DE102015015497A1 - Verschiedene Anwendungen von auf hochauflösenden fluoreszenz-basierten Mikroskopiemethoden (RESOLFT/STED u.a.) basierende Verfahren, wie beispielsweise fluoreszenz-basierte Nanostrukturierung - Google Patents

Verschiedene Anwendungen von auf hochauflösenden fluoreszenz-basierten Mikroskopiemethoden (RESOLFT/STED u.a.) basierende Verfahren, wie beispielsweise fluoreszenz-basierte Nanostrukturierung Download PDF

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Abstract

Es wird eine Vorrichtung und ein Verfahren vorgestellt, mit der man Nanostrukturierung/Nanomodifizierung und andere Prozesse gesteuert, kontrolliert und präzise in atomarer Auflösung durchführen kann. Dies wird realisiert durch das zeitlich gezielte Anregen räumlich genau lokalisierter einzelner Fluorophormoleküle oder -atome, damit diese bei Abregung Fluoreszenz-Photonen emittieren, wobei diese emittierten Fluoreszenz-Photonen auf andere in unmittelbarer Umgebung liegende einzelne Atome oder Moleküle treffen, damit bei diesen dem Fluorophor benachbarten oder umliegenden Atomen oder Molekülen bestimmte Vorgänge in atomarer Dimension (z. B. deren (energetischer) Anregung oder Modifizierung, Zerstörung, Defragmentierung, Degradierung von deren physikalisch-chemischer Struktur oder Transport/Bewegen von zumindest einzelnen Molekülabschnitten oder Abtragung/Entfernung/Wegnahme von einzelnen Atomen/Molekülen o. ä.) induziert werden, um eben diese Prozesse wie beispielsweise Nanostrukturierung, Nanomodifizierung oder Informationsspeicherung/Informationsverarbeitung zu ermöglichen. Dabei basieren dieses Verfahren und die entsprechende Vorrichtung auf RESOLFT/STED oder andere hochauflösende Mikroskopiemethoden, wobei jedoch die Photonen des emittierten Fluoreszenzlichtes nicht für die Detektion oder Analyse, sondern für andere Anwendungen, wie eben die bereits oben genannten Prozesse wie Nanostrukturierung/Nanomodifizierung etc. verwendet werden.

Description

  • Einleitung:
  • Es wird ein Verfahren bzw. die entsprechende Vorrichtung angewandt, die auf hochauflösende fluoreszenz-basierte Mikroskopiemethoden (wie beispielsweise RESOLFT/STED) basieren, bei denen ein Fluorophor zur Fluoreszenz angeregt wird und daraufhin ein Fluoreszenz-Photon emittiert. Das emittierte Fluoreszenz-Photon wird dann jedoch nicht wie üblich durch einen Detektor detektiert, sondern wird auf das den Fluorophor umgebende Material gelenkt, um dort einzelne Atome oder Moleküle zeitlich und räumlich präzise und genau individuell anzusteuern, um a) deren phys.-chem. Eigenschaften hochaufgelöst zeit- und punktgenau zu verändern und/oder b) für weitergehende Schritte, die in der Mikro- und Nanotechnik üblich sind, vorzubereiten.
  • Es werden verschiedene Anwendungen diskutiert.
  • Stand der Technik:
  • Es folgt eine Übersicht über die zu Zeit gängigen hoch- oder superauflösenden Mikroskopiemethoden. Viele von ihnen basieren auf Fluoreszenztechniken.
  • RESOLFT:
  • RESOLFT (Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions) umfasst die beiden superauflösenden Fluoreszenz-Mikroskopietechniken STED und GSD. In der Literatur wird allerdings manchmal RESOLFT und STED gleichgesetzt.
  • STED:
  • Das STED (Stimulated emission depletion microscopy) Verfahren beruht auf Übergänge zwischen energetisch unterschiedlichen elektronischen Zuständen, die nacheinander ablaufen [1]–[5].
  • Damit man das STED Verfahren durchführen kann, ist es wichtig, dass drei unterschiedliche (elektronische) Zustände oder Energieniveaus in der Probe bzw. in dem die Probe markierenden Fluoreszenzfarbstoff existieren (1):
  • – Der unterste oder energetisch niedrigste Zustand Z1:
  • Der energetisch niedrigste Zustand ist ein nicht-fluoreszenter oder nicht-fluoreszenzfähiger Zustand. Er wird auch Dunkelzustand genannt.
  • – Der mittlere oder energetisch mittlere Zustand Z2:
  • Der energetisch mittlere Zustand ist ein fluoreszenter oder fluoreszenzfähiger Zustand. Er wird auch Hellzustand genannt.
  • Den Übergang vom nicht-fluoreszenten Zustand in den fluoreszenten Zustand wird auch Anschalten oder Aktivierung oder Einstellen oder Umschalten genannt. Der Übergang vom fluoreszenten Zustand in den nicht-fluoreszenten Zustand wird auch Ausschalten oder Abschalten oder Deaktivierung oder Umschalten genannt.
  • – Der oberste oder energetisch höchste Zustand Z3:
  • Der energetisch höchste Zustand ist ein fluoreszierender Zustand, da das Atom/Molekül in diesem Zustand ein Fluoreszenzphoton emittieren kann.
  • Der Übergang vom fluoreszenten Zustand in den fluoreszierenden Zustand wird Anregung genannt, der Übergang vom fluoreszierenden Zustand in den fluoreszenten Zustand wird als Abregung bezeichnet und kann durch Emission von Fluoreszenzlicht geschehen. Auch strahlungslose Übergänge sind möglich (z. B. Quenchen).
  • Das Aktivierungs-, Anregungs-, Abregungs- und Deaktivierungslicht können unterschiedliche Wellenlängen besitzen.
  • Beim STED Verfahren befinden sich im Ausgangszustand die fluoreszierenden Farbstoffmoleküle (Fluorophore) auf der Probenoberfläche in dem zu detektierenden, kreisförmigen Bereich B1 im energetisch untersten Zustand Z1 (nicht-fluoreszenter Zustand). In einem ersten Belichtungsschritt werden durch einfallendes Aktivierungs- oder Anschaltlicht S1 mit entsprechender Wellenlänge sämtliche Fluorophore vom nicht-fluoreszenten Zustand Z1 in den energetisch mittleren Zustand Z2 (fluoreszenter Zustand) angehoben. In einem zweiten Belichtungsschritt werden durch einfallendes Anregungslicht S2 mit entsprechender Wellenlänge sämtliche Fluorophore im zu detektierenden Bereich vom fluoreszenten Zustand Z2 in den energetisch höchsten fluoreszierenden Zustand Z3 gebracht. In einem dritten Belichtungsschritt wird mit einem Abregungslichtstrahl S3, der zentral in der Mitte eine Nullstelle und an den Rändern eine Intensität ungleich Null besitzt, der Randbereich RB1 des Bereichs B1 durch stimulierte Emission abgeregt, so dass die sich in diesem Randbereich RB1 befindlichen Fluorophore von dem fluoreszierenden Zustand Z3 wieder in den fluoreszenten Zustand Z2 zurückkehren. Da der beaufschlagende Abregungslichtstrahl S3 zentral eine Nullstelle besitzt, d. h. also zentral keine Intensität besitzt, bleiben dort die wenigen oder sogar nur ein einzelnes Fluorophor im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese können nun selber spontan durch Fluoreszenz, d. h. durch Emission eines Fluoreszenzphotons, in den fluoreszenten Zustand Z2 zurückkehren. Es besteht aber nun auch die Möglichkeit, durch einen weiteren, zusätzlichen Abregungsstrahl S4 ohne zentrale Nullstelle die in der zentralen Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3 verbliebenen Fluorophore durch stimulierte Emission abzuregen, so dass man den Zeitpunkt der Fluoreszenzemission selber wählen oder festlegen kann.
  • Die somit von den in der zentralen Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3 verbliebenen wenigen Fluorophore emittieren dann spontan oder stimuliert die Fluoreszenzphotonen, die dann auf die Detektoroberfläche gelangen. Da die Emission der Fluoreszenzphotonen von den Fluorophoren innerhalb und außerhalb der zentralen Nullstelle sukzessiv stattfindet, kann man somit eine Abbildung der Oberfläche erzielen, die ein Auflösungsvermögen weit unterhalb der optischen Beugungsgrenze nach Abbé besitzt.
  • Der Abregungsvorgang selber ist aber eigentlich aus rein wellenoptischer Sicht ebenfalls beugungsbeschränkt: würde die Abregung linear mit der Intensität des Abregungsstrahls erfolgen, wäre keine wesentliche Verbesserung oder Erhöhung der Auflösung nach Abbé zu erzielen [5]. Jedoch erst durch einen Materialeffekt, nämlich der Sättigung der Abregung mit dem Abregungslichtstrahl läßt sich die Auflösungsgrenze überwinden [5]: wie bereits weiter oben ausgeführt, besitzt die Intensität des Abregungsstrahls S2 zentral eine Nullstelle, die allerdings nicht stufenförmig ausgebildet ist, sondern innerhalb des Querschnitt-Strahlprofils des Abregungsstrahls erfolgt der Übergang vom Randbereich RB1 mit maximaler Intensität zum Mittelpunkt der zentral gelagerten Nullstelle stetig, so dass eigentlich nur in einem sehr, sehr kleinen zentral gelegenen Nullstellen-Bereich NB1 der Nullstelle die Intensität wirklich gleich null beträgt. Bereits geringste Intensitäten des Abregungsstrahls reichen allerdings aus, um den fluoreszierenden Zustand Z3 komplett zu entvölkern, d. h. alle angeregten Elektronen vom angeregten Zustand Z3 in den abgeregten Zustand Z2 zu überführen. So bleiben nur in einem sehr, sehr kleinen Teilbereich, nämlich im Bereich der Nullstelle NB1, die Fluorophore im fluoreszierenden Zustand Z3, der der Mitte der Nullstelle des Abregungslichtstrahls entspricht. Der Durchmesser dieses Teilbereichs, nämlich des Bereichs der Nullstelle NB1, liegt weit unterhalb der klassischen Beugungsgrenze. Das Unterschreiten der klassischen optischen Auflösungsgrenze nach Abbé erfolgt also nicht auf rein wellenoptischem Wege, sondern wird mit Hilfe eines materialeigenen Effekts, nämlich der Sättigung, erreicht.
  • Der Abregungsstrahl S2 muss nicht unbedingt kreisförmig oder rotationssymmetrisch mit einer zentralen Nullstelle sein. Denkbar sind auch alle anderen Intensitätsverteilungen, die jedoch mindestens eine Nullstelle oder ein zumindest lokales Intensitäts-Minimum besitzen müssen. Denkbar sind auch mehrere Nullstellen angeordnet in einem Array (Gitter), andere nicht-punktförmige geometrische Figuren oder eine linienförmige Nullstelle. Letzteres würde sich besonders anbieten, wenn man große Probenbereiche abzuscannen hat und wenn nur eine Raumdimension interessant ist für eine superaufgelöste Darstellung (Linienscan).
  • Wenn die zu untersuchenden Stoffe autofluoreszent sind, d. h. sie fluoreszieren von alleine, ohne dass man einen fluoreszenten Farbstoff (Fluorophor) zugeben und immobilisieren muss, dann kann man den STED und die anderen Vorgänge auch eben ohne Fluorophor durchführen, wodurch ein aufwendiger Prozessschritt (immobilisieren der Fluorophore) unterlassen werden kann.
  • Der optischen Eigenschaften der Fluoreszenzstrahlung (Wellenlänge, Intensität, Halbwertszeit, Polarisation etc.) hängen auch von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der atomaren/molekularen Umgebung ab, insbesondere die Wellenlänge der emittierten Fluoreszenzstrahlung wird von der atomaren/molekularen Umgebung beeinflusst (chemical-shift). Somit lassen sich aus der detektierten Fluoreszenzstrahlung, insbesondere der Wellenlänge, aber auch aus den übrigen optischen Eigenschaften der emittierten Fluoreszenzstrahlung, Rückschlüsse und Informationen ziehen oder erhalten über die physikalisch-chemischen Eigenschaften und über die atomare/molekulare Struktur der unmittelbaren Umgebung des Fluorophors.
  • Im Prinzip ist eigentlich alles, was bei normalen Fluoreszenzen anwendbar ist (zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung, Mapping, Lebensdauer-Imaging-Nanoskopie (FLIN) etc.) auch auf STED anwendbar.
  • GSD:
  • Beim GSD(Ground State Depletion)-Verfahren erfolgt durch den Abregungsstrahl S3 keine Abregung vom fluoreszierenden Zustand Z3 in den fluoreszenten Zustand Z2, sondern stattdessen wird ein Übergang vom fluoreszenten Zustand Z2 in den nicht-fluoreszenten Dunkelzustand Z1 induziert (Fall 1), oder ein Übergang vom fluoreszierenden Zustand Z3 in den nicht-fluoreszenten Dunkelzustand Z1 induziert (Fall 2), und zwar entweder bevor das Anregungslicht S2 die Elektronen vom fluoreszenten Zustand Z2 in den fluoreszierenden Zustand Z3 anregen (Fall 1) oder nachdem das Anregungslicht S2 die Elektronen vom fluoreszenten Zustand Z2 in den fluoreszierenden Zustand Z3 anregen [6]–[8].
  • Beim Dunkelzustand handelt es sich oft um einen langlebigen Tripelzustand.
  • Im Prinzip ist das STED-Verfahren nicht auf elektronische An- und Abregungen und Übergänge zwischen elektronischen Elektronenniveaus beschränkt, sondern auch andere Arten von An- und Abregungen wie beispielsweise zwischen einzelnen Vibrations- oder Rotationsniveaus des Fluorophormoleküls erscheinen möglich. Erfolgt beispielsweise der Abregungsvorgang von Z3 zu Z2 zwischen zwei Vibrationsniveaus in demselben elektronisch angeregten Zustand, dann kann anstelle eines UV-Fluoreszenzphotons ein IR-Photon emittiert werden; oder wenn sich der Fluorophor im Zustand Z3 befindet, und zwar in Form eines hohen Vibrationszustandes in einem elektronisch angeregten Zustand, dann kann ein IR-Abregungsstrahl S3 oder S4 den Fluorophor in einen niedrigeren Vibrationszustand im selben elektronisch angeregten Zustand bringen, von dem es dann mittels Emission eines Fluoreszenzphotons in den elektronischen Grundzustand übergeht.
  • Anstelle der normalen Fluoreszenzübergänge im STED-Prozess kann auch Röntgenfluoreszenz angewandt werden, zumal Röntgenstrahlung eine sehr viel geringe Wellenlänge besitzt, was für das Auflösungsvermögen vorteilhaft ist. Außerdem können dann noch im Rahmen der fluoreszenzbasierten Nanostrukturierung, die weiter unten ausführlich behandelt wird, die bereits bekannten und bewährten Photoresistschichten verwendet werden.
  • Ebenfalls sind auch andere optische oder nicht-optische Aktivierungs- oder Anregungsarten, z. B. mittels Ramanprozesse, elastische oder inelastische Stoß- oder Streuprozesse mit Elektronen, Protonen oder anderen Partikeln, denkbar, um von einem energetisch unteren Zustand Z1 zu einem energetisch mittleren Zustand Z2 oder von einem energetisch mittleren Zustand Z2 zu einem energetisch hohen Zustand Z3 zu gelangen. Beispielsweise kann man mittels einer angelegten Spannung oder opto-akustischer Prozesse u. a. die Fluorophore von dem Zustand Z1 in den Zustand Z2 oder vom Zustand Z2 in den Zustand Z3 bringen, oder mittels Elektrolumineszenz kann man die Fluorophore vom Zustand Z2 in den Zustand Z1 oder von Z3 nach Z2 befördern. Allerdings würde man bei diesen alternativen An- und Abregungsarten, durch die der Fluorophor insbesondere vom Zustand Z3 in den Zustand Z2 gelangt, schon allein wegen der fehlenden Nullstelle die Ortsauflösung verlieren; es sei denn, man beherrscht einen Prozess, bei denen Partikel durch inelastische Stoß- oder Streuprozesse einen Teil der Energie ortsgenau abgeben könnten, um den Fluorophor (elektronisch) an- oder abzuregen, insbesondere vom Zustand Z3 in den Zustand Z2, weil hochbeschleunigte Teilchen wie beispielsweise Elektronen, nach de Broglie eine Wellenlänge besitzen, die weit unterhalb der optischen Wellenlängen liegen, nämlich im unteren Nanometerbereich. Anstelle von Nullstellen könnte man die Minima oder Maxima von Beugungs- und Interferenzmustern von miteinander interferierenden Elektronen oder der Fokus eines Elektronenstrahls zur ortsgenauen An- oder Abregung der Fluorophore verwenden, da der Durchmesser der Interferenzstreifen oder der Fokusdurchmesser wegen der de Broglie-Beziehung bei hoher Teilchenenergie viel kleiner als die Nullstelle des Abregungslichts S3 sein kann.
  • Wenn die Elektronen auf hohe Geschwindigkeiten beschleunigt werden, um eben eine sehr geringe de Broglie-Wellenlänge zu erhalten, aber dadurch eine zu hohe Energie für die resonante An- oder Abregung des Fluorophors besitzen, dann können die Elektronen auch streifend einfallen, um nur einen Teil der Energie an den Fluorophor abzugeben. Ein weiterer Vorteil wäre es, dass durch einen streifenden Einfall der Fluorophor nicht so einfach zerstört werden würde.
  • Wegen der im Vergleich zu Elektronen größeren Masse könnte man gemäß der de Broglie-Beziehung mit auf hohe Geschwindigkeiten beschleunigten Protonen und Neutronen noch viel geringere Wellenlängen erzielen und somit auch viel geringere Fokusdurchmesser und schmalere Interferenzstreifen; allerdings wächst auch die Gefahr, die Probe oder den Fluorophor durch den Einfall dieser massereichen Teilchen zu zerstören. Somit könnte nur tote Materie wie Halbleitermaterialien, aber keine empfindlichen organischen Proben untersucht werden. Auch für die später vorgestellte fluoreszenzbasierte Nanostrukturierung wären Teilchenstrahlen mit Elektronen, Protonen oder Neutronen von Interesse.
  • PALM:
  • Auch PALM (Photoactivated localization microscopy) oder STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy) beruht auf einer Aktivierung und Deaktivierung der fluoreszierenden Moleküle (Fluorophore) [9]–[12]: Im Ausgangszustand liegen die Fluorophore auf der zu untersuchenden Probenoberfläche im deaktivierten Dunkelzustand Z1 vor. Durch die großflächige Beaufschlagung der Probenoberfläche mit Aktivierungslicht geringer Intensität wird ein geringer Anteil der Fluorophore in einen fluoreszenzfähigen Hellzustand Z2 überführt. Dabei ist es wichtig, die Intensität des Aktivierungslichts so gering zu halten, dass nur sehr wenige Fluorophore in den Hellzustand gelangen. Aus stochastischen Gründen sind im allgemeinen diese wenigen aktivierten Fluorophore meist relativ gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt, so dass zwischen zwei einzelnen aktivierten Fluorophoren im Mittel ein Abstand herrscht, der ein Vielfaches der optischen Auflösungsgrenze nach Abbé beträgt. Eine Erhöhung der Intensität des Aktivierungslichts würde eine größere Anzahl von Fluorophoren in den aktivierten Hellzustand überführen. Dabei würde sich der mittlere Abstand zwischen zwei aktivierten Fluorophoren verringern. Allerdings darf dieser mittlere Abstand auf keinen Fall die optische Auflösungsgrenze nach Abbé unterschreiten. Nach der erstmaligen Aktivierung eines geringfügigen Anteils der Fluorophore auf der Probenoberseite werden diese wenigen, relativ weit voneinander beabstandeten aktivierten Fluorophore durch eine weitere Beaufschlagung mit Anregungslicht zur Fluoreszenz angeregt. Dabei besitzt das Anregungslicht solch eine ausreichende Intensität, dass möglichst sämtliche aktivierten Fluorophore zur Fluoreszenz angeregt werden. Dabei emittieren die angeregten Fluorophore das Fluoreszenzlicht. Da die einzelnen aktivierten Fluorophore einen großen Abstand zueinander besitzen, welcher ein Vielfaches von der Auflösungsgrenze nach Abbé beträgt, erscheinen die fluoreszierenden Fluorophore dem Beobachter oder der aufnehmenden ortsauflösenden Kamera (CCD/CMOS) einzeln und isoliert und beugungsbedingt als leuchtende Kreis- oder Kugelscheibe mit einer kreisförmigen oder kugelförmigen Strahlungsverteilung (Beugungsscheibchen). In einem isotropen Medium muss sich aus prinzipiellen Gründen und aus einfachen Symmetrieüberlegungen heraus das das Fluoreszenzlicht emittierende Fluorophor-Molekül im Zentrum oder Mittelpunkt der leuchtenden Kugelscheibe befinden. Durch die Emission des Fluoreszenzlichts werden diese Fluorophore abgeregt, um dann wieder durch Deaktivierung in den deaktivierten Dunkelzustand überführt zu werden. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird ortsaufgelöst mittels der CCD/CMOS-Kamera aufgenommen: da die Fluoreszenzstrahlungscharakteristik des emittierenden Fluorophors kreis- oder kugelförmig ist, ist das Fluoreszenzlicht kreis- oder kugelsymmetrisch um den Emissionsort (Fluorophor) angeordnet oder anders ausgedrückt, der Fluorophor befindet sich punktgenau im Zentrum des leuchtenden Kreis- oder Kugelscheibchens, so dass die örtliche Position des Zentrums des leuchtenden Kreis- oder Kugelscheibchens, das für den Emissionsort des Fluoreszenzlichts und somit für die örtliche Position des Fluorophors steht, einfach durch die Berechnung des geometrischen Mittelpunktes des leuchtenden Kreis- oder Kugelscheibchens bestimmt werden kann. Das so aufgenommene Fluoreszenzbild wird zunächst computergestützt überarbeitet, indem aus bereits weiter oben ausgeführten Gründen der eigentliche Aufenthaltsort des fluoreszierenden Fluorophor-Moleküls durch Bestimmung des Mittelpunkts der leuchtenden Kugelscheibe weiter eingeengt wird, und zwar mit einer Genauigkeit, die weit unterhalb des optischen Auflösungsvermögens nach Abbé liegt. Das ist nur dadurch möglich, wenn als Voraussetzung der Abstand der einzelnen fluoreszierenden Fluorophore groß genug ist, so dass sich zwei benachbarte leuchtende Kugelscheiben nicht überlappen, sondern isoliert und kreisförmig erscheinen. Das so überarbeitete Bild wird dann abschließend abgespeichert. Diese Prozedur wird wiederholt durchgeführt, und aus stochastischen Gründen werden bei jeder Wiederholung dieser Prozedur meistens andere Fluorophore auf der Probenoberfläche aktiviert und zur Fluoreszenz angeregt. Bei jeder Wiederholung wird ein anderes Fluoreszenz-Einzelbild mit der CCD/CMOS-Kamera aufgenommen. Nach einer ausreichend großen Anzahl von Wiederholungen werden dann die überarbeiteten, unterschiedlichen Einzelbilder überlagert; und es ergibt sich als Gesamtbild (fast) vollständig eine Abbildung der fluoreszenzmarkierten Struktur auf der zu untersuchenden Probenoberfläche, und zwar mit einer Auflösung unterhalb der Auflösungsgrenze nach Abbé.
  • Es ist offensichtlich, dass dieses Verfahren aufwendige computergestützte Berechnungen benötigt, die entweder sehr lange dauern und/oder entsprechend leistungsfähige Computerhardware und Software notwendig sind.
  • SIM:
  • Ein drittes hoch- oder superauflösendes Mikroskopieverfahren ist das sogenannte SIM(Structured Illumination Microscopy)-Verfahren [13]–[18]. Dabei wird die zu mikroskopierende Oberfläche mit einem periodischen Streifenmuster mit einer entsprechenden Periode mit dem Wellenvektor kS beleuchtet (strukturierte Beleuchtung), wodurch die Auflösung bedeutend erhöht werden kann. Dies lässt sich anschaulich im reziproken Raum (k-Raum) mit Hilfe der Fouriertransformation erklären: Ohne das Streifenmuster besitzt die Oberfläche des zu mikroskopierenden Objekts ein Fourier-Spektrum, dessen Wellenvektoren sich im reziproken Raum alle innerhalb einer Zone, beispielsweise einer Kugel, befinden, die im reziproken Raum um den Ursprung des Wellenvektor-Koordinatensystems angeordnet ist. Durch die (sinusförmige) strukturierte Beleuchtung mit dem Streifenmuster wird diese Kugel im reziproken Raum um den Wellenvektor kS der strukturierten Beleuchtung verschoben, so dass sie nicht mehr konzentrisch um den Ursprung des Koordinatensystems angeordnet ist, sondern in seinem ersten Quadranten. Dadurch werden sämtliche k-Vektoren der Kugel mit dem Wellenvektor kS der strukturierten Beleuchtung vektoriell addiert, so dass als Resultat dieser Vektoraddition sämtliche k-Vektoren eine größere Länge bzw. höheren Betrag besitzen und somit eine kleinere Wellenlänge λ wegen k = 2π/λ. Eine niedrigere Wellenlänge bedeutet aber nach Abbé eine höhere Auflösung wegen d = λ/NA = λ/nsinα (mit d = minimaler beobachtbarer Abstand, NA = numerische Apertur), so dass durch die strukturierte Beleuchtung die optische Auflösungsgrenze nach unten verschoben wird.
  • Man kann diesen Effekt auch einfach experimentell beobachten (Moirée-Effekt).
  • Als weitere hoch- oder superortsauflösende Mikroskopieverfahren sind noch SPDM (Spectral Precision Distance Microscopy), SPDMphymod mit „blinkenden Farbstoffen”, SOFI (Superresolution optical fluctuation imaging), SALM (Spectrally Assigned Localization Microscopy), 4Pi, SNOM oder NSOM (Near-field scanning optical microscope) und/oder technische Ableitungen und/oder Kombinationen davon oder mit anderen Mikroskopiemethoden zu nennen [19]–[23].
  • Nanostrukturierung:
  • Es existieren bereits viele Verfahren oder Prozesse nur Strukturierung von verschiedenen Materialien (Halbleiter, Metalle, Polymere, Keramiken etc.) im Nanometermaßstab (Nanostrukturierung). Exemplarisch wird nun das folgende Verfahren herausgestellt: An der Oberfläche eines zu strukturierenden Materials im Nanometermaßstab sind UV-sensible Moleküle immobilisiert worden. Durch die Beaufschlagung mit UV-Licht, dessen Wellenlänge im Absorptionsbereich der UV-sensiblen Moleküle liegt, können die UV-sensiblen Moleküle aktiviert und angeregt werden, um eine Photoreaktion und dadurch einen Nanostrukturierungsprozess zu starten. Nachteilig ist die punktgenaue Immobilisierung der UV-sensiblen Moleküle auf der Materialoberfläche, und zwar genau an der Stelle, an der die Nanostrukturierung stattfinden soll. Bei der weiter unten vorgestellten fluoreszenz-basierten Nanostrukturierung kann man die Oberfläche des zu strukturierenden Materials großflächig mit Fluorophoren bedecken, um dann z. B. mittels des STED-Verfahrens einzelne Fluorophore optisch anzusteuern, d. h. zu aktivieren und anzuregen, damit gezielt punktgenau der Nanostrukturierungsprozess starten kann.
  • Aufgabenstellung:
  • In vielen Anwendungsgebieten der Mikro- und Nanotechnik ist die Leistungsfähigkeit (Performance) von den Mikro- oder Nanobauteilen sehr stark abhängig von der räumlichen Dichte sowie der räumlich lokalen Auflösung der sich in den Bauteilen befindlichen Mikro- und/oder Nanostrukturen. Beispielsweise sind in der Mikroelektronik integrierte Schaltkreise (Chips) wie beispielsweise Prozessoren und Speicherchips umso leistungsfähiger, je größer deren Dichte an Transistoren oder Schaltelementen ist (siehe Integrationsgrad bei integrierten Schaltkreisen wie z. B. VLSI bis GLSI). d. h. je dichter die Transistoren gepackt sind, desto höher ist die Leistungsfähigkeit des integrierten Schaltkreises. Da die integrierten Schaltkreise meistens mittels optischer Lithographie hergestellt werden, stellt bei der Herstellung solcher mikroelektronischer Bauteile das optische Auflösungsvermögen nach Abbé eine Grenze dar, die die Transistordichte der integrierten Schaltkreise und somit ihre Leistungsfähigkeit beschränkt. Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung vorzustellen, die diese Grenze des optischen Auflösungsvermögens nach Abbé unterschreitet, um z. B. die Integrationsdichte von Nanostrukturen jenseits der vom optischen Auflösungsvermögen vorgegebenen Grenze stark zu erhöhen.
  • Lösungsweg:
  • Das Verfahren bzw. die entsprechende Vorrichtung basiert auf eine hochauflösende fluoreszenzbasierte Mikroskopiemethode, wie beispielsweise RESOLFT/STED. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren/Vorrichtung wird genau diese dieselbe Mikroskopiemethode benutzt, um ein Fluoreszenz-Photon hochortsaufgelöst zu erzeugen, indem ein Fluorophor hochortsaufgelöst angeregt wird und dadurch ein Fluoreszenz-Photon emittiert wird. Jedoch werden die emittierten Photonen des Fluoreszenzlichts nicht zur Detektion oder Analyse verwendet, d. h. das vom Fluorophor emittierte Fluoreszenz-Photon gelangt nicht in einen Detektor, sondern das vom Fluorophor emittierte Fluoreszenzphoton wird, bevor es auf eine Detektoroberfläche treffen würde, vorher abgezweigt und dann für eine andere Anwendung, wie z. B. Nanostrukturierung/Nanomodifizierung oder Informationsspeicherung/Informationsverarbeitung, verwendet [24]; z. B. wird das vom Fluorophor emittierte Fluoreszenzphoton abgelenkt, um ein Molekül im umliegenden Material zu modifizieren, und zwar mit einer Ortsauflösung unterhalb der Auflösungsgrenze von Abbé.
  • Anstelle von RESOLFT/STED können auch andere hochauflösende fluoreszenz-basierte Mikroskopiemethoden, wie beispielsweise PALM oder SOFI, bei denen ein Fluorophor nach superortsaufgelöster Anregung ein Fluoreszenz-Photon superortsaufgelöst emittiert, verwendet werden, auf denen das erfindungsgemäße Verfahren/Vorrichtung beruht.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung und Ausführungsbeispiele und Anwendungsbeispiele
  • Wie bereits unter dem Stand der Technik detailliert beschrieben, wird beim RESOLFT/STED-Verfahren u. a. eine geringe Anzahl von Fluoreszenz-Photonen von einem fluoreszenzfähigen Molekül (Fluorophor) räumlich hochaufgelöst und genau lokalisiert emittiert; und zwar mit einer räumlichen Auflösung bis hinunter in den atomaren Maßstab von wenigen nm, die weit unter der klassischen optischen Auflösungsgrenze nach Abbé für Licht liegt. Beim RESOLFT/STED-Verfahren werden die emittierten Fluoreszenz-Photonen zur optischen Detektion und zur anschließenden Analyse benutzt, indem diese auf einen optischen Detektor fallen und ein entsprechendes Meßsignal auslösen; allerdings können diese emittierten Fluoreszenz-Photonen auch für andere Anwendungen benutzt werden, die wie folgt beschrieben werden [24]: Allen Anwendungen ist gemeinsam, dass sie einen STED-Prozess wie detailliert unter dem Stand der Technik beschrieben durchlaufen. Dadurch emittiert der im Zustand Z3 sich befindliche Fluorophor hochortsaufgelöst einige wenige Fluoreszenzphotonen, indem es vom Zustand Z3 in den Zustand Z2 übergeht. Diese werden im Folgenden als die vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzphotonen bezeichnet. Alle Anwendungen haben nun gemein, dass sie die vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzphotonen anderweitig nutzen als zur reinen bildgebenden Detektion. So läßt sich der STED-/RESOLFT-Prozess zur fluoreszenz-basierten Nanostrukturierung und zur Realisierung von Akuatoren, Sensoren oder anderen Vorrichtungen oder Verfahren verwenden, wie im Folgenden gezeigt wird:
  • I.) Fluoreszenzbasierte Nanostrukturierung
  • Unter einer Nanostrukturierung von Material versteht man entweder eine Modifikation oder eine Ablation von Material im Nanomaßstab.
  • Unter einer photonen-basierten Modifizierung eines Materials versteht man die photonen-induzierte Änderung der physikalisch-chemischen Struktur des den Fluorophor lokal umgebenden und bestrahlten bzw. behandelten Materials, indem die einfallenden Photonen das Material photolytisch und/oder pyrolytisch anregen und somit eine photonen-induzierte Reaktion (photochemischer oder photothermischer Prozess) auslösen. Dies führt zu einer Änderung der molekularen Struktur wie beispielsweise molekulare Anordnung oder Erzeugung neuer Molekülstrukturen durch Spaltung oder Entstehung neuer Verbindungen, z. B. Vernetzung. Dies geht einher mit der Änderung der physikalisch-chemischen Eigenschaften. Dazu können die optischen Eigenschaften (Brechzahl, Transmission, Reflexion, Absorptionskoeffizient, optische Aktivität, Polarisation, Doppelbrechung, nichtlinear-optische Eigenschaften etc.), die elektrischen Eigenschaften (Widerstand, Leitwert, Dielektrizität, elektrische Polarisierbarkeit etc.), die magnetischen Eigenschaften (Suszeptibilität, Magnetisierung, magnetische Polarisierbarkeit etc.), mechanischen Eigenschaften (Dichte, Festigkeit, Stabilität etc.) thermischen Eigenschaften (Wärmeleitfähigkeit, Wärmeausdehnungskoeffizient, Wärmekapazität etc.), die akustischen Eigenschaften (Ausbreitungsgeschwindigkeit und Dämpfung akustischer Wellen etc.), physikalisch-chemische Eigenschaften (Verdampfungsenthalpie, Sublimationsenthalpie, Kondensationsenthalpie, Benetzbarkeit, Oberflächenspannung, Adsorptionseigenschaften und andere Oberflächen- oder Volumeneigenschaften etc.) oder chemischen Eigenschaften (Reaktionsenthalpie, Reaktionsfähigkeit, selektive Ätzbarkeit beispielsweise zur Erzeugung von photonischen Kristallen oder Halbleiterheterostrukturen, lokale Reaktionsinhibition, lokale Erhöhung der Reaktivität oder lokale Vorbehandlung etc.) zählen.
  • Unter Ablation versteht man den definierten Abtrag oder Wegnahme von Material mittels (Laser-)Licht ohne sichtbare thermische Schädigung des umliegenden Materials. Die abgetragene Stelle zeichnet sich aus durch scharfe Kanten und Abtragsflächen mit möglichst geringen thermischen Schädigungen wie beispielsweise Debris, so dass in der Mikro- oder Nanotechnik die Eigenschaften des umliegenden Materials nicht verändert werden.
  • Die fluoreszenzbasierte Nanostrukturierung wird dabei wie folgt realisiert: Hierbei wird ein hochauflösendes fluoreszenzbasiertes Mikroskopieverfahren wie beispielsweise RESOLFT/STED/GSD (1) durchlaufen (das Verfahren ist nicht auf RESOLFT/STED beschränkt, sondern kann auch alle anderen hochauflösende, fluoreszenzbasierte Mikroskopieverfahren umfassen, aber der Einfachheit und Anschaulichkeit halber wird hier das STED- oder GSD-Verfahren zur Demonstration gewählt): Zunächst erfolgt durch ein Anschaltlicht S1 eine Aktivierung des Fluorophors vom nicht-fluoreszenzfähigen Dunkelzustand Z1 in den fluoreszenzfähigen Hellzustand Z2. Danach wird der Fluorophor durch einfallendes Anregungslicht S2 in einen fluoreszierenden Zustand Z3 überführt. Daraufhin wird der Fluorophor und seine Umgebung mit einem Anregungslicht S3 beaufschlagt, welches zentral eine Nullstelle besitzt. Somit und wegen des bereits oben erläuterten Sättigungseffektes verbleibt nur das eine Fluorophor im angeregten, fluoreszierenden Zustand Z3, und zwar in einem Bereich weit unterhalb des klassischen optischen Auflösungsvermögens, d. h. der noch angeregte und fluoreszierende Bereich ist weitaus kleiner als nach der optischen Auflösungsgrenze von Abbé eigentlich möglich, während alle umliegenden Fluorophore entweder (wie im Falle von STED) in den fluoreszenzfähigen Hellzustand Z2, der aber nicht fluoreszierend ist, oder gleich (wie im Falle von GSD) in den nicht-fluoreszenzfähigen Dunkelzustand Z1 abgeregt worden ist. Der im fluoreszierenden Zustand Z3 verbliebene Fluorophor emittiert nun spontan oder durch einen weiteren Abregungsstrahl S4 stimuliert ein paar wenige Fluoreszenz-Photonen, indem es vom Zustand Z3 in den Zustand Z2 übergeht. Diese durch das Durchlaufen des STED/GSD-Prozesses gewonnenen Fluoreszenz-Photonen werden nicht zur rein bildgebenden Detektion benutzt, indem sie in einen Detektor fallen, sondern die durch den STED- oder GSD-Prozess entstandenen Fluoreszenz-Photonen werden dazu verwendet, diese auf das umliegende Material zu lenken, um dieses mit den vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzphotonen hochortsaufgelöst zu beaufschlagen, damit dieses hochortsaufgelöst strukturiert wird, indem es entweder lokal modifiziert oder lokal abgetragen wird, und zwar kontrolliert, gezielt und steuerbar mit einer Auflösung in atomarem Maßstab, das weit unter der optischen Auflösungsgrenze nach Abbé liegt.
  • Die nun folgende Nanostrukturierung und/oder Nanomodifizierung geht wie folgt vonstatten:
    Durch den vorangegangenen STED-Prozess (siehe oben und unter Stand der Technik detailliert beschrieben) emittiert der Fluorophor eine geringe Anzahl von Fluoreszenz-Photonen. Diese werden aber in diesem Fall nicht für die Detektion verwandt, sondern diese breiten sich aus und treffen auf die Atome oder Moleküle des umliegenden, benachbarten Materials, von denen sie absorbiert und energetisch angeregt, d. h. in einen energetisch höheren Zustand angehoben werden. Die Anregung kann entweder von photolytischer oder pyrolytischer Natur sein, d. h. die Anregung kann entweder elektronisch, vibratorisch oder rotatorisch geschehen. Dadurch wird eine Photo-Reaktion ausgelöst, die die physikalisch-chemische Struktur des umliegenden Materials verändert. Bei der Photo-Reaktion kann es sich entweder um einen photochemische oder um eine photothermische Reaktion oder um eine Mischform oder Hybridform aus beiden (photochemisch und/oder photothermisch) oder um eine mehrstufige Reaktion handeln, die aus mehreren einzelnen photochemischen und/oder photothermischen Reaktionsstufen zusammengesetzt ist. Das kann beispielsweise durch einen direkten Bindungsbruch geschehen (photolytisch) oder durch photonen-induzierte Vibrations- oder Rotationsbewegungen von einzelnen Molekülgruppen (pyrolytisch) oder durch Modifizierung der sterischen Struktur oder durch cis-trans-Isomerie [25], bei der das emittierte Fluoreszenzphoton das Ziel-Molekül von einem cis-Zustand in einen trans-Zustand oder umgekehrt überführt. Später wird beschrieben, dass dieser Vorgang zur Informationsspeicherung dienen kann, bei der der cis-Zustand als binäre 1 und der trans-Zustand als binäre 0 oder umgekehrt interpretiert werden kann. Weitere mögliche Photo-Reaktionen sind Norrish I oder II, u. a. an benachbarten Polymethacrylatmolekülen.
  • Auch eine totale Defragmentierung oder Degradation erscheint theoretisch möglich, so dass es zu einem genau definierten Abtrag des Materials im Nanometermaßstab an einer bestimmten Stelle in diesem Bereich kommt. Zurück bleiben leere, materialfreie Stellen mit einer genau definierten Größe, Form und mit Randgebieten ohne thermische Schädigung, die aufgrund von Quanteneffekten die nanophysikalischen und/oder nanochemischen Eigenschaften des so behandelten Materials verändern, wie beispielsweise das Absorptionsspektrum und somit den Farbeindruck. Beispielsweise können dadurch photonische Kristalle mit bestimmten meta-optischen Eigenschaften wie negativem Brechungsindex erzeugt werden; oder die elektronischen Bänder der Kristallstruktur können modifiziert werden, um Halbleiterheterostrukturen wie beispielsweise Quantenpunkte, Quantentöpfe oder Quantenfilme herzustellen. Auch die Modifizierung der physikalisch-chemische Eigenschaften von Kristallstrukturen erscheint möglich.
  • Für die Anregung des Fluorophors kommen verschiedene Mechanismen in Frage:
    down-conversion: Die Photonen des Anregungslichts besitzen eine höhere Quantenenergie als die Photonen des emittierten Fluoreszenzlichts: so kann der Fluorophor durch energiereiche UV-Strahlung angeregt werden, die Wellenlänge des emittierten Fluoreszenzlichts kann im UV/Vis, sichtbaren oder (nahen) IR-Spektrum liegen (down-conversion, Stokes). Dies kann wichtig sein für pyrolytische Anregung von photothermischen Prozessen.
    up-conversion: Die Photonen des Anregungslichts besitzen eine niedrigere Quantenenergie als die Photonen des emittierten Fluoreszenzlichts; d. h. es ist aber auch denkbar, dass das Anregungslicht eine niedrigere Quantenenergie besitzt als das emittierte Fluoreszenzlicht (up-conversion, Anti-Stokes), so dass beispielsweise der Fluorophor mittels sichtbarem oder IR-Licht angeregt wird und somit hochenergetisches UV-Licht als Fluoreszenzlicht emittiert wird, dessen Quantenenergie ausreichend groß ist, um elektronische Bindungen photolytisch anzuregen und direkt zu brechen und/oder eine andere photochemische Reaktion auszulösen, und somit das umliegende Material in den beaufschlagten Stellen atomar ortsgenau und gezielt zu modifizieren und/oder abzutragen.
  • Auch eine Mehrphoton-Anregung der Fluorophore erscheint denkbar, beispielsweis aus mehreren Photonen aus dem nahen IR-Spektrum durch einen fs-Laser, so dass das emittierte Fluoreszenzlicht im UV-Bereich liegt und dessen Photonen ausreichend hohe Photonenenergien besitzen zur Nanostrukturierung. Dagegen ist eine Mehrphotonen-Nanostrukturierung, bei der mehrere emittierte Photonen des Fluorophors gemeinsam und gleichzeitig einen Modifikationsprozess des umliegenden Materials bewirken, wohl eher unwahrscheinlich.
  • Auch mehrstufige Prozesse sind denkbar, in denen es zu einer Strukturierung auf mittelbarem oder indirektem Wege kommt. Dazu können Photoresist-Schichten mit oder ohne Photoinitiatoren verwendet werden, die beispielsweise als Schutzschicht zum selektiven Ätzen oder als Reaktionsschicht oder als Opferschicht oder als funktionale Schicht dienen. Auch andere typische Arbeitsschritte der Mikro- oder Nanotechnik wie beispielsweise Sputtern oder Abformen können sich daran anschließen oder damit kombiniert werden. Besonders geeignet erscheinen neben Photoresist-Schichten aus Novolacken besonders Photoresist-Schichten aus UV-modifizierbaren Polymethacrylaten, an denen gezielt an atomaren Stellen Norrish-Reaktionen zur Brechzahländerung durchgeführt werden können [26]. Dazu sollten dann die Photo-Schichten mit den Fluorophoren entsprechend dotiert oder versehen werden.
  • So können um den Fluorophor gelagerte photo-modifizierbare/photoablative Materialien wie beispielsweise Photoresiste mit oder ohne Photoinitiatoren durch das emittierte Fluoreszenzphoton beaufschlagt und durch eine dadurch ausgelöste Photo-Reaktion örtlich gezielt lokal in atomarer Auflösung modifiziert oder abgetragen oder sonst wie verändert werden.
  • Neben dem gezielten Auslösen von bestimmten chemischen Reaktionen an einzelnen Molekülen (z. B. Biomolekülen) kann man durch die fluoreszenzbasierte Nanostrukturierung auch einfache und komplexe Nanostrukturen wie z. B. dünne Schichten, Voids, Gitter u. a. erzeugen, die unter anderem zum weiteren Aufbau von Nanomaschinen benutzt werden können, oder aber es können bereits bestehende Nanosysteme, wie beispielsweise biologische Systeme, z. B. Zellen, modifiziert werden; so erscheint auch eine genetische Modifikation möglich, wenn der Fluorophor gezielt an einer bestimmten Stelle am DNA-Molekül befestigt wird.
  • II.) Fluoreszenzbasierter Aktuator
  • Man kann die bereits oben ausführlich diskutierte fluoreszenz-basierte Nanostrukturierung bereits als erstes Beispiel interpretieren, in dem der RESOLFT/STED/GSD-Prozess bereits zur Realisierung eines Aktuators genutzt wird, da der sich im Zustand Z3 befindliche Fluorophor, der die zur Nanostrukturierung benutzten Fluoreszenzphotonen emittiert, als einen Aktuator aufgefasst werden kann. Neben der oben ausführlich vorgestellten fluoreszenz-basierten Nanostrukturierung kann der STED/RESOLFT-Prozess auch zur Realisierung von weiteren Aktuatoren verwendet werden:
    Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird das STED-Prozess oder ein vergleichbarer Prozess durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung bleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im fluoreszierenden Zustand Z3 im Bereich der zentralen Nullstelle des Abregungsstrahls S3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen, die in diesem Fall nicht für die Detektion verwandt werden, sondern als punktuelle Lichtquelle dient
    • – zur allgemeinen örtlich hochaufgelösten Beleuchtung eines anderen Objektes, um dieses mit wenigen Photonen zu beaufschlagen, damit z. B. die Photonen am anderen Objekt kontrolliert und gezielt gestreut werden, damit z. B. das andere Objekt „hell erscheint und so gemessen werden kann; auch eine Raman-Streuung oder eine weitere Fluoreszenz an anderen Objekten erscheint möglich
    • – zum örtlich hochaufgelösten Lichteintrag/Lichteinkopplung in das Umgebungsmaterial: durch die gezielte Beaufschlagung der Umgebung (z. B. von benachbarten Molekülen) mittels der vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzphotonen werden diese durch die benachbarten Atome/Moleküle absorbiert, um dort eine photonen-induzierte Reaktion, insbesondere eine photochemische/photolytische Reaktion oder Prozess, auszulösen; dabei kann es beispielsweise um die bereits weiter oben ausführlich diskutierte fluoreszenz-basierte Nanostrukturierung handeln, bei denen ganze Bereiche im Nanometermaßstab bearbeitet, modifiziert oder abgetragen werden, oder es kann um einzelne Moleküle handeln, die durch die Absorption der emittierten Fluoreszenzphotonen gezielt zu einer photochemischen Reaktion oder zu einem weiteren RESOLFT/STED-Prozess angeregt werden
    • – zur örtlich hochaufgelösten Energieübertragung von einem Fluorophor/Molekül auf ein benachbartes Fluorophor/Molekül und von diesem Fluorophor/Molekül wiederum auf ein weiter benachbartes Fluorophor/Molekül oder von einem Fluorophor oder Nanomaschine auf eine andere benachbarte Nanomaschine; so kann ein minimaler Energiefluss in der Größenordnung von wenigen Energiequanten hinsichtlich Energiemenge und -richtung kontrolliert gesteuert werden
    • – zum örtlich hochaufgelösten Energieeintrag oder -abfluss, beispielsweise in ein molekulares System oder in eine Nanomaschine, um diese mit Energie zu versorgen, damit diese arbeiten und ihre Funktion verrichten kann
    • – zur örtlich hochaufgelösten Informationsübertragung (dies wird später ausführlich diskutiert)
    • – zur örtlich hochaufgelösten punktuellen Erwärmung, beispielsweise um photothermische Prozesse auszulösen
  • Zur Veranschaulichung wird im folgenden auf ein paar ausgewählte Anwendungsbeispiele detailliert eingegangen:
  • 1.) Fluoreszenzbasierte Datenspeicherung oder Datenverarbeitung
  • Hier wird ein auf dem STED-Prozess basierendes Verfahren vorgeschlagen, um digitale Bausteine auf kleinstem Raum zum a) Schalten von Molekülen (z. B. von einen cis- in einen trans-Zustand und umgekehrt) und somit zum b) Speichern und/oder eventuell Verarbeiten von Informationen zu realsieren. Dabei ist die Abmessung bzw. Dichte entscheidend, denn je kleiner die Abmessung, desto leistungsfähiger ist die Datenverarbeitungseinheit.
  • Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird der STED-Prozess oder ein vergleichbarer Prozess durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 bleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im fluoreszierenden Zustand Z3 im Bereich der zentralen Nullstelle des Abregungsstrahls S3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen, die in diesem Fall nicht für die Detektion verwandt werden, sondern die sich ausbreiten und auf benachbarte Moleküle des sie umgebenden Materials treffen. Diese benachbarten Moleküle des die Fluorophore umgebenden Materials besitzen die Eigenschaften, durch Auftreffen eines Fluoreszenz-Photons ihren Zustand zu ändern, d. h. von einem stabilen Zustand in einen anderen stabilen Konformations-Zustand überführt zu werden oder umzuschalten. Dabei kann es sich beispielsweise um isomere Zustände handeln, wie beispielsweise die cis-trans-Isomerie bspw. von Cyclohexan oder Derivate. Durch Beaufschlagung des benachbarten Moleküls durch das vom Fluorophor emittierte Fluoreszenz-Photon geht eben dieses beaufschlagte Molekül von einem isomeren Zustand in den anderen über, beispielsweise von dem isomeren trans-Zustand in den isomeren cis-Zustand. Dies kann man als Abspeicherung einer Informationseinheit (Bit) auffassen, wobei beispielsweise der isomere trans-Zustand für die digitale Information „0” und der isomere cis-Zustand für die digitale Information „1” steht. Natürlich können die isomeren Zustände auch umgekehrt interpretiert werden. Werden viele cis-trans-Isomere in die Nähe des Fluorophors oder der Fluorophore angeordnet und definiert und gezielt mittels des emittierten Fluoreszenz-Photons angesteuert und beaufschlagt, so nehmen alle diese cis-trans-Isomere jeweils den gewünschten isomeren Zustand ein, der jeweils für eine Bit-Information steht. Somit läßt sich auf kleinstem Raum pro Isomer eine Bit-Information abspeichern, verarbeiten und wieder auslesen.
  • Auch eine Verarbeitung von Informationen erscheint auf dieser Basis möglich zu sein: wenn zwei Fluorophore Zugriff auf dasselbe Cyclohexan-Molekül besitzen (oder auf ein anderes Molekül, dass die cis-trans-Isomerie besitzt), dann kann man sich folgendes Prozedere vorstellen: wenn beide Fluorophore nicht emittieren, dann bleibt das Cyclohexan-Molekül in seiner Ausgangsstellung, emittiert eines der beiden Fluorophore, so schaltet das Cyclohexan-Molekül um, emittieren beide Fluorophore (fast) gleichzeitig, so schaltet das Cyclohexan-Molekül wieder in den Ausgangszustand; das Umschaltverhalten des Cyclohexan-Moleküls unter dem Einfluss der beiden Fluorophore entspricht einer exklusiven OR-Wahrheitstabelle. Dabei bleibt die Frage offen, was passiert, wenn beide Fluorophore genau gleichzeitig das Cyclohexan-Molekül beaufschlagen.
  • Neben der cis-trans-Isomerie sind auch andere Ausführungsformen möglich und denkbar; so kann beispielsweise zum Zwecke der Informationsspeicherung auch auf andere Photoisomerie- oder Konformationsisomerie-Zustände zurückgegriffen werden. Allerdings müßten diese ebenfalls mittels eines emittierten Fluoreszenzphotons umschaltbar und zeitlich stabil sein.
  • 2.) Fluoreszenzbasierte Nanoaktuatoren/Nanomaschinen
  • Das STED-Verfahren kann auch zum Betreiben oder zur Schaltung von Nanomaschinen oder Nanoaktuatoren verwendet werden. Unter Nanomaschinen oder Nanoaktuatoren versteht man Maschinen mit Abmessungen im Nanometerbereich, die mechanische Arbeit leisten können, und zwar in einem bis auf wenige Nanometer genau lokalisierten Bereich. Auch in diesem Anwendungsbeispiel kann man auf die cis-trans-Isomerie zurückgreifen: Zum Schalten oder zum Betreiben der Nanomaschinen in atomaren Dimensionen durch die vom Fluorophor emittierten einfallenden Fluoreszenz-Photonen oder zum Ausführen von Aktuatoraufgaben kann auch hier die cis-trans-Isomerie der benachbarten Moleküle ausgenutzt werden: durch das Umschalten vom isomeren cis-Zustand in den isomeren trans-Zustand oder umgekehrt kann beispielsweise Arbeit auf kleinstem Raum geleistet werden. Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird dazu das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen, welche sich ausbreiten und auf benachbarte Moleküle des sie umgebenden Materials treffen. Dadurch wird wie bereits weiter oben beschrieben die benachbarten Moleküle beispielsweise von cis-Zustand in den trans-Zustand umgeschaltet. Da dadurch Masse in Form von Molekülabschnitten bewegt wird, wird dadurch mechanische Arbeit verrichtet. Dies kann verwendet werden, um andere molekulare Einheiten mechanisch zu bewegen oder um anderen molekularen Einheiten oder Nanomaschinen Energie in mechanischer Form zuzuführen, damit diese mechanische Arbeit leisten können, oder um andere molekulare Einheiten oder andere Nanomaschinen zu schalten oder um an andere molekulare Einheiten oder Nanomaschinen betriebswichtige Informationen zu übergeben oder zu übermitteln.
  • Als ein konkretes Beispiel kann angeführt werden, dass das Molekül im cis-Zustand dann als Nanohebel in der Ausgangsstellung fungieren kann, während dasselbe Molekül im trans-Zustand als Nanohebel im Arbeitszustand dient. Das gezielte Umschalten wird dann durch das STED-Verfahren bewerkstelligt, indem das emittierte Fluoreszenzphoton das Molekül vom cis- in den trans-Zustand überführt und umgekehrt.
  • Dabei ist dieses Verfahren nicht nur auf die cis-trans-Isomerie beschränkt, sondern jeder Zustand oder Photoisomerie, der durch Einfall oder Absorption von Lichtquanten die Konfiguration des Moleküls ändert, kann dazu verwendet werden.
  • 3.) Fluoreszenzbasierte atomare oder molekulare Licht- und/oder Energiequelle:
  • Der Fluorophor kann als atomare oder molekulare Licht- oder Energiequelle zur Beleuchtung/Beaufschlagung von umliegendem Material dienen oder um Energie einer atomaren oder molekularen Einheit gezielt zuzuführen, um diese elektronisch anzuregen oder damit diese Arbeit verrichten kann oder um Informationen an diese zu übermitteln.
  • Für die Nanotechnik sind auch atomare oder molekulare Lichtquellen von Interesse, die gemäß dem STED-Verfahren funktionieren und die deswegen an einer genau örtlich definierten Position zu einem genau definierten Zeitpunkt eine genau definierte Anzahl von Photonen mit einer genau definierten Quantenenergie emittieren können, um beispielsweise einen FRET-Prozess z. B. für eine Nanometerskala anzuregen [27]. Dazu wird der Fluorophor mit dem STED-Verfahren zum richtigen Zeitpunkt aktiviert und angeregt, um ein solches Photon zu emittieren:
    Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen, welche sich ausbreiten und auf benachbarte Moleküle des sie umgebenden Materials treffen.
  • Um den richtigen Emissionszeitpunkt des Fluoreszenzphotons auszuwählen, kann nach dem Abregungslicht S3 der in der Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3 verbliebene Fluorophor durch einen weiteren stimulierenden Abregungslichtstrahl S4 beaufschlagt werden, so dass durch stimulierte Emission der Fluorophor zum gewünschten Zeitpunkt das Fluoreszenzlicht emittiert.
  • Solche atomaren Lichtquellen können im Verbund auch verwendet werden, um durch das STED-Verfahren gezielt optische Resonanzmoden in benachbarten Mikro- oder Nanopartikeln anzuregen (beispielsweise optische Moden im Volumen oder in Kavitäten des Partikels, und zwar zwischen dessen spiegelnden Oberflächen auf den Innen- und/oder Außenseiten, oder es können Moden in den das Partikel umfassenden kugelförmigen transparenten Schichten angeregt werden oder auch Whispering Gallery Modes können angeregt werden [28]). Die Mikro- oder Nanopartikel können dann beispielsweise eingesetzt werden als labelfreie (Bio-)sensoren (bsp. zum ortsgenauen Nachweis von einzelnen Zielanalyten oder zur atomar ortsgenauen Bestimmung des pH-Wertes) oder als Detektor mit einer räumlich atomaren Auflösung für externe Einflüsse, die die Resonatorbedingungen ändern, e. g. Druck oder Temperatur). Da auch in dieser Anwendung das STED-Verfahren eingesetzt wird, kann eine räumliche Auflösung der nachzuweisenden Zielanalyte oder der zu detektierenden Parameter in atomarer Größenordnung erfolgen.
  • Neben der Anwendung als Biosensor können die Fluorophore mittels des STED-Verfahrens auch Cantilever-Spitzen eines AFM oder eines anderen Rasterelektronenmikroskops oder eines Feldelektronenmikroskops atomar ortsgenau markieren, um diese vor der ersten Messung kalibrieren zu können.
  • Man kann sich auch vorstellen, dass zwei benachbarte Fluorophore die Fluoreszenzstrahlung synchronisiert mit derselben Phase abstrahlen, indem nach dem Abregungslicht S3 die in der Nullstelle im Zustand Z3 verbliebenen Fluorophore durch einen stimulierenden Abregungslichtstrahl S4 gleichzeitig beaufschlagt werden, so dass durch stimulierte Emission beide Fluorophore gleichzeitig mit einer konstanten Phasenbeziehung das Fluoreszenzlicht emittieren. Als „Nanolaser” kann man eine solche Anordnung noch nicht interpretieren, da der Resonator und somit eine Vorzugsausbreitungsrichtung fehlt. Eventuell handelt es sich um einen „Nanosuperstrahler”. Falls man aber die beiden oder mehreren Fluorophore innerhalb eines Quantenfilms oder innerhalb einer Grenzschicht eines Halbleiterlasers mit reflektierenden Innenflächen integriert, kann eventuell doch dem emittierten Fluoreszenzlicht eine Richtung vorgegeben werden.
  • III.) Fluoreszenzbasierter Sensor
  • Als Sensoren können Bauteile oder auch einzelne Moleküle bezeichnet werden, die geeignet sind, bestimmte physikalische oder chemische Größen, die ein Objekt oder einen Prozess charakterisieren, zu messen, indem diese mittels eines Effektes erfasst und ein entsprechendes Meßsignal generiert und ausgegeben wird.
  • Der STED-Prozess kann verwandt werden, um hochempfindliche Sensoren im Nanometermaßstab, die eine Hoch- oder Superortsauflösung besitzen, zu realisieren. Dabei kommen die Sensoren in Form von fluoreszierenden Molekülen vor.
  • Dabei kann man zwei Arten von Sensoren mit prinzipiell verschiedenen Funktionsweisen unterscheiden:
    • – bei der ersten Funktionsweise beeinflusst die unmittelbare atomare oder molekulare Umgebung die physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften des fluoreszierenden Sensormoleküls wie beispielsweise Fluoreszenzwellenlänge, Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzdauer, Phase des emittierten Fluoreszenzlichts, so dass aus dem emittierten Fluoreszenzlicht des Fluorophors Rückschlüsse auf die unmittelbare physikalische und/oder chemische Umgebung geschlossen werden können. Dabei kann man sowohl kinetische als auch thermodynamische Vorgänge mit oder ohne Stoff- oder Phasenumwandlung untersuchen.
    • – bei der zweiten Funktionsweise wird das fluoreszierende Sensormolekül entweder an ein mobiles oder bewegtes Medium oder an ein stationäres oder ruhendes Medium fixiert, so dass im ersten Fall der fluoreszierende Sensor mit dem mobilen Medium mitbewegt und im zweiten Falle der fluoreszierende Sensor im oder auf dem stationären Medium ruht. Dabei fungiert der fluoreszierende Fluorophor als Sender. Somit kann man im ersten Falle die Bewegung des Mediums nachverfolgen und somit Informationen über deren Kinematik und/oder Dynamik erhalten, oder man kann im zweiten Falle erkennen, wenn ein anderes Medium sich über dem stationären Medium ausbreitet oder sich darüber hinwegbewegt, um somit die Bewegung eines anderen Mediums anzuzeigen.
  • Fluoreszenzbasierter Sensor gemäß der ersten Funktionsweise
  • Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im fluoreszierenden Zustand Z3 im Bereich der zentralen Nullstelle. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen, die auf die Detektoroberfläche treffen und mit denen man ein räumlich superaufgelöstes Bild erzeugen kann.
  • Bei dem Sensor gemäß der ersten Funktionsweise hängen die Eigenschaften des vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzlichts (Wellenlänge, Intensität, Polarisation, Halbwertzeit, Phasenverschiebung etc.) auch von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der unmittelbaren atomaren oder molekularen Umgebung wie beispielsweise den benachbarten Bindungsverhältnissen der chemischen Umgebung ab, da die physikalisch-chemischen Eigenschaften der molekularen Umgebung einen Einfluss auf die elektronische Struktur oder Eigenschaften des Fluorophor-Moleküls besitzen, was wiederum Einfluss auf die Eigenschaften des emittierten Fluoreszenzlichts (Wellenlänge, Intensität, Halbwertszeit, Phasenverschiebung etc.) hat, so dass anhand des emittierten Fluoreszenzlichts die physikalisch-chemischen Umgebungseigenschaften bestimmt werden können und somit z. B. Rückschlüsse auf die Bindungsverhältnisse in der unmittelbaren Umgebung in atomarer Auflösung möglich sind. Ein besonderes Beispiel ist das Quenchen.
  • Dies ermöglicht eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten:
    Da man mittels des detektierten Fluoreszenzlichtes anhand deren optischen Fluoreszenzeigenschaften wie Fluoreszenzwellenlänge und -dauer Rückschlüsse auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der unmittelbaren atomaren/molekularen Umgebung ziehen kann, und zwar punktuell mit einer räumlichen Auflösung im Nanometermaßstab, erscheint es möglich, zusammen mit den reinen räumlich hochaufgelösten Ortsinformationen für die rein bildgebende Detektion und Darstellung eine räumliche Verteilung der physikalisch-chemischen Eigenschaften in atomarer Auflösung bereitzustellen (mapping).
  • Folgende Anwendungsbeispiele in den folgenden Themengebieten erscheinen denkbar:
  • ohne Stoffumwandlung:
  • Man kann hinsichtlich der Materialuntersuchung ohne Stoffumwandlung mittels des Sensors gemäß der ersten Funktionsweise zwischen Anwendungen aus dem Gebiet der Kinetik und aus dem Gebiet der Thermodynamik unterscheiden:
  • kinetisch:
    • Kinetik, Diffusion, Osmose, Absorption, Adsorption, Physisorption, Chemisorption, Kristallwachstum, Defektbildung im Kristallgitter (Halbleiterkristalle: Frenkeldefekte etc.), Rißbildung, Elektrophorese, Mischvorgänge, Quenchen, Konvektion, akustischen und/oder thermische Effekte, Korrosionsvorgänge, eventuell auch Plasma möglich
  • thermodynamisch:
    • Phasenumwandlung, Kondensation, Sublimation, Phasenumwandlung auch beim Supraleiter, Auskondensation, Auflösen in Lösungen, Mischvorgänge, Kristallisation, Absorption, Adsorption, Umwandlung von einem Aggregatzustand in einen anderen Aggregatzustand
  • technische oder Ingenieurwissenschaftliche Prozesse oder Vorgänge:
  • Der Fluorophor wird als Marker in eine Mikro- oder Nanovorrichtung eingebaut oder ist dort selbst als aktives Element tätig, beispielsweise zur Prozessüberwachung während seiner eigenen Herstellung oder während des Betriebs, Überwachung der Alterung, Veränderungen der funktionalen Eigenschaften im Betriebsablauf, Dejustage, Abnutzung, Zerstörung
  • mit Stoffumwandlung:
  • Man kann hinsichtlich der Materialuntersuchung mit Stoffumwandlung mittels des Sensors gemäß der ersten Funktionsweise zwischen Anwendungen aus dem Gebiet der Kinetik und aus dem Gebiet der Thermodynamik unterscheiden:
  • kinetisch:
  • Reaktionskinetik, chemischer Reaktionsverlauf zwischen Reaktionspartnern: dabei dient der Fluorophor als Marker oder ist selber aktiver Reaktionspartner, Katalyse, kernchemische Reaktionen
  • Allgemein kann man bezüglich des Sensors gemäß der ersten Funktionsweise noch folgende Anwendungsgebiete voneinander unterscheiden:
    Oberflächen- oder Volumeneffekte, Phänomene an der Phasengrenze oder Grenzflächenphänomene zwischen gleichen oder verschiedenen Phasen und/oder Aggregatzuständen, Untersuchungen im festen, flüssigen oder gasförmigen Aggregatzustand oder im Plasma, oder in nicht eindeutig definierten Aggregatzuständen wie Glas, Sand, Pulver etc.
  • Folgende konkrete Anwendungsbeispiele sind denkbar, aber stellen lediglich nur eine begrenzte Auswahl dar:
    Es können physikalische, chemische oder biologische Eigenschaften, Größen und/oder Zustände oder technische, natur- und/oder ingenieurwissenschaftliche Kenngrößen von statischen (zeitlich sich nicht verändernden) oder dynamischen (zeitlich sich verändernden) technischen, physikalischen, chemischen oder biologischen Systemen (natürlich oder künstlich), wie beispielsweise Substanzen, Materialien, homogene oder heterogene Stoffsysteme, Reaktionssysteme, biologische Zellen, technische Vorrichtungen sowie Prozesse/Vorgänge in diesen (z. B. Phasenumwandlung, chem. Reaktionen) nicht-zeitaufgelöst oder zeitaufgelöst in atomarem oder molekularem Maßstab in verschiedenen Aggregatzuständen/Phasen bestimmt werden.
  • Nachdem wie bereits mehrfach oben beschrieben der RESOLFT/STED/GSD-Prozess durchlaufen wurde, wird ein vom Fluorophor emittiertes Fluoreszenzphoton erzeugt, deren optische Fluoreszenzeigenschaften wie Fluoreszenzwellenlänge oder -dauer u. a. Informationen über die chemische Umgebung des Fluorophors enthält und die ausgewertet werden. Man kann eine Festkörperoberfläche (kristallin, amorph, Halbleiter, Metall, Polymer, (bio-)chemische Substanzen u. a.) mit diesen Fluorophoren bestücken und somit die Bindungsverhältnisse der z. B. durch Physisorption/Chemisorption/Van-der-Waal-Kräfte angelagerten Atome oder Moleküle bestimmen.
  • Man kann somit die Oberflächenzustände vermessen und auch den gesamten Absorptions- oder Adsorptionsbelegungs- oder Desorptionsprozess zeit- und ortsaufgelöst verfolgen (Sorptionsisotherme). Ebenfalls ist es möglich, die Veränderung im darüber liegenden Bereich anzuzeigen, z. B. wenn Gas, Dampf oder ein anderes Fluidum über die Oberfläche oder innerhalb eines Strömungskanals strömt, an deren Innenflächen der Fluorophor immobilisiert worden ist. Das am Fluorophor vorbeifließende Teilchen oder Medium oder Fluidum tritt mit dem Fluorophor in Wechselwirkung. Dadurch ändern sich die chemische Umgebung des Fluorophors und somit auch die Fluoreszenzeigenschaften der von ihm emittierten Fluoreszenzphotonen wie Fluoreszenzwellenlänge oder -dauer. Bei transparenten Festkörpern (Glas, Polymere) kann man die Fluorophore auch im Materialvolumen, oder zumindest dicht unterhalb der Oberfläche anbinden, um etwas über die Bindungszustände im Materialvolumen oder dicht unterhalb der Oberfläche zu erfahren. Man kann die Fluorophore auch an Mikro- oder Nanopartikel (Microbeads) anbinden, die sich in einem Fluidum befinden und in einer Flüssigkeitsströmung) auflösen. Fluorophore müssen nicht immer unbedingt nur an Festkörperoberflächen angebunden werden, sondern können auch mit Flüssigkeitsmolekülen oder Gasmolekülen verbunden werden. Eventuell können die Fluorophore auch in einem Plasma eingesetzt werden; oder aber die Fluorophore können auch in Form eines Liganden oder eines Zentralteilchens in eine Komplexverbindung oder allgemein in einen Molekülabschnitt eines beliebigen (biochemisches oder synthetisches oder andersartiges) Molekül eingebracht werden, um etwas über die Bindungsverhältnisse innerhalb des Moleküls in Erfahrung zu bringen.
  • Nicht nur statische Situationen lassen sich dadurch beschreiben, sondern auch dynamische Vorgänge, in denen sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Umgebung zeitlich verändern: so kann man beispielsweise die Fluorophore an einen Reaktionspartner (Edukt) in Form eines Labels oder Markers anbinden, der daraufhin eine chemische Reaktion durchläuft. Es ist auch möglich, dass der Fluorophor selber ein Reaktionspartner ist. In jedem Fall lassen sich anhand der emittierten Fluoreszenzstrahlung in-situ Rückschlüsse ziehen auf die zeitliche Veränderung der Bindungsverhältnisse im Verlauf der chemischen Reaktion. Bei den chemischen Reaktionen kann es sich um jegliche Art von chemischen Reaktionen handeln; dazu zählen biochemische Reaktionen (z. B. Polymerase-Kettenreaktion) wie auch technische Reaktionen aus der Technischen Chemie (z. B. Polymerisation). Auch kernchemische Reaktionen sind denkbar, wenn durch radioaktive Strahlung sich die Kernzahl und somit das chemische Element ändert, hat dies auch Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften der vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzstrahlung. Analog lässt sich somit auch die zeitliche Änderung von physikalisch-chemischen Eigenschaften während des Ablaufs von biologischen, physikalischen, geophysikalischen, geologischen, mineralogischen Vorgängen oder Prozessen (Phasenumwandlung) im Nanometermaßstab in-situ verfolgen.
  • Ein weiteres großes Anwendungsgebiet ist die Ingenieurwissenschaft, insbesondere die Mikro- und Nanotechnik. Durch einen Sensor gemäß der ersten Funktionsweise lassen sich so auch Fehler im Produktions- oder Herstellungsablauf von Mikro- oder Nanostrukturen auffinden. Die Fluorophore können auch zur Qualitätssicherung oder -kontrolle während der Produktion von Mikro- oder Nanostrukturen eingesetzt werden; oder in Mikro- oder Nanokomponenten eingebaute Fluorophore werden zur Prozessüberwachung eingesetzt, um die Funktionalität und Alterungsprozesse von sich im Betrieb befindlichen Mikro- oder Nanostrukturen in-situ zu überprüfen. Zur Prozessüberwachung gehören auch das Erkennen von Veränderungen der funktionalen Eigenschaften im Betrieb, Dejustage, Abnutzung oder Zerstörung. Dabei sind die Fluorophore selber als Marker eingebaut oder fungieren selber als aktive Komponente in der Mikro- oder Nanovorrichtung.
  • Falls notwendig, können die Fluorophore auch einen gewünschten Reparatur- oder Selbstzerstörungsprozess der Mikro- oder Nanostruktur auslösen.
  • Dies alles gilt auch für biologische, biochemische oder chemische Systeme wie Mikroreaktoren, Nanoreaktoren oder biologische Zellen.
  • Fluoreszenzbasierter Sensor gemäß der zweiten Funktionsweise
  • Bei dem Sensor gemäß der zweiten Funktionsweise dient der Fluorophor lediglich als Lichtquelle, die unbeeinflusst von der lokalen physikalisch-chemischen Umgebung Fluoreszenzlicht mit unveränderten Eigenschaften emittiert.
  • Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben worden ist, wird das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im Bereich der Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen. Dabei sind mehrere verschiedene Anwendungen möglich, wie im Folgenden genauer erörtert:
  • Bedeckungssensor
  • Die Oberfläche eines stationären Objekts wird mit Fluorophoren ausgestattet, die Fluoreszenzlicht superortsaufgelöst emittieren. Dieses Fluoreszenzlicht wird von einem Detektor superortsaufgelöst detektiert. Zu einer Änderung des Detektionssignals kommt es nur, wenn der Fluorophor von einem anderen mobilen Objekt (Gas- oder Flüssigkeitsströmung, bewegte feste Teilchen mit größerem oder kleinerem Durchmesser wie Sand, Pulver etc.) teilweise oder vollständig verdeckt wird. Aus dem Detektionssignal kann man dann den Zeitpunkt des Vorbeiflugs des sich vorbeibewegenden Teilchens bestimmen oder im Falle von vielen Fluorophoren angeordnet in Form eines zweidimensionalen Feldes auf der Oberfläche des stationären Objekts kann man die genauen Ortskoordinaten des vorbeifliegenden Teilchens in atomarer Auflösung messen. Bei einer teilweisen Verdeckung von vielen kleineren vorbeifliegenden Teilchen kann man eine Teilchendichtemessung durchführen, oder im Falle von vorbeiströmenden Flüssigkeiten oder Gase kann man Transmissions- oder Absorptions- oder Reflexionsmessungen superortsaufgelöst durchführen; oder an die Innenseite/-fläche von μ-Fluideinrichtungen oder μ-Fluidkanäle oder in biologische Zellen befestigen, um die Anwesenheit von Fluiden anzuzeigen und um deren Nanometerströmungsverhalten zu untersuchen.
  • Nachverfolgung von Objekten
  • Der Fluorophor wird auf einem mobilen Objekt immobilisiert. Wenn sich nun dieses mobile Objekt in Bewegung setzt und der Fluorophor emittiert nun Fluoreszenzstrahlung, dann lässt sich der stetig veränderte Aufenthaltsort des Fluorophors und damit des mobilen Objektes, mit dem es fest verbunden ist, und somit seine Trajektorie in-situ und momentan verfolgen, und zwar in atomarer Auflösung weit unterhalb der Abbé'schen Auflösungsgrenze (hochortsaufgelöste Nachverfolgung).
  • Man kann die Fluorophore auch an Mikro- oder Nanopartikel (Microbeads) anbinden und in eine Flüssigkeitsströmung) einbringen oder aber der Fluorophor liegt selbst in flüssiger Form vor und ist damit selber Teil der Flüssigkeitsströmung. Somit kann man den Verlauf der gesamten Flüssigkeit im Nanometermaßstab verfolgen. Die Strömung kann nach Bernoulli strömen und kann eine Schichtenströmung sein (Newton'sches Fluid), oder es kann eine turbulente Strömung sein. Dadurch kann man das Scherverhalten, besonders an der Grenzfläche zu anderen Flüssigkeiten oder zur Wand des flüssigkeitsführenden Mikrokanals, Turbulenzen im Nanomaßstab, die innere Reibung (Viskosität) oder die Reynold-Zahl (Umschlagpunkt von laminarer in turbulenter Strömung) und andere rheologische Effekte superortsaufgelöst bestimmen. Dabei muss entweder der Abregungsstrahl S3 mit Nullstelle bzw. die entsprechende Optik mitbewegt werden, oder es sind sehr viele Fluorophore immobilisiert, und der Abregungsstrahl trifft immer nur eine bestimmte Stelle.
  • Dosimeter
  • Bei dieser Anwendung können einzelne UV-Photonen hochortsaufgelöst detektiert werden, die bei PALM oder STED als Anregungslicht verwendet werden. Anders als beim PALM- oder STED-Verfahren werden in diesem Falle die Detektoren, die das emittierte Fluoreszenzphoton detektieren, nicht eingesetzt, um ein Bild der Probe in Superauflösung zu erhalten, sondern hier ist das Ziel, dass der Fluorophor selber als Sensor eingesetzt wird, um die Existenz und Menge von einfallendem UV-Anregungslicht ortsaufgelöst anzuzeigen. Fällt auch nur eine geringe Menge von UV-Anregungslicht auf die den Fluorophor enthaltende Oberfläche ein, so wird sich dies durch Fluoreszenzerscheinung bemerkbar machen, wenn vorher die Stellen mit dem Aktivierungslicht S1 angeschaltet worden ist und optional (im Falle von STED) bei Bedarf Abregungslicht S3 (mit einer Nullstelle) angewandt worden ist, um nur noch einzelne punktuelle Stellen sensitiv für das einfallende UV-Licht bereitzustellen. Ansonsten bleibt die Probe dunkel, denn wenn kein UV-Anregungslicht S2 auf die mit Fluorophoren bestückte Probenoberfläche einfällt oder die entsprechenden Stellen sind nicht mit Aktivierungslicht eingeschaltet worden, dann werden die Fluorophore auch kein Fluoreszenzlicht emittieren. Vorteil mit dem STED-Verfahren ist, dass man einzelne Stellen der Probe in atomarer Dimension ein- und ausschalten kann, so dass diese einzelnen Stellen für den Nachweis aktiviert oder deaktiviert werden können, um eine vorher nicht dagewesene räumliche Auflösung der Verteilung des Anregungslichts S2 zu erreichen. Praktisch handelt es sich hierbei um ein ortsauflösendes Dosimeter mit einer Ortsauflösung weit unterhalb der optischen Auflösungsgrenze, um u. a. auch die Intensitätsverteilung innerhalb des Anregungslichtstrahls zu untersuchen.
  • Auch das SIM-Verfahren ist für diese Art der Anwendung geeignet, da man durch die Beaufschlagung mit periodisch strukturiertem Licht das Auflösungsvermögen beträchtlich erhöhen kann.
  • IV.) Weitere Anwendungen
  • 1.) Fluoreszenzbasierte Markierung (Identifizierung/Authentifizierung/Informationsträger)
  • Wie bereits weiter oben Ausführungsbeispiele ausführlich beschrieben, wird das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im Bereich der Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen.
  • Nicht nur biologische Moleküle, auch Moleküle von technischen Werkstoffen/Materialien insbesondere von Mikro- oder Nanomaschinen (oder von anderen Vorrichtungen, die nur eine sehr, sehr begrenzte Oberfläche in der Größenordnung von einigen Atomdurchmessern zur Verfügung haben, bspw. Cantilever-Spitzen eines AFM oder Feldelektronenmikroskops) können mittels des STED-Verfahrens atomar ortsgenau oder lokal markiert werden, um eben Informationen zu speichern über diesen Werkstoff/Material oder Maschine (Hersteller, Herstellungsdatum und -land, Produkt- oder Seriennummer, Produktions- oder Prozessparameter, chemische Zusammensetzung, physikalischchemischen, funktionalen und/oder technischen Eigenschaften/Merkmale etc.), um später durch eine atomare lokale Abrufung der Informationen mittels des STED-Verfahrens eine Identifizierung und/oder Authentifizierung und/oder Nachverfolgung eben dieser zu ermöglichen.
  • Speziell für diese Anwendung oder allgemein für jede andere Anwendung kann auch der 3D-Druck/stereolithographische Druck angewandt werden, um die Fluorophore nicht nur an der Oberfläche, sondern auch im Materialvolumen (bulk) selber in atomaren Maßstäben ortsgenau zu positionieren.
  • 2.) Optische Falle
  • Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im Bereich der Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen.
  • Wenn der Fluorophor nun in einer optischen Falle eingefügt worden ist, dann kann man mittels des STED-Verfahrens die Position des in der optischen Falle (wie beispielsweise in DE 10 2014 005 219 A1 beschrieben) genau lokalisieren. Man kann dann die laserstrahl-gestützte Kühlung von einzelnen Atomen oder Molekülen ortsgenau genau verfolgen. Dies ist wichtig, da der zur Kühlung des Fluorophors oder des mit dem Fluorophor markierten Moleküls eingesetzte Laserstrahl muss genau die richtige Phasenbeziehung an der richtigen Stelle besitzen, damit der Fluorophor/das Molekül durch Abregung auch gekühlt wird. Ansonsten muss, wenn die STED-Messung eine unpassende Ortsposition ergibt, über ein Feedback-Signal die Phase des einfallenden Laserstrahls oder die Position des zu kühlenden Atoms/Moleküls nachgesteuert werden.
  • Anstelle von STED können auch andere Technologien zur Lokalisierung unterhalb der Beugungsgrenze verwenden werden.
  • 3.) FRET-Paar (Donor und Akzeptor)
  • Man kann den STED-Prozess auch mit dem FRET(Förster-Resonanzenergietransfer)-Prozess kombinieren. Dabei stellt das Fluorphor den Akzeptor oder Donor im FRET-Paar (bestehend aus Donor und Akzeptor) dar oder das FRET-Paar dient in seiner Gesamtheit als einzelner Fluorophor. Mittels des FRET-Prozesses lassen sich Rückschlüsse auf die physikalisch-chemische Umgebung ziehen.
  • Wie bereits weiter oben ausführlich beschrieben, wird das STED oder ein vergleichbares Verfahren durchlaufen. Nach Beaufschlagung der Abregungsstrahlung S3 verbleiben nur noch ein oder wenige Fluorophore im Bereich der Nullstelle im fluoreszierenden Zustand Z3. Diese(s) Fluorophor(e) emittieren nun ein oder mehrere Fluoreszenzphotonen, die auf einen ortsauflösenden Detektor treffen, so dass sich ein hochaufgelöstes Bild der Probe ergibt.
  • Dabei kann der Fluorophor als FRET-Paar vorliegen; oder der Fluorophor kann als Akzeptor des FRET-Paares vorliegen, dann erfolgt die Anregung des Akzeptors mittels des STED-Prozesses hochortsaufgelöst, d. h. der Resonanzenergietransfer zwischen Akzeptor und Donor findet statt, nachdem der Abregungsstrahl S3 die Position des Akzeptors mittels der Nullstelle eingeengt hat, und somit erfolgt die Emission des Fluoreszenzlichtes des Donors ebenfalls hochortsaufgelöst; oder der Fluorophor kann als Donor des FRET-Paares vorliegen, dann erfolgt die Emission des Donors mittels des STED-Prozesses hochortsaufgelöst, nachdem der Abregungsstrahl S3 die Umgebung des Fluorophors bzw. Donors abgeregt hat.
  • Liegt nun der Fluorophor als FRET-Paar oder als Akzeptor oder Donor des FRET-Paares vor, so lassen sich die hochaufgelösten Ortsinformationen mit den entsprechenden Informationen über die physikalisch-chemische Umgebung an derselben Stelle kombinieren. Man erhält auf die Weise eine superortsaufgelöste räumliche Verteilung (mapping) der physikalisch-chemischen Eigenschaften der untersuchten Probenoberfläche.
  • Eigentlich stellt dies einen Spezialfall eines Sensors gemäß der ersten Funktionsweise dar.
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  • Legende:
  • 1: Elektronisches Termschema beim RESOLFT/STED-Prozess
  • 2: Prinzip des SIM veranschaulicht im reziproken Raum
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • DE 102014005219 A1 [0093]

Claims (1)

  1. Verwendung eines optisch nicht-beugungsbegrenzten optisch hoch- oder superortsauflösendes Mikroskopieverfahrens und/oder -Vorrichtung wie RESOLFT, STED, GSD, PALM, FPALM, PALMIRA, STORM, dSTORM, SIM, 3D-SIM, SMI, SPDM, SPDMphymod mit „blinkenden Farbstoffen”, SOFI, SALM, 4Pi, 4Pi-STED, TIRF, 3D LIMON, LSI-TIRF, SNOM und/oder technische Ableitungen und/oder Kombinationen davon oder mit anderen Mikroskopiemethoden wie beispielsweise FCS oder FCCS zur fluoreszenz-basierten Nanostrukturierung und anderen Anwendungen, die eine Hoch- oder Superortsauflösung erfordern.
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