DE102015108849A1 - Verfahren zur Proteinimmobilisierung mittels modifizierter DNase-Domänen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger unter Verwendung eines Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, eine Affinitätsmatrix umfassend mindestens ein derartiges Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, die Verwendung desselben, sowie eine Nukleinsäure, die für ein solches Polypeptid codiert.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger unter Verwendung eines Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, eine Affinitätsmatrix umfassend mindestens ein derartiges Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, die Verwendung desselben, sowie eine Nukleinsäure, die für ein solches Polypeptid codiert.
  • Die Immobilisation von Proteinen spielt eine wichtige Rolle in der Bioanalytik und biotechnologischen Produktion von Feinchemikalien. So wird beispielsweise im Rahmen der pharmazeutischen Wirkstofffindung die Bindung von Substanzen an therapeutisch relevante Proteine („Targets“) durch oberflächenbasierte Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz-(SPR)-Spektroskopie untersucht, wozu die Targets auf Goldoberflächen immobilisiert werden. Eine weitere Anwendung besteht in enzymgekoppelten Immunabsorptionstests (ELISA), die eine Kopplung von Proteinen an die Oberflächen von Mikrotiterplatten erfordern. Auch in der biokatalytischen Herstellung von Naturstoffen nimmt die Kopplung von Enzymen an Festphasen eine bedeutende Position ein, da so eine einfache Abtrennung des löslichen Produkts und eine Wiederverwendung der immobilisierten Enzyme ermöglicht wird.
  • Bezüglich der zahlreichen etablierten Immobilisierungsverfahren für Proteine unterscheidet man kovalente und nicht-kovalente Ansätze. Bei einer kovalenten Kopplung wird das Protein über eine chemische Bindung an die Festphase gebunden. Dies setzt voraus, dass entweder das Protein oder die Oberfläche zunächst chemisch aktiviert werden. Demgegenüber erfordern nicht-kovalente Ansätze keine chemische Vorbehandlung. Die Prinzipien, auf denen nicht-kovalente Verfahren basieren, sind vielfältig und reichen von unspezifischer physikalischer Adsorption zu spezifischen Wechselwirkungen zwischen chemischen Gruppen und Biomolekülen. Häufig verwendete Systeme für spezifische nicht-kovalente Immobilisierungen sind bspw. die Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin, Nickel-Nitriloessigsäure (NTA) und Poly-Histidinsequenzen sowie die Wechselwirkung von Antikörpern mit ihrem spezifischen Epitop.
  • Etablierte kovalente und nicht-kovalente Immobilisierungsverfahren besitzen ein Profil gegensätzlicher Vor- und Nachteile. Kovalente Ansätze weisen eine optimale Stabilität sowie – bei Verwendung gängiger Verfahren – eine hohe Kosteneffizienz auf. Demgegenüber ist die Orientierung der immobilisierten Proteine ungerichtet, die Proteine müssen in hochreiner Form vorliegen, die z.T. harschen Reaktionsbedingungen der chemischen Aktivierung können zu einer Inaktivierung führen, und die fehlende Reversibilität der Immobilisierung kann bei teuren Trägermaterialien (z.B. SPR-Goldoberflächen) erhebliche Kostensteigerungen verursachen, da eine Wiederverwendung der Oberflächen unmöglich ist.
  • Nicht-Kovalente Verfahren verfügen zwar in der Regel nicht über die Stabilität einer kovalenten Kopplung und erfordern zum großen Teil teure Trägermaterialien, jedoch können diese Ansätze viele Nachteile kovalenter Verfahren überwinden: Die Immobilisierung kann unter schonenden Bedingungen erfolgen, die Orientierung der Proteine ist vielfach einheitlich, und zudem ist die Immobilisierung häufig reversibel. Ferner müssen bei spezifischen nicht-kovalenten Verfahren die zu immobilisierenden Proteine nicht aufgereinigt vorliegen, da sie über die spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche in einem Schritt aufgereinigt und immobilisiert werden können.
  • Bisher existiert kein Verfahren, das die Vorzüge von kovalenten und nicht-kovalenten Immobilisierungsansätzen gleichermaßen in sich vereint. Ein System, das viele, jedoch nicht sämtliche genannten Vorteile aufweist, basiert auf der Interaktion zwischen der Desoxyribonuklease-Domäne (DNase-Domäne) des Colicins E7 (DNase E7) und ihrem Inhibitorprotein Im7 (Hosse et al.; Cormann et al.).
  • Bei den Colicinen handelt es sich um eine Gruppe von Bacteriocinen, die von Enterobacteriacae als Antwort auf Stress gebildet werden. Diese Proteine töten Bakterienzellen, indem sie entweder als Ionophore wirken und so eine Depolarisation der inneren Membran herbeiführen, oder im Periplasma oder Cytoplasma lytisch wirken (beispielsweise als Nuklease). Üblicherweise umfasst ein Colicin-Peptid eine zentrale Rezeptor-Domäne, eine N-terminale Translokationsdomäne und eine C-terminale cytotoxische Domäne. Eine Klasse von Colicinen, die enzymatischen E-Klasse Colicine, gelangt ins Innere einer Zelle, indem das Enzym erst mit dem Vitamin B12-Rezeptor Kontakt aufnimmt und dann von dem im Periplasma lokalisierten Tol-Komplex eingeschleust wird. Es sind neun E-Klasse Colicine bekannt: Bei E1 handelt es sich um ein Ionophor-bildendes Colicin, und bei den übrigen entweder um Desoxyribonukleasen (E2, E7, E8 und E9) oder Ribonukleasen (E3, E4, E5 und E6).
  • Die Expression eines Colicins der E-Klasse in einer Wirtszelle gestaltet sich problematisch, da die Wirtszelle in der Lage sein muss, die Aktivität der Nuklease zu kontrollieren, da andernfalls die Nukleinsäuren der Wirtszelle angegriffen werden würden. Dies wird durch Co-Expression der sogenannten „Immunitätsproteine“ verhindert. Bei diesen Immunitätsproteinen handelt es sich um Inhibitoren der Colicine, die an die Colicin-Nukleasedomäne binden und diese so inaktivieren. Der Komplex aus Immunitätsprotein und Colicin wird in die extrazelluläre Umgebung sekretiert und es ist dieser Komplex, der dann an die Zielzelle anbindet. Sobald die Translokation initialisiert ist, dissoziiert das Immunitätsprotein und lässt so die Zielzelle ungeschützt gegenüber der Colicin-Nukleaseaktivität. Ein Beispiel eines solchen Immunitätsproteins ist Im9, das mit einer extrem hohen Affinität (Kd = 10–16 M bei pH 7, 25 °C (Wallis et al.) an die Endonuklease-(DNase)Domäne des Colicins E9 bindet. Ein anderes Beispiel ist das Immunitätsprotein Im3, das an die Ribonuklease-(RNase)Domäne des Colicins E3 bindet (Kd = 10–12 bei pH 7, 25 °C (Walker et al.). Aufgrund dieser sehr hohen Affinitäten stellen die Nuklease-Immunitätsprotein-Komplexe ideale Module für affinitätsbasierte Immobilisierungs- und Aufreinigungsverfahren dar.
  • Ein weiterer Vorteil in der Verwendung der Komplexe aus Colicin-DNase und Im-Protein in affinitätsbasierten Immobilisierungs- und Aufreinigungsverfahren liegt in den ähnlich hohen Spezifitäten der einzelnen DNase-Domänen für ihre jeweiligen, spezifischen Im-Protein-Partner, während die nicht-spezifischen Immunitätsproteine in hohem Maße benachteiligt werden (Li et al.). So bindet beispielsweise das Protein Im7, welches spezifisch für die DNase-Domäne des Colicins E7 ist, an die nicht-verwandte DNase-Domäne des E9 Colicins mit einem Kd-Wert von ungefähr 10–4 M, also um ein 1012-faches schwächer als das spezifische Protein Im9 unter den gleichen Bedingungen.
  • In etablierten Verfahren zur affinitätsbasierten Aufreinigung unter Verwendung von Colicin-DNase-Im-Protein-Komplexen wird beispielsweise die DNase E7 kovalent an das Trägermaterial gebunden und das eigentlich zu immobilisierende Protein (z.B. das pharmakologisch relevante Zielprotein oder das biokatalytisch aktive Enzym) als Fusionsprotein mit Im7 exprimiert (sogenannter „Im7-tag“). Die Immobilisierung erfolgt über die Interaktion zwischen der ans Trägermaterial gebundenen DNase E7 und dem Im7-tag. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber den bisher beschriebenen Methoden sind Folgende:
    • – Reversible Immobilisierung bei gleichzeitiger Stabilität einer kovalenten Kopplung (Hosse et al., 2009);
    • – Einheitliche Orientierung der immobilisierten Proteine (Cormann et al.);
    • – Aufreinigung und Immobilisierung in einem Schritt möglich (Hosse et al.; Cormann et al.);
    • – DNase E7 oder enzymatisch inaktive Punktmutanten können vergleichsweise einfach exprimiert werden (Walker et al.; Hosse et al.) und
    • – DNase E7-Oberflächen weisen eine gute Langzeitstabilität auf (Hosse et al.).
  • Demgegenüber steht jedoch der Nachteil, dass eine gleichzeitige Durchführung von Aufreinigung und Immobilisierung nur unter harschen Bedingungen (Puffer mit hoher Ionenstärke) erfolgen kann, da DNase E7 zur unspezifischen Bindung von vielen Proteinen neigt (Cormann et al.). Diese mangelnde Spezifität schränkt zugleich die Verwendung von DNase E7-Oberflächen im Rahmen der biomolekularen Interaktionsanalyse durch SPR ein.
  • Ein weiteres Problem, das bisher weder durch das DNase E7-System noch durch die übrigen beschriebenen Verfahren gelöst werden konnte, besteht in der Immobilisierung unterschiedlicher Proteine in unmittelbarer räumlicher Nähe. Ein solches Verfahren wäre insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffentwicklung von herausragender Bedeutung, da es sich bei der aktiven Form vieler therapeutisch relevanter Proteine nicht um einzelne Moleküle sondern um Komplexe aus zwei Proteinuntereinheiten (Dimere) handelt. Würde es gelingen diese als Nanostruktur unmittelbar nebeneinander zu immobilisieren, könnte man den aktiven Proteinkomplex auf der Oberfläche nachbilden und Wirkstoffe anhand einer nahezu nativen Struktur des Zielproteins identifizieren und weiterentwickeln.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, die gleichzeitige Aufreinigung und Immobilisation von Zielproteinen unter Verwendung des Colicin-Desoxyribonuklease-Systems auch unter milden Bedingungen zu ermöglichen, die Immobilisation unterschiedlicher Zielproteine in unmittelbarer räumlicher Nähe zu realisieren, sowie die Spezifität des Colicin-Desoxyribonuklease-Immobilisationssystems insgesamt zu verbessern.
  • In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung daher auf ein Verfahren zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, und die derart modifiziert ist, dass sie in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, auf einem festen Träger immobilisiert und dann mit dem Zielprotein, welches mit mindestens einem spezifischen Bindungspartner der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne konjugiert ist, unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Bindung der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne an den mindestens einen spezifischen Bindungspartner erlauben.
  • In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung schließlich auf eine Affinitätsmatrix umfassend einen festen Träger und mindestens ein darauf immobilisiertes Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, die
    • i) in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D);
    • ii) zusätzlich in einer Position, die den Position 43 und 102 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, wobei es sich bei der Substitution in Position 43 um den Austausch der Aminosäure Asparaginsäure (D) gegen bevorzugt Cystein (C) handelt, und/oder bei der Substitution in Position 102 um den Austausch von Histidin (H) gegen bevorzugt Alanin (A);
    • iii) wahlweise mit mindestens einer zweiten modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, einer Variante oder einem funktionalen Fragment davon gemäß Merkmalen i)–ii), die bevorzugt eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 besitzt, über einen Peptidlinker verbunden ist.
  • In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegenden Erfindung auf ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, und die derart modifiziert ist, dass sie in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist.
  • In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines wie hierin beschriebenen Polypeptids zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger.
  • In einem letzten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid wie hierin beschrieben codiert
  • Der Begriff „Variante“, wie hierin in Zusammenhang mit Peptiden, insbesondere einer Proteindomäne, verwendet, bezieht sich auf natürliche oder artifiziell erzeugte Variationen eines nativen Proteins oder einer Domäne davon, die eine gegenüber der Referenzform abgewandelte Aminosäuresequenz aufweisen. Eine solche Variante kann einzelne oder mehrere Substitutionen einer natürlicherweise an der entsprechenden Position vorkommenden Aminosäure durch eine andere, Insertionen (Einfügen von einer oder mehreren Aminosäuren) und/oder Deletionen (Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren) aufweisen, insbesondere eine oder mehrere Substitutionen. Handelt es sich bei dem Protein um ein Enzym, haben derartige Varianten vorzugsweise mindestens 50, vorzugsweise 60 oder mehr, noch bevorzugter 70, 80, 90, 100 % oder mehr der Enzymaktivität der Referenzform. In verschiedenen Ausführungsformen hat eine derartige Variante eine Aminosäuresequenz, die zu der als Referenz dienenden Sequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 % identisch ist. Die Varianten haben vorzugsweise dieselbe Länge wie die Referenzsequenz. Varianten können sich gegenüber der Referenzform durch verbesserte Eigenschaften auszeichnen, wie beispielsweise höhere Enzymaktivität, höhere Stabilität, geänderte Substratspezifität, etc.. Die hierin beschriebenen Varianten der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne zeichnen sich ferner dadurch aus, dass die modifizierten Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entsprechen, invariabel sind, d.h. nicht weiter variiert werden und insbesondere nicht zurück zu der ursprünglichen Aminosäure verändert sind.
  • Der Begriff „funktionales Fragment“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, das im Vergleich zu der als Referenz dienenden Sequenz N- und/oder C-terminal um mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Aminosäuren verkürzt ist, wobei die Funktionalität des Polypeptides durch die Verkürzung nicht wesentlich beeinträchtigt wird, wobei „nicht wesentlich beeinträchtigt“ in diesem Kontext bedeutet, dass das Fragment mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 50% der Aktivität des nicht verkürzten Polypeptids aufweist. Bei der Aktivität kann es sich hierbei um die Bindungsaffinität für einen Bindungspartner oder die enzymatische Aktivität handeln. Die hierin beschriebenen funktionalen Fragmente der modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne zeichnen sich ferner dadurch aus, dass sie mindestens eine, vorzugsweise alle Aminosäuren an der/den modifizierten Position(en), die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht/entsprechen, einschließen, d.h. nicht derart verkürzt sind, dass keine der hierin beschrieben Modifikationen (Substitutionen) mehr in dem Fragment enthalten sind.
  • Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul et al., 1990 und Altschul et al., 1997) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al.), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al.) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren.
  • Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet die Angabe, dass eine Aminosäureposition einer numerisch bezeichneten Position, beispielsweise in SEQ ID NO:1 entspricht, dass die entsprechende Position der numerisch bezeichneten Position in beispielsweise SEQ ID NO:1 in einem wie oben definierten Alignment zugeordnet ist.
  • Wie vorangehend beschrieben, wurde die Wildtyp-DNase E7 bisher erfolgreich zur Immobilisierung von Im7-Fusionsproteinen auf Oberflächen eingesetzt (Hosse et al.; Cormann et al.). Ferner wurden bereits DNase E7-Mutanten exprimiert, deren enzymatische Funktion durch eine Modifikation inaktiviert worden war (Walker et al., 2002).
  • Eine erste Verbesserung gegenüber im Stand der Technik bekannten Verfahren besteht nun in Substitutionen in bestimmten Positionen der Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, einer Variante oder einem funktionalen Fragment davon, so dass positiv geladene Aminosäuren auf der Oberfläche der Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die nicht an der Bindung des Inhibitorproteins beteiligt sind, in negativ geladene Aminosäuren überführt werden ( ).
  • Die Bezeichnung „Substitution“ bezeichnet im Kontext der vorliegenden Erfindung eine punktuelle Abwandlung (Punktmutation) der Aminosäuresequenz eines Polypeptids. Dabei beruht die Abwandlung auf dem Austausch einer im Wildtyp-Protein vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure. Die Aminosäuresequenz eines Polypeptids kann eine oder mehrere Substitutionen gleichzeitig aufweisen. Der Begriff „modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne“ bezeichnet dementsprechend eine Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die an mindestens einer Position in ihrer Aminosäuresequenz eine Substitution aufweist.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet die Bezeichnung „positiv-geladene Aminosäure“, dass die entsprechende Aminosäure unter physiologischen Bedingungen (ungefähr pH 7) eine positiv geladene Seitenkette aufweist, und die Bezeichnung „negativ geladene Aminosäure“, dass die entsprechende Aminosäure unter physiologischen Bedingungen eine negativ geladene Seitenkette aufweist.
  • Die Seitenkette einer Aminosäure umfasst den Teil des Moleküls, der nicht an der Ausbildung einer Peptidbindung innerhalb einer Proteinstruktur beteiligt ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung betreffen Substitutionen einer Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, einer Variante oder eines funktionales Fragmentes, wie voranstehend definiert, mindestens eine der Aminosäuren in den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 der Wildtyp-Colicine E2, E9, E8 und E7. Dabei wird mindestens eine der Aminosäuren in den vorgenannten Positionen der Aminosäuresequenz in eine andere Aminosäure überführt. Der Austausch der im Wildtyp-Protein vorkommenden Aminosäuren besteht dementsprechend in der Überführung in eine andere Aminosäure, vorzugsweise in eine Aminosäure, die keine positive Ladung trägt, beispielsweise Alanin (A), Leucin (L), Glycin (G) oder Valin (V), bevorzugter in eine Aminosäure, die polar ist, beispielsweise Serin (S), Glutamin (Q) oder Asparagin (N), am meisten bevorzugt in eine Aminosäure, die negativ geladen ist, beispielsweise Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D). Eine solche Substitution gemäß der vorliegenden Erfindung besteht, beispielsweise, in dem Austausch der Aminosäure Arginin (R) gegen Glutaminsäure (E) in Position 4, der Aminosäure Lysin (K) gegen Asparaginsäure (D) in Position 13, der Aminosäure Lysin (K) gegen Asparaginsäure (D) in Position 15, der Aminosäure Lysin (K) gegen Glutaminsäure (E) in Position 27, der Aminosäure Lysin (K) gegen Asparaginsäure (D) in Position 40, der Aminosäure Lysin (K) gegen wahlweise Asparaginsäure (D) oder Glutaminsäure (E) in Position 44 und der Aminosäure Lysin (K) gegen Asparaginsäure (D) in Position 47. Durch die Einführung einer Aminosäure mit negativ geladener Seitenkette führt dies zu einer Ladungsumkehr an der entsprechenden Position der Aminosäuresequenz und dementsprechend zu einer Verschiebung der Nettoladung der Proteinoberfläche von positiv hin zu neutral beziehungsweise negativ. Letztendlich führt diese Ladungsumkehr dazu, dass der isoelektrische Punkt von einem stark basischen Wert (beispielsweise DNase E7: 10,15) auf einen nahezu neutralen Wert (beispielsweise modifizierte DNase-Domäne E7: 7,13) abgesenkt werden kann, und die Nettoladung des Proteins bei neutralem pH deutlich geringer ist.
  • Eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, und die derart modifiziert ist, dass sie in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, auf einem festen Träger immobilisiert und dann mit dem Zielprotein, welches mit mindestens einem spezifischen Bindungspartner der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne konjugiert ist, unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Bindung der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne an den mindestens einen spezifischen Bindungspartner erlauben. Dabei sind die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease derart gestaltet, dass sie/es mindestens eine, vorzugsweise alle der vorgenannten Modifikationen umfasst. Generell gelten für die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise für das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease, die in voranstehenden Abschnitten angeführten Definitionen.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Polypeptid“ ein beliebiges Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz eine gemäß der vorliegenden Erfindung modifizierte Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 umfasst. Bevorzugt handelt es sich bei einem solchen Polypeptid beispielsweise um eine Colicin-Desoxyribonuklease E2, E7, E8 oder E9. Prinzipiell eignet sich jedoch jedes Polypeptid, welches in der Lage ist, in seiner nativen Form die biologische Aktivität der enthaltenen modifizierten Colicin-DNase-Domäne, einer Variante oder eines funktionalen Fragments davon umfassend eine Aminosäuresequenz, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, zu gewährleisten.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dient der Immobilisierung und/oder Isolierung und Aufreinigung von einzelnen biologischen Molekülen und/oder Komplexen solcher Moleküle aus Mischungen. Bei diesen Komplexen kann es sich, beispielsweise, um Proteinkomplexe handeln, oder um ein Protein und eine Nukleinsäure, wie beispielsweise Chromatin. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Zielprotein“ daher ein beliebiges Proteinmolekül oder einen Komplex aus mindestens einem Proteinmolekül und einem oder mehreren anderen Molekülen. Das Verfahren kann auch der Immobilisierung bzw. Isolierung von Organellen, Zellmembran(-segmenten) oder sogar ganzen Zellen aus komplexen Mischungen dienen. Darüber hinaus kann es sich bei den Komplexen, die mittels des hierin beschriebenen Verfahrens immobilisiert, isoliert und aufgereinigt werden können, auch um in vitro gebildete Transkriptions- und/oder Translations-Assays handeln, die aus Zellextrakten gewonnen wurden. Diese und weitere Anwendungsmöglichkeiten des hierin offenbarten Verfahrens sind dem Fachmann bekannt.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „fester Träger“ eine beliebige Oberfläche, die zur Immobilisierung von Molekülen, insbesondere Polypeptiden, auf ihrer Oberfläche geeignet ist. Dabei kann es bei einem solchen festen Träger insbesondere eine Oberfläche handeln, die für die Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie geeignet ist. Ein nicht-einschränkendes Beispiel einer solchen Oberfläche ist eine mit carboxymethyliertem Dextran beschichtete Goldoberfläche. Ferner bezeichnet der Begriff „Immobilisation“, bzw. „immobilisiert“ den Zustand der Bindung eines Moleküls, beispielsweise eines Polypeptids, an eine unbewegliche Phase, beispielsweise die Oberfläche eines festen Trägers. Eine derartige Bindung kann kovalent und nicht-kovalent sein. Auch Tags können bei einer solchen Immobilisation eines Moleküls involviert sein, beispielsweise Polyhistidin-Tags. Verfahren zur Immobilisation eines Moleküls, beispielsweise eines Polypeptids, auf einer geeigneten Oberfläche sind dem Fachmann bekannt.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 vorkommenden Aminosäuren an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, gegen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D) ausgetauscht.
  • Die so herbeigeführte Abnahme der Nettoladung der modifizierten DNase-Domänen gegenüber den Wildtyp-Proteinen bewirkt eine deutlich verminderte unspezifische Bindung an DNase-Oberflächen in Puffern mit physiologischer Salzkonzentration (Beispiel 5). So tritt bei Salzkonzentrationen von 150 bzw. 250 mM NaCl keine detektierbare unspezifische Bindung eines Proteingemisches (In-vitro-Translationsreaktion) an Oberflächen auf, die mit modifizierten Varianten der DNasen E7 und E9 beschichtet sind, wie in gezeigt. Während die Wildtyp-DNase E7 ( , durchgezogene Kurven) erst bei einer hohen NaCl-Konzentration von 500 mM keine unspezifische Bindung aufweist, tritt bei den modifizierten DNase-Domäne E7 ( , gestrichelte Kurven) und E9 ( , gepunktete Kurven) auch bei einer physiologischen NaCl-Konzentration von 150 mM keine unspezifische Bindung auf. Demgegenüber erfolgt unter diesen Bedingungen eine deutliche unspezifische Bindung der Lösung an eine Oberfläche mit Wildtyp-DNase E7. Bei höheren Beladungsdichten ist im Fall der Wildtyp-DNase E7 zu einer vollständigen Unterdrückung der unspezifischen Bindung sogar eine NaCl-Konzentration von 1 M notwendig (Cormann et al.).
  • Wird dem Proteingemisch Im7- bzw. Im9-GFP in einer Konzentration von 400 nM zugesetzt, erfolgt eine Bindung an die Wildtyp- ebenso wie an die modifizierten DNase-Domänen ( ). zeigt die Immobilisierung und Aufreinigung von Im9-GFP durch die modifizierte DNase-Domäne E9 (gestrichelte Kurve) sowie Im7-GFP durch die modifizierte DNase-Domäne E7 (durchgezogene Kurve). Daraus folgt, dass eine gleichzeitige Immobilisierung und spezifische Aufreinigung von Im7- und Im9-Fusionsproteinen mit den modifizierten DNase-Domänen bei physiologischer NaCl-Konzentration möglich ist, während eine gute Reinheit bei der Wildtyp-DNase E7 Hochsalzbedingungen erfordert. Da dies das Risiko einer Denaturierung des immobilisierten Proteins erhöht, stellen die modifizierten DNase-Domänen eine deutlich verbesserte Variante zur Aufreinigung und Immobilisierung von Inhibitorfusionsproteinen im Vergleich zur Wildtyp-Form dar.
  • Durch die hierin beschriebenen Modifikationen (Substitutionen) der Aminosäuresequenzen der Colicin-DNase-Domänen der Colicine E2, E9, E8 und E7 kann jedoch nicht nur die Spezifität der Bindung durch den jeweiligen spezifischen Inhibitor verbessert werden. Gleichzeitig werden auch die generell in Immobilisationsverfahren vorteilhaften Eigenschaften der Colicine (Stabilität, Reversibilität der Immobilisierung) bewahrt: zeigt die Immobilisierung von Im7-GFP (400 nM) auf einer Oberfläche mit modifizierter DNase-Domäne E7. Die Immobilisierung erfolgt ohne merkliche Dissoziation von der Oberfläche. Diese ausgezeichnete Stabilität entspricht dem Wildtyp-Protein (Hosse et al.; Cormann et al.). zeigt die auf einer Oberfläche mit modifizierter DNase E7 immobilisierte Menge an Im7 innerhalb von 30 identischen Zyklen aus Immobilisierung und Regeneration (d.h. Ablösen des immobilisierten Proteins von der Oberfläche). Da die Kapazität der Oberfläche während dieses Experiments nahezu konstant ist, erfolgt kein nennenswerter Aktivitätsverlust. Diese positive Eigenschaft des natürlichen Proteins (Hosse et al.) konnte folglich in der modifizierten Variante ebenfalls erhalten werden.
  • Gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren kann die wie voranstehend erläutert modifizierte Colicin-DNase-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon zusätzlich zu der vorgenannten mindestens einen Substitution eine oder mehrere zusätzliche Modifikation(en) (Substitutionen) aufweisen.
  • Eine erste zusätzliche Modifikation besteht darin, ein oberflächenexponiertes Cystein zu erzeugen, das eine gerichtete kovalente Immobilisierung der modifizierten Colicin-DNase-Domäne über die Thiolfunktion der Seitenkette an die Oberfläche eines geeigneten festen Trägers ermöglicht. Eine derartige Modifikation betrifft die Position 43 der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 der natürlichen Colicine E2, E9, E8 und E7. In ihrer Wildtyp-Form weisen die vorgenannten Proteine in Position 43 die Aminosäure Asparaginsäure (D) auf.
  • Eine zweite zusätzliche Modifikation besteht darin, die Endonuklease-Aktivität der jeweiligen Colicin-DNase-Domäne zu inaktivieren, wodurch sowohl die Expression als auch die Aufreinigung des rekombinanten Proteins erheblich erleichtert werden kann. Eine derartige Modifikation betrifft die Position 102 der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 der Wildtyp-Colicine E2, E9, E8 und E7. In ihrer Wildtyp-Form weisen die vorgenannten Proteine in Position 102 die Aminosäure Histidin auf. Die Inaktivierung kann durch den Austausch dieses Histidins mit einer beliebigen anderen Aminosäure realisiert werden, bevorzugt mit einer unpolaren, hydrophoben Aminosäure, beispielsweise Alanin (A), Valin (V), Leucin (L) oder Isoleucin (I).
  • Somit besteht eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darin, dass die modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon zusätzlich in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 43 und 102 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substitution in Position 43 um den Austausch der Aminosäure Asparaginsäure (D) gegen Cystein (C), und/oder bei der Substitution in Position 102 um den Austausch von Histidin (H) gegen Alanin (A).
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, in dem zusätzlich zu der mindestens einen modifizierten Colicin-DNase-Domäne, einer Variante oder einem funktionalen Fragment davon eine zweite Colicin-DNase-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon verwendet wird. In einer solchen Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens zwei modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domänen, Varianten oder funktionale Fragmente davon, die über mindestens einen Peptidlinker verbunden sind. Mögliche Substitutionen in der Aminosäuresequenz dieser mit der ersten modifizierten Colicin-DNase-Domäne fusionierten anderen Colicin-DNase-Domäne umfassen dabei sämtliche vorangehend beschriebene Substitutionen.
  • Linker sind chemische Strukturen, die ein Protein mit einem anderen Protein (im Falle eines Fusionsproteins) oder auch mit einer festen Phase, einem Farbstoff oder einem Tag verbinden. Linker können den jeweiligen Bedingungen und Anforderungen angepasst werden. So sind sie beispielsweise in Länge sowie chemischer Natur variabel und können beispielsweise eher hydrophob oder hydrophil sein, aus einzelnen chemischen Molekülen (z.B. Polyethylenglycol, einzelnen Aminosäuren oder Aminosäurederivaten) oder aus kleinen Polypeptiden bestehen. Ein Linker, der einzelne Proteine miteinander zu einem Fusionsprotein verbindet, sollte so gestaltet sein, dass Expression, Faltung und Aktivität der einzelnen Proteine nicht gestört werden. Spaltbare Linker beinhalten Sequenzen, die von Proteasen erkannt und so gespalten werden, dass die zuvor fusionierten Proteine wieder isoliert vorliegen. Möglichkeiten zur Herstellung von Fusionsproteinen, die mittels eines Linkermoleküls miteinander verbunden sind, sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Linker gemäß der vorliegenden Erfindung sind Peptidlinker, beispielsweise solche die über Peptidbindungen zwei Polypeptide miteinander verbinden. Sie können spaltbar sein, das bedeutet, dass sie, beispielsweise, durch die enzymatische Aktivität einer Protease durch Spaltung einer Peptidbindung in zwei oder mehrere Fragmente zerlegt werden können. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung haben Peptidlinker Längen von 1–50 Aminosäuren, vorzugsweise 2–20 Aminosäuren.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Fusionsprotein“ ein beliebiges artifizielles Polypeptid, umfassend mindestens zwei einzelne Polypeptide, die über mindestens eine Peptidbindung miteinander verbunden (fusioniert) sind. Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff „Fusionsprotein“ somit ein Protein ein, bei dem es sich um ein Konjugat aus zwei oder mehreren (modifizierten) Colicin-DNase-Domänen, Varianten oder funktionalen Fragmenten davon, oder aus dem im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu immobilisierenden und/oder aufzureinigenden Zielprotein und einem für die jeweilige modifizierte Colicin-DNase-Domäne spezifischen Bindungspartner (spezifischen Inhibitor) handeln kann. Beide werden bevorzugt gemeinsam als Fusionsprotein exprimiert und können über einen Peptidlinker variabler Größe miteinander verbunden sein.
  • In einem Polypeptid umfassend eine erste und eine zweite modifizierte Colicin-DNase-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon können die erste modifizierte DNase-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon und die zweite modifizierte Colicin-DNase-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon gleich oder verschieden voneinander sein. So kann es sich beispielsweise um ein Polypeptid umfassend eine erste modifizierte Colicin-DNase-Domäne, eine Variante oder funktionales Fragment davon mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 besitzt, und eine zweite Colcin-DNase-Domäne, eine Variante oder funktionales Fragment davon mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 besitzt, handeln. Da insbesondere die DNasen E7 und E9 eine hohe Spezifität für ihre jeweiligen Inhibitoren (Im7 bzw. Im9) aufweisen, die DNase E7 also kein Im9 und die DNase E9 kein Im7 bindet, können mit einem solchen Konstrukt Im7- und Im9-Fusionsproteine selektiv als Dimer immobilisiert werden. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die zweite modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform weist die erste modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 besitzt, und weist die zweite modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 besitzt.
  • Die Abnahme der Nettoladung der gemäß der vorliegenden Erfindung modifizierten DNase-Domänen bewirkt, wie vorangehend erläutert, nicht nur eine gegenüber den Wildtyp-Proteinen deutlich verminderte unspezifische Bindung an DNase-Oberflächen in Puffern mit physiologischer Salzkonzentration (Beispiel 5), sondern vermindert auch die elektrostatische Abstoßung zweier modifizierter Colicin-DNase-Domänen als Teil eines Fusionsproteins gegenüber den Wildtyp-Varianten deutlich, sodass ein stabiles Dimer gebildet werden kann, das zur Immobilisierung und ggf. auch Stabilisierung oder auch der Erzeugung von definierten Zielprotein-Dimeren geeignet ist.
  • So veranschaulicht die sequentielle Immobilisierung von Im7- und Im9-GFP (durchgezogene Kurve) bzw. Im9- und Im7-GFP (gestrichelte Kurve) durch ein Fusionsprotein aus jeweils einer modifizierten Domäne der DNase E7 und E9. Unabhängig von der Reihenfolge kommt es zu einer Immobilisierung von ungefähr identischen Mengen beider Proteine. Die Stabilität der Bindung entspricht den isolierten DNase-Domänen (vgl. ). Daraus folgt, dass beide DNase-Domänen des Fusionsproteins aktiv vorliegen und auf diese Weise zwei unterschiedliche Proteine in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander immobilisiert werden können.
  • In einer weiteren Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, in dem der mindestens eine spezifische Bindungspartner ein Inhibitor ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Colicin-DNase-Inhibitorprotein Im2, Im7, Im8 und Im9, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Colicin-DNase-Inhibitorprotein Im7 und Im9.
  • Prinzipiell richtet sich die Wahl des mindestens einen spezifischen Inhibitors nach der verwendeten Colicin-DNase-Domäne. Wird, beispielsweise, ein Polypeptid umfassend mindestens eine wie voranstehend beschriebene modifizierte Colicin-DNase-Domäne E7 in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, sollte der korrespondierende spezifische Inhibitor Im7 verwendet werden. Wird hingegen ein Polypeptid umfassend mindestens eine wie voranstehend beschriebene modifizierte Colicin-DNase-Domäne E9 verwendet, sollte der korrespondierende spezifische Inhibitor Im9 verwendet werden. Für den Fall, dass ein Polypeptid umfassend mindestens zwei modifizierte Colicin-DNase-Domänen, wie voranstehend beschrieben, verwendet wird, beispielsweise umfassend eine modifizierte Colicin-DNase-Domäne E7 und eine modifizierte Colicin-DNase-Domäne E9, können die korrespondierenden spezifischen Inhibitoren Im7 und Im9 gemeinsam verwendet werden. Auf diese Weise können ein, zwei oder mehrere unterschiedliche Zielproteine, die zwecks Aufreinigung und/oder Immobilisierung an die spezifischen Inhibitoren gebunden sind, in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander immobilisiert werden, beispielsweise Proteindimere.
  • Dementsprechend besteht eine weitere Ausführungsform darin, dass der mindestens eine spezifische Bindungspartner mit mindestens einem Zielprotein in Form eines Fusionsproteins fusioniert ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der mindestens eine spezifische Inhibitor über ein Verbindungsmolekül mit mindestens einem Zielprotein verbunden und bildet einen Inhibitor-Zielprotein-Konjugat, wobei das Verbindungsmolekül bevorzugt ein Peptidlinker ist. Möglichkeiten zur Herstellung von Fusionsproteinen aus Colicin-Inhibitorprotein und Zielprotein, die mittels eines Linkermoleküls miteinander verbunden sind, sind dem Fachmann bekannt.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung vorgenommen Modifikationen an den Colicin-Desoxyribonuklease-Domänen, Varianten oder funktionalen Fragmenten davon, wie voranstehend definiert, sind übersichtlich in zusammengefasst. zeigt einen direkten Vergleich der Aminosäuresequenzen der Wildtyp-(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4) und der gemäß der vorliegenden Erfindung modifizierten (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8) Colicin-DNase-Domänen E2, E9, E8 und E7. SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10 zeigen die Aminosäuresequenzen der gemäß der vorliegenden Erfindung modifizierten Colicin-DNase-Domäne E9 und E7 als Teil eines Dimers (Fusionsproteins). An sieben Positionen (schwarz hinterlegt: 4, 13, 15, 27, 40, 44, 47) wurden basische Aminosäuren durch negativ geladene Reste ersetzt, wodurch der isoelektrische Punkt der modifizierten Proteine herabgesenkt und die unspezifische Bindung in SPR-Experimenten vollständig unterdrückt werden konnte. Ferner können an den Positionen 43 und 102 (grau) zusätzliche Mutationen, wie hierin beschrieben, eingeführt werden. Durch die Cysteinfunktion an Position 43 wird eine Immobilisierung über eine Thiolfunktion erlaubt. Die Mutation von Histidin 102 zu Alanin führt zu einer Inaktivierung der DNase-Aktivität (Walker et al.) und erleichtert die Expression und Aufreinigung des rekombinanten Proteins. Die DNase-Domänen sind bzgl. ihrer Aminosäuresequenz und dreidimensionalen Struktur nahezu identisch und unterscheiden sich nur in der Bindestelle für die jeweiligen Inhibitorproteine (hellgrau).
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst mehrere Schritte, die nachfolgend beschrieben werden.
  • In einem ersten Schritt erfolgt die Immobilisierung des Polypeptids umfassend mindestens eine gemäß der vorliegenden Erfindung modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon auf der Oberfläche eines festen Trägers, beispielsweise einer Oberfläche, die für die Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie geeignet ist, beispielsweise einer mit carboxymethyliertem Dextran überschichteten Goldoberfläche. Derartige Oberflächen und Möglichkeiten zur Immobilisierung eines Polypeptids umfassend eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder funktionales Fragment davon sind dem Fachmann bekannt und können, beispielsweise, Tags involvieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Immobilisierung allerdings durch Aminkopplung oder über die in der Position, die Position 43 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, durch Substitution eingeführte Thiolfunktionalität des Cysteins (C). Im nächsten Schritt erfolgt das Kontaktieren eines Zielproteins, das mit einem spezifischen Bindungspartner der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, einer Variante oder einem funktionalem Fragment davon fusioniert ist, mit dem immobilisierten Polypeptid. Das Kontaktieren kann das Umfließen, Umspülen und ähnliches umfassen. Um eine hinreichende Bindung des Inhibitors an die auf der Oberfläche immobilisierte DNase-Domäne zu ermöglichen, sollte die Kontaktzeit nicht zu kurz gewählt werden. Die Kontaktzeit kann, beispielsweise, zwischen 0,5 bis 10 min liegen, ist aber nicht auf diesen Bereich beschränkt. Je nach Bedarf kann dann, in einem letzten Schritt, das Eluieren des an die Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon gebundenen Zielproteins erfolgen, beispielsweise unter Verwendung geeigneter Elutionspuffer (Hosse et al.).
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht somit in einem Verfahren umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Immobilisieren des Polypeptids umfassend eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon auf der Oberfläche eines festen Trägers;
    • b) Kontaktieren eines Zielproteins, das mit einem spezifischen Bindungspartner der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, der Variante oder dem funktionalen Fragment davon fusioniert ist, mit dem immobilisierten Polypeptid; und
    • c) wahlweise Eluieren des an die Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment gebundenen Zielproteins.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf eine Affinitätsmatrix umfassend einen festen Träger und mindestens ein darauf immobilisiertes Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, die
    • i) in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D);
    • ii) zusätzlich in einer Position, die den Position 43 und 102 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, wobei es sich bei der Substitution in Position 43 um den Austausch der Aminosäure Asparaginsäure (D) gegen bevorzugt Cystein (C) handelt, und/oder bei der Substitution in Position 102 um den Austausch von Histidin (H) gegen bevorzugt Alanin (A);
    • iii) wahlweise mit mindestens einer zweiten modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, einer Variante oder einem funktionalen Fragment davon gemäß Merkmalen i)–ii), die bevorzugt eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 besitzt, über einen Peptidlinker verbunden ist.
  • Dabei sind die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease derart gestaltet, dass sie/es mindestens eine, vorzugsweise alle der vorgenannten Modifikationen umfasst. Generell gelten für die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise für das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease, die in voranstehenden Abschnitten angeführten Definitionen.
  • In einer Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Affinitätsmatrix, wobei die mindestens eine darauf immobilisierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  • Weiterhin richtet sich die vorliegende Erfindung darüber hinaus auf ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, und die derart modifiziert ist, dass sie in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist. Dabei sind die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease derart gestaltet, dass sie/es mindestens eine, vorzugsweise alle der vorgenannten Modifikationen umfasst. Generell gelten für die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise für das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease, die in voranstehenden Abschnitten angeführten Definitionen.
  • In einer Ausführungsform sind die in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 vorkommenden Aminosäuren in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, gegen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D) ausgetauscht.
  • In einer Ausführungsform weist die modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon zusätzlich in mindestens einer der Positionen, die Position 43 und 102 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure auf.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Substitution in Position 43 um den Austausch der Aminosäure Asparaginsäure (D) gegen Cystein (C), und/oder bei der Substitution in Position 102 um den Austausch von Histidin (H) gegen Alanin (A).
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens zwei modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domänen, Varianten oder funktionale Fragmente davon, die über mindestens einen Peptidlinker verbunden sind.
  • In einer anderen Ausführungsform weist die zweite modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform weist die erste modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 besitzt, und weist die zweite modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz auf, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 besitzt.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptids umfassend mindestens eine wie hierin beschrieben modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger. Dabei sind die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease derart gestaltet, dass sie/es mindestens eine, vorzugsweise alle der vorgenannten Modifikationen umfasst. Generell gelten für die Variante der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease, beziehungsweise für das Fragment der wie hierin beschrieben modifizierten Colicin-Dexoxyribonuklease, die in voranstehenden Abschnitten angeführten Definitionen.
  • Schließlich richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert.
  • Hierbei kann es sich um DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die für ein Polypeptid wie hierin beschrieben codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression des hierin beschriebenen Polypeptids. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon-Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
  • Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekular-biologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA-und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook et. al. bekannt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Spezifität des Colicin-Desoxyribonuklease-Immobilisationssystems verbessert, indem die physikalischen Eigenschaften einer Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne durch Modifikationen (Substitutionen) so verändert werden, dass eine höhere Spezifität erreicht wird, ohne die positiven Eigenschaften des Wildtyp-Proteins (reversible und gleichzeitig stabile Immobilisierung; gute Langzeitstabilität) zu beeinträchtigen. Weiterhin können zwei der so modifizierten DNase-Domänen miteinander fusioniert werden, wodurch eine Immobilisierung der jeweiligen spezifischen Fusionsproteine in unmittelbarer Nähe ermöglicht wird. Dieses System vereint sämtliche Vorteile etablierter kovalenter und nicht-kovalenter Immobilisierungsverfahren und eröffnet erstmals die Möglichkeit selektiv Homo- oder Heterodimere auf Oberflächen zu erzeugen.
  • Beispiele:
  • Beispiel 1: Klonierung der Expressionsplasmide
  • Für die Expression modifizierter Domänen der DNasen E7 und E9 sowie einem Fusionsprotein aus Varianten beider Domänen wurden entsprechende Codon-optimierte Sequenzen mit flankierenden NheI- und PstI-Schnittstellen als lineares DNA-Fragement von Life Technologies bezogen. Die Fragmente wurden mit NheI und PstI restringiert und in eine modifizierte Form des Plasmids pREST6a kloniert, welches eine Expression mit N-terminalem Strep-Tag II ermöglicht (Korste et al.). Ein Codon-optimiertes synthetisches DNA-Fragment, das für Im9 codiert, wurde mit flankierenden NcoI- und NdeI-Schnittstellen ebenfalls von Life Technologies bezogen und in das Plasmid pIVEX2.3d (5Prime) kloniert, wodurch das Plasmid pIVEX23I9N erhalten wurde. Das für superfolder GFP codierende Gen (Pédelacq et al.) wurde von einem bestehenden Plasmid (Wulfhorst et al.) mit den Oligonukleotiden GFP_NdeI_for und GFP_SmaI_rev durch PCR amplifiziert und über NdeI- und SmaI-Restriktion in die Plasmide pIVEX23I9N und pIVEX23IN (Cormann et al.) kloniert. Die so erhaltenen Plasmide ermöglichen eine Expression von superfolder GFP mit N-terminalem Im9- bzw. Im7-tag sowie jeweils einem C-terminalem His6-tag. Für die Expression von Im7 ohne Fusionspartner und der Wildtyp-DNase E7 wurde auf bestehende Expressionsplasmide zurückgegriffen (Cormann et al., Hosse et al.,).
  • Oligonukleotidsequenzen
    • GFP_NdeI_for: SEQ ID NO:11
    • GFP_SmaI_rev: SEQ ID NO:12
  • Beispiel 2: Expression und Aufreinigung der DNase-Domänen
  • Die Expression der DNase-Domänen in E. coli erfolgte unter Verwendung des Expressionsstamms Overexpress C43 (Lucigen). Dazu wurden 200 μl kompetenter Zellen durch Hitzeschock mit dem jeweiligen Expressionsplasmid transformiert und auf einer selektiven LB-Agarplatte (+1% Glukose, 100 μg/ml Ampicilin) ausplattiert. Anschließend wurden 50 ml LB-Medium (+1% Glukose, 100 μg/ml Ampicilin) mit einer Einzelkolonie transformierter Zellen angeimpft und über Nacht unter Schütteln (200 rpm) bei 37 °C angezogen. Am folgenden Tag wurden vier Kulturen von 500 ml LB-Medium (+1% Glukose, 100 μg/ml Ampicilin) mit jeweils 5 ml der Vorkultur inokuliert und bis zu einer optischen Dichte von 0,6 unter Schütteln (200 rpm) bei 37 °C inkubiert. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte durch 0,5 mM IPTG. Nach dreistündiger Expression wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und das Zellsediment in 15 ml TBS-Puffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0) aufgenommen. Nach Zugabe von AEBSF Hydrochlorid (0,1 mM) und Zellaufschluss durch Ultraschallbehandlung wurden unlösliche Zelltrümmer durch Zentrifugationentfernt und jeweils 5 ml des löslichen Überstands auf eine Streptactin-Affinitätschromatographiesäule (Strep-Tactin High Capacity Superflow 1 ml, IBA) aufgetragen. Nach Waschen mit 15 Säulenvolumen TBS-Puffer wurde das rekombinante Protein mit 10 Säulenvolumen Elutionspuffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 2,5 mM Desthiobiotin, pH 8,0) eluiert, gegen 1 l HBS-Puffer (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5) dialysiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Wildtyp-DNase E7 wurde nach einem publiziertem Verfahren (Hosse et al.) exprimiert und aufgereinigt.
  • Beispiel 3: Expression und Aufreinigung von Im7, Im7- und Im9-GFP
  • Die Expression und Aufreinigung von Im7, Im7-GFP und Im9-GFP erfolgte nach einem für Im7 publizierten Verfahren (Cormann et al.). Dazu wurden analog zu den DNase-Domänen Zellen des Stammes Overexpress C43 mit den Expressionsplasmiden transformiert und eine entsprechende Vorkultur angezogen. Mit 2,5 ml dieser Vorkultur wurden 250 ml LB-Medium (+1% Glukose, 100 μg/ml Ampicilin) inokuliert und die Kultur bis zu einer optischen Dichte von 0,6 angezogen. Nach dreistündiger Expression und Zellernte durch Zentrifugation wurden die sedimentierten Zellen in 5 ml IMAC-Puffer (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 7,5) aufgenommen und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt und der Überstand vollständig auf eine mit 5 ml Ni-NTA-Agarose gefüllte Tropfsäule aufgetragen. Kontaminationen wurden durch Waschen mit 7 Säulenvolumen IMAC-Puffer entfernt und das rekombinante Protein mit 4 Säulenvolumen IMAC-Elutionspuffer (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 7,5) eluiert. Nach Dialyse gegen HBS-Puffer wurden die aufgereinigten Proteine in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
  • Beispiel 4: Immobilisierung der DNase-Domänen auf SPR-Oberflächen
  • Die Cystein-haltigen modifizierten DNase-Domänen wurden zunächst mit 2 mM TCEP in HBS-Puffer versetzt um evt. gebildete Disulfidbrücken zu lösen. Anschließend wurden die DNasen mit Zentrifugationskonzentratoren in 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,5) umgepuffert und die Proteinkonzentration auf 0,1 mg/ml eingestellt. Die Immobilisierung auf CM3-SPR-Oberflächen (GE Healthcare) erfolgte mit einem Gerät des Typs Biacore 3000 (GE Healthcare). Dazu wurde die Oberfläche mit einer frisch angesetzten 1:1 Mischung der Stocklösungen von EDC (400 mM) und NHS (100 mM) bei einer Flussrate von 5 μl/min aktiviert. Anschließend erfolgte die kovalente Kopplung der DNasen für 10 min bei einer identischen Flussrate. Die Deaktivierung der Oberfläche erfolgte durch eine Ethanolaminlösung (1 M, pH 8,5) für 7 min bei 5 μl/min.
  • Beispiel 5: SPR-Experimente
  • 5.1 Vergleich der unspezifischen Bindungseigenschaften
  • Zur Quantifizierung der unspezifischen Bindung von Komponenten eines komplexen Proteingemisches an unterschiedliche DNase-Oberflächen wurde ein Reaktionsgemisch des In-vitro-Translationskits „RTS 100 E. coli HY“ (5Prime) 1:1000 in Hepes-Puffer (20 mM Hepes, pH 7,5) mit Salzkonzentrationen von 150, 250 bzw. 500 mM NaCl verdünnt und bei einer Flussrate von 20 μl/min für 4 min über Oberflächen gegeben, auf denen wie unter (4) beschrieben modifizierte Varianten der DNasen E7 und E9 sowie Wildtyp-DNase E7 immobilisiert worden waren. Eine vierte unbehandelte Oberfläche diente als Referenzoberfläche um gesondert unspezifische Bindung an die Oberflächenmatrix zu detektieren. Abschließend wurden unspezifisch an die Oberfläche gebundene Proteine bei einer Flussrate von 60 μl/min durch Injektionen von 60 μl „Gentle Elution Buffer“ (Thermo Scientific) mit Zusatz von 0,05 % (v/v) Tween 20 und 30 μl einer 20 mM Glycinlösung (pH 2,0) entfernt.
  • 5.2 Immobilisierung von Im7-GFP
  • Aufgereinigtes Im7-GFP wurde in einer Konzentration von 400 nM in HBS-Puffer bei einer Flussrate von 20 μl/min für 3 min über eine mit modifizierter DNase E7 beschichtete Oberfläche gegeben und die Dissoziation für weitere 3 min verfolgt. Anschließend wurde das immobilisierte Protein bei einer Flussrate von 60 μl/min durch Injektionen von 60 μl „Gentle Elution Buffer“ (Thermo Scientific) mit
  • Zusatz von 0,05 % (v/v) Tween 20 und 30 μl einer 20 mM Glycinlösung (pH 2,0) wieder von der Oberfläche gelöst.
  • 5.3 Aufreinigung von GFP-Fusionsproteinen auf SPR-Sensoroberflächen
  • Um zu überprüfen ob die spezifische Aufreinigung eines Im7- bzw. Im9-Fusionsproteins aus einem Proteingemisch möglich ist wurde ein Reaktionsgemisch des In-vitro-Translationskits „RTS 100 E. coli HY“ (5Prime) 1:1000 in HBS-Puffer verdünnt und diese Verdünnung mit Im7- bzw. Im9-GFP in einer Konzentration von 400 nM versetzt. Das so verunreinigte Im7- bzw. Im9-GFP wurde bei einer Flussrate von 20 μl/min über Oberflächen gegeben, auf denen zuvor modifizierte Varianten der DNasen E7 (Im7-GFP) bzw. E9 (Im9-GFP) immobilisiert worden waren (vgl. 5.1). Die Dissoziation des immobilisierten Fusionsproteins wurde für 3 min beobachtet und die verbliebene Menge an Fusionsprotein wie unter (5.2) beschrieben entfernt.
  • 5.4 Test der Langzeitstabilität der modifizierten DNasen
  • Die Langzeitstabilität der modifizierten DNase E7 gegenüber den zur Ablösung der Im7-Fusionsproteine verwendeten Lösungen („Gentle Elution Buffer“ +0,05 % (v/v) Tween 20; 20 mM Glycin, pH 2,0) wurde untersucht, indem Im7 ohne Fusionspartner mit einer Konzentration von 400 nM in HBS-Puffer bei einer Flussrate von 20 μl/min über eine Oberfläche mit modifizierter DNase E7 gegeben wurde. Anschließend wurde Im7 wie unter (5.2) für Im7-GFP beschrieben wieder entfernt. Diese Abfolge von Immobilisierung und Regeneration wurde mit derselben Oberfläche in identischer Weise 30mal wiederholt und die jeweils immobilisierte Menge an Im7 bestimmt.
  • 5.5 Sequentielle Immobilisierung von GFP-Fusionsproteinen durch ein dimeres DNase-Konstrukt
  • Die Aktivität der DNase-Domänen des DNase E7/E9-Dimers wurde untersucht indem bei einer Flussrate von 20 μl/min zunächst Im7-GFP in einer Konzentration von 400 nM in HBS-Puffer für 4 min und anschließend analog Im9-GFP über die Oberfläche gegeben wurde. Die Dissoziation wurde für 4 min verfolgt und beide Proteine wie unter (5.2) für Im7-GFP beschrieben von der Oberfläche gelöst. Der Vorgang wurde wiederholt, wobei jedoch die Reihenfolge der Injektionen von Im7- und Im9-GFP umgekehrt wurde.
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  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
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    • Wulfhorst et al. [0075]
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    • Hosse et al. [0075]
    • Hosse et al. [0076]
    • Cormann et al. [0077]

Claims (15)

  1. Ein Verfahren zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, und die derart modifiziert ist, dass sie in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, auf einem festen Träger immobilisiert und dann mit dem Zielprotein, welches mit mindestens einem spezifischen Bindungspartner der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne konjugiert ist, unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Bindung der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne an den mindestens einen spezifischen Bindungspartner erlauben.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruche 1, wobei der mindestens eine spezifische Bindungspartner ein Inhibitor ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Colicin-DNase-Inhibitorprotein Im2, Im7, Im8 und Im9, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Colicin-DNase-Inhibitorprotein Im7 und Im9.
  3. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der mindestens eine spezifische Bindungspartner mit mindestens einem Zielprotein in Form eines Fusionsproteins fusioniert ist.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der mindestens eine spezifische Inhibitor über ein Verbindungsmolekül mit mindestens einem Zielprotein verbunden ist und ein Inhibitor-Zielprotein-Konjugat bildet, wobei das Verbindungsmolekül ein Peptidlinker ist.
  5. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die folgenden Schritte: a) Immobilisieren des Polypeptids umfassend eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon auf der Oberfläche eines festen Trägers; b) Kontaktieren eines Zielproteins, das mit einem spezifischen Bindungspartner der modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, der Variante oder dem funktionalen Fragment davon fusioniert ist, mit dem immobilisierten Polypeptid; und c) wahlweise Eluieren des an die Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment gebundenen Zielproteins.
  6. Eine Affinitätsmatrix umfassend einen festen Träger und mindestens ein darauf immobilisiertes Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, die i) in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D); ii) zusätzlich in einer Position, die den Position 43 und 102 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, wobei es sich bei der Substitution in Position 43 um den Austausch der Aminosäure Asparaginsäure (D) gegen bevorzugt Cystein (C) handelt, und/oder bei der Substitution in Position 102 um den Austausch von Histidin (H) gegen bevorzugt Alanin (A); iii) vorzugsweise eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitz; iv) wahlweise mit mindestens einer zweiten modifizierten Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, einer Variante oder einem funktionalen Fragment davon gemäß Merkmalen i)–ii), die bevorzugt eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 besitzt, über einen Peptidlinker verbunden ist.
  7. Ein Polypeptid umfassend mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, eine Variante oder ein funktionales Fragment davon, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 besitzt, und die derart modifiziert ist, dass sie in mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist.
  8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und das Polypeptid gemäß Anspruch 7, wobei die in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 vorkommenden Aminosäuren an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 4, 13, 15, 27, 40, 44 und 47 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, gegen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D) ausgetauscht sind.
  9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8 und das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon zusätzlich in mindestens einer der Positionen, die Position 43 und 102 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 entspricht, eine Substitution der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 an dieser Position vorkommenden Aminosäure gegen eine andere Aminosäure aufweist, wobei es sich bei der Substitution in Position 43 vorzugsweise um den Austausch der Aminosäure Asparaginsäure (D) gegen Cystein (C) handelt, und/oder bei der Substitution in Position 102 vorzugsweise um den Austausch von Histidin (H) gegen Alanin (A) handelt.
  10. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9 und das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die mindestens eine modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  11. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 und das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Polypeptid mindestens zwei modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domänen, Varianten oder funktionale Fragmente davon umfasst, die über mindestens einen Peptidlinker verbunden sind.
  12. Das Verfahren gemäß Anspruch 11 und das Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei die zweite modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 besitzt.
  13. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 und das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei die erste modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 besitzt, und die zweite modifizierte Colicin-Desoxyribonuklease-Domäne, die Variante oder das funktionale Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, oder 99 %, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 besitzt.
  14. Die Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13 zur Immobilisierung eines Zielproteins auf einem festen Träger.
  15. Eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13 codiert.
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