazol, Anthroxazol, Phenanthroxazol, Isoxazol, Benzothiazol, Benzofuran, Isobenzofuran, Dibenzofuran, Chinolin, Isochinolin, Pteridin, Benzo-5,6-chinolin, Benzo-6,7-chinolin, Benzo-7,8-chinolin, Benzoisochinolin, Acridin, Phenothiazin, Phenoxazin, Benzopyridazin, Benzopyrimidin, Chinoxalin, Phenazin, Naphthyridin, Azacarbazol, Benzocarbolin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Thieno[2, 3b]thiophen, Thieno[3, 2b]thiophen, Dithienothiophen, Isobenzothiophen, Dibenzothiophen, Benzothiadiazothiophen oder Kombinationen dieser Gruppen. Am meisten bevorzugt sind Imidazol, Benzimidazol und Pyridin.
Weitere als Reste geeignete monovalente mono- oder polyzyklische aromatische Ringsysteme mit 6 bis 28 aromatischen Ringatomen und weitere geeignete monovalente mono- oder polyzyklische heteroaromatische Ringsysteme mit 5 bis 28 aromatischen Ringatomen sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 2570185 A1 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Offenbarungsgehalt hiermit vollständig Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Rest entweder eine organische kationische Gruppe oder eine organische protonierbare Gruppe, das heißt, eine Gruppe die in Lösung als kationische Gruppe vorliegen kann. Vorzugsweise liegt diese Gruppe in einer wässrigen Lösung mit einem pH im Bereich zwischen 6 und 8 in kationischer Form, das heißt, in protonierter Form, vor. Dabei sollen unter dem Begriff "organische Gruppe" nicht nur solche Gruppen verstanden werden, die Wasserstoff und Kohlenstoff enthalten, sondern auch solche, die Stickstoff und Wasserstoff enthalten, wie beispielsweise Amine.
Weitere als Reste geeignete organische protonierbare oder organische kationische Gruppen sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 2570182 A1 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Offenbarungsgehalt hiermit vollständig Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Rest eine deprotonierbare Gruppe oder eine anionische Gruppe, das heißt, eine Gruppe, die in Lösung als anionische Gruppe vorliegen kann. Vorzugsweise liegt diese Gruppe in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Bereich zwischen 6 und 8 vollständig oder teilweise in anionischer Form, das heißt in deprotonierter Form, vor. Ebenfalls umfasst sind polare Gruppen, die ein Wasserstoffatom aufweisen, welches mittels stärkerer Basen abgespalten werden kann, wobei diese Wasserstoffatome vorzugsweise an ein Heteroatom gebunden sind.
Weitere als Reste geeignete deprotonierbare oder anionische Gruppen sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 2570181 A1 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Offenbarungsgehalt hiermit vollständig Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Rest ein monovalentes mono- oder polyzyklisches aromatisches Ringsystem mit 6 bis 28 aromatischen Ringatomen oder ein monovalentes mono- oder polyzyklisches aromatisches Ringsystem mit 5 bis 28 aromatischen Ringatomen, wie zuvor beschrieben, das mit einer anionischen Gruppe oder einer deprotonierbaren Gruppe, wie zuvor beschrieben, substituiert vorliegt. Bevorzugt liegen diese Gruppen in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Bereich zwischen 6 und 8 vollständig oder teilweise als ionische Gruppen vor. Diese Gruppen umfassen auch polare Gruppen, die ein Wasserstoffatom aufweisen, welches mittels stärkerer Basen abgespalten werden kann, wobei diese Wasserstoffatome bevorzugt an ein Heteroatom gebunden sind.
Solche Reste sind insbesondere in der Europäischen Patentanmeldung EP 2570184 A1 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Offenbarungsgehalt hiermit vollständig Bezug genommen wird.
Im Gegensatz zu den Resten sind die funktionellen Gruppen primär nicht dazu gedacht mit Analyten zu wechselwirken, obwohl nicht komplett ausgeschlossen werden kann, dass diese dennoch eine Wechselwirkung mit den Analyten eingehen.
Die vorliegende Erfindung ist des Weiteren auf ein Verfahren zur Herstellung des zuvor beschriebenen Biosensors gerichtet, umfassend die Schritte:

a) Aktivieren der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats;
b) Aufbringen einer Polymerschicht auf das metallbeschichtete Substrat;
c) Vernetzen der Polymere der Polymerschicht;
d) Aufbringen des mindestens einen Rests auf die Oberfläche der Polymerschicht, wobei der mindestens eine Rest so aufgebracht ist, dass auf einzelnen definierten, räumlich begrenzten Bereichen der Polymerschicht jeweils ein vorgegebener unterschiedlicher Derivatisierungsgrad eingestellt ist; und
e) gegebenenfalls sequentielles Aufbringen weiterer Reste auf die Polymerschicht, wobei die weiteren Reste jeweils in unterschiedlichen Konzentrationen und unterschiedlichen Verhältnissen zu dem mindestens einen Rest gemäß Schritt d) auf den einzelnen definierten, räumlich begrenzten Bereichen der Polymerschicht aufgebracht sind.

Das verwendete Material für das Substrat ist abhängig vom eingesetzten Messverfahren. Werden reflexionsoptische Verfahren, wie z.B. die Oberflächenplasmonresonanz, eingesetzt, besteht das Substrat vorzugsweise aus einem für einen Laserstrahl transparenten Material aus der Gruppe umfassend Kunststoffe, zum Beispiel Polymethylmethacrylat, Polyethylenterephthalat, Polycarbonat und Cycloolefinpolymer, Metalle, Metalloxide und Silikate, wie z.B. Glas, Quarz oder Keramiken. In diesem Zusammenhang ist es wünschenswert, dass das Substrat aus einem Material gebildet ist, welches keine Anisotropie in Bezug auf die Polarisation zeigt.
Die Metallschicht kann sowohl unter Zuhilfenahme einer Zwischenschicht, die der Haftvermittlung dient, auf das Substrat aufgebracht sein, wie beispielsweise eine Chromschicht, als auch in direktem Kontakt mit dem Substrat sein. Das Metall, welches für den Metallfilm verwendet wird, ist nicht speziell eingeschränkt, solange es zur Erzeugung von Oberflächenplasmonresonanz geeignet ist. Vorzugsweise ist das Metall ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium und Aluminium sowie Kombinationen daraus. Gold ist besonders bevorzugt.
Die Dicke der Metallschicht kann frei gewählt werden. Vorzugsweise liegt die Dicke der Metallschicht jedoch im Bereich von 0,1 nm bis 500 nm, und mehr bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 200 nm. Wenn die Dicke der Metallschicht 500 nm übersteigt, kann der Effekt der Oberflächenplasmonresonanz nicht ausreichend detektiert werden. Für den Fall, dass eine Chromschicht oder dergleichen zwischen dem Substrat und dem Metallfilm eingefügt ist, ist die Dicke der eingefügten Schicht vorzugsweise in dem Bereich von 0,1 nm bis 10 nm.
Die Metallschicht kann durch bekannte Verfahren auf dem Substrat ausgebildet werden, wie beispielsweise Gasphasenabscheidung, Kathodenzerstäubung, Ionenplattieren, Galvanisieren und nicht-elektrolytisches Plattieren.
Zur Aktivierung der metallbeschichteten Substrat-Oberfläche wird diese erfindungsgemäß zunächst mit einer reaktiven Initiator Gruppe modifiziert, d.h. die Initiatorgruppe wird mit einer (unmodifizierten) Substrat-Oberfläche verbunden, bevor dann in einem Folgeschritt die (modifizierte) Substrat-Oberfläche mit dem Polymer verknüpft (und somit weiter modifiziert) wird. Die Modifikation der Substrat-Oberflache kann unter Einsatz von Standardmethoden erfolgen.
Die reaktive, oberflächengebundene Initiator-Gruppe kann dabei ausgewählt sein aus einer der folgenden chemisch reaktiven Gruppen: Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Acylhalogenid-, Ester-, Aldehyd-, Epoxy- oder Thiolgruppe. Sie kann auch ausgewählt sein aus einer der folgenden biologisch oder chemisch reaktiven Gruppen: Disulfide, Metallchelate, Nucleotide- und Oligonucleotide, Peptide oder Haptene, wie beispielsweise Biotin-, Digoxigenin-, Dinitrophenylgruppen oder ähnliche Gruppen.
Soll die Polymerschicht kovalent an die aktivierte metallbeschichtete Substrat-Oberfläche gebunden werden, erfolgt die Anbindung über Ankermoleküle aus der Gruppe typischer Kopplungsreagenzien, zum Beispiel bestehend aus einer Epoxid-, einer Hydroxyl-, einer Carboxyl- einer Succinimidyl- oder einer Alkoxy-Gruppe. Bevorzugte Ankermoleküle sind Succinimidyl-Gruppen. Das Aufbringen der Ankermoleküle erfolgt über Reaktion der Metalloberfläche mit funktionellen Gruppen der Ankermoleküle z.B. -SH, -SS-, -SeH, -SeSe, and -COSH- Gruppen.
Das Polymer kann durch alle Beschichtungsverfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Polymerchemie bekannt sind, auf die metallbeschichtete Substratoberfläche aufgebracht werden, wie beispielsweise Gasphasenabscheidung, Adsorption, Polymerisation aus der Flüssig-, Gas- oder Plasmaphase, Spin-Coating, Oberflächenkondensation, Benetzung, Eintauchen, Sprühen, Einweichen, Bedampfen, Anlegen von elektrischen Feldern oder Druck, sowie Verfahren, die auf molekularer Selbstassemblierung basieren, wie beispielsweise Flüssigkristalle oder Langmuir-Blodgett-Schichtbildung. Das Polymer kann hierbei direkt als Einzelschicht oder Mehrfachschicht auf das Substrat aufgebracht sein, oder durch schrittweises wiederholtes Aufbringen von Einzelschichten.
Nach Aufbringen des vernetzbaren Polymers auf der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats folgt erfindungsgemäß ein Vernetzungsschritt. Zur Erzeugung des polymeren Netzwerks (derivatisiert oder underivatisiert) kann jedes Verfahren herangezogen werden, welches einem Fachmann bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Vernetzung der Polymerschicht durch mindestens ein Vernetzungsreagenz und die Polymere sind kovalent miteinander vernetzt. Das mindestens eine Vernetzungsreagenz ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dicarbonsäuren, Diaminen, Diolen und Bis-Epoxiden, zum Beispiel 1,10-Decandicarbonsäure, Ethylenglykoldiglycidylether (EGDGE) oder 4,4'-Biphenylbicarbonsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Vernetzungsreagenz ein lineares, konformativ flexibles Molekül mit einer Länge zwischen 1 bis 20 Atomen.
Das vernetzbare Polymer bildet erfindungsgemäß auf der Substratoberfläche eine Polymerschicht aus. Der Begriff "Polymerschicht" oder "Polymerfilm" bezeichnet das Vorhandensein eines zwei- oder vorzugsweise dreidimensionalen synthetischen oder biosynthetischen polymeren Netzwerks aus mindestens einer Lage, für gewöhnlich jedoch zwischen einigen und wenigen zehn molekularen Polymerlagen. Die Polymerschicht kann aus einer chemisch homogenen Zusammensetzung bestehen, oder aus zumindest zwei unterschiedlichen Polymerarten, deren Ketten sich gegenseitig durchdringen (zum Beispiel Polyacrylsäure und ein Polyamin).
Bei einer möglichen Ausführungsform der Erfindung ist die Polymerschicht, deren Polymere untereinander durch kovalente Bindungen vernetzt sind, durch nicht-kovalente Wechselwirkungen an das darunterliegende metallbeschichtete Substrat gebunden, das bedeutet, die Polymerschicht ist nur durch physikalische und/oder chemische Adsorption an das metallbeschichtete Substrat gebunden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das vernetzbare Polymer zunächst auf der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats adsorbiert und anschließend vernetzt. Die Vernetzung des Polymers kann jedoch auch erst nach der Derivatisierung der funktionellen Gruppen mit dem mindestens einen Rest durchgeführt werden.
Der Vernetzungsgrad der Polymerschicht liegt bevorzugt im Bereich von 5 % bis 30 %, basierend auf der Anzahl der funktionellen Gruppen, die zur Vernetzung zur Verfügung stehen. Die Vernetzung erfolgt vorzugsweise durch Kondensation funktioneller Gruppen, es können jedoch auch alle anderen in der Polymerchemie bekannten Verfahren angewendet werden, einschließlich radikal- und fotochemische Verfahren. Die Vernetzung kann durch Reaktion zwischen funktionellen Gruppen eines Polymers (intramolekular) und/oder benachbarter Polymere (intermolekular) erfolgen. Die Vernetzung kann zudem auch direkt zwischen funktionellen Gruppen der beteiligten Polymere erfolgen, ohne dass ein Vernetzungsreagenz zugegeben wird. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn Copolymere oder Polymermischungen verwendet werden, die mindestens zwei unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweisen, welche miteinander in Reaktion treten können, wie beispielsweise Aminogruppen und Carboxylgruppen, die nach Aktivierung unter Bildung einer Amidbindung miteinander reagieren können. Vorzugsweise erfolgt die Vernetzung durch Ausbildung einer kovalenten C-N-Bindung, zum Beispiel einer Amid-, Urethan-, Harnstoff- oder sekundären bzw. tertiären Aminbindung, die durch Reaktion aktivierter Carbonsäuren oder Epoxide mit Aminen entstehen.
Durch die intra- und intermolekulare Vernetzung der Polymerschicht wird ein stabiles zwei-, vorzugsweise dreidimensionales Polymernetzwerk ausgebildet. Obwohl die Vernetzung durch jedes aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden kann, einschließlich nicht selektiver Methoden, die auf Radikalbildung basieren, wie beispielsweise elektrochemische, licht- oder durch (ionisierende) Strahlen induzierte Methoden, erfolgt die Vernetzung bevorzugt nur zwischen funktionellen Gruppen des Polymers unter Verwendung mindestens eines Vernetzungsreagenzes, welches dazu in der Lage ist, eine Kondensationsreaktion mit den besagten funktionellen Gruppen einzugehen.
Durch den nicht zu hoch gewählten Vernetzungsgrad weist der erfindungsgemäß vernetzte Polymerfilm einerseits die Fähigkeit zu Schwellen oder zu Schrumpfen auf, andererseits wird durch die intra- oder intermolekulare Vernetzung der Polymerschichten ein stabiles zwei- oder vorzugsweise dreidimensionales Netzwerk gebildet, wodurch eine Desorption von der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats verhindert wird. Eine weitere Erhöhung der Stabilität kann erreicht werden, indem die Ketten der Polymerschicht kovalent an das Substratmaterial gebunden werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Begriff "Vernetzungsgrad" definiert als die maximale Anzahl der durch die Vernetzungsreaktion ausgebildeten Vernetzungen, basierend auf der Gesamtanzahl der funktionellen Gruppen, die zur Vernetzung zur Verfügung stehen. Wenn wie bevorzugt bifunktionale Reagenzien bei der Vernetzung eingesetzt werden, spiegelt der Vernetzungsgrad folglich das molare Verhältnis zwischen der Menge an Vernetzungsreagenz, welches an der Vernetzungsreaktion beteiligt ist, und der Anzahl der funktionellen Gruppen, die in dem Polymer zur Vernetzung zur Verfügung stehen, wider (in diesem Fall bedeutet das, dass zwei funktionelle Gruppen zur Ausbildung einer Vernetzung notwendig sind), vorausgesetzt, die Vernetzungsreaktion verläuft nahezu quantitativ. Prinzipiell ist jedoch sowohl die Bildung von Vernetzungen innerhalb einer Polymerkette bzw. zwischen zwei unterschiedlichen Polymerketten möglich als auch die Entstehung endständiger, nicht vernetzter Seitenketten durch eine unvollständig verlaufende Quervernetzung.
Wie es zuvor bereits beschrieben wurde, enthält das vernetzbare Polymer funktionelle Gruppen, die vor oder nach dem Aufbringen des Polymers auf das metallbeschichtete Substrat, oder vor oder nach der Vernetzung des Polymers durch den mindestens einen Rest substituiert bzw. derivatisiert werden können.
Erfindungsgemäß werden jeweils definierte Teilbereiche der funktionellen Gruppen, die auf der Polymeroberfläche des Biosensors als Bindungsstellen des mindestens einen Rests zu Verfügung stehen, durch den mindestens einen oder die gegebenenfalls mehreren Derivatisierungsschritte derivatisiert. Das bedeutet, dass – unter Berücksichtigung der Reaktivitäten unterschiedlicher funktioneller Gruppen und Reagenzien – jeweils ein gezielt gewählter Prozentsatz der in dem underivatisierten Polymer vorhandenen funktionellen Gruppen, die gleich oder verschieden sein können, zu funktionellen Gruppen umgesetzt werden, die mit dem entsprechend gewählten mindestens einen Rest derivatisiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Sättigung der Bindungsstellen mit dem mindestens einen Rest, was dem Derivatisierungsgrad entspricht, zwischen 0 % und 100 % entsprechend der besten Lösung des Trennproblems.
Wie es ebenfalls zuvor bereits beschrieben wurde, ist der mindestens eine Rest entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise erfindungsgemäß auf einzelne definierte, räumlich begrenzte Bereiche der Polymerschicht jeweils in unterschiedlichen Konzentrationen aufgebracht, und weitere Reste können sequentiell auf den einzeln definierten, räumlich begrenzten Bereichen der Polymerschicht jeweils in unterschiedlichen Konzentrationen und Verhältnissen zu dem mindestens einen Rest aufgebracht sein, so dass der Biosensorchip einzelne definierte, räumlich begrenzte Bereiche umfasst, in denen der mindestens eine Rest mit den gewünschten Derivatisierungsgraden vorliegt, wodurch räumlich definierte Messbereiche (Spots) auf der Oberfläche des Biosensorchips ausbildet werden.
Das Aufbringen des mindestens einen Rests auf die Oberfläche des Biosensorchips unter Einhaltung der gewünschten molaren Verhältnisse, die zur Einstellung des gewünschten Derivatisierungsgrads in dem jeweiligen räumlich getrennten Messbereich notwendig sind, erfolgt bevorzugt unter Verwendung einer Pipettiervorrichtung, einer Tüpfelvorrichtung, einer Mikropipettiervorrichtung, eines Mikrodruckkopfes mit einer Mikrokanal-Flüssigkeitsprozessierungseinheit oder eines Ink-Jet-Verfahrens. Mittels dieser Vorrichtungen bzw. Verfahren ist eine genaue Lokalisierung der einzelnen definierten, räumlich begrenzten Bereiche auf der Oberfläche des Biosensorchips möglich.
Insbesondere für den Fall, dass ein sequentielles Aufbringen mehrere Reste gewünscht ist, kann der Mikrodruckkopf mit einer Mikrokanal-Flüssigkeitsprozessierungseinheit für jeden einzelnen Messbereich über eine Reaktionskammer über die jeweils zugehörigen mikro-Kanäle ein individuelles Reaktionsgemisch mit den entsprechenden Resten automatisiert zuführen, womit ein sequentielles Aufbringen für den jeweiligen Messbereich erreicht wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Biosensorchip als Array mit einer Vielzahl von Feldern bzw. Messbereichen auf einem planaren Festphasenträger ausgebildet sein. Jedes einzelne dieser Felder kann dabei entsprechend den zuvor beschriebenen, einzeln definierten, räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche des Biosensorchips als separate Messoberfläche genutzt werden und. Erfindungsgemäß unterscheiden sich diese Messoberflächen jeweils in der Art bzw. Konzentration des darauf aufgebrachten mindestens einen Rests, wobei die einzelnen Messoberflächen jeweils den gewünschten Derivatisierungsgrad aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung des Biosensorchips zur Herstellung einer Chromatographiphase, zur Interaktionsanalyse, in Screening-Verfahren oder als Mikroarray in der bildgebenden Oberflächenplasmonenresonanz.
Die räumliche Struktur des entstehenden Arrays kann durch eine mechanische Strukturierung des Trägers vorgegeben sein. Werden in der vorliegenden Erfindung strukturierte Trägerplatten als Biosensoroberflächen eingesetzt, so weisen diese bevorzugt eine Vielzahl regelmäßig angeordneter, positionsaddressierbarer Felder zur Bereitstellung von Bindungsstellen auf, wobei diese Felder in Kavitäten mit nur geringer Tiefe lokalisiert sind. Vorzugsweise besitzen die Kavitäten eine Tiefe von 20 bis 100 µm. Dabei wird eine Flüssigkeitsbarriere bereitgestellt, wobei gleichzeitig die Oberfläche so gering wie möglich gehalten wird, um eventuelle unspezifische Adsorptionsphänomene zu minimieren. Weiterhin beinhalten diese Felder die erfindungsgemäße Polymerschicht, die die funktionellen Gruppen als Bindungsstellen zur Aufbringung des mindestens einen Rests bereitstellt, wobei das verwendete Polymer erfindungsgemäß in jedem Feld frei gewählt werden kann. Vorzugsweise ist die Polymerschicht über nicht kovalente Wechselwirkungen oder kovalente Bindungen an die Oberfläche der Trägerplatte gebunden.
Mit Hilfe so ausgestalteter Felder/Messbereiche gelingt es, Nachteile im Hinblick auf eine unspezifische Bindung zu vermeiden oder zu minimieren. Erfindungsgemäß weisen wenigstens zwei dieser Felder die gleiche Derivatisierung auf, um zur Erhöhung der Messgenauigkeit wenigstens eine Zweifachbestimmung zu ermöglichen. Zudem kann die Herstellung einer solchen Trägerplatte dadurch kostengünstig gestaltet werden, das Verfahren und Materialien der Fotolithographie und Ätztechniken, wie sie in der Halbleitertechnik angewendet werden, zum Einsatz kommen.
Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Biosensorchips in Kombination mit der SPR-Technologie kann die Bindung von Zielmolekülen, z.B. Biomolekülen, an bestimmte Reste bzw. Restekombinationen direkt gemessen werden. Die SPR-Technologie ermöglicht dabei, bei geeigneter chemischer Kompatibilität des auf der Oberfläche des Biosensorchips aufgebrachten mindestens einen Rests mit den flüssigkeitsberührenden Oberflächen des SPR-Imagers ein Online-Monitoring sowie eine Quantifizierung der an den Biosensorchip gebundenen Moleküle.
Die SPR-Spektroskopie ist eine wohlbekannte und bedeutende Methode zum Nachweis von Molekülen, insbesondere Biomolekülen, und zur Bestimmung von chemischen Reaktionen an Oberflächen. Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) ist das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen elektromagnetischen Wellen und dem freien Elektronengas einer leitenden Oberfläche. Die Oberflächenplasmonenresonanz basiert auf der internen Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen einem Dielektrikum und einer Metallschicht, das heißt zwischen zwei Medien, deren Dielektrizitätskonstanten unterschiedliche Vorzeichen aufweisen. Eine stark gedämpfte elektromagnetische Oberflächenwelle schreitet entlang der Metallschicht fort. Innerhalb des Volumens der gedämpften elektromagnetischen Welle werden Konzentrationsänderungen, zum Beispiel von Biomolekülen, in Form von Änderungen des Brechungsindex an der Oberfläche detektiert. Dies führt zugleich zu einer Änderung der Resonanzbedingung der an der Metallschicht reflektierten elektromagnetischen Lichtwelle. Jede Brechungsindexänderung im an der bestrahlten Fläche angrenzenden Medium führt zu einer Verschiebung der Resonanz und folglich zu einer Intensitätsänderung des reflektierten Strahls, die zum Beispiel mittels einer CCD-Kamera oder einer Flächenanordnung von Fotodetektoren simultan und ortsaufgelöst gemessen werden kann.
Durch Kombination des erfindungsgemäßen Biosensors mit bildgebender SPR können die entsprechend gleichzeitig auf den einzelnen Spot erfolgten Bindungen von Zielmolekülen an verschiedenen Resten bzw. Restekombinationen gleichzeitig auf einem Biosensorchip gemessen werden.
Durch Online Monitoring, das heißt, die Messung der Bindung erfolgt mittels bildgebender SPR in Echtzeit während ein Analyt, der die Zielmoleküle enthält, durch eine Flusszelle durchfließt, in der der erfindungsgemäße Biosensorchip mit den bindefähigen Resten angebracht ist, ist in einem Messvorgang eine schnelle Quantifizierung der an den erfindungsgemäßen Biosensorchip gebundenen Zielmoleküle möglich, wodurch schnell Informationen über das entkoppelte Bindeverhalten eines Reste oder einer Restekombination mit dem Zielmolekül erhalten werden können, was wiederrum für die einzelnen möglichen Varianten einen direkten Vergleich der Bindungskonstanten in Abhängigkeit von dem gewählten Derivatisierungsgrad in den einzelnen definierten Bereichen des Biosensors ermöglicht.
Die direkte Übertragbarkeit der erhaltenen Messergebnisse auf entsprechend aufgebaute Chromatographiephasen ist aufgrund der hohen Übereinstimmung der dreidimensionalen Bindeplätze auf dem erfindungsgemäßen Biosensorchip und der Chromatographiephasen gewährleistet. Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine Chromatographiephase, die durch den erfindungsgemäßen Einsatz des Biosensorchips hergestellt werden kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein SPR-Imager, der den erfindungsgemäßen Biosensorchip umfasst.
Der Erfindung ermöglicht einen gegenüber heute angewandten Screening-Ansätzen (96 Phasen pro Tag) zur Identifizierung geeigneter Polymerbeschichtungen (Art des Polymers oder Copolymers, Vernetzungsgrad, Schichtdicke), von Liganden und insbesondere Ligandenkombinationen sowie dem Derivatisierungsgrad eine signifikante Vervielfachung des Durchsatzes (bis zu 96 Phasen in 10 Minuten). Durch die schnelle quantitative Bestimmung der Bindungskinetik und der Bindungsaffinitäten der verwendeten Reste bzw. Restekombinationen und die einfache Herstellung von Phasen auf dem erfindungsgemäßen Biosensorchip können entsprechende Phasenbibliotheken angelegt werden. Das Screening der identifizierten Reste bzw. Restekombinationen kann dann auf vorhandenen oder entsprechend neu synthetisierten Phasen der Phasenbibliothek erfolgen.
Dies ermöglicht die Durchführung von Vorstudien zur Prozessentwicklung und Findung optimaler Binde-, Wasch- und Elutionsbedingungen ohne großen Zeitaufwand, die auf mit entsprechenden Resten ausgestatten Chromatographiephasen übertragbar sind. Dadurch kann ein ideales Modellsystem für die Chromatographiephase erhalten werden, welches für "Trouble Shooting"-Studien eingesetzt werden kann, da hiermit beliebige Prozessbedingungen simuliert und das Bindeverhalten ohne Zeitverlust untersucht werden kann. Durch die Erhöhung der Screening-Rate ist die vorliegende Erfindung auch geeignet, um komplexe Bindeaufgabestellungen zu lösen, da in diesen Fällen eine deutlich erhöhte Anzahl von Phasen bzw. Resten oder Restekombinationen gescreent werden müssen.
Im Nachfolgenden soll die Erfindung anhand von Figuren und Beispielen erläutert werden, die jedoch nicht einschränkend auf den Schutzumfang zu verstehen sind.
Beispiel 1: Herstellung eines Biosensorchips
Zur Beschichtung wurden Gold-beschichtete, mit N-Succinimid Spacern funktionalisierte Biosensorchips eingesetzt (e.g. GWC open-platform SPRchip^TM, HORIBA Chip CS SPRi-BioChip^TM). Diese Modifikation der Chip oberfläche erlaubt eine direkte Kopplung von Polymeren über Aminogruppen.
a) Immobilisierung von Polymer an den NHS-aktivierten Sensor Chip:
Der Biosensorchip wird in eine 8–10% Lösung von Polyvinylamin (Molekulargewicht 20–50 kDa) in 100mM Natriumphosphatpuffer pH7 bei 25°C für 120 min inkubiert. Anschließend wird der Chip einmal in Wasser und einmal in Isopropanol gewaschen.
b) Quervernetzung des Polymers in definierten Oberflächenbereichen.
Mittels einer Vorrichtung zum Aufbringen von Nanovolumen (e.g. Wasatch Microfluidics CFM, Arrayit NanoPrint^TM LM60 oder HORIBA SPRi Arrayer^TM) wurden ausgewählte 48 Bereiche (Spots) mit je 3 mal 5 nl einer 0,56 mM Ethylenglycoldiglycidylether Lösung in Isopropanol beaufschlagt und 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der Chip je 10s mit

1. Isopropanol 2. 0,5M Trifluressigsäure in Wasser 3. Wasser 4. Dimethylformamid 5. 0,5M Trifluressigsäurein Dimethylformamid 6. Dimethylformamid gespült.

c) Derivatisierung der Polymeroberfläche mit 2 Liganden
Die Liganden 3-indolylpropansäure und Urocansäure wurden in verschiedenen Verhältnissen in DMF mit Aktivatorreagenz HBTU und Puffer Triethyamin gemäß untenstehendem Mischungsschema gemischt und die 48 Bereiche (4 mal 11 Verschiedene Mischungsverhältnisse, 4 Spots mit DMF/HBTU Mischung ohne Liganden) 3 mal wie unter b) beschrieben mit jeweils 5nl Mischung beaufschlagt. Die Beaufschlagung wurde 2 mal nach jeweils 15 min wiederholt. Tabelle 1
Schema Aufbringung der Reaktionen auf den Biosensorchip
Beispiel 2: IgG Bindung auf dem Biosensorchip bei pH 7.4 in Laufpuffer 1
Der wie in Beispiel 1 vorbereitete Biosensorchip wird in ein geeignetes Surface Plasmon Resonance Imager Gerät (z.B. GWC SPRimager^®II, Horiba SPRI-PLEX II 115 oder vergleichbare Systeme) eingebracht, mit Laufpuffer 1 äquilibriert und die zeitabhängige Bindung ( ) von IgG in Laufpuffer 1 (10µM/ml IgG in 100mM NaKHPO₄ pH7.4) an den verschiedenen mit unterschiedlichen Ligandenverhältnissen beschichteten definierten Bereichen (Spots, ) beobachtet. Die Ablösung des gebundenen IgG erfolgte durch Injektion von Regenierungslösungen RP1 (150mM Natriumazetat pH4.3 + 100mM NaCl) und RP2 (400mm Essigsäure).
Die Negativkontrolle Reaktion 12 (gestrichelte Linie) zeigt nahezu keine Bindung, während bei den verschiedenen unterschiedlichen Derivatisierungsreaktionen mit variablen Verhältnissen der Liganden (Tabelle 1) unterschiedliche Plasmonresonanzintensitäten und damit IgG Bindungen beobachtet werden können. Die Regenierung mit Regenerierungslösung 1 (RP1) war nicht ausreichend um das gebundene IgG vollständig abzulösen. Erst Regenerierungslösung 2 (RP2) löst die gebundenen IgG Moleküle vollständig ab. Die Messkurven erreichen dann wieder die Basislinie (0% Reflectivity).
Die Versuchsanordnung erlaubt somit eine vergleichende Bestimmung der Eignung verschiedener Ligandenkombinationen oder Verhältnisse zur reversiblen Bindung des Zielmoleküls IgG.
Gemittelte Darstellung (n = 3) der Adsorbtionskinetiken von IgG (10µg/ml in 100mM NaKHPO₄ pH7.4) an die 12 verschieden derivatisierten Bereiche auf dem Biosensorchip (je 3 Spots). Nach der IgG Bindung wurde mit Regenerierungslösung 1 (RP1: 150mM Natriumazetat pH4.3 + 100mM NaCl) und anschließend mit Regenerierungslösung 2 (RP2: 400mM Essigsäure) regeneriert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 98/40739 A1 [0003]
US 5436161 [0005]
DE 10036907 A1 [0006]
EP 2570183 A1 [0044]
EP 2570185 A1 [0049]
EP 2570182 A1 [0051]
EP 2570181 A1 [0053]
EP 2570184 A1 [0055]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Zhong und Porter, Anal. Chem. (1995), 709A–715A [0004]
Bardea, A.; Dagan, A.; Willner, I. Anal. Chim. Acta 385, (1998), 33–43 [0004]
Neumann, et al. („SPR-based Fragment Screening: Advantages and Application“, Current Topics in Medical Chemistry, 2007, 7, 1630–1642) [0010]

Claims

Biosensorchip, umfassend – ein metallbeschichtetes Substrat; – eine Polymerschicht, die auf das metallbeschichtete Substrat aufgebracht ist und die auf ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen als Bindungsstellen aufweist; – mindestens einen Rest, der über die Bindungsstellen auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebracht ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere der Polymerschicht untereinander vernetzt sind und wobei der Biosensorchip weiterhin einzelne definierte, räumlich begrenzte Bereiche umfasst, auf denen der mindestens eine Rest so aufgebracht ist, dass auf den einzelnen definierten Bereichen jeweils ein vorgegebener unterschiedlicher Derivatisierungsgrad durch eine unterschiedliche Sättigung der Bindungsstellen mit dem mindestens einen Rest eingestellt ist, wobei wenigstens zwei Einzelbereiche mit der gleichen Derivatisierung und dem gleichen Derivatisierungsgrad vorhanden sind.
Biosensorchip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallbeschichtung des Substrats ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium und Aluminium, sowie Kombinationen daraus.
Biosensorchip nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallbeschichtung des Substrats eine Goldbeschichtung ist.
Biosensorchip nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere der Polymerschicht durch mindestens ein chemisches Vernetzungsreagenz kovalent miteinander vernetzt sind.
Biosensorchip nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das chemische Vernetzungsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dicarbonsäuren, Diaminen, Diolen und Bis-Epoxiden.
Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht aus einem Polyamin oder einem Polyvinylamin oder einem Polyamin-Polyvinylamin-Copolymer besteht.
Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die vernetzte Polymerschicht kovalent oder über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die metallbeschichtete Substratoberfläche gebunden ist.
Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Sättigung der Bindungsstellen mit dem mindestens einen Rest zwischen 0% und 100% liegt.
Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Rest und ein zweiter Rest, der verschieden von dem ersten Rest ist, auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebracht sind.
Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensorchip wenigstens drei Einzelbereiche mit einer gleichen Derivatisierung und einem gleichen Derivatisierungsgrad umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Biosensorchips nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die Schritte, a) Aktivieren der Oberfläche des metallbeschichteten Substrats; b) Aufbringen einer Polymerschicht auf das metallbeschichtete Substrat; c) Vernetzen der Polymere der Polymerschicht; d) Aufbringen des mindestens einen Rests auf die Oberfläche der Polymerschicht, wobei der mindestens eine Rest so aufgebracht ist, dass auf einzelnen definierten, räumlich begrenzten Bereichen der Polymerschicht jeweils ein vorgegebener unterschiedlicher Derivatisierungsgrad eingestellt ist; und e) gegebenenfalls sequentielles Aufbringen weiterer Reste auf die Polymerschicht, wobei die weiteren Reste jeweils in unterschiedlichen Konzentrationen und unterschiedlichen Verhältnissen zu dem mindestens einen Rest gemäß Schritt d) auf den einzelnen definierten, räumlich begrenzten Bereichen der Polymerschicht aufgebracht sind.
Verfahren zur Herstellung eines Biosensorchips nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Rest mittels einer Pipettiervorrichtung, einer Tüpfelvorrichtung, einer Micropipettiervorrichtung, eines Microdruckkopfes mit Microkanal-Flüssigkeitsprozessierungseinheit oder eines Ink-Jet-Verfahrens unter Beibehaltung der gewünschten molaren Verhältnisse aufgebracht wird.
Verwendung eines Biosensorchips gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung einer Chromatographiephase, zur Interaktionsanalyse, in Screening-Verfahren oder als Microarray in der bildgebenden Oberflächenplasmonenresonanz.
Oberflächenplasmonenresonanz-Imager, umfassend einen Biosensorchip gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.