DE102015006335A1 - Methods and constructs for the targeted nucleic acid editing in plants - Google Patents

Methods and constructs for the targeted nucleic acid editing in plants

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DE102015006335A1
DE102015006335A1 DE201510006335 DE102015006335A DE102015006335A1 DE 102015006335 A1 DE102015006335 A1 DE 102015006335A1 DE 201510006335 DE201510006335 DE 201510006335 DE 102015006335 A DE102015006335 A DE 102015006335A DE 102015006335 A1 DE102015006335 A1 DE 102015006335A1
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DE
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Patent type
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plant
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nucleic acid
target
grna
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Pending
Application number
DE201510006335
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German (de)
Inventor
Markus Niessen
Hinrich Harling
Susana Martin-Ortigosa
Corinna Streitner
Nadine Schumann
Erik Jongedijk
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Kws Saat Se
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KWS SAAT SE
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Konstrukte zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zielstruktur. The present invention relates to methods and constructs for targeted alteration of a nucleic acid target region in a target plant structure. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Konstrukte zur direkten Gewinnung einer Pflanze oder von Pflanzenmaterial, welche eine zuvor gezielt in eine meristematische Zelle eingebrachte Editierung einer Nukleinsäure, jedoch nicht die hierfür zur Erzeugung der gezielten Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion zuvor eingebrachten rekombinanten Konstrukte, umfasst. Specifically, the present invention provides methods and constructs for the direct extraction of a plant or plant material which comprises a previously deliberately introduced into a meristematic cell editing of a nucleic acid, but not for this previously introduced to produce the targeted modification of the nucleic acid-target region recombinant constructs relates.

Description

  • Technisches Gebiet technical field
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle umfassend die Bereitstellung und Einbringung mindestens einer gRNA sowie einer einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne oder mindestens eines rekombinanten Konstruktes, umfassend eine gRNA sowie eine Cas-Nuklease und/oder eine Effektor-Domäne, oder die dafür kodierenden Sequenzen, sowie mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz, in eine pflanzliche Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, wodurch direkt eine Pflanze, ein Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle gewonnen werden kann, wobei das mindestens eine rekombinante Konstrukt vorzugsweise nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert wird. The present invention particularly relates to methods for producing a plant, a plant material or plant cell comprising providing and introducing at least one gRNA and one of a Cas-nuclease, and / or an effector domain or at least one recombinant construct comprising a gRNA and a Cas nuclease and / or an effector domain, or for the coding sequences, and at least one regulatory sequence and / or a localization sequence, in a plant target structure comprising at least a meristematic cell, thereby directly recovered a plant, plant material or a plant cell can be wherein the at least one recombinant construct is preferably not integrated chromosomally or extrachromosomally. Zudem werden geeignete rekombinante Konstrukte und Vektoren sowie Verfahren zur Einbringung dieser Konstrukte und Vektoren in eine pflanzliche Zielstruktur von Interesse offenbart. In addition, suitable recombinant constructs and vectors as well as methods for the introduction of these constructs and vectors into a plant target structure of interest are disclosed. Schließlich wird die Verwendung eines rekombinanten Konstrukts zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zelle offenbart, sowie Pflanzen, Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich oder erhalten sind. Finally, the use of a recombinant construct for targeted alteration of a nucleic acid target region in a plant cell is disclosed, as well as plants, plant material or plant cell, obtainable by the process of the invention or obtained.
  • Hintergrund der Erfindung Background of the Invention
  • Genom Editierung stellt ein molekularbiologisches Verfahren dar, durch welches gezielte Modifikationen wie Insertionen, Deletionen oder Punktmutationen oder Kombinationen davon in das Genom eines lebenden Organismus eingebracht werden können. Genome editing represents a molecular biological process by which specific modifications such as insertions, deletions or point mutations, or combinations thereof of a living organism can be introduced into the genome. Hierfür werden gezielte molekulare Instrumente benötigt, welche zum einen Nukleaseaktivität besitzen, darüber hinaus aber auch mit ausreichender Spezifität zu der zu verändernden Zielsequenz geleitet werden können, um eine gezielte und ortsgerichtete Mutagenese planen und durchführen zu können. For this targeted molecular tools are required, which have to a nuclease, but it also can also be passed with sufficient specificity to be changed target sequence to plan and targeted and site-directed mutagenesis to perform. In der Pflanzenbiotechnologie hat sich die gezielte Genome Editierung in den letzten Jahren zu einer Alternative im Vergleich zur klassischen Züchtung und zu transgenen Ansätzen entwickelt. In plant biotechnology, the targeted genome editing in recent years has become an alternative compared to conventional breeding and transgenic approaches. Die bisher verfügbaren Tools wie Zink-Finger Nukleasen (ZFNs) oder „transcription activator-like effector nucleases” (TALENs) sind im Bereich der Pflanzenbiotechnologie allerdings nur begrenzt eingesetzt worden, was an der teilweise niedrigen Effizienz, aber auch an schwierigem und aufwendigem Design der Konstrukte liegt. The previously available tools such as zinc finger nucleases (ZFNs) or "transcription activator-like effector nucleases" (Talens) are however limited use in the field of plant biotechnology, what at some low efficiency, but also difficult and elaborate design constructs is.
  • Ein weiteres molekulares Werkzeug, welches in den letzten Jahren gehäuft zur präzisen und ortsgerichteten Genommodifikation eingesetzt wurde, sind Cas-Nuklease-basierte Systeme. Another molecular tool that has been used frequently for precise, site-directed genomic modification in recent years, Cas nuclease based, systems. Diese Nukleasen sind Teil des nunmehr in der Literatur als „CRISPR/Cas” bezeichneten Systems (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-assoziierte Gene). These nucleases are part of the system called "CRISPR / Cas" now in the literature (Clustered Regularly interspaced short palindromic repeat / CRISPR-associated genes). Dieses System wurde ursprünglich 1987 bei Analyse des iap Gens von E. coli identifiziert, wobei natürlich vorkommende Wiederholungssequenzen im bakteriellen Genom identifiziert wurden. This system was originally identified in the analysis of the iap gene of E. coli 1987, naturally occurring repeat sequences were identified in the bacterial genome. Später wurde herausgefunden, dass diese palindromischen DNA-Widerholungssequenzen von 20 bis 50 Nukleotiden einem Muster folgen. It was later found that this palindromic DNA Widerholungssequenzen of 20 to 50 nucleotides follow a pattern. Hierauf wurde das Akronym CRISPR geprägt ( Then the acronym was coined CRISPR ( ), wobei sich die Forschung nach wie vor auf Bakterien fokussierte. ), Wherein the research focused on bacteria as before. Schließlich wurde beschrieben, dass der CRISPR-Lokus eine Art bakterielles Immunsystem darstellt und erworbene Immunität gegen Phagen verleihen kann ( Finally, it was reported that the CRISPR locus is a kind of bacterial immune system and can confer acquired immunity against phage ( ), indem die invadierende Phagen-DNA zunächst als Protospacer in einen CRISPR Lokus eingebaut, der Lokus dann transkribiert und schließlich der CRISPR-vermittelte Silencing Mechanismus aktiviert wird. ) By the invadierende phage DNA initially installed as Protospacer in a CRISPR locus, the locus then transcribed and finally mechanism is activated the CRISPR-mediated silencing.
  • Durch die funktionelle Charakterisierung erfolgte auch die schrittweise Nutzung des Systems als universelles Werkzeug zur Genommodifikation höherer Organismen. Through the functional characterization of the progressive use of the system was carried out as a universal tool for genome modification of higher organisms. Zwischenzeitlich ist eine Vielzahl von CRISPR/Cas Systemen, einschließlich eines Typ-II Systems, beschrieben (siehe etwa Meanwhile, a plurality of CRISPR / Cas systems, including a type II system described (see for example ), wobei die Analysen bei weitem noch nicht abgeschlossen sind. ), Where the analyzes are not far from complete.
  • Durch die Entdeckung und Nutzbarmachung des bakteriellen Typ-II CRISPR Systems steht ein weiteres „Genome Editing” System mit großem Potential zur Verfügung. The discovery and exploitation of the bacterial type II CRISPR system another 'genome editing' system is of great potential available.
  • Das CRISPR/Cas System erlaubt es, durch eine kleine individuell anpassbare nicht kodierende RNA (guide RNA bzw. gRNA) in Kombination mit einer Cas-Nuklease einen gezielten DNA Doppelstrangbruch zu erzeugen. The CRISPR / Cas system makes it possible to produce by a small custom-fit non-coding RNA (gRNA guide or RNA) in combination with a Cas nuclease a specific DNA double-strand break. Die in natürlichen Systemen durch CRISPR/Cas vermittelte Immunantwort benötigt CRISPR-RNA (crRNA), wobei die Maturierung dieser Leit-RNA, welche die gezielte Aktivierung der Cas-Nuklease steuert, zwischen den unterschiedlichen derzeit charakterisierten CRISPR Systemen deutlich variiert. Mediated in natural systems by CRISPR / Cas immune response requires CRISPR RNA (crRNA), the maturation of this routing RNA which controls the selective activation of the Cas nuclease, between the different systems currently characterized CRISPR varies significantly. Zunächst wird die invadierende DNA, welche auch „Spacer” genannt wird, zwischen zwei aneinander liegenden Repeat-Regionen am proximalen Ende des CRISPR Lokus integriert. First, the invadierende DNA, which is also called "spacer" is integrated between two adjacent repeat regions at the proximal end of the CRISPR locus. Typ-II CRISPR Systeme kodieren als Schlüsselenzym für den Interferenzschritt eine Cas9-Nuklease, welche sowohl eine crRNA als auch eine trans-aktivierende RNA (tracrRNA) als Leitmotiv benötigt. Type II systems encode CRISPR as a key enzyme in the interference step, a Cas9 nuclease, which requires both a crRNA as well as a trans-activating RNA (tracrRNA) as the guiding principle. Diese hybridisieren und bilden doppelsträngige (ds) RNA Regionen, welche von RNAseIII erkannt und gespalten werden können, um reife crRNAs zu bilden. This hybridize and form double-stranded (ds) RNA regions, which can be recognized by RNaseIII and cleaved to form mature crRNAs. Diese wiederum assoziieren dann mit dem Cas-Molekül, um die Nuklease gerichtet zur Nukleinsäure-Zielregion zu führen. This in turn then associate with the Cas-molecule to directed to nucleic acid target region to lead the nuclease. Rekombinante gRNA Moleküle können sowohl die variable DNA-Erkennungs- als auch die Cas-Interaktionsregion umfassen und somit abhängig von der konkreten Ziel-Nukleinsäure und der gewünschten Cas-Nuklease gezielt entworfen werden. Recombinant gRNA molecules may comprise both the variable DNA recognition and the Cas interaction region and thus are specifically designed depending on the particular target nucleic acid and the desired Cas nuclease. Als weiterer Sicherheitsmechanismus müssen in der Nukleinsäure-Zielregion zudem PAMs (protospacer adjacent motifs), DNA-Sequenzen, welche direkt vom Cas9/RNA-Komplex erkannter DNA folgen, vorhanden sein. As a further safety mechanism PAMs need in the nucleic acid target region also (protospacer Adjacent motifs), DNA sequences which follow directly from the detected Cas9 / RNA complex DNA may be present. So lautet die PAM-Sequenz für die Cas9 aus Streptococcus pyogenes etwa „NGG” oder „NAG” (Standard IUPAC Nukleotid-Code)( That is the sequence for the PAM Cas9 from Streptococcus pyogenes as "NGG" or "NOS" (standard IUPAC nucleotide code) ( ). ). Die PAM-Sequenz für Cas9 aus Staphylococcus aureus lautet „NNGRRT” oder „NNGRR(N)”. The PAM sequence for Cas9 from Staphylococcus aureus is "NNGRRT" or "NNGRR (N)". Weitere variante CRISPR/Cas9 Systeme sind bekannt. Other variant CRISPR / Cas9 systems are known. So schneidet eine Neisseria meningitidis Cas9 bei der PAM Sequenz NNNNGATT. So cuts a Neisseria meningitidis Cas9 with PAM sequence NNNNGATT. Eine Streptococcus thermophilus Cas9 schneidet bei der PAM-Sequenz NNAGAAW. A Streptococcus thermophilus Cas9 intersects with PAM sequence NNAGAAW. Durch Einsatz von modifizierten Cas-Polypeptiden lassen sich ferner gezielte Einzelstrangbrüche erzielen. By use of modified polypeptides Cas further directed single-strand breaks can be achieved. Der kombinierte Einsatz von Cas-Nickasen mit unterschiedlichen rekombinanten gRNAs kann durch doppeltes DNA-Nicking ebenfalls hochgezielte DNA-Doppelstrangbrüche induzieren. The combined use of Cas-nickases with different recombinant gRNAs can induce DNA by double-nicking also high specific DNA double-strand breaks. Durch den Einsatz von zwei gRNAs kann darüber hinaus die Spezifität der DNA-Bindung und dadurch der DNA-Spaltung optimiert werden. Through the use of two gRNAs the specificity of the DNA binding and thus of DNA cleavage can be optimized beyond.
  • Durch den natürlichen Reparaturmechanismus der Pflanzenzelle wird der DNA Doppelstrangbruch entweder durch „non-homologous end joining” (NHEJ) oder „homology-directed repair” (HDR) bzw. homologe Rekombination (HR) repariert. By the natural repair mechanism of the plant cell the DNA double-strand break is repaired by either "non-homologous end-joining" (NHEJ) or "homology-directed repair" (HDR) or homologous recombination (HR). Darüber hinaus wurden in Pflanzen auch sogenannte Alternative end joining Wege (AEJ) beschrieben ( In addition, so-called alternative end-joining pathways (AEJ) have been described in plants ( ). ).
  • Anders als die genetische Veränderung bakterieller Genome stellt die Modifikation von komplexen eukaryontischen Genomen eine größere Herausforderung dar, da auf Grund der Komplexität dieser Genome molekulare Werkzeuge bereitgestellt werden müssen, welche eine zielgenaue Genommodifikation ohne unerwünschte Off-Target-Effekte, dh unerwünschte Mutationen oder Modifikationen innerhalb des Genoms oder der nicht genomischen DNA der Zielzelle, bewirken. Unlike the genetic modification of bacterial genomes, the modification of complex eukaryotic genomes more challenging as molecular tools have to be provided due to the complexity of these genomes that a targeted genome modification without unwanted off-target effects, ie undesired mutations or modifications within of the genome or the genomic DNA of the target cell does not cause.
  • Aus Out US 8,697,359 B1 US 8,697,359 B1 ist bekannt, dass unter Einsatz der CRISPR/Cas Technologie eukaryontische Genome, speziell Säugergenome und diese bevorzugt zu therapeutischen Zwecken, verändert werden können. it is known that can be changed using the CRISPR / Cas technology eukaryotic genomes, particularly mammalian genomes and prefers for therapeutic purposes. Hierbei wird die Expression eines Zielgens durch gezielte Einführung einer Cas9 Endonuklase sowie einer guide RNA (gRNA) programmierbar unterdrückt. Here, the expression of a target gene by targeted insertion of a Cas9 Endonuklase and a guide RNA (gRNA) is suppressed programmable. Diese gRNA ist ein wesentliches Element eines jeden Cas9-CRISPR-Systems, da sie die eigentliche Cas-Nuklease gerichtet zur (genomischen) Ziel-DNA leitet. This gRNA is an essential element of every Cas9-CRISPR system as it faces the (genomic) target DNA directs the actual Cas nuclease. Hierzu wird für Cas9-CRISPR-Systeme zudem eine tracr (trans-activating CRISPR RNA) Sequenz und eine tracr mate Sequenz offenbart, welche von der gRNA umfasst sein kann, wobei die tracr Sequenzen hybridisieren, um so erkannt zu werden. For this purpose a tracr (trans-activating CRISPR RNA) sequence and a tracr mate sequence also is for Cas9-CRISPR systems disclosed which may be encompassed by the gRNA, wherein the tracr sequences hybridize to be recognized. Der Einsatz der CRISPR-Technologie zur Modifikation von komplexen pflanzlichen Genomen sowie dafür erforderliche molekulare Werkzeuge werden jedoch nicht offenbart. The use of the CRISPR technology for modification of complex plant genomes as well as for necessary molecular tools are not disclosed.
  • WO 2015/026885 A1 WO 2015/026885 A1 hingegen widmet sich speziell der Anwendung der CRISPR/Cas Technologie in Pflanzen. however, specifically devoted to the application of the CRISPR / Cas technology in plants. Jedoch wird/werden hier ausschließlich eine Herangehensweise und geeignete molekulare Werkzeuge offenbart, welche zwingend die Subkultivierung, Selektion und Regeneration von Pflanzenkalli nach erfolgter Einführung der CRISPR/Cas Werkzeuge benötigen und somit nicht die direkte Gewinnung einer Pflanze oder von Pflanzenmaterial, enthaltend die gewünschte DNA-Veränderung ermöglicht, welche/welches die gewünschte DNA-Veränderung enthält. However, is / are here solely an approach and appropriate molecular tools disclosed which necessarily subculturing, selection and regeneration of plant calli after the introduction of the CRISPR / Cas need tools and therefore not the direct recovery of a plant or of plant material containing the desired DNA change allows that / containing the desired DNA changes.
  • Eine Übersicht zum aktuellen Status der Entwicklung des Einsatzes der CRISPR/Cas Technologie zur Genom Editierung von Pflanzengenomen findet sich in An overview of the current status of the development of the use of the CRISPR / Cas technology for genome editing of plant genomes found in . , Hier wird ua über die Problematik der Bereitstellung spezifischer gRNAs für das Targeting in Mais berichtet. There are reports on the problem of providing specific gRNAs for targeting in maize. Ferner wird die Problematik der hohen „Off-target” Mutationsraten thematisiert, welche nicht nur beim Einsatz von CRISPR/Cas bei Säugerzellen, sondern auch beim Einsatz in Pflanzenzellen beobachtet wird, wobei hier das Design der einzelnen CRISPR/Cas Werkzeuge entscheidend ist, um in der jeweiligen Zielzelle/dem jeweiligen Zielorganismus eine ortsgerichtete gezielte Veränderung ohne „Off-target” Wirkungen zu erzielen. Furthermore, the problem of high "off-target" mutation rates, is discussed, which is observed not only in the use of CRISPR / Cas in mammalian cells, but also when used in plant cells where the design of the individual CRISPR / Cas tools is crucial here in to achieve site-directed targeted modification without "off-target" effects of the target cell / the particular target organism. Ferner erkennt Bortesi & Fischer, dass das CRISPR/Cas System auch zur epigenetischen Veränderung von DNA eingesetzt werden kann, da das CRISPR/Cas System auch zur Spaltung methylierter DNA verwendet werden kann, stellt jedoch fest, dass hierzu noch keine Anwendungen in Pflanzen bekannt sind. Further Bortesi & Fischer recognizes that the CRISPR / CAS system can also be used for epigenetic changes in DNA, since the CRISPR / CAS system can also be used to cleave methylated DNA, but notes that purpose are known no applications in plants ,
  • Weiterhin beschreibt further describes , welche wie Nickasen verwendet werden, und damit eine höhere Spezifität erzeugen ( Which are used as nickases, and thus produce a higher specificity ( ). ). präsentieren jedoch ausschließlich Daten für humane Zellen, nicht für Pflanzenzellen. However, present data only for human cells, not for plant cells.
  • bezieht sich auf die Verwendung des CRISPR/Cas Systems in humanen Zellen, wobei hier Nuklease-Null Varianten von Cas9 oder Aptamer-gekoppelte gRNAs zum Einsatz kommen, welche an transkriptionelle Aktivatordomänen fusioniert sein können ( refers to the use of the CRISPR / Cas system in human cells, here variants of Cas9 or aptamer-coupled gRNAs be used zero-nuclease, which can be fused to transcriptional Aktivatordomänen ( ). ). erwähnt jedoch nicht, wie und in welchem Umfang ein entsprechendes System in Pflanzenzellen zum Einsatz kommen könnte. However, no mention of how and to what extent a corresponding system in plant cells could be used.
  • Zusammenfassend sind viele der heute verwendeten Ansätze im pflanzlichen Bereich nur temporär und/oder räumlich begrenzt (transient) dahingehend, dass Mutationen in bereits ausdifferenzierten Zellen, z. In summary, many of the approaches used today in the plant area only temporary and / or limited in space (transient) are to the effect that mutations in already differentiated cells such. B. in Blättern, bewirkt werden, diese Mutationen jedoch nicht über die Keimbahn weitervererbt werden. B. are in leaves causes these mutations are not inherited through the germ line. Des Weiteren gibt es Ansätze, die eine stabile Integration der kodierenden Sequenzen inklusive der hierfür erforderlichen regulatorischen Sequenzen wie Promotoren und Terminatoren ins Genom voraussetzen, über diese dann eine stabile Mutation erzeugt werden kann, die von Generation zu Generation vererbt wird. Furthermore, there are approaches that require a stable integration of the coding sequences, including the requisite regulatory sequences such as promoters and terminators into the genome, a stable mutation can be generated through this then that is inherited from generation to generation. Hierbei sind jedoch die CRISPR/Cas Werkzeuge nach wie vor im Genom der Pflanze und dadurch auch potentieller Pflanzenprodukte wie Früchte und Samen enthalten, was bzgl. der Risikobewertung der entsprechenden Produkte unerwünscht ist. Here, however, the CRISPR / Cas tools are still in the genome of the plant and thereby contain potential plant products such as fruits and seeds that regard. The risk assessment of such products is undesirable.
  • Demnach ist der CRISPR/Cas Ansatz in der Pflanzenbiotechnologie nach wie vor von einer niedrigen Effizienz, aber auch einem schwierigen und aufwendigen Design der Konstrukte gekennzeichnet, sowie dem häufigen Auftreten von Off-Target Effekten. Accordingly, the CRISPR / Cas approach in plant biotechnology is still of a low efficiency, but also in a difficult and expensive design of the constructs, as well as the frequent occurrence of off-target effects. Zudem basieren viele der derzeitigen Ansätze darauf, die CRISPR/Cas Werkzeuge entweder stabil in das Genom einer Pflanzenzelle zu integrieren oder in Zellen eines ausdifferenzierten Gewebes, etwa in Blätter, einzuführen. In addition, many of the current approaches are based on either integrate the CRISPR / Cas tools stably integrated into the genome of a plant cell or in cells of differentiated tissues, such as leaves, introduce. Folglich werden bei dem stabilen Ansatz zum einen auch die einzelnen Werkzeuge wie beispielsweise die Cas9, und nicht nur die von ihnen bewirkten gezielten DNA-Veränderungen, an die Nachkommen vererbt. Consequently, in the stable approach to one, the individual tools such as the Cas9, and not only effected by them targeted DNA changes, inherited by the offspring. Bei der Transformation in ausdifferenzierte Zellen und Gewebe wird die durch die CRISPR/Cas Werkzeuge eingeführte Mutation nur in den jeweiligen Zellen wirksam, kann jedoch nicht über die Keimbahn weitervererbt werden. In the transformation in differentiated cells and tissues introduced by the CRISPR / Cas tools mutation is effective only in the cells, but can not be passed down through the germline.
  • Es besteht somit ein anhaltendes Bedürfnis nach der Etablierung von transienten und zudem optional induzierbaren Verfahren und Konstrukten, basierend ua auf gRNAs und Cas-Nukleasen oder gRNAs und anderen Effektor-Domänen, zur Erwirkung einer gewünschten Veränderung einer Zielsequenz in einer pflanzlichen Zielzelle, wobei nur die Veränderung der Zielsequenz, jedoch nicht die Konstrukte an die Nachkommen weitergegeben werden. There is thus a continuing need for the establishment of transient and also optionally inducible method and constructs based in part on gRNAs and Cas nucleases or gRNAs and other effector domains in the obtaining of a desired change in a target sequence in a target plant cell, wherein only the change in the target sequence, but not the constructs are passed on to offspring. Zudem besteht ein großes Bedürfnis danach, ein CRISPR/Cas basiertes Verfahren bereitzustellen, das die Möglichkeit eröffnet, direkt eine Keimbahnveränderung in einer pflanzlichen Zelle oder einem pflanzlichen Gewebe durchzuführen, sodass die Veränderung vererbbar ist und an der Pflanze, die aus der veränderten Pflanzenzelle oder dem Gewebe resultiert, unmittelbar Saatgut geerntet werden kann, welches die gezielte Genommodifikation enthält, ohne aufwendige und kostspielige Zwischenschritte beschreiten zu müssen. In addition, there is a great need for it to provide a CRISPR / Cas-based method which opens the possibility to perform directly a germline alteration in a plant cell or plant tissue so that the alteration is heritable and on the plant, the changed from the plant cell or the tissue result, seed can be harvested directly containing the targeted genome modification, to have tread without complex and costly intermediate steps. Schließlich besteht ein Bedürfnis, das RNA-dirigierte DNA-Modifikationssystem, welches durch die CRISPR/Cas Werkzeuge bereitgestellt wird, gezielt zu erweitern, indem nicht nur genomische Zielstrukturen, sondern jegliche Nukleinsäure als Zielstruktur, nicht nur im Genom einer Zelle, sondern etwa auch im Zytosol oder in Plastiden, kontrolliert modifiziert werden kann. Finally, there is a need, which is provided by the CRISPR / Cas tools, the RNA-directed DNA-modification system to expand a targeted by not only genomic target structures, but any nucleic acid as a target, not only in the genome of a cell, but, for example also in the may be modified in the cytosol or plastids controlled.
  • Zusammenfassung der Erfindung Summary of the Invention
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, Verfahren und molekulare Werkzeuge bereitzustellen, welche die transiente Transformation von pflanzlichem Gewebe oder von pflanzlichen Zellen, speziell von meristematischen Zellen, und dadurch die kontrollierte Veränderung einer beliebigen Nukleinsäure-Zielregion in einem beliebigen pflanzlichen zellulären Kompartiment zu erlauben. Therefore, the present invention is based on the object to provide methods and molecular tools, which to the transient transformation of plant tissue or plant cells, especially from meristematic cells, and thereby the controlled variation of any nucleic acid target region in any vegetable cellular compartment allow.
  • Es war Ziel, die oben genannten Vorteile in einem System, welches breit in der Pflanzenbiotechnologie anwendbar ist, zu vereinigen. The objective was to unite the advantages mentioned above in a system that is widely applicable in plant biotechnology.
  • Diese Aufgabe wird durch die hierin bereitgestellten Verfahren und Konstrukte gemäß dem Gegenstand der beigefügten Ansprüche und ferner wie hierin in der Beschreibung, den Figuren und dem beigefügten Sequenzprotokoll detailliert dargelegt, gelöst. This object is provided methods and constructs according to the object of the appended claims by the herein and set forth further herein in the description of the figures and the attached sequence listing in detail dissolved. Die Aufgabe wird speziell durch die Bereitstellung eines Verfahrens umfassend die Transformation oder Transfektion von mindestens einer meristematischen Zelle gelöst. The object is especially achieved by the provision of a process comprising the transformation or transfection of at least one meristematic cell. Darüber hinaus wird die Aufgabe durch die Bereitstellung von rekombinanten Konstrukten gelöst, welche gezielt modifizierte CRISPR/Cas-Werkzeuge und/oder weitere Effektor-Domänen umfassen. Moreover, the object is achieved by the provision of recombinant constructs which comprise specifically modified CRISPR / Cas-tools and / or additional effector domains. Schließlich wird die Aufgabe durch die Bereitstellung von geeigneten regulatorischen Sequenzen und Lokalisationssequenzen gelöst, welche es erlauben, das rekombinante Konstrukt von Interesse kontrolliert in ein beliebig ansteuerbares Kompartiment einer pflanzlichen Zielstruktur von Interesse zu dirigieren. Finally, the object is achieved by the provision of appropriate regulatory sequences and localization sequences, which allow the recombinant construct of interest controlled to conduct in an arbitrarily controllable compartment of a plant target structure of interest.
  • Hierdurch kann mindestens eine gezielte Veränderung in jeglicher Nukleinsäure-Zielregion in einem beliebigen Kompartiment einer pflanzlichen Zelle, insbesondere einer meristematischen pflanzlichen Zelle, erzielt werden. This can achieve at least a specific change in any nucleic acid target region in a desired compartment of a plant cell, in particular a meristematic plant cell. Da die so veränderte mindestens eine meristematische Zelle die gezielte Veränderung in der Nukleinsäure-Zielregion durch die anschließende Zellteilung und Differenzierung unmittelbar und direkt an ihre Nachkommen weitergeben kann und/oder sie das Potential besitzt, dass aus der meristematischen Zelle ein ganzer veränderter pflanzlicher Organismus heranreift, kann so die Bereitstellung einer Pflanze oder von Pflanzenmaterial oder einer pflanzlichen Zelle erreicht werden, ohne komplexe weitere Kultivierungs- oder Kreuzungs- und Selektionsschritte (vor allem komplexe Rückkreuzungsregime) einschlagen zu müssen. Since the can so modified at least one meristematic cell, the specific change in the nucleic acid-target region by the subsequent cell division and differentiation to pass immediately and directly to their progeny and / or it has the potential that matures from the meristematic cell, a whole modified plant organism, can be achieved as providing a plant or plant material or a plant cell, without complex additional cultivation or crossing and selection steps to have (especially complex back-crossing regime) to take. Vielmehr kann aus der mindestens einen so veränderten meristematischen Zielzelle unmittelbar und direkt eine Pflanze, Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle gewonnen werden. Rather, it can be recovered from the at least one modified so meristematic target cell immediately and directly a plant, plant material or a plant cell. Hierdurch ist es möglich, gRNA(s) und/oder Cas-Nukleasen) und/oder weitere Effektor-Domänen) nur transient in den Meristemen zu produzieren bzw. bereitzustellen bzw. aktivieren, wobei diese rekombinanten Makromoleküle vorzugsweise anschließend, dh nachdem gRNA(s) und/oder Cas-Nuklease(n) und/oder weitere Effektor-Domäne(n) die gewünschte Wirkung erfüllt haben, degradiert werden, da keine Integration davon ins Genom oder endogene extrachromosomale DNA stattfindet, was auf Grund regulatorischer Aspekte und der Risikobewertung des Pflanzenprodukts vorteilhaft sein kann. This makes it possible, gRNA (s) and / or Cas-nucleases) and / or additional effector domains) only transiently to produce or provide or activate in the meristems, said recombinant macromolecules preferably subsequently, ie after gRNA (s ) have and / or Cas nuclease (s) and / or further effector domain (s) meets the desired effect, be degraded because no integration of it takes place in the genome or endogenous extra-chromosomal DNA, due to regulatory issues and risk assessment of may be beneficial plant product. Die hierin verwendeten Cas-Nukleasen können auch eine oder mehrere Mutation(en) in der katalytischen Domäne, welche für die DNA-(Doppel- bzw. Einzelstrang)spaltung verantwortlich ist, enthalten. The Cas nucleases used herein may also include one or more mutation (s) in the catalytic domain, which cleavage of the DNA (double or single stranded) is responsible included. Dies resultiert in einem breiten Anwendungsspektrum der Cas-Nuklease und, etwa im Fall von Cas-basierten Nickasen, auf einer höheren Spezifität der Bindung, da zwei CRISPR/Cas Konstrukte zum Einsatz kommen, um beide Einzelstränge des DNA-Doppelstrangs an der gewünschten Stelle zu spalten. This results in a wide range of applications of the Cas-nuclease, and, as in the case of Cas-based nickases at a higher specificity of binding, since two CRISPR / Cas constructs are used to both single strands of the DNA duplex at the desired location to columns. Auch Cas-null Varianten werden hierin vorgeschlagen sowie deren kombinierter Einsatz mit weiteren Effektor-Domänen zur Optimierung einer gezielten Nukleinsäure-Editierung. Even Cas-null variants are proposed herein as well as their combined use with other effector domains to optimize a specific nucleic acid-editing.
  • Darüber hinaus wurde gefunden, dass durch die Ausnutzung des Wirkmechanismus der CRISPR/Cas-Werkzeuge auch weitere Effektor-Domänen wie DNA- bzw. RNA- bzw. Histon-modifizierende oder DNA- bzw. RNA- bzw. Histon-bindende Polypeptide oder Nukleinsäuren, umfassend zum Beispiel alle Arten von monomeren, dimeren oder multimeren Nukleasen, umfassend Nickasen, Aktivatoren und Repressoren der Transkription, Phosphatasen, Glykosylasen, oder Enzyme, welche epigenetische Veränderungen bewirken können, wie Methylasen, Acetylasen, Methyltransferasen oder Histon-Deacetylasen, Aptamere, umfassend einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen sowie Peptide, fluoreszierende Proteine, Proteine zur Biolumineszenz, Markernukleinsäure- oder Markeraminosäuresequenzen, und dergleichen, und Kombinationen davon gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren eingesetzt werden können, wodurch sich das Spektrum der bekannten gezielten Genom-Editierung hin zu einer allgemeinen Nukleinsäure-Editierung, die nicht In addition, it was found that, by exploiting the mechanism of action of the CRISPR / Cas tools even more effector domains, such as DNA or RNA and histone modifying or DNA or RNA or histone binding polypeptides or nucleic acids comprising, for example, all types of monomeric, dimeric or multimeric nucleases comprising nickases, activators and repressors of transcription, phosphatases, glycosylases, or enzymes which may cause epigenetic changes such methylases, acetylases, methyltransferases or histone deacetylases, aptamers, comprising single-stranded DNA or RNA sequences as well as peptides, fluorescent proteins, proteins for bioluminescence, Markernukleinsäure- or marker amino acid sequences, and the like, and combinations thereof according to the methods provided herein can be used, whereby the spectrum of the known targeted genome editing to a general nucleic acid-editing that does not auf genomische DNA per se beschränkt ist, verbreitern lässt. is limited to genomic DNA per se can widen.
  • Die vorliegende Offenbarung bietet somit die Möglichkeit, den CRISPR/Cas-Mechanismus dahingehend auszuweiten, dass nicht nur die nukleolytische Spaltung von DNA, sondern auch eine beliebige Modifikation von genomischer DNA, z. Thus, the present disclosure provides the ability to extend the CRISPR / Cas mechanism to the effect that not only the nucleolytic cleavage of DNA, but also any modification of genomic DNA, eg. B. die epigenetische Veränderung, sowie von RNA in pflanzlichen Zellen (wie beispielsweise mRNA) ermöglicht wird. B. allowing the epigenetic modification, as well as RNA in plant cells (such as mRNA).
  • Durch den Einsatz weiterer regulatorischer Sequenzen, umfassend Promotoren, Teminatoren, Transkriptionsfaktorbindestellen oder Introns, und/oder von Lokalisationssequenzen, umfassend Kern-, Mitochondrien- und Plastidenlokalisationssequenzen, stellt die vorliegende Offenbarung zudem die Möglichkeit bereit, jegliche Nukleinsäure-Zielregion einer pflanzlichen Zielstruktur gezielt zu modifizieren, wodurch zum Beispiel auch mitochondriale und Plastiden-DNA als Ziel der Editierung fungieren kann. Through the use of further regulatory sequences, including promoters, terminators, transcription factor binding sites, or introns, and / or localization sequences, including nuclear, mitochondrial and Plastidenlokalisationssequenzen, the present disclosure also provides the ability to modify any nucleic acid target region of a target plant structure targeted , which can act as a target of editing, for example, mitochondrial and plastid DNA. Darüber hinaus eröffnet sich auch die Möglichkeit der gezielten Veränderung von RNA, z. In addition, the possibility of targeted modification of RNA, such opened. B. von mRNA, wobei auch hier die gRNA-dirigierte Sequenzerkennung, welche dem CRISPR/Cas-System zu Grunde liegt, ausgenutzt und gemäß der vorliegenden Offenbarung „umprogrammiert” wird, um den Anwendungsbereich der CRISPR/Cas-Technologie zu erweitern. B. mRNA is where here too the gRNA-directed sequence recognition, which is the CRISPR / Cas system to basically utilized and "reprogrammed" in the present disclosure to enhance the scope of the CRISPR / Cas technology.
  • Hierin werden auch Verfahren und Konstrukte bereitgestellt, bei welchen gRNA und/oder Cas-Nuklease bereits verknüpft mit einer weiteren Effektor-Domäne auf einem rekombinanten Konstrukt bereitgestellt werden. Herein also provides methods and constructs are provided in which gRNA and / or Cas nuclease already linked are provided with a further effector domain in a recombinant construct.
  • Weiterhin wird ein Verfahren bereitgestellt, bei welchem die mindestens eine gRNA sowie die mindestens eine Cas-Nuklease und/oder die mindestens eine weitere Effektor-Domäne separat auf unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten bereitgestellt werden. Furthermore, a method is provided, wherein the separately provided on different recombinant constructs at least one gRNA and the at least one Cas nuclease and / or the at least one further effector domain. Gemäß dieses Verfahrens kann die gRNA-Komponente als DNA oder RNA bereitgestellt werden, die Cas-Nuklease oder Variante davon kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden und die Effektor-Domäne kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden. According to this method, the gRNA component may be provided as DNA or RNA, the Cas nuclease or variant thereof as DNA or RNA, or be provided as a polypeptide and the effector domain can be used as DNA or RNA, or be provided as a polypeptide.
  • Zudem war es eine Aufgabe, durch die Etablierung pflanzenspezifischer Konstrukte und Verfahren die Möglichkeit bereitzustellen, die Konstrukte gezielt, etwa induzierbar oder gewebe- oder organellspezifisch, bereitzustellen und unerwünschte Off-Target Effekte zu minimieren. It was also an object to provide by establishing plant-specific constructs and methods the possibility of the constructs specifically about inducible or tissue or organelle, deploy, and to minimize unwanted off-target effects. Schließlich stellte es eine Aufgabe dar, Verfahren und Konstrukte zu entwerfen, die nicht nur die Möglichkeit effizienter Gen-Knock-Ins, sondern beispielweise auch gerade die Möglichkeit spezifischer Gen-Knock-Outs, von Insertionen von genetischen Fragmenten, spezifischer epigenetischer Modifikationen, der Einführung von Punktmutationen, Acetylierungen, Methylierungen, Phosphorylierung, Glykosylierungen, Markierungen durch Resistenzmarker oder fluoreszierende Proteine, Aktivierung oder Reprimierung der Transkription, gezielter Spaltung von doppelsträngiger oder einzelsträngiger Nukleinsäuren, der Bindung von Nukleinsäuren und dergleichen bieten, sodass ein breiter Einsatzbereich in der Pflanzenzüchtung eröffnet wird. Finally, it represented a task of designing methods and constructs, which not only allows more efficient gene knock-ins, but also for example just the possibility of specific gene knock-outs, insertions of genetic fragments, specific epigenetic modifications, the introduction offer of point mutations, acetylation, methylation, phosphorylation, glycosylation, markings by resistance marker or fluorescent proteins, activation or repression of transcription, selective cleavage of double-stranded or single-stranded nucleic acids, the binding of nucleic acids and the like, so that a wide range of applications in plant breeding is opened. Aus züchterischer wie regulatorischer Sicht ist es wünschenswert, sowohl eine stabile Vererbbarkeit eines durch die Modifikation bewirkten Merkmals über mindestens eine Generation hinweg bei gleichzeitiger Abwesenheit der hierfür erforderlichen Konstrukte des CRISPR/Cas-Systems in der resultierenden Pflanze oder den resultierenden pflanzlichen Zellen zu ermöglichen. From a breeding as regulatory point of view, it is desirable, both a stable inheritance of a caused by the modification of the characteristic of at least one generation of time to allow the simultaneous absence of the requisite constructs of the CRISPR / Cas system in the resulting plant or the resulting plant cells.
  • Konkrete Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Beispielen, den Figuren, dem Sequenzprotokoll sowie insbesondere den beigefügten Patentansprüchen. Specific aspects and embodiments of the present invention will become apparent from the following detailed description and examples, the drawings, the sequence listing and in particular in the appended claims.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen Brief Description of Drawings
  • 1A 1A –F zeigen Maisembryonen von unterschiedlicher Größe. F show maize embryos of different sizes. In den hier analysierten Embryonen ist das Meristem eindeutig als scheibenförmige Struktur im Zentrum des Embryos zu erkennen. In the analyzed here embryos the meristem is clearly recognizable as a disc-shaped structure in the center of the embryo. Abhängig von der Größe und des Entwicklungsstadiums der Embryonen ist das Meristem unterschiedlich entwickelt und unterschiedlich gut erkennbar. Depending on the size and stage of development of the embryo meristem is different designs and different easily recognizable. Das Meristem ist zusätzlich noch durch einen Stern (*) markiert. The meristem is additionally by an asterisk (*) marks.
  • 2A 2A und B zeigen einen direkten Vergleich der Meristeme eines 0,5 mm großen und eines 1 mm großen Mais-Embryos. and B show a direct comparison of the meristems of 0.5 mm and a 1 mm maize embryos. In beiden Fällen ist das Meristem als scheibenförmige Struktur im Zentrum des Embryos zu erkennen, allerdings ist in dem 1 mm großen Embryo das Meristem bereits sehr stark von Blattgewebe umgeben. In both cases, the meristem is visible as a disk-shaped structure in the center of the embryo, but in the 1-mm embryo meristem is already heavily surrounded by leaf tissue. Dies erschwert die Zugänglichkeit des Meristems, so dass kleinere Embryonen mit einem exponierteren Meristem zu bevorzugen sind. This complicates the accessibility of the meristem, so that smaller embryos with a more exposed meristem are preferable.
  • 3A 3A –D geben präparierte Meristeme in Mais-Keimlingen wieder. -D give prepared meristems in maize seedlings again. Da das Meristem in Keimlingen komplett von Blättern umgeben ist, muss es freipräpariert werden, um für einen Beschuss, Mikroinjektion etc. zugänglich zu sein. Since the meristem is completely surrounded in seedlings of leaves, it must be dissected to be etc. accessible to bombardment, microinjection. Dazu werden die äußeren Gewebestrukturen vollständig entfernt, so dass das Meristem (Pfeile) frei liegt. For this purpose, the outer fabric structures are completely removed so that the meristem (arrows) is exposed.
  • 4A 4A –C zeigen präparierte Meristeme in älteren Maispflanzen. C show prepared meristems in older maize plants. Da das Meristem in älteren Pflanzen, wie auch bei Keimlingen komplett von Blättern umgeben ist, muss es präpariert werden, um für einen Beschuss, Mikroinjektion etc. zugänglich zu sein. Since the meristem is completely surrounded in older plants, as well as in seedlings of leaves, it must be prepared to be etc. accessible to bombardment, microinjection. Dazu werden die äußeren Blätter vollständig entfernt, so dass das Meristem (Pfeile) frei liegt. For this purpose, the outer sheets are completely removed so that the meristem (arrows) is exposed.
  • 5 5 zeigt den biolistischen Testbeschuss der Mais-Embryo-Meristeme. shows the biolistic test shelling of corn embryo meristems. Links ist ein schematisches Bild eines Embryos mit der scheibenförmigen Meristemstruktur (hervorgehoben durch einen doppelten Ring und einen Pfeil) wiedergegeben. The left is a schematic image of an embryo with the disc-shaped Meristemstruktur (highlighted by a double ring, and an arrow) is reproduced. Rechts zeigt die Fluoreszenz von RFP nach Testbeschuss. The right shows the fluorescence of RFP after test bombardment. Für den Testbeschuss wurde ein für ein RFP (rot fluoreszierendes Protein) codierendes Gen verwendet. For the test, a fire for an RFP (red fluorescent protein) coding gene was used. Es ist eine eindeutige Expression des Proteins in den meristematischen Regionen (doppelter Ring) detektierbar. It is an unambiguous expression of the protein in the meristematic regions (double ring) detectable.
  • 6 6 verdeutlicht die Präparation von „Tassel”-Meristemen an adulten Maispflanzen. illustrates the preparation of "Tassel" -Meristemen on adult maize plants. Durch eine fensterartige Öffnung werden die Meristeme (Pfeil) halbseitig freigelegt. Through a window-like opening, the meristems (arrow) are exposed one side. Die rekombinanten Kontrukte können dann z. The recombinant Kontrukte can then z. B. über Bombardment oder Mikroinjektion eingebracht werden. B. be introduced via bombardment or microinjection. Vorteilhaft ist, dass die Pflanze nicht stark geschädigt wird und die Meristeme nicht vollständig frei liegen (etwa 1–2 Tage später ist das „Tassel-Meristem” bereits nicht mehr durch die Öffnung zu sehen, da es weiter nach oben geschoben wird) und dadurch eine Oxidation und weiterer Schaden reduziert wird. It is advantageous that the plant is not severely damaged and the meristems are not completely clear (about 1-2 days later, the "Tassel meristem" is already no longer visible through the opening as it is pushed upward) and thus oxidation and further damage is reduced.
  • 7 7 zeigt den biolistischen Testbeschuss eines freigelegten „Tassel”-Meristems aus Mais. shows the test biolistic bombardment of an exposed "Tassel" -Meristems from corn. Links ist ein schematisches Bild der Meristemgewebe der Maisfahne („Tassel”) wiedergegeben. On the left a schematic diagram of the meristem tissue of corn flag ( "Tassel") is played. Rechts zeigt die Fluoreszenz von RFP nach Testbeschuss. The right shows the fluorescence of RFP after test bombardment. Für den Testbeschuss wurde ein für ein RFP (rot fluoreszierendes Protein) kodierendes Gen verwendet. For the test, a fire for an RFP (red fluorescent protein) was used encoding gene. Es ist eine eindeutige Expression des Proteins in den meristematischen Geweben detektierbar. It is an unambiguous expression of the protein in the meristematic tissues detectable.
  • Ausführliche Beschreibung Full description
  • Definitionen definitions
  • Der Begriff Pflanze oder pflanzliche Zelle, wie hierin verwendet, bezieht sich auf pflanzliche Organismen, Pflanzenorgane, differenzierte und undifferenzierte Pflanzengewebe, Pflanzenzellen, Samen und deren Abkömmlinge oder Nachkommen. The term plant or plant cell, as used herein, refers to plant organisms, plant organs, differentiated and undifferentiated plant tissue, plant cells, seeds, and their derivatives, or descendants. Pflanzliche Zellen umfassen z. Plant cells include, for. B. Zellen von Samen, reifen und unreifen Embryonen, meristematischen Geweben, Keimlingen, Kallusgeweben, Blättern, Blüten, Wurzeln, Pflanzensprossen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, Protoplasten, Makroalgen und Mikroalgen. As cells of seeds, mature and immature embryos, meristematic tissue, seedlings, callus, leaves, flowers, roots, plant shoots, gametophytes, sporophytes, pollen and microspores, protoplasts, macroalgae and microalgae.
  • Pflanzenmaterial, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches Material, das von einer Pflanze in einem beliebigen Entwicklungsstadium gewonnen werden kann. Plant material, as used herein, refers to any material that can be obtained from a plant in any stage of development. Der Begriff umfasst somit pflanzliche Zellen, Gewebe und Organe sowie ausgebildete Pflanzenstrukturen sowie ebenfalls subzelluläre Komponenten wie Nukleinsäuren, Polypeptide, sowie alle chemischen Pflanzenstoffe, die innerhalb einer Pflanzenzelle vorliegen und/oder von dieser produziert werden können. The term therefore includes plant cells, tissues and organs as well as educated plant structures and also subcellular components such as nucleic acids, polypeptides, and any chemical plant compounds that are present within a plant cell and / or can be produced from this.
  • Der Begriff chromosomal oder extrachromosomal integriert, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die transiente Einbringung und/oder die Gestaltung des einen bzw. der mehreren rekombinanten Konstrukts/Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung und damit auf das anschließende Schicksal des einen bzw. der mehreren rekombinanten Konstrukts/Konstrukte in einer pflanzliche Zielstruktur, z. The term chromosomally or extrachromosomally incorporated, as used herein, refers to the transient incorporation and / or the design of the one or more recombinant construct / constructs of the present invention and thus to the subsequent fate of the one or more recombinant construct / constructs in a target plant structure, such. B. einer Zelle, wobei sowohl das eine bzw. die mehreren rekombinanten Konstrukt(e) als auch die Bedingungen zur Einbringung davon derart gehalten sind, dass keine Integration des mindestens einen rekombinanten Konstrukts in das endogene Nukleinsäurematerial einer pflanzlichen Zielstruktur, umfassend das Genom oder extrachromosomale Nukleinsäuren der pflanzlichen Zielstruktur, z. B. a cell, wherein each of the one or more recombinant construct (s) and the conditions are maintained for insertion thereof such that no integration of the at least one recombinant construct into the endogenous nucleic acid material of a target plant structure comprising the genome or extrachromosomal nucleic acids of the target plant structure such. B. einer Zelle, stattfindet, sodass das mindestens eine rekombinante Konstrukt nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert in die endogene DNA/RNA der Zielzelle und somit nicht an die Nachkommen der Zelle weitergegeben wird. B. a cell takes place, so that the at least one recombinant construct will not be chromosomally or extrachromosomally incorporated into the endogenous DNA / RNA of the target cell and therefore not passed on to the progeny of the cell. Das eine bzw. die mehreren rekombinante(n) Konstrukt(e) oder dessen Transkriptions- bzw. Translationsprodukte liegen somit nur vorübergehend, dh transient, konstitutiv oder induzierbar, aktiv in der Zielzelle vor, sind aber nicht an die Nachkommen der Zielzelle vererbbar, dh sie liegen auch nicht in den Nachkommen einer Zielzelle aktiv vor. The one or more recombinant (s) construct (s) or its transcription and translation products are therefore only temporary, that is, transiently, constitutively or inducibly active in the target cell before, but are not inherited by the progeny of the target cell, ie they do not have active in the offspring of a target cell.
  • Der Begriff Abkömmling oder Nachkomme, wie hierin verwendet, bezeichnet im Kontext eines rekombinanten Mikroorganismus, einer Pflanze oder einer Zelle gemäß der vorliegenden Offenbarung die Nachkommen eines solchen Organismus oder einer solchen Zelle, welche durch natürliche reproduktive ungeschlechtliche Zellteilungs- und Differenzierungsvorgänge aus dem Ursprungsorganismus oder der Ursprungszelle hervorgehen. The term descendant or descendant, as used herein, refers in the context of a recombinant microorganism, a plant or a cell according to the present disclosure, the progeny of such an organism or of such a cell, which by natural reproductive asexual cell division and differentiation processes from the organism of origin or the emerge cell of origin. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass im Zuge der Zellteilung und Differenzierung auf natürliche Weise Mutationen ins Genom eines Organismus eingeführt werden können, wodurch sich der Abkömmling oder der Nachkomme genomisch vom Elternorganismus unterscheidet, jedoch nach wie vor der gleichen (Sub-)Spezies zugeordnet werden kann. It is known to those skilled in the art that in the course of cell division and differentiation mutations can be introduced into the genome of an organism in a natural way, making the descendant or the descendant different genomic from the parent organism, however, remains the same (sub) species can be assigned. Auch derartige durch natürliche Vorgänge veränderte Abkömmlinge, welche neben der gezielt eingebrachten Veränderung weitere Veränderungen in anderen DNA-Regionen tragen sind daher vom Begriff Abkömmling oder Nachkomme gemäß der vorliegenden Offenbarung umfasst. therefore also encompasses such modified by natural processes derivatives which are carry further modifications in other regions of DNA adjacent to the deliberately introduced change from the term descendant or descendant of the present disclosure.
  • Der Begriff Vektor oder Vektorsystem, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Transportmittel, um ein rekombinantes Konstrukt, umfassend Nukleinsäuren oder auch Polypeptide sowie gegebenenfalls weitere Sequenzen wie regulatorische Sequenzen oder Lokalisationssequenzen, direkt oder indirekt in eine gewünschte Zielzelle bzw. pflanzliche Zielstruktur in das erwünschte zelluläre Kompartiment einbringen zu können. The term vector or vector system, as used herein, refers to a means of transport, a recombinant construct comprising nucleic acids or polypeptides, and optionally further sequences such as regulatory sequences, or localization sequences, directly or indirectly into a desired target cell or plant target structure desired in the to bring cellular compartment. Die direkte Einbringung erfolgt direkt in eine pflanzliche Zielzelle bzw. pflanzliche Zielstruktur, welche Nukleinsäuren enthält, die gemäß der vorliegenden Offenbarung gezielt verändert werden sollen. The direct introduction is made directly into a plant cell or plant destination target structure containing nucleic acids which are to be selectively changed in accordance with the present disclosure. Die indirekte Einbringung umfasst die Einbringung in eine Struktur, z. The indirect contribution includes a contribution to a structure such. B. Zellen von Blätter oder weitere pflanzliche Organe und Gewebe, welche zwar nicht direkt die pflanzliche Zielzelle von Interesse umfassen, wodurch jedoch die systemische Ausbreitung und Weiterleitung des Vektors, umfassend ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung, in die pflanzliche Zielstruktur, z. B. cells from leaves or other plant organs and tissues, which although not directly comprise the target plant cell of interest, whereby, however, the systemic spread and transfer of the vector comprising a recombinant construct according to the present disclosure, in the target plant structure, such. B. meristematische Gewebe oder Zellen oder Stammzellen, gewährleistet wird. B. meristematic tissue or cells, or stem cells, is ensured. Der Begriff Vektor oder Vektorsystem, wie hierin verwendet, umfasst im Kontext der Transfektion von Aminosäuresequenzen geeignete Agenzien zur Peptid- oder Proteintransfektion wie z. The term vector or vector system, as used herein in the context of transfection of amino acid sequences suitable agents for the peptide or Proteintransfektion such. B. ionische Lipidmischungen oder Agenzien, die zur Transfektion einer Nukleinsäure geeignet sind, wie z. B. ionic lipid mixtures or agents that are suitable for transfecting a nucleic acid, such. B. Trägermaterialen, durch welche Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen mittels Partikel-Beschuss in eine Zelle eingeführt werden können, wie z. B. carrier materials may be through which nucleic acid and amino acid sequences introduced by particle bombardment into a cell, such. B. Gold- und Wolframpartikel. As gold and tungsten particles. Ferner umfasst dieser Begriff speziell bei der Anwendung der hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte auch virale Vektoren, dh modifizierte Viren, wie zum Beispiel solche, welche aus einem der folgenden Viren stammen: Maize Streak Virus (MSV), Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV), Brome Mosaic virus (BMV), Maize stripe virus (MSpV), Maize rayado fino virus (MYDV), Maize yellow dwarf virus (MYDV), Maize dwarf mosaic virus (MDMV) und bakterielle Vektoren, wie zum Beispiel Agrobacterium spp., wie zum Beispiel Agrobacterium tumefaciens. Furthermore, this term also includes viral vectors, particularly with the application of the herein disclosed methods and constructs, ie modified viruses, such as those which originate from one of the following viruses: maize streak virus (MSV), Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV), Brome Mosaic virus (BMV), Maize stripe virus (MSPV) Maize rayado fino virus (MYDV), Maize yellow dwarf virus (MYDV), Maize dwarf mosaic virus (MDMV) and bacterial vectors such as Agrobacterium spp., such as example Agrobacterium tumefaciens. Schließlich umfasst der Begriff auch geeignete Transportmittel zur Einführung von linearen Nukleinsäuren (einzel- oder doppelsträngig) in eine Zielzelle. Finally, the term also includes suitable means of transport for the introduction of linear nucleic acids (single-stranded or double-stranded) in a target cell. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind in Kenntnis der hierin offenbarten Konstrukte alle weiteren Sequenzen bekannt, über welche ein Vektor verfügen muss, um in einer erwünschten Zielzelle funktional zu sein. Those skilled in the art will be aware of any further sequences having regard to the constructs disclosed herein, by means of which must have a vector to be functional in a desired target cell. Auch die gängige Herstellung, Aufarbeitung und Anwendung derartiger Vektoren ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. The integrated production, processing and use of such vectors are known to those skilled in the field.
  • Der Begriff Vektorsystem, wie hierin verwendet, bezeichnet ein System, das aus mindestens einem oder mehreren Vektor(en) besteht oder diese(n) enthält. The term vector system, as used herein, refers to a system consisting of at least one or more vector (s) or those (n) contains. So kann ein Vektorsystem einen Vektor aufweisen, welcher zwei unterschiedliche rekombinante Konstrukte, umfassend Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzen, enthält/kodiert. As a vector system may comprise a vector comprising two different recombinant constructs comprising nucleic acid and / or amino acid sequences, contains / coded. Ein Vektorsystem kann darüber hinaus auch mehrere Vektoren enthalten, die ihrerseits mindestens eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Offenbarung enthalten/kodieren. A vector system may further also include a plurality of vectors, which in turn contain at least one nucleic acid or amino acid sequence according to the present disclosure / encoding.
  • Der Begriff Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf natürliche wie synthetische Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA), welche auch synthetische Nukleotidanaloga enthalten können. The term nucleic acid or nucleic acid sequence as used herein refers to natural and synthetic deoxyribonucleic acids (DNA) and ribonucleic acids (RNA), which may also contain synthetic nucleotide analogs. Die Nukleinsäuren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung zur Synthese eines gewünschten Produkts wie Protein oder RNA oder zur gezielten Steuerung davon verwendet werden, z. The nucleic acids used according to the present invention for synthesis of a desired product, such as protein or RNA, or for the targeted control of them, eg. B. eine Cas-Nuklease oder eine gRNA, können gegebenenfalls „auf die Anwendung in einer pflanzlichen Zielstruktur angepasst” sein. B. a Cas nuclease or gRNA can be "adapted to the application in a target plant structure" if necessary. In einer Ausführungsform können die vorgenannten Sequenzen Codon-optimiert sein, dh die Codon-Verwendung eines Genes oder einer RNA wird spezifisch auf die der Zielzelle/Zielorganismus angepasst. In one embodiment, the aforementioned sequences may be codon-optimized, that is, the codon usage of a gene or RNA is specifically adapted to the target cell / target organism. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass ein gewünschtes Zielgen, welches ein Protein von Interesse kodiert, ohne Änderung der translatierten Proteinsequenz modifiziert werden kann, um der spezifischen Spezies-abhängigen Codon-Verwendung Rechnung zu tragen. It is known to those skilled in the art that a desired target gene encoding a protein of interest, can be modified without changing the translated protein sequence in order to take account of the specific species-dependent codon usage. So sind/können die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung spezifisch auf die Codon-Verwendung von Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, Triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Bra Thus, / may the nucleic acids of the present invention specific to the codon usage of Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, Triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum , Triticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, tauschii Hordeum marinum, Aegilops, Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, lycopersicum Solanum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Bra ssica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. ssica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. oder Populus trichocarpa angepasst (werden). (Be) or Populus trichocarpa adjusted. Ferner muss gemäß der vorliegenden Offenbarung die Sequenz der gRNA oder der die gRNA kodierenden Sequenz an die Nukleinsäure-Zielregion innerhalb einer pflanzlichen Zielstruktur angepasst werden. Further according to the present disclosure, the sequence of the gRNA or the sequence encoding the gRNA has to be adapted to the nucleic acid-target region within a target plant structure. In einer weiteren Ausführungsform kann die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz zudem in der Region angepasst werden, welche für die Interaktion oder Kopplung mit einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne verantwortlich ist. In another embodiment, the gRNA or the sequence encoding the gRNA also can be adjusted in the region, which is responsible for the interaction or coupling with a Cas nuclease and / or an effector domain.
  • Der Begriff Sequenzen, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen sowie Aminosäuresequenzen, wobei die jeweilige Sequenz neben natürlichen Nukleotiden und Aminosäuren auch synthetische Analoga oder synthetische Verknüpfungen als Bausteine enthalten können. The term sequences, as used herein, refers to nucleic acid sequences and amino acid sequences, wherein each sequence may also comprise synthetic analogs or synthetic linkages as building blocks in addition to natural nucleotides and amino acids.
  • Die Begriffe Polypeptid, Polypeptidsequenz, Proteinsequenz und Aminosäuresequenz werden hierin austauschbar verwendet. The terms polypeptide, polypeptide sequence, protein sequence and amino acid sequence are used interchangeably herein.
  • Der Begriff regulatorische Sequenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure- oder eine Protein-Sequenz, welche die Transkription und/oder Translation der einer offenbarten Nukleinsäure-Sequenzen in cis oder trans steuern kann. The term regulatory sequence as used herein refers to a nucleic acid or a protein sequence which can direct the transcription and / or translation of a disclosed nucleic acid sequences in cis or trans.
  • Der Begriff Konstrukt oder rekombinantes Konstrukt (hierin austauschbar verwendet) wie hierin verwendet bezieht sich auf ein einen Plasmidvektor, umfassend unter anderen Plasmide, Cosmide, künstliche Hefe- oder bakterielle Chromosomen (YACs und BACs), eine Expressionskassette, einzelsträngige oder lineare Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, welche in eine Zielzelle gemäß der vorliegenden Offenbarung eingebracht werden können. The term construct or recombinant construct (used interchangeably herein) as used herein relates to a plasmid vector, comprising among others, plasmids, cosmids, artificial yeast or bacterial chromosomes (YACs and BACs), an expression cassette, single-stranded or linear nucleic acid sequences or amino acid sequences, which can be introduced into a target cell according to the present disclosure. Ein erfindungsgemäßes rekombinante Konstrukt kann CRISPR/Cas Werkzeuge oder Teile davon, umfassend mindestens eine gRNA oder mindestens eine Cas-Nuklease Variante und/oder mindestens eine weitere Effektor-Domänen entweder in der Form einer Nukleinsäure oder einer Aminosäuresequenz. An inventive recombinant construct may CRISPR / Cas tools or parts thereof, comprising at least one or at least one gRNA Cas nuclease variant and / or at least one further effector domain, either in the form of a nucleic acid or amino acid sequence. Ferner kann das rekombinante Konstrukt regulatorische Sequenzen und/oder Lokalisationssequenzen umfassen. Further, the recombinant construct regulatory sequences and / or localization sequences may comprise. Das rekombinante Konstrukt kann in einen Plasmidvektor integriert vorliegen und/oder isoliert von einem Plasmidvektor vorliegen, z. The recombinant construct may be integrated into a plasmid vector and / or isolated presence of a plasmid vector, z. B. in der Form einer Polypeptidsequenz oder einer nicht-Plasmidvektor verknüpften einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäure vorliegen. B. in the form of a polypeptide sequence or a non-single plasmid vector linked or double stranded nucleic acid are present. Nach Einbringung liegt das Konstrukt vorzugsweise extrachromosomal und nicht in das Genom integriert und gewöhnlich in der Form einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen RNA oder eines Polypeptids vor. After introducing the construct extrachromosomally and is preferably not integrated into the genome and usually in the form of a double-stranded or single-stranded DNA, a double-stranded or single-stranded RNA or a polypeptide. Rekombinant wie hierin verwendet bedeutet eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzabfolge, wie sie so insbesondere in ihrer Gesamtheit nicht natürlich vorkommt. Recombinant as used herein means a nucleic acid sequence or amino acid sequence, so as not to occur especially in their entirety, of course.
  • Wann immer die vorliegende Offenbarung auf Sequenzhomologien oder Sequenzidentitäten von Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen in Form von Prozentangaben Bezug nimmt, beziehen sich diese Angaben auf Werte, wie sie unter Verwendung von EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nucleotide) ( Whenever the present disclosure takes on sequence homology or sequence identity of nucleic acid or protein sequences in the form of percentages reference, these figures relate to values ​​as using EMBOSS Pairwise Water Sequence alignments (nucleotides) ( ) für Nukleinsäuresequenzen bzw. EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Protein) ( ) (For nucleic acid sequences or EMBOSS Pairwise Water Sequence alignments of protein) ( ) für Aminosäuresequenzen berechnet werden können. ) Can be calculated for amino acid sequences. Bei vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI) zur Verfügung gestellten Tools für lokale Sequenzalignments verwenden einen modifizierten Smith-Waterman Algorithmus (siehe At the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI) provided tools for local sequence alignments use a modified Smith-Waterman algorithm (see und and ). ). Ferner wird hierbei bei der Durchführung des jeweiligen paarweisen Alignments zweier Sequenzen unter Verwendung des modifizierten Smith-Waterman Algorithmus auf die vom EMBL-EBI derzeit angegebenen Default Parameter Bezug genommen. Further, algorithm, reference is made to the presently specified by the EMBL-EBI default parameters in this case in the implementation of the respective pairwise alignments of two sequences using the modified Smith-Waterman. Diese lauten (i) für Aminosäuresequenzen: Matrix = BLOSUM62, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5 sowie (ii) für Nukleinsäuresequenzen: Matrix = DNAfull, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5. These are (i) amino acid sequences: Matrix = BLOSUM62, gap open penalty = 10 and gap extend penalty = 0.5, and (ii) nucleic acid sequences: Matrix = DNAfull, Gap open penalty = 10 and gap extend penalty = 0.5.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter „homologen Sequenzen” oder „Homologe” oder vergleichbaren Termini Nukleinsäuresequenzen verstanden, welche den gleichen phylogenetischen Ursprung haben. For the purposes of the present invention, nucleic sequences are understood to be "homologous sequences" or "homologues" or similar terms, which have the same phylogenetic origin. Vorzugsweise üben Proteine, die durch diese Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die gleiche Funktion aus. Preferably practice proteins encoded by these nucleic acid sequences that perform the same function. Homologe Nukleinsäuresequenzen weisen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität auf. Homologous nucleic acid sequences have at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85% or at least 90%, more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity.
  • Nukleinsäure-Zielregion, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliche genomische sowie extrachromosomale DNA oder RNA, insbesondere mRNA, eines Zielorganismus oder einer Zielzelle, deren Modifikation erwünscht ist und die durch die hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte bewirkt werden kann und ist bewusst nicht auf Gen-Regionen, dh Regionen, welche die Information zur Transkription einer mRNA tragen, beschränkt. Nucleic acid-target region, as used herein, refers to any genomic and extrachromosomal DNA or RNA, in particular mRNA, a target organism or a target cell, the modification is desired and disclosed by the herein methods and constructs can be effected and is deliberately not to gene regions, ie regions which carry information on the transcription of an mRNA limited.
  • Komplementär oder Komplementarität, wie hierin verwendet, beschreibt die Beziehung zwischen zwei DNA- oder RNA-Nukleinsäureregionen, welche auf Grund ihrer Nukleobasen nach dem Schlüssel-und-Schloss Prinzip zueinander passen und Wasserstoffbrücken untereinander eingehen (hybridisieren). Complementary or complementarity as used herein describes the relationship between two DNA or RNA nucleic acid regions which fit principle due to their nucleobases for the key-and-lock to each other and hydrogen bonds between themselves received (hybridize). Hierbei gelten nach der Watson-Crick Basenpaarung die Basen Adenin und Thymin/Uracil bzw. Guanin und Cytosin als komplementär. Here, the bases adenine and thymine / uracil and guanine and cytosine apply for the Watson-Crick base pairing as complementary. Auch weitere Nicht-Watson-Crick-Paarungen, wie Reverse-Watson-Crick-, Hoogsteen-, Reverse-Hoogsteen und Wobble-Paarung sind vom Begriff komplementär umfasst, sofern die entsprechenden Basenpaare Wasserstoffbrücken zueinander eingehen, dh zwei unterschiedliche Nukleinsäurestränge miteinander auf Grund ihrer Komplementarität hybridisieren können. Even more non-Watson-Crick pairs, such as reverse Watson-Crick, Hoogsteen, reverse Hoogsteen and wobble pairing included are complementary from the concept, provided that the corresponding base pairs hydrogen bonding to each other go, ie two different nucleic acid strands together due to their can hybridize complementarity.
  • Unter „Hybridisieren” oder „Hybridisierung” wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang anlagert, dh Basenpaarungen eingeht. By "hybridizing" or "hybridization" is meant an operation, in which a single-stranded nucleic acid molecule anneals to a largely complementary nucleic acid strand, ie, base-pairing is received. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Standard procedures for hybridization are, for example, in beschrieben. described. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen der Nukleinsäuresequenz eine Basenpaarung mit dem weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Preferably is understood to mean that at least 60%, more preferably at least 65%, 70%, 75%, 80% or 85%, particularly preferably 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , received 97%, 98% or 99% of the bases of the nucleic acid sequence of base-pairing with the largely complementary nucleic acid strand. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. The possibility of such accumulation depends on the stringency of the hybridization conditions. Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. The term "stringency" refers to hybridization conditions. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. High stringency is given if a base pairing is more difficult, low stringency when a base pairing is facilitated. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Temperatur ab. The stringency of hybridization conditions depends for example on the salt concentration or ionic strength and temperature. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Generally, the stringency can be increased by increasing the temperature and / or a reduction of the salt content. Unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen” sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuresequenzen stattfindet. "Stringent hybridization conditions" means those conditions under which a hybridization takes place predominantly only between homologous nucleic acid sequences. Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen” bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. The term "hybridization conditions" refers not only to the ruling in the actual attachment of nucleic acids conditions, but also to the ruling in the subsequent washing steps conditions. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuren hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität aufweisen. Stringent hybridization conditions are, for example, conditions under which only predominantly of hybridizing to those nucleic acids having at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85% or at least 90%, more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, have at least 98% or at least 99% sequence identity. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 65°C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa 1 Stunde. Stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C, followed by repeated washing in 0.1 × SSC at 65 ° C for a total of about 1 hour. Der hier verwendete Begriff ”stringente Hybridisierungsbedingungen” kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68°C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA und 1% BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 × SSC und 0,1% SDS bei 68°C. As used herein, "stringent hybridization conditions" can also mean: hybridizing at 68 ° C in 0.25 M sodium phosphate, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA and 1% BSA for 16 hours and followed by two washes with 2 x SSC and 0.1% SDS at 68 ° C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt. Preferably, hybridization under stringent conditions occurs.
  • Detaillierte Beschreibung Detailed description
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen einer pflanzlichen Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst, wobei die mindestens eine meristematische Zelle mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst; One aspect of the present invention relates to a method for producing a plant, a plant material or a plant cell, comprising the steps of: (i) providing a target plant structure which comprises at least a meristematic cell, wherein the at least one meristematic cell at least one nucleic acid target region comprises; (ii) Bereitstellen mindestens einer gRNA oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinanten) Konstrukt(e) mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, und optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, und Bereitstellen mindestens einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinante(n) Konstrukt(e) mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz, und optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, wobei die gRNA dazu in der Lage ist, sowohl an einen Abschnitt der Nukleinsäure-Zielregion zu hybridisieren als auch mit der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne zu interagieren; (Ii) providing at least one gRNA or providing one or more recombinant construct / constructs, wherein the or recombinant) construct (s) at least one gRNA or a localization sequence for a gRNA coding sequence and optionally at least one regulatory sequence and / or includes, and providing at least one nuclease Cas and / or an effector domain or providing one or more recombinant construct / constructs, wherein the or recombinant (s) construct (s) at least one Cas nuclease or for a Caspari nuclease coding sequence and / or at least one effector domain or a sequence coding for an effector domain sequence, and optionally at least a regulatory sequence and / or a localization sequence, wherein the gRNA thereto is able to both a portion of the nucleic acid hybridizing target region but to also interact with the Cas nuclease and / or the effector domain; wobei wenn die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz durch ein oder mehrere rekombinante(s) Kontrukt(e) bereitgestellt werden, die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf oder in dem gleichen, oder auf oder in unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten lokalisiert sein kann; wherein when the gRNA or the gRNA coding sequence and the Cas nuclease or the Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain, or the sequence coding for an effector domain sequence (with one or more recombinant (s) Kontrukt e are provided), the gRNA or the gRNA coding sequence and the Cas nuclease or or Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain, or the sequence coding for an effector domain sequence or in the same, or may be located in different recombinant constructs; optional: wobei die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und/oder die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf die Anwendung in einer pflanzlichen Zelle hin angepasst sind; optional: wherein the gRNA or the gRNA coding sequence and / or the Cas nuclease or towards the Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain, or a sequence encoding an effector domain sequence on the application in a plant cell are adapted; (iii) optional: Bereitstellen mindestens eines Vektors zur Einbringung des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte; (Iii) optionally providing at least one vector for introducing the recombinant construct or the / constructs; (iv) optional: Bereitstellen mindestens eines weiteren rekombinanten Konstrukts umfassend einen rekombinanten Nukleinsäure-Abschnitt zur gezielten Homologie-gerichteten Reparatur der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur oder Insertion in die Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur bevorzugt umfassend mindestens eine regulatorische Sequenz und optional mindestens eines weiteren Vektors zur Einbringung des mindestens einen weiteren rekombinanten Konstrukts; (Iv) optionally providing at least one further recombinant construct comprising a recombinant nucleic acid segment for targeted homology-directed repair of the nucleic acid target region in the target plant structure or insertion into the nucleic acid-target region in the target plant structure preferably comprising at least one regulatory sequence and optionally at least one further vector for introducing the at least one further recombinant construct; (v) Einbringen der gRNA, der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne und/oder des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte in die pflanzliche Zielstruktur; (V) introducing the gRNA, the Cas nuclease and / or the effector domain and / or the or the recombinant construct / constructs into the target plant structure; (vi) Kultivieren der pflanzlichen Zielstruktur unter Bedingungen, welche die Aktivierung der eingeführten gRNA, Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne und/oder des bzw. der eingeführten rekombinanten Konstrukts/Konstrukte und dadurch eine gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur gestatten, um eine pflanzliche Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, die die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst, zu erhalten; (Vi) culturing the plant target structure under conditions permitting the activation of the introduced gRNA, Cas nuclease and / or the effector domain and / or the or the recombinant construct / constructs introduced and thereby a targeted modification of the nucleic acid-target region in the allow target plant structure comprising obtaining a vegetable target structure, at least a meristematic cell comprising the targeted alteration of nucleic acid-target region; (vii) Gewinnen einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle, (viii) wobei die Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle direkt durch Zellteilung und Differenzierung und optional einer Fremdbefruchtung oder Selbstung aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle gewonnen wird, und wobei die gewonnene Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst, wobei das bzw. die rekombinante(n) Konstrukt(e), welche mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, und/oder mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz umfassen, vorzugsweise nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert werden/sind. (Vii) obtaining a plant, plant material or a plant cell from the selectively modified at least a meristematic cell, (viii) wherein the plant, the plant material or the plant cell targeted modified directly by cell division and differentiation, and, optionally, a cross-pollination or selfing from the at least one meristematic cell is obtained, and wherein the plant-derived, plant material or the plant cell comprises the selective modification of the nucleic acid-target region, wherein the or recombinant (s) construct (s) comprising at least one gRNA or for a gRNA coding sequence, and / or at least one Cas nuclease or a sequence encoding a Cas nuclease sequence and / or at least one effector domain or a sequence coding for an effector domain sequence, preferably not integrated chromosomally or extrachromosomally / are.
  • Meristematische Zellen gehören einem Gewebetyp innerhalb einer Pflanze an, welcher als Meristem oder auch Bildungsgewebe bezeichnet wird. Meristematic cells include a type of tissue to within a plant, which is referred to as a meristem or forming fabric. Wie auch Stammzellen in tierischen Organismen besitzen pflanzliche meristematische Zellen als undifferenzierte Zellen die Fähigkeit, sich je nach Umwelteinfluss zu jeglichem spezialisierten Zelltyp zu differenzieren. As well as stem cells in animal organisms possess plant meristematic cells as undifferentiated cells the ability to differentiate under different environmental conditions to any specialized cell type. Meristeme sind bei pflanzlichen Organismen nicht nur während der Embryonalentwicklung, sondern während des gesamten Lebenszyklus vorhanden, sodass eine gezielte Veränderung von meristematischen Zellen und Geweben gemäß der vorliegenden Offenbarung nicht auf pflanzliche Embryonen oder Keimlinge beschränkt ist, sondern auch in größeren Keimlingen und ausgereiften Pflanzen beispielsweise in Meristemen, aus welchen generative Pflanzenorgane (z. B. in Mais die Fahne oder der Kolben) hervorgehen, durchgeführt werden kann. Meristems are present in plant organisms not only during embryonic development, but throughout the life cycle, so that a selective change of meristematic cells and tissues according to the present disclosure is not limited to plant embryos or embryos, but also in larger seedlings and mature plants, for example in meristems from which generative plant organs (eg. as the flag or the piston in corn) emerge, can be performed.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist die meristematische Zelle eine reife oder unreife pflanzliche Zelle eines pflanzlichen Embryos oder eines Keimlings oder einer Pflanze, umfassend mindestens eine meristematische Zelle oder meristematisches Gewebe. According to one embodiment, the meristematic cell is a mature or immature plant cell of a plant embryo or seedling or a plant comprising at least one meristematic cell or meristematic tissue.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist die meristematische Zelle eine Zelle einer monokotyledonen oder einer dikotyledonen Pflanze. According to one embodiment, the meristematic cell is a cell of a monocotyledonous or a dicotyledonous plant.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein spezielles Verfahren bereitgestellt, welches gezielt die geringe Population an meristematischen Zellen in einer Pflanze in all ihren Entwicklungsstadien als pflanzliche Zielstruktur entweder direkt oder indirekt ansteuern kann. According to the present invention, a specific method is provided which can selectively control the small population of meristematic cells in a plant in all its stages of development as herbal target structure either directly or indirectly. Die mindestens eine meristematische Zielzelle kann direkt oder indirekt angesteuert. The at least one meristematic target cell can be controlled directly or indirectly. werden, dh mindestens ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung kann direkt in die mindestens eine meristematische Zielzelle eingebracht werden bzw. das mindestens eine rekombinante Konstrukt kann mit Hilfe eines geeigneten Vektors in eine beliebige pflanzliche Zelle oder ein beliebiges pflanzliches Gewebe eingebracht werden, wobei das mindestens eine rekombinante Konstrukt im Anschluss zu der pflanzlichen Zielstruktur transportiert werden kann. , ie at least one recombinant construct according to the present disclosure may be introduced directly into the at least one meristematic target cell and the at least one recombinant construct may be introduced with the help of a suitable vector in any plant cell or any plant tissue, wherein the at least a recombinant construct in the terminal can be transported to the target plant structure. Dies erfolgt etwa durch die systemische Ausbreitung von mindestens einem durch einen Vektor in eine pflanzliche Zelle oder in ein pflanzliches Gewebe eingeführten rekombinanten Konstrukt. This is done for example by systemic spread of at least one introduced by a vector into a plant cell or plant tissue in a recombinant construct.
  • Eine pflanzliche Zielstruktur, wie hierin verwendet, umfasst mindestens eine pflanzliche meristematische Zelle, welche als Gewebe, Pflanzenmaterial, als ganze Pflanze oder als isolierte Zelle vorliegen kann, wobei die pflanzliche meristematische Zelle zudem mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion enthält. A plant target structure, as used herein, comprises at least one vegetable meristematic cell, which may be present as tissue, plant material, as the whole plant or as an isolated cell, wherein said plant meristematic cell also contains at least one nucleic acid target region. Die in der pflanzlichen Zielstruktur enthaltene mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst DNA- und RNA-Sequenzen und kann innerhalb der Zielstruktur chromosomal oder extrachromosomal vorliegen. The target plant in the structure given by at least one nucleic acid target region includes DNA and RNA sequences, and may be present within the target structure chromosomally or extrachromosomally.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung, welcher sich auf die Einführung einer gezielten Nukleinsäure-Veränderung in eine nicht chromosomale Zielstruktur bezieht, umfasst der Begriff pflanzliche Zielstruktur, wie hierin verwendet, mindestens eine pflanzliche Zelle, welche als Gewebe, Pflanzenmaterial, als ganze Pflanze oder als isolierte Zelle vorliegen kann, wobei die pflanzliche Zelle zudem mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion, umfassend DNA und RNA, enthält. In one aspect of the present invention, which relates to the introduction of a targeted nucleic acid change in a non-target chromosomal structure, the term vegetable target structure, as used herein, at least a plant cell comprising as a tissue, plant material, as the whole plant, or may be isolated cell, wherein said plant cell further comprises at least a nucleic acid target region comprising DNA and RNA contains.
  • Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen meristematischen Zelle als Zielstruktur durch transient eingeführte CRISPR/Cas-Werkzeuge und/oder gegebenenfalls weitere Effektor-Domänen verändert. According to one aspect of the present invention, a nucleic acid target region in a plant meristematic cell as a target structure by transiently introduced CRISPR / Cas-tools and / or at least optionally changed more effector domains. Da die so veränderte mindestens eine meristematische Zelle die gezielte Veränderung in der Nukleinsäure-Zielregion durch die anschließende Zellteilung und Differenzierung unmittelbar und direkt an ihre Nachkommen weitergeben kann bedarf das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung keiner weiteren Kreuzungs- und Selektionsschritte, um eine Pflanze, Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle mit der erwünschten gezielten Veränderung bereitzustellen. Since the can pass immediately and directly on to their offspring, thus modified, at least a meristematic cell, the specific change in the nucleic acid-target region by the subsequent cell division and differentiation requires the method of the present invention, no further breeding and selection steps to a plant, plant material or providing a plant cell with the desired targeted modification. Vielmehr können aus den embryonalen oder ebenso aus sekundären Meristemen, wie z. Rather, from the embryonic or also from secondary meristems such. B. Pollen oder Ovarien, optional unter Durchführung einer Selbstung oder einer Fremdbefruchtung, pflanzliche Organismen oder pflanzliche Zielstrukturen gewonnen werden, welche die gezielt eingeführte Veränderung tragen. As pollen or ovaries, are obtained by performing optional selfing or pollination, vegetable or vegetable organisms target structures, which carry the targeted introduced change.
  • In einer Ausführungsform bietet das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den weiteren Vorteil, dass die CRISPR/Cas-Werkzeuge und/oder gegebenenfalls weitere Effektor-Domänen nur transient in die pflanzliche Zielstruktur, bevorzugt eine meristematische Zelle oder ein meristematisches Gewebe, eingebracht werden, sodass keine stabile Integration der CRISPR/Cas Werkzeuge wie Cas-Nuklease und gRNA und ggf. regulatorischen Sequenzen sowie ggf. weiterer Effektor-Domänen in die endogenen chromosomalen oder endogenen extrachromosomalen Nukleinsäuren der pflanzlichen Zielstruktur erfolgt. In one embodiment the method provides according to the present invention has the further advantage that the CRISPR / Cas-tools and / or optionally further effector domains only transiently expressed in the plant target structure, preferably a meristematic cell or meristematic tissue can be introduced, so that no stable integration of the CRISPR / Cas tools like Cas nuclease and gRNA and possibly regulatory sequences and any further effector domains takes place in the endogenous chromosomal or extrachromosomal endogenous nucleic acids of the target plant structure.
  • Gemäß der vorliegenden Offenbarung wurde gefunden, dass durch die Ausnutzung des Wirkmechanismus der RNA-dirigierten DNA-Modifikation der CRISPR-Cas Werkzeuge auch weitere Effektor-Domänen, gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren, eingesetzt werden können, wodurch sich das Spektrum der gezielten Genom Editierung verbreitern lässt. According to the present disclosure has been found that can be used by the utilization of the mechanism of action of RNA-directed DNA-modification of the CRISPR-Cas tools also more effector domains, methods provided in accordance with the herein, resulting in the spectrum of the targeted genome widen editing leaves. Es können entweder die Cas-Nuklease Variante oder die gRNA oder beide davon mit einer Effektor-Domäne verknüpft werden. There can be it linked to an effector domain either Cas nuclease variant or gRNA or both.
  • Eine Effektor-Domäne wie hierin verwendet umfasst DNA- bzw. RNA-modifizierende oder DNA- bzw. RNA-bindende Polypeptide oder Nukleinsäuren, umfassend alle Arten von monomeren, dimeren oder multimeren Nukleasen, wie z. as used herein an effector domain comprising comprises DNA or RNA-modifying or DNA or RNA-binding polypeptides or nucleic acids, all types of monomeric, dimeric or multimeric nucleases such. B. TALE Nukleasen, Meganukleasen, Zink-Finger-Nukleasen, Ribonuklease, Desoxyribonukleasen, Exonukleasen, Endonukleasen und Restriktionsendonukleasen vom Typ I, II, III oder IV und dergleichen und umfassend Nickasen, Aktivatoren und Repressoren der Transkription, Phosphatasen, Glykosylasen, oder Enzyme, welche epigenetische Veränderungen bewirken können, wie beispielsweise Acetylasen, Methylasen, Methyltransferasen, Proteine, welche methylierte DNA binden können, oder Histon-Deacetylasen, Aptamere, umfassend einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen sowie Peptide, fluoreszierende Proteine, Markernukleinsäure- oder Markeraminosäuresequenzen, und dergleichen, und Kombinationen davon. B. TALE nucleases meganucleases, zinc-finger nucleases, ribonuclease, deoxyribonucleases, exonucleases, endonucleases and restriction endonuclease type I, II, III or IV, and the like, and comprising nickases, activators and repressors of transcription, phosphatases, glycosylases, or enzymes, can cause which epigenetic changes such as acetylases, methylases, methyltransferases, proteins, can bind methylated DNA, or histone deacetylases, aptamers, comprising single-stranded DNA or RNA sequences as well as peptides, fluorescent proteins, Markernukleinsäure- or marker amino acid sequences, and the like , and combinations thereof. Im Bezug auf Enzyme oder Polypeptide allgemein, umfasst der Begriff „Effektor-Domäne” auch eine katalytische Domäne oder Kern-Domäne des jeweiligen Enzyms oder Polypeptides, z. In terms of enzymes or polypeptides in general, the term "effector domain" and a catalytic domain or the core domain of the particular enzyme or polypeptide such. B. einem Bindeprotein, wobei die katalytische Domäne bzw. Kern-Domäne nach wie vor dazu in der Lage ist, die enzymatische oder die Bindefunktion des jeweiligen nativen Enzyms oder Polypetids zu erfüllen. For example, a binding protein, wherein the catalytic domain or the core domain to is still able to fulfill the enzymatic or binding function of the respective native enzyme or Polypetids. Der Entwurf derartiger trunkierter Domänen und deren Anpassung auf die gewünschte Funktion hin ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. The design of such truncated domains and their adaptation to the desired function back is known to those skilled in the art.
  • Hierin werden Verfahren und Konstrukte bereitgestellt, bei welchen gRNA und/oder Cas-Nuklease bereits verknüpft mit einer weiteren Effektor-Domäne als oder auf einem rekombinanten Konstrukt bereitgestellt werden. Described herein are methods and constructs are provided in which gRNA and / or Cas nuclease already linked are provided as or on a recombinant construct with a further effector domain.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, bei welchem die mindestens eine gRNA sowie die mindestens eine Cas-Nuklease und/oder mindestens ein weitere Effektor-Domäne separat auf unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten bereitgestellt werden. In another embodiment, a method is provided, wherein the separately provided on different recombinant constructs at least one gRNA and the at least one Cas nuclease and / or at least one further effector domain. Gemäß dieses Verfahrens kann die gRNA Komponente als DNA oder RNA bereitgestellt werden, die Cas-Nuklease oder Variante davon kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden, und die Effektor-Domäne kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden. According to this method, the gRNA component may be provided as DNA or RNA, the Cas nuclease or variant thereof can be used as DNA or RNA, or be provided as a polypeptide sequence, and the effector domain can be used as DNA or RNA, or be provided as a polypeptide.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche die simultane Einbringung mindestens einer gRNA sowie mindestens einer Cas-Nuklease Variante zusammen mit mindestens einer Effektor-Domäne umfasst, kann die Effektor-Domäne mit der gRNA bzw. der Cas-Nuklease Variante durch einen Nukleinsäure- oder Aminosäure-Linker verknüpft sein, um eine ideale Anordnung der Domänen zueinander und dadurch deren Funktionalität durch adäquate Flexibilität der Domänen zueinander zu gewährleisten. According to one embodiment of the present invention that includes the simultaneous introduction of at least one gRNA and at least one Cas nuclease variant together with at least one effector domain, the effector domain with the gRNA or Cas nuclease variant, by a nucleic acid or amino acid linker be linked to each other an ideal arrangement of the domains and thereby to ensure their functionality by adequate flexibility of the domains to one another.
  • Aktivatoren und Repressoren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen können, umfassen vorzugsweise SEQ ID NOs: 1–4 sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie die Sequenzen mit den entsprechenden SEQ ID NOs. Activators and repressors which may be used according to the present invention preferably comprise SEQ ID NOs: 1-4 as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73% , 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences which despite modification still fulfill the same function as the sequences with the corresponding SEQ ID NOs ,
  • Verfahren zur Anzucht und Kultivierung der Mikroorganismen und Viren, welche gemäß der vorliegenden Offenbarung als Vektoren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. A method for growth and cultivation of microorganisms and viruses which can be used as vectors according to the present disclosure are known to those skilled in the art.
  • In einer Ausführungsform wird das rekombinante Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung mit Hilfe mindestens eines Vektors oder eines Vektorsystems in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht. In one embodiment, the recombinant construct is introduced into the plant the target structure according to the present invention using at least one vector or a vector system.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das rekombinante Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung direkt ohne einen zusätzlichen Vektor in die Zielzelle eingebracht, vorzugsweise durch mechanische Verfahren, durch Transfektion oder durch Ausnutzung von Endozytose. In another embodiment, the recombinant construct is introduced according to the present invention directly without an additional vector in the target cell, preferably by mechanical processes, by transfection or by utilizing endocytosis.
  • Ebenfalls vorgesehen, gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist die Einbringung von mindestens einem rekombinanten Konstrukt in eine pflanzliche Zielstruktur. Also provided, according to an embodiment of the present invention is the introduction of at least one recombinant construct into a plant target.
  • Vektoren und Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie der/das jeweils nicht modifizierte Vektor oder Vektorsystemmit der entsprechenden SEQ ID NO. Vectors and vector systems of the present invention include those selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12-15 and 25-38, as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% , 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences which despite modification yet fulfill the same function as the / the respective unmodified vector or Vektorsystemmit the corresponding SEQ ID nO. Die genannten Vektoren und Vektorsysteme können etwa Codon-optimierte oder trunkierte rekombinante Konstrukte umfassen, oder sie können gezielte Punktmutationen enthalten, um ihre Aktivität in unterschiedlichen Zielzellen zu gewährleisten. The vectors and vector systems mentioned can comprise from about codon optimized truncated or recombinant constructs, or they may contain specific point mutations in order to ensure their activity in various target cells. Die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 31 ist eine Hybridsequenz, bei der der Bereich zwischen den BclI und der BssHII-Schnittstellen des Fescue Segments RNA3 des Brom-Mosaik-Virus (s. NCBI: DQ530425) durch den korrespondierenden Abschnitt des R_BMV_RNA3_S113'A/G ( The sequence of SEQ ID NO: 31 is a hybrid sequence, in which the region between the Bcl I and the BssHII interfaces of the segment Fescue RNA3 of bromine mosaic virus (see NCBI. DQ530425) through the corresponding portion of the R_BMV_RNA3_S113'A / G ( ) Fragmentes ersetzt wurde. ) Fragment was replaced. Ferner wird gemäß der vorliegenden Offenbarung auch ein Agrobacterium spp. Further, according to the present disclosure also an Agrobacterium spp. als Vektor angesehen und kann alleine oder in Kombination mit weiteren Einbringungsmitteln bzw. Vektoren verwendet werden. regarded as a vector and can be used alone or in combination with other means or introducing vectors. Gemäß einer Ausführungsform werden die og Vektoren und Vektorsysteme gemäß SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38 oder Sequenzen mit og Sequenzhomologie hierzu als Gerüststruktur verwendet, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte, umfassend mindestens eine gRNA sowie mindestens eine Cas-Nuklease und/oder mindestens eine Effektor-Domäne in eine pflanzliche Zielstruktur einzubringen. According to one embodiment the above-mentioned vectors and vector systems of SEQ ID NOs are: 12-15 and 25-38 or sequences having above-mentioned sequence homology thereto is used as a scaffold structure to recombinant constructs of the invention comprising at least one gRNA and at least one Cas nuclease, and / or bring at least one effector domain into a plant target structure. Die hierfür erforderlichen molekularbiologischen Methoden und Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. The necessary for this molecular biological methods and procedures are known to those skilled in the art.
  • Rekombinante Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 23 und 24 sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie das jeweils nicht modifizierte rekombinante Konstrukt mit der entsprechenden SEQ ID NO. Recombinant constructs according to the present invention include those selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24 as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences which despite modification yet fulfill the same function as the respective non-modified recombinant construct with the corresponding SEQ ID NO. Die genannten rekombinanten Konstrukte können etwa Codon-optimierte oder trunkierte Sequenzen umfassen, oder sie können gezielte Punktmutationen enthalten, um ihre Aktivität oder Bindungseigenschaften in unterschiedlichen Zielzellen zu gewährleisten oder zu modifizieren. The recombinant constructs mentioned can comprise from about codon optimized or truncated sequences, or they may contain specific point mutations in order to ensure their activity or binding properties in different target cells or modify. In SEQ ID NO: 23 entsprechen die Positionen 16239–16258 der Position für die jeweilige gRNA von Interesse, welche je nach Ziel-Nukleinsäuresequenz modifiziert werden kann und muss. In SEQ ID NO: 23 corresponding to positions 16239-16258 of the position for the respective gRNA of interest that can be modified depending on the target nucleic acid sequence and must. In SEQ ID NO: 24 entsprechen die Positionen 16645–16664 der Position für die jeweilige gRNA von Interesse, welche je nach Ziel-Nukleinsäuresequenz modifiziert werden kann und muss. In SEQ ID NO: 24 corresponding to positions 16645-16664 of the position for the respective gRNA of interest that can be modified depending on the target nucleic acid sequence and must.
  • In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle, wobei das rekombinante Konstrukt ausgewählt ist aus SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen. In one aspect, the present invention relates to methods for producing a plant, a plant material or a plant cell, wherein said recombinant construct is selected from SEQ ID NOs: 23 and 24, as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences.
  • In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Pflanze, ein Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle, erhältlich oder erhalten durch ein Verfahren umfassend das Einbringen eines rekombinanten Konstrukts gemäß SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, in eine pflanzliche Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst. In a further aspect, the present invention relates to a plant, plant material or plant cell, obtainable or obtained by a process relating comprising introducing a recombinant construct according to SEQ ID NOs: 23 and 24, as well as sequences having at least 66%, 67% , 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences , in a target plant structure which comprises at least one meristematic cell.
  • In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von mindestens einem rekombinanten Konstrukt gemäß SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, zur gezielten Veränderung mindestens einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zelle. In yet another aspect, the present invention relates to the use of at least one recombinant construct according to SEQ ID NOs: 23 and 24, as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72 %, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences for the targeted modification of at least one nucleic acid target region in a plant cell.
  • Zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Cas-Polypeptidsequenzen sowie Cas-kodierende Nukleinsäuresequenzen, welche speziell auf den Einsatz in einer pflanzlichen Zelle hin optimiert wurden bzw. deren kodierende Konstrukte geeignete regulatorische Sequenzen tragen, welche die adäquate Transkription und/oder Translation in einer pflanzlichen Zelle im dafür vorgesehenen zellulären Kompartiment, umfassend den Zellkern, das Zytosol, ein Mitochondrium, ein Plastid, umfassend einen Chloroplasten, bewirken können. For use in the present invention, all Cas polypeptide sequences and Cas-encoding nucleic acid sequences which have been specifically optimized for use in a plant cell toward and whose encoding constructs carry appropriate regulatory sequences encoding the appropriate transcription and / or translation in a suitable plant cell in the appropriate cellular compartment, can cause the nucleus to the cytosol, a mitochondrion, a plastid, a chloroplast comprising comprising. Ferner müssen die jeweiligen Cas-Nukleasen in einer Ausführungsform über ihre intrinsische Nukleasefunktion verfügen. Further, the respective Cas nucleases in one embodiment must have their intrinsic Nukleasefunktion.
  • Alternativ können gemäß eines Aspekts der vorliegenden Offenbarung auch Cas-Nickasen zum Einsatz kommen, dh Cas-Polypeptide, die dahingehende verändert wurden, dass sie nur noch einen DNA-Strang spalten und nicht wie eine native Cas-Nuklease einen DNA-Doppelstrangbruch erzeugen. Alternatively, Cas-nickases can be used, ie Cas polypeptides which have been altered to that effect that it only cleave a DNA strand and not as a native Cas nuclease produce a DNA double-strand break. Accordance with one aspect of the present disclosure Dies bietet zum einen die Möglichkeit einer erhöhten Spezifität, da zur Erzielung eines Doppelstrangbruchs zwei rekombinante Konstrukte umfassend eine Cas-Nickase zum Einsatz kommen müssen. This provides on the one hand the possibility of increased specificity, as to obtain a double-strand break, two recombinant constructs comprising a need Cas-nickase are used. Zum anderen bietet sich die Möglichkeit, einen gezielt versetzten Doppelstrangbruch anstelle eines „Blunt” Schnittes einzuführen. Secondly, the possibility of a targeted staggered double-strand break instead of a "blunt" introduce section provides.
  • Schließlich können gemäß eines Aspekts der vorliegenden Offenbarung auch Cas-null Nukleasen, dh Varianten, welche über keine Nukleaseaktivität mehr verfügen, zum Einsatz kommen. Finally, according to one aspect of the present disclosure also Cas-zero nucleases, that is, variants which have no nuclease come used. Hiermit eröffnet sich die Möglichkeit, die Cas-Nuklease zusammen mit einer weiteren Effektor-Domäne gemäß der vorliegenden Offenbarung, z. Herewith the possibility that Cas nuclease together with another effector domain of the present disclosure, such opened. B. einem weiteren DNA- bzw. RNA-modifizierenden oder DNA- bzw. RNA-bindenden Polypeptid oder Nukleinsäuren, gemäß der vorliegenden Offenbarung zu verwenden, wodurch sich das Spektrum der Einführung gezielter Veränderungen in einer pflanzlichen Zielstruktur erweitert. B. a further DNA or RNA-modifying or DNA or RNA-binding polypeptide or nucleic acids used according to the present disclosure, whereby the spectrum of the introduction of targeted changes in a target plant structure extended.
  • Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, gezielte Mutationen in die katalytische Domäne einer Cas-Nuklease von Interesse einzuführen, um diese zu einer Nickase oder zu einer Cas-null Nuklease „umzuprogrammieren”. It is known to those skilled in the art to introduce specific mutations in the catalytic domain of Cas nuclease of interest to "reprogram" them into a nickase or a Cas-zero nuclease.
  • Beispielhafte Cas-Nukleasen oder Cas-Nuklease kodierende Sequenzen zur Anwendung in der vorliegenden Offenbarung sind in SEQ ID NOs 16–22 und als UniProtKB/Swiss-Prot Datenbankzugang Q99ZW2.1 (SEQ ID NO: 39) offenbart und umfassen auch solche Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie die jeweils nicht modifizierten Sequenzen mit der entsprechenden SEQ ID NO bzw. zugänglich unter der genannten Datenbankhinterlegungsnummer. Exemplary Cas nucleases or Cas nuclease coding sequences for use in the present disclosure are shown in SEQ ID NOs 16-22 and as UniProtKB / Swiss-Prot database access Q99ZW2.1 (SEQ ID NO: 39) disclosed and also include those sequences with at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99 % sequence homology to these sequences which despite modification yet fulfill the same function as the respective non-modified sequences with the corresponding SEQ ID nO or accessible under said database accession number.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung nutzt den dem CRISPR/Cas System zu Grunde liegenden Wirkmechanismus der RNA-gesteuerten DNA-Modifikation dahingehend, dass eine Effektor-Domäne anstelle von oder zusammen mit der Cas-Nuklease durch eine gezielt angepasste gRNA an die gewünschte Position einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zielstruktur dirigiert wird, sodass die Effektor-Domäne gezielt platziert werden kann, um die gewünschte Nukleinsäure Editierung zu bewirken. Yet another aspect of the present invention takes the CRISPR / Cas system underlying mechanism of action of RNA-directed DNA modification in that an effector domain in place of or together with the Cas-nuclease by a specifically adapted gRNA to the desired position is directed to a nucleic acid target region in a target plant structure, so that the effector domain can be specifically placed to cause the desired nucleic acid editing.
  • In einer Ausführungsform dieses Aspekts ist die Nukleinsäure-Zielregion eine genomische DNA. In one embodiment of this aspect, the nucleic acid-target region is a genomic DNA.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts ist die Nukleinsäure-Zielregion eine mitochondriale oder plastidäre DNA, wobei das rekombinante Konstrukt eine Lokalisationssequenz umfasst, welche die Lokalisation des rekombinanten Konstrukts im entsprechenden Zielkompartiment, z. In a further embodiment of this aspect, the nucleic acid-target region of a mitochondrial or plastid DNA, wherein said recombinant construct comprises a localization sequence showing the localization of the recombinant construct in the corresponding target compartment, z. B. einem Mitochondrium oder einem Chloroplasten, umfasst. B. a mitochondrion or chloroplast comprises.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die die Effektor-Domäne kodierende Sequenz zusätzlich eine Sequenz ausgewählt aus einer Kernlokalisationssequenz, einer Plastidenlokalisationssequenz, vorzugsweise einer Mitochondrienlokalisationssequenz und einer Chloroplastenlokalisationssequenz. In one embodiment, the Cas nuclease or the Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain or the effector domain coding sequence additionally comprises a sequence selected from a nuclear localization sequence, a Plastidenlokalisationssequenz, preferably a mitochondrial localization sequence and a Chloroplastenlokalisationssequenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz zusätzlich eine Sequenz ausgewählt aus einer Kernlokalisationssequenz, einer Plastidenlokalisationssequenz, vorzugsweise einer Mitochondrienlokalisationssequenz und einer Chloroplastenlokalisationssequenz. In another embodiment, the gRNA or the sequence encoding the gRNA additionally comprises a sequence selected from a nuclear localization sequence, a Plastidenlokalisationssequenz, preferably a mitochondrial localization sequence and a Chloroplastenlokalisationssequenz.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts ist die Nukleinsäure-Zielregion eine Ribonukleinsäure (RNA) in einem beliebigen pflanzlichen Kompartiment, z. In yet another embodiment of this aspect, the nucleic acid-target region is a ribonucleic acid (RNA) in any vegetable compartment, z. B. dem Zytosol. As the cytosol. Gemäß dieser Ausführungsform kann eine gezielt modifizierte gRNA bereitgestellt werden, welche dazu in der Lage ist, mit einer RNA-Zielstruktur zu interagieren. According to this embodiment a specifically modified gRNA can be provided that this is capable of interacting with an RNA target structure. Die gRNA kann zudem eine weitere Effektor-Domäne, z. The gRNA, a further effector domain also, eg. B. ein Aptamer, umfassen. B. comprise an aptamer.
  • Dem Fachmann auf dem Gebiet ist bekannt, dass das Design der entsprechenden mindestens einen gRNA, welche zusammen mit mindestens einer Cas-Nuklease und/oder mit mindestens einer Effektor-Domäne verwendet wird, von der Spezifität und speziell den Bindungs- und Erkennungseigenschaften der jeweils verwendeten Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne sowie der Nukleinsäure-Zielregion, welche gezielt verändert werden soll, abhängt. Those skilled in the art will recognize that the design of which an effector domain is used together with at least one Cas nuclease, and / or with at least the corresponding at least one gRNA, that used in each case on the specificity and specifically the binding and recognition properties Cas nuclease and / or the effector domain and the nucleic acid target region which is to be selectively modified, is dependent.
  • Wildtyp Cas-Nukleasen, speziell vom Typ Cas9, erzeugen einen „blunt” Doppelstrangbruch in der Ziel-DNA-Sequenz, dh ohne Einzelstrang-DNA-Überhang. Wild type Cas nucleases, especially of the type Cas9 generate a "blunt" double-strand break in the target DNA sequence, ie without single-stranded DNA overhang. Hierdurch wird der zelleigene DNA-Reparaturmechanismus der Zielzelle aktiviert über den sog. Nicht-homologe Reparatur (non-homologous end joining oder NHEJ) induziert. Thereby, the cell's own DNA repair mechanism of the target cell activated by the so-called. Non-homologous repair (non-homologous end-joining or NHEJ) induced. Dieser Mechanismus ist jedoch fehleranfällig, es kann also zur Etablierung unerwünschter Mutationen an den Orten der Wiederzusammenführung der einzelnen DNA-Stränge kommen. However, this mechanism is prone to errors, so it can come to the establishment of unwanted mutations in the places of reunification of the individual DNA strands. Mittels NHEJ können etwa einfache oder mehrfache Gen-Knock-Outs mediiert werden, wobei die DNA-Stränge nach dem gezielten DNA-Bruch durch zelleigene Mechanismen wieder zusammengeführt werden. Means NHEJ may be mediated for example single or multiple gene knock-outs, wherein the DNA strands are brought together again after the targeted DNA break by cellular mechanisms. Ein weiterer Reparaturmechanismus ist die Homologie-gerichtete Reparatur (homology-directed repair (HDR) oder homologe Rekombination (HR)). Another repair mechanism is the homology-directed repair (homology-directed repair (HDR) or homologous recombination (HR)). Auch dieser Mechanismus dient der Wiederzusammenführung von DNA-Strängen bei DNA-Läsionen. This mechanism also serves to rejoining of DNA strands in DNA lesions. Im Gegensatz zu NHEJ benötigt HDR jedoch die Anwesenheit einer Matrize, dh einem homologen DNA-Stück, welches die Legierung der einzelnen DNA-Stränge mediiert. In contrast to NHEJ HDR however requires the presence of a template, that is a homologous DNA piece that mediates the alloy of the individual DNA strands. Hierdurch können etwa Insertionen, Gen-Austausch oder die gezielte Zusammenführung der einzelnen Stränge ohne die Hinzufügung von unerwünschten, nicht-steuerbaren Mutationen erreicht werden. In this way, as insertions, gene exchange or selective merging of the individual strands without the addition of undesirable, non-controllable mutations can be achieved. Beide Reparaturmechanismen, NHEJ und HDR/HR stellen natürlich vorkommende Mechanismen zur DNA-Reparatur dar, welche in jeder hierin offenbarten Zelle als natürliche Reparaturmechanismen vorkommen. Of course, both repair mechanisms, NHEJ and HDR / HR represent occurring mechanisms for DNA repair, which occur as a natural repair mechanisms in each disclosed herein cell.
  • Entscheidend für die ortsgerichtete Einführung der Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion ist gemäß dem oben dargelegten Mechanismus des Typ-II CRISPR/Cas Systems die gezielte Auswahl und das gezielte Design der gRNA-Sequenzen, um die Spaltung von Off-Target Regionen anders als der Zielregion zu vermeiden. is critical for site-directed introduction of the modification of a nucleic acid target region in accordance with the procedure set forth above mechanism of the type II CRISPR / Cas system, the targeted selection and the specific design of the gRNA sequences to the cleavage of off-target regions other than the target region to avoid. Die Identifikation geeigneter PAM-Motive in Abhängigkeit der verwendeten CRISPR/Cas Werkzeuge und optional weiterer Effektor-Domänen und die Verwendung dieser Information zum Design geeigneter rekombinanter Konstrukte ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. The identification of suitable PAM motifs depending on the CRISPR / Cas tools and optional additional effector domains used and use this information to design appropriate recombinant constructs is known to those skilled in the art.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wird das Genom oder die extrachromosomale Nukleinsäure-Zielregion einer Zelle daher zunächst nach geeigneten PAM-Sequenzen hin durchsucht, um so gezielt eine passende gRNA entwerfen zu können. According to one embodiment of the present disclosure the genome or extrachromosomal nucleic acid target region of a cell is therefore first searches for suitable PAM sequences out, to so design an appropriate targeted gRNA.
  • Der Begriff guide RNA oder gRNA wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, welches aus natürlicher oder synthetischer RNA und/oder aus natürlicher oder synthetischer DNA bestehen kann und über die Funktion verfügt, einen Komplex mit einer Cas-Nuklease bilden zu können, wodurch die Cas-Nuklease erst in die Lage versetzt wird, eine Nukleinsäure-Zielregion zu erkennen. The term guide RNA or gRNA as used herein refers to a nucleic acid molecule which may consist of natural or synthetic RNA and / or natural or synthetic DNA and has the function of being able to form a complex with a Cas nuclease, whereby the Cas nuclease will only be able to recognize a nucleic acid target region. Zudem verfügte eine gRNA neben der Cas-Nuklease-Interaktionsdomäne über die Funktion einer Erkennungsdomäne, zur gezielten Hybridisierung an ein komplementäres Ziel-Nukleinsäuremolekül von Interesse. In addition, a gRNA disposal next to the Cas nuclease interaction domain of the function of a recognition domain for selective hybridization to a complementary target nucleic acid molecule of interest. Folglich können gRNAs eine intrinsische Hairpin-Region durch komplementäre Basenpaarung bilden, wodurch die natürliche tracrRNA/crRNA Hairpin-Struktur nachgeahmt wird (siehe Consequently gRNAs may form an intrinsic hairpin region by complementary base pairing, whereby the natural tracrRNA / crRNA hairpin structure is mimicked (see oben) und zudem je nach erwünschter Zielsequenz eine geeignete Erkennungsdomäne umfassen. above) and additionally comprise a suitable recognition domain depending on the desired target sequence.
  • Gemäß der vorliegenden Offenbarung können gRNAs verwendet werden, welche speziell auf den Einsatz in einer pflanzlichen Zelle hin angepasst wurden. According to the present disclosure gRNAs can be used which have been specifically adapted for use in a plant cell out.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde zudem erarbeitet, dass eine beliebige gRNA wie hierin beschrieben zusätzlich an mindestens eine Effektor-Domäne, wie z. According to the present invention has also been developed that any gRNA as described herein in addition to at least one effector domain, such. B. ein Aptamer, gekoppelt oder zusammen mit der Effektor-Domäne eingebracht werden kann, um so die Funktionalität der gRNA zu erweitern. can be for example an aptamer, coupled or placed together with the effector domain, so as to enhance the functionality of the gRNA. Das rekombinante Konstrukt umfassend eine gRNA und mindestens eine Effektor-Domäne kann als DNA- oder RNA-Konstrukt in die pflanzliche Zielstruktur unter Einsatz eines geeigneten rekombinanten Konstrukts und/oder Vektors eingebracht werden. The recombinant construct comprising a gRNA and at least one effector domain can be introduced into the plant the target structure using a suitable recombinant construct and / or vector as a DNA or RNA construct. Die Effektor-Domäne kann zudem nicht nur aus einer Nukleinsäure bestehen, sondern auch als Polypeptid, oder eine dafür kodierende Sequenz, vorliegen. The effector domain may also consist not only of a nucleic acid, but also as a polypeptide or a sequence encoding it are present.
  • In einer Ausführungsform wird die gRNA gekoppelt an die Cas-Nuklease und/oder die Effektor-Domäne, z. In one embodiment, the gRNA is coupled to the Cas-nuclease and / or the effector domain, z. B. das/die DNA- bzw. RNA-modifizierende oder das/die DNA- bzw. RNA-bindende Polypeptid oder Nukleinsäure, in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht. As the / the DNA or RNA-modifying or / the introduced DNA or RNA-binding polypeptide or nucleic acid in the plant target structure.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die gRNA als separates rekombinantes Konstrukt unabhängig von der Cas-Nuklease und/oder die Effektor-Domäne, z. In another embodiment, the gRNA will as a separate recombinant construct independent of the Cas nuclease and / or the effector domain, z. B. das DNA- bzw. RNA-modifizierende oder DNA- bzw. RNA-bindende Polypeptid oder Nukleinsäure, in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht. B. introduced the DNA or RNA-modifying or DNA or RNA-binding polypeptide or nucleic acid, vegetable in the target structure.
  • Die gRNA kann als DNA- oder als RNA-Molekül in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht werden. The gRNA can be introduced as a DNA or RNA molecule in the plant target structure. So können die gRNAs gemäß einer Ausführungsform direkt in Form einer synthetischen Nukleinsäure, z. Thus, according to an embodiment gRNAs can directly in the form of a synthetic nucleic acid, eg. B. als RNA, wahlweise auch im Komplex mit einer Cas-Nuklease, oder in einer anderen Ausführungsform in Form eines aktivierbaren und transkribierbaren rekombinanten DNA-Konstrukts in die Zielzelle eingebracht werden. B. be introduced as RNA, optionally in a complex with a Cas nuclease, or in another embodiment in the form of an activatable and transcribable recombinant DNA construct in the target cell. Ferner kann gemäß der vorliegenden Offenbarung eine einzelne gRNA eingesetzt werden, oder es können duale oder multiple gRNAs in einem oder mehreren rekombinanten Konstrukt(en) gleichzeitig in eine Zelle eingeführt werden, wobei die gRNAs über die selbe oder individuelle regulatorische Sequenz(en) verfügt/verfügen. Further, according to the present disclosure a single gRNA can be used, or it can be introduced simultaneously into a cell dual or multiple gRNAs in one or more recombinant construct (s), wherein the gRNAs via the same or individual regulatory sequence (s) has / feature. Da die Interaktionsdomäne einer klassischen CRISPR/Cas gRNA stets mit der gleichen Cas-Nuklease interagieren wird, kann durch den Einsatz individueller gRNAs, welche als weitere Komponente eine unterschiedliche Erkennungssequenz tragen, in einem Ansatz ein Multiplexing, dh die gezielte Veränderung mehrerer Zielregionen in einem Ansatz erreicht werden. Since the interaction domain of a classical CRISPR / Cas gRNA will always interact with the same Cas nuclease, by the use of individual gRNAs which carry as a further component a different recognition sequence, in one approach, a multiplexing, that is the targeted alteration of several target regions in a batch be achieved. Erforderlich kann hierbei stets sein, dass sich anliegend an die oder innerhalb der Zielregion eine PAM-Sequenz befindet. Required can always be here is that adjacent to or within the target region a PAM sequence is. Das Design einer geeigneten gRNA kann vom Fachmann auf dem Gebiet in Kenntnis der verwendeten Cas-Nuklease, der Nukleinsäure-Zielregion, der Art der erwünschten Nukleinsäure-Veränderung, ausgewählt aus Mutation, Insertion oder Deletion, sowie der erwünschten Zielzelle in silico bestimmt werden. The design of a suitable gRNA can be determined by those skilled in the art having regard to the Cas-nuclease used, the nucleic acid-target region, the nature of the desired nucleic acid modification selected from mutation, insertion or deletion, as well as the desired target cell in silico. Die Wirksamkeit dieser gRNAs in vivo sowie mögliche Off-Target Effekte müssen jedoch für jede gRNA separat evaluiert werden. However, the effectiveness of these gRNAs in vivo and potential off-target effects must be evaluated separately for each gRNA. Zudem gilt es für nicht-etablierte Systeme, wie bei der transienten Transformation von pflanzlichen Meristemzellen, geeignete Vektoren und Verfahren zur Einbringung mindestens einer gRNA zusammen mit mindestens einer geeigneten Cas-Nuklease und/oder mindestens einer Effektor-Domäne, z. Moreover, it applies to non-established systems, as in the transient transformation of plant meristem cells, suitable vectors and methods of introducing at least one gRNA together with at least one suitable Cas nuclease and / or at least one effector domain, z. B. eines/einer DNA- bzw. RNA-modifizierenden oder eines/einer DNA- bzw. RNA-bindenden Polypeptids oder Nukleinsäure, zu etablieren, um die konzertierte Aktivität beider Moleküle in der Zielzelle zu gewährleisten. a / to establish as a DNA or RNA modifying or / a DNA or RNA binding polypeptide or nucleic acid in order to ensure the concerted activity of both molecules in the target cell.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruhen die erfindungsgemäßen Verfahren und dadurch die hiermit erzeugten Pflanzen, Pflanzenmaterialien oder Zellen auf dem natürlich vorkommenden DNA-Reparaturmechanismus der Zielzelle. In one embodiment of the present invention, methods of the invention and thus the plants produced hereby, plant materials or cells are based on the naturally-occurring DNA repair mechanism of the target cell.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wird die Reparatur eines Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA-Bruchs, welcher zuvor durch eine Cas-Nuklease und/oder eine weitere Effektor-Domäne mediiert wurde, durch eine oder mehrere HDR Matrize(n) geheilt, welche nicht natürlich vorkommt/vorkommen, sondern in die Zielzelle eingeführt wurde(n). In another embodiment of the present disclosure to repair a single-stranded or double-stranded DNA breakage, which was previously mediated by a Cas nuclease and / or a further effector domain, by one or more HDR die (s) cured, which not naturally occurring / happen, but has been introduced into the target cell (s).
  • Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung wird daher in einer Ausführungsform eine HDR-Matrize offenbart, welche optional zusammen mit oder zeitversetzt zu den CRISPR/Cas Konstrukten und/oder einer weiteren mindestens einen Effektor-Domäne in eine Zielzelle eingebracht werden kann, um gezielt einen HDR-Mechanismus zu induzieren und dadurch gezielte Nukleinsäuresequenzen als Insertion an die Stelle des Doppelstrangbruchs einzufügen. In the context of the present disclosure, an HDR-die is disclosed in an embodiment which can be incorporated a time offset to the CRISPR / Cas constructs and / or another at least one effector domain into a target cell, optionally together with or to specifically target a HDR mechanism to induce and thereby insert targeted nucleic acid sequences as an insertion in place of the double-strand break. Hierdurch können sowohl gezielte Knock-Ins, als auch die gezielte Reparatur der DNA-Läsion zur Verhinderung einer unerwünschten Mutation am Ort des DNA-Bruchs bewirkt werden. In this way, both targeted knock-ins, as well as the targeted repair of the DNA lesion to prevent unwanted mutation at the site of DNA breakage can be effected. Ein Knock-In kann hierbei das gezielte Einfügen von mindestens einem Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 500 Nukleotide oder mindestens 1000 Nukleotide in die Ziel-Nukleinsäure in der pflanzlichen Zelle bedeuten. A knock-in can in this case the targeted insertion of at least one nucleotide, at least 2 nucleotides, at least 3 nucleotides, at least 4 nucleotides, at least 5 nucleotides, at least 6 nucleotides, at least 7 nucleotides, at least 8 nucleotides, at least 9 nucleotides, at least 10 nucleotides, mean at least 15 nucleotides, at least 20 nucleotides, at least 50 nucleotides, at least 100 nucleotides, at least 200 nucleotides, at least 500 nucleotides or at least 1000 nucleotides in the target nucleic acid in the plant cell. Ein Knock-In kann hierbei auch der gezielte Austausch von mindestens einem Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid bedeuten. A knock-in can mean here and the targeted exchange of at least one nucleotide for another nucleotide. Ferner kann ein Knock-In auch durch zwei, drei, vier oder mehr Austausche oder eine Kombination von Einfügen und Austauschen erzielt werden. Furthermore, a knock-in can be achieved by two, three, four or more exchanges or a combination of insertion and replacement. Insertionen meinen das gezielte Einfügen von mindestens einem Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 500 Nukleotide, mindestens 1000 Nukleotide, mindestens 2000 Nukleotide, mindestens 5000 Nukleotide, mindestens 10000 Nukleotide oder mindestens 15000 Nukleotide in die Ziel-Nukleinsäure in der pflanzlichen Zelle bedeuten. Insertions mean the targeted insertion of at least one nucleotide, at least 2 nucleotides, at least 3 nucleotides, at least 4 nucleotides, at least 5 nucleotides, at least 6 nucleotides, at least 7 nucleotides, at least 8 nucleotides, at least 9 nucleotides, at least 10 nucleotides, at least 15 nucleotides, mean at least 20 nucleotides, at least 50 nucleotides, at least 100 nucleotides, at least 200 nucleotides, at least 500 nucleotides, at least 1000 nucleotides, at least 2000 nucleotides, at least 5000 nucleotides, at least 10,000 nucleotides, or at least 15,000 nucleotides in the target nucleic acid in the plant cell. Eine Nukleinsäuresequenzen als Insertion kann eine Sequenz einer Transkriptionsfaktorbindestelle, eine regulatorische Sequenz, eine Polypeptid-kodierende Sequenz, eine Intronsequenz, eine Sequenz kodierend für eine nicht-kodierende RNA (z. B. IncRNA), eine Expressionskassette oder ein RNAi-Konstrukt. A nucleic acid sequences and insertion may be a sequence of a transcription factor binding site, a regulatory sequence, a polypeptide-encoding sequence, an intron sequence, a sequence coding for a non-coding RNA (z. B. IncRNA), an expression cassette or a RNAi construct. Ferner kann ein Knock-In hierbei auch herbeigeführt werden durch die Deletion von Sequenzabschnitten, welche die Funktionalität eines Gens stören (beispielsweise die Deletion von Transposoninsertionen). Furthermore, a knock-in can in this case also be brought about by the deletion of sequence portions, which interfere with the functionality of a gene (for example, the deletion of transposon insertions). Die HDR-Matrize kann als einzelsträngige oder als doppelsträngige Nukleinsäure in die pflanzliche Zielstruktur von Interesse eingebracht werden. The HDR template can be introduced as a single or as double-stranded nucleic acid in the plant target structure of interest.
  • In einer Ausführungsform wird eine Ziel-Nukleinsäure in einer pflanzlichen Zelle gezielt ausgeschaltet (Knock-Out), dh die Transkription und ggf. Translation der Nukleinsäure wird verhindert. In one embodiment, a target nucleic acid is switched off deliberately in a plant cell (Knock-Out), ie the transcription and optionally translation of the nucleic acid is prevented. Dies kann durch die gezielte Mutation oder Deletion einer regulatorischen Sequenz wie Promotor- oder Terminatorsequenz einer Ziel-Nukleinsäure erfolgen oder durch die gezielte Mutation oder Deletion der Ziel-Nukleinsäure selbst oder Teile davon. This can be done through the specific mutation or deletion of a regulatory sequence such as promoter or terminator sequence of a target nucleic acid, or by the specific mutation or deletion of the target nucleic acid itself or parts thereof. Weiterhin kann auch durch gezielte Mutation oder Deletion, welche den Leseraster einer Ziel-Nukleinsäure verändern, oder durch gezielte Mutation oder Deletion von potentiellen Spleißsignalen ein Knock-Out erzielt werden. Furthermore, a knock-out may also be achieved through specific mutation or deletion, which alter the reading frame of a target nucleic acid, or by selective mutation or deletion of potential splice signals. In einer Ausführungsform erfolgt dieser Knock-Out ohne Einsatz einer HDR Matrize, in einer anderen Ausführungsform wird hierfür zusätzlich zu den CRISPR/Cas Konstrukten und/oder einer weiteren Effektor-Domäne eine HDR Matrize in die Zielzelle eingebracht. In one embodiment of this knock-out takes place without the use of HDR die, in another embodiment of this one HDR die is introduced into the target cell in addition to the CRISPR / Cas constructs and / or a further effector domain. Eine gezielte Mutation ist beispielsweise ein Austausch von mindestens einem Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid, vorzugsweise mit der Folge, dass das betroffene Codon dann für eine andere Aminosäure kodiert. A targeted mutation is, for example, an exchange of at least one nucleotide for another nucleotide, preferably with the result that the codon affected then codes for a different amino acid. Eine gezielt ausgeschaltete Ziel-Nukleinsäure in einer pflanzlichen Zelle weist mindestens eine gezielte Mutation oder Deletion, kann aber auch zwei, drei, vier oder mehr gezielte Mutationen und/oder Deletionen aufweisen. A selectively switched off target nucleic acid in a plant cell at least has a specific mutation or deletion, but may also comprise two, three, four or more specific mutations and / or deletions have.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann zusätzlich zu der Einführung einer gezielten Veränderung eine Ziel-Nukleinsäuresequenz der natürliche NHEJ Mechanismus einer Pflanzenzelle bewusst durch Zugabe eines entsprechenden Inhibitors unterdrückt werden, wodurch der NHEJ Mechanismus der Zelle reprimiert wird. In yet another embodiment, a target nucleic acid sequence can be the natural NHEJ mechanism of a plant cell are deliberately suppressed by addition of a suitable inhibitor, in addition to the introduction of a targeted modification, whereby the NHEJ mechanism of the cell is repressed. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei welcher die pflanzliche Zielstruktur eine isolierte meristematische Zelle eines Keimlings/Pflanze oder eines pflanzlichen Embryos oder freigelegte meristemastische Zelle einer Pflanze in einem späteren Entwicklungsstadium ist, werden die die meristematischen Zellen umfassenden pflanzlichen Zielstrukturen vor, während und nach der Einbringung des mindestens einen rekombinanten Konstrukts gemäß der vorliegenden Offenbarung derart kultiviert, dass einer Oxidation der isolierten Strukturen vorgebeugt wird. In one embodiment of the present invention, wherein the target plant structure is an isolated meristematic cell of a seedling / plant or a plant embryo or exposed meristemastische cell of a plant in a later stage of development, which comprising the meristematic cells of plant target structures before, during and after introduction of at least one recombinant construct according to the present disclosure cultured such that oxidation of the isolated structures is prevented. In einer Ausführungsform umfasst dies die Zugabe eines Antioxidans. In one embodiment, this comprises adding an antioxidant.
  • Die nachfolgende Tabelle 1 führt geeignete Medien zur Kultivierung unterschiedlicher pflanzlicher Zielstrukturen auf, welche meistematische Zellen umfassen. The following Table 1 lists suitable media for the cultivation of various plant target structures, which comprise meistematische cells. Weitere geeignete Reaktionsbedingungen wie Puffer, Zusätze, Temperatur- und pH-Bedingungen sowie ggf. weitere notwendige Zusätze können vom Fachmann auf dem Gebiet in Kenntnis eines hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte, gemäß eines beliebigen Aspekts der vorliegenden Offenbarung leicht bestimmt werden. Further suitable reaction conditions such as buffers, additives, temperature and pH conditions as well as possibly further necessary additives can be readily determined by those skilled in the art in knowledge of a herein disclosed methods and constructs of any one aspect of the present disclosure. Tabelle 1: Medienzusammensetzungen zur Kultivierung unterschiedlicher pflanzlicher Zielstrukturen mit meristematischen Zellen (MS Medium = Murashige Skoog Medium; MS Salze = Murashige Skoog Salze (Toshio Murashige, Folke Skoog: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. In: Physiologia Plantarum, Jg. 15 (1962), Heft 3, S. 473–497, ISSN 0031-9317, doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x). Table 1: media compositions for cultivation of various plant-target structures with meristematic cells (MS medium = Murashige Skoog medium; MS salts = Murashige Skoog salts (Toshio Murashige, Folke Skoog: A Revised Medium for Rapid Growth and bio assay with Tobacco Tissue Cultures In: Physiologia. plantarum, vol 15 (1962), Heft 3, S. 473-497, ISSN 0031-9317, doi:. 10.1111 / j.1399-3054.1962.tb08052.x).
    Embryo embryo Embryo embryo Embryo-Bombardment Embryo bombardment Embryo-Bombardment Embryo bombardment Agro-Embryo Agro-embryo Agro-Embryo Agro-embryo Planzen-Meristem Exposition Planzen meristem exposure
    MM1(MM = Maturation Medium)-Reifungsmedium 1 MM1 (MM = maturation medium) -Reifungsmedium 1 MM2-Reifungsmedium 2 MM2 maturation medium 2 MM1OSM (Osmotikum) MM1OSM (osmotic agent) MM1MOD (MOD = modifiziert MM1MOD (MOD = modified MM1Tim (Tim = Timentin) MM1Tim (Tim = Timentin) MM1ACE MM1ACE Meristem Peeling-Antioxidans Meristem exfoliating antioxidant
    MS Salze MS salts MS Medium MS medium MS Salze MS salts MS Salze MS salts MS Salze MS salts MS Salze MS salts MS Salze MS salts
    30,8 g/l 30.8 g / l 3,4 g/l 3.4 g / l 30,8 g/l 30.8 g / l 30,8 g/l 30.8 g / l 30,8 g/l 30.8 g / l 30,8 g/l 30.8 g / l 95 mg/L 95 mg / L
    Saccharose sucrose Saccharose sucrose Saccharose sucrose Saccharose sucrose Saccharose sucrose Saccharose sucrose Cystein cysteine
    36,4 g/l Sorbitol 36.4 g / l Sorbitol 95 mg/l L-Cystein 95 mg / l L-cysteine 150 mg/l Timetin 150 mg / l Timetin 19.62 g/l ACE 19.62 g / l ACE 100 mg/L Ascorbinsäure 100 mg / L ascorbic acid
    36,4 g/l Mannitol 36.4 g / l mannitol 4,25 mg/l Silbernitrat 4.25 mg / l silver nitrate
    95 mg L-Cystein 95 mg L-cysteine
    4,25 mg/l L-Silbernitrat 4.25 mg / l L-silver nitrate
  • Die transiente Einführung der hierin offenbarten Konstrukte in meristematische Zellen oder Gewebe bietet den Vorteil, dass sich aus diesen Reproduktionsgewebe entwickeln, über welche die gezielte Veränderung dann stabil an die nächste Generation weitergegeben werden kann, wobei die Folgegeneration frei von den zuvor eingeführten Konstrukten ist. Transient introduction of the herein disclosed constructs into meristematic cells or tissues provides the advantage that develop from these reproductive tissues through which the selective change can then be passed stably to the next generation, the next generation is free from the previously introduced constructs. Die hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte erlauben ferner, an der derart veränderten Pflanze direkt Saatgut zu ernten, welches die stabile DNA-Veränderung trägt, ohne als Zwischenschritt über eine Zellkultur in Form von Kallusproduktion und -regeneration zu gehen, womit auch auf die hierfür notwendigen Selektions- und Regenrationsschritte sowie die hierfür erforderlichen Medien und Zusätze umgangen werden können. The methods disclosed herein and constructs also allow to harvest at the such modified plant directly seed carrying the stable DNA-change, without going as an intermediate step on a cell culture in the form of callus production and regeneration, thus also the necessary selection - and Regenrationsschritte and the necessary media and additives can be circumvented.
  • Die hierin offenbarten Verfahren eigenen sich zur Erzeugung von gezielten DNA-Veränderungen sowohl in monokotylen wie auch dikotylen Pflanzen. The methods disclosed herein are suitable for the production of targeted DNA changes both in monocotyledonous as well as dicotyledonous plants. Beispiele für Monokotyledonen sind Gräser und Getreide wie Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, Triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Traticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii. Examples of monocots are grasses and grains such as Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Traticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii. Beispiele für Dikotyledonen sind Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capselia bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. Examples of dicots are Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, lycopersicum Solanum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capselia bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. oder Populus trichocarpa. or Populus trichocarpa.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure-Sequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird mindestens eine oder mehrere regulatorische Sequenzen. In one embodiment, the nucleic acid sequence, which is used for the targeted alteration of a nucleic acid target region comprises at least one or more regulatory sequences.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäure-Sequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt als regulatorische Sequenz mindestens einen oder mehrere Promotor(n), optional einen pflanzen- und gewebespezifischen, einen phänotypischen, einen konstitutiven oder induzierbaren Promotor, welcher geeignet zur Induktion der Transkription in einer gewünschten Zielzelle ist. In one embodiment, the nucleic acid sequence used for the targeted alteration of a nucleic acid target region as a regulatory sequence at least one or more promoter (s), optionally a plant and tissue-specific, a phenotypic, a constitutive or inducible promoter which is suitable for inducing is the transcription in a desired target cell. Ein Promotor ist eine Nukleinsäureregion, welche an der Erkennung sowie der Bindung von RNA-Polymerasen sowie anderen Proteinen beteiligt ist, um die Transkription zu steuern. A promoter is a nucleic acid region which is involved in recognition and binding of RNA polymerase and other proteins to direct transcription. Geeignete Promotoren für entweder die gRNA oder die Cas-Nuklease sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Suitable promoters for either the gRNA or Cas nuclease are well known to those skilled in the art. Die Induktion eines induzierbaren Promotors kann durch Stimuli wie Temperatur, Chemikalien, pH, Licht, endogene Pflanzensignale, z. The induction of an inducible promoter, by stimuli such as temperature, chemicals, pH, light, endogenous plant signals such. B. ausgeschüttet nach Verwundung der Pflanze, und dergleichen erfolgen. As distributed by wounding the plant, and the like. Beispielhafte Promotoren sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nos: 5–11, und umfassen auch solche Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie das jeweils nicht modifizierte Sequenz mit der entsprechenden SEQ ID NO. Exemplary promoters are selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5-11, and include those sequences with at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences which despite modification yet fulfill the same function as the respective non-modified sequence with the corresponding SEQ ID NO. Weitere vorteilhafte Promotoren sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Promotoren der Wall-Associated Kinasen (WAKs) 1 und 2 (siehe z. B. Further advantageous promoters are selected from the group consisting of promoters of Wall-Associated kinases (waks) 1 and 2 (see, eg. B. sowie z. and z. B. NCBI Eintrag: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), einem Promotor des SCARECROW1 (scr1) Gens (siehe z. B. B. NCBI entry: NCBI Reference Sequence: (NC_003070.9), a promoter of the Scarecrow1 (SCR1) gene see, for example. und sowie z. and and z. B. NCBI Eintrag: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), einem Promotor der FAF2- und FAF4-Gene (siehe z. B. B. NCBI entry: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), a promoter of the FAF2- and FAF4 genes (see, for example. sowie z. and z. B. NCBI Eintrag: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), einem Promotor des OSH1-Gens (siehe z. B. B. NCBI entry: NCBI Reference Sequence: (NC_003070.9), a promoter of the gene OSH1 see, for example. sowie z. and z. B. Genbank Eintrag: GenBank: CP002688.1 oder GenBank: AP008209.2) oder ein Promotor eines Metalloprotein-Gens, z. B. Genbank entry: GenBank: CP002688.1 or GenBank: AP008209.2), or a promoter of a metalloprotein gene,. B. aus Reis (z. B. GenBank: BAD87835.1). For example, from rice (. Eg GenBank: BAD87835.1). Die Promotoren der vorliegenden Erfindung können natürlich vorkommende, synthetische oder chimäre Promotoren, oder eine Kombination davon, sein. The promoters of the present invention may be naturally occurring, synthetic or chimeric promoters, or a combination thereof, may be. Ein bevorzugter Promotor gemäß der vorliegenden Offenbarung ist ein in einer pflanzlichen Meristemzelle aktiver Promotor oder ein in Plastiden einer pflanzlichen Zelle aktiver Promotor. A preferred promoter according to the present disclosure is a promoter active in a plant Meristemzelle or an active in plastids of a plant cell promoter. In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure-Sequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird, zudem als regulatorische Sequenz mindestens einen Terminator. Moreover, as a regulatory sequence in an embodiment comprising the nucleic acid sequence which is used for the targeted alteration of a nucleic acid target region, at least one terminator.
  • In einer Ausführungsform umfasst die die Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird, umfassend eine gRNA und eine Cas-Nuklease, oder eine dafür kodierende Sequenz, mindestens eine oder mehrere Kernlokalisationssequenz(en) (KLS), welche die Kernlokalisation der zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion verwendeten Nukleinsäuren und Polylpeptiden bewirken. In one embodiment, the nucleic acid or amino acid sequence, which is used for the targeted alteration of a nucleic acid target region comprising a gRNA and a Cas-nuclease, or a sequence encoding it, at least one or more nuclear localization sequence (s) (KLS) which cause the nuclear localization of the nucleic acids and Polylpeptiden used for targeted alteration of a nucleic acid target region.
  • In einer Ausführungsform umfasst das rekombinante Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird, eine gRNA und eine Cas-Nuklease, oder eine dafür kodierende Sequenz, eine oder mehrere Plastidenlokalisationssequenz(en) (PLS), zum Beispiel eine Mitochondrien- oder Chloroplastenlokalisationssequenz(en) (MLS oder CLS), welche die Lokalisation der zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion verwendeten Nukleinsäuren und Polypeptiden in den entsprechenden pflanzlichen Plastiden bewirkt. In one embodiment, the recombinant construct comprising comprising a nucleic acid or which is used for the targeted alteration of a nucleic acid target region amino acid sequence, a gRNA and a Cas-nuclease, or a sequence encoding it, one or more Plastidenlokalisationssequenz (s) (PLS), for example a mitochondrial or Chloroplastenlokalisationssequenz (s) (MLS or CLS), which effects the localization of the nucleic acids and polypeptides used for the targeted alteration of a nucleic acid target region in the appropriate plant plastids.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure-Sequenz, welche für eine hierin offenbarte Cas-Nuklease kodiert, oder eine hierin offenbarte Cas-Nuklease zudem eine tag-Sequenz. In one embodiment, the nucleic acid sequence encoding a herein disclosed Cas nuclease encoded or disclosed herein Cas nuclease also a tag sequence. Eine tag-Sequenz ist ein Nukleinsäure- oder Proteinabschnitt, welcher der Cas-Nuklease oder der gRNA, oder der die Cas-Nuklease oder die gRNA kodierenden Nukleinsäure-Sequenz vorangestellt und/oder nachgestellt und/oder innerhalb der Sequenz lokalisiert sein kann, um optional unter anderem deren Lokalisation, Visualisierung innerhalb einer Zielzelle zu ermöglichen. A tag sequence is a nucleic acid or protein portion that can be preceded by the Cas nuclease or gRNA, or the Cas nuclease or gRNA encoding nucleic acid sequence and / or adjusted and / or located within the sequence to optional part, to enable their localization, visualization within a target cell. Besonders bevorzugt sind tag-Sequenzen ausgewählt aus der folgenden Liste: Polyhistidin(His)-Tag, Glutathione-S-transferase(GST)-tag, Thioredoxin-Tag, FLAG-tag, einem Tag mit Fluoreszenz-Eigenschaften, ausgewählt aus einem Grünfluoreszierenden Protein(GFP)-tag, einem DsRed-tag, einem mCherry-tag und dergleichen, einem Streptavidin oder strep-Tag, Maltose-Bindeprotein(MBP)-Tag, Chloroplastentransitpeptid, Mitochondrientransitpeptid, ein Snap-Tag und/oder ein Sekretionstag. Particularly preferred tag sequences are selected from the following list: polyhistidine (His) tag, Glutathione-S-transferase (GST) tag, thioredoxin tag, FLAG-tag, a tag with fluorescent properties, selected from a green fluorescent protein (GFP) -tag, a DsRed-tag, a mCherry-tag and the like, a streptavidin or Strep-tag, maltose binding protein (MBP) tag, chloroplast transit peptide, mitochondrial transit peptide, a snap-day and / or a Sekretionstag.
  • In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle zudem eine Screeningschritt. In one embodiment according to the present invention, the method for producing a plant, a plant material or a plant cell further comprises a screening step. In diesem Schritt wird durch Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuresequenz einer Zielregion, z. In this step, the nucleic acid sequence of a target region, such method is for analysis. B. durch Polymerase-Kettenreaktion oder durch Sonden, überprüft, ob die Einbringung, Aktivierung und anschließende Reaktion des mindestens einen rekombinanten Konstrukts gemäß der vorliegenden Offenbarung zur erwünschten gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion. For example, by polymerase chain reaction or by probes, checks whether the input, activation and subsequent reaction of the at least one recombinant construct according to the present disclosure to the desired targeted alteration of a nucleic acid target region. Verfahren, um dieses Screening durchzuführen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet für jegliche pflanzliche Zielstruktur sowie Nukleinsäure-Zielregion, bekannt. The method to perform this screening, are known to those skilled in the art for any target plant structure as well as nucleic acid-target region, are known.
  • Gemäß der vorliegenden Offenbarung können die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zelle durch mechanische Verfahren, unter anderem Partikel-Beschuss, Mikroinjektion und Elektroporation, oder durch induzierte Endozytose, geeignete Vektoren, direkte Transfektion, und dergleichen eingebracht werden. According to the present disclosure, the vectors and / or recombinant constructs for targeted alteration of a nucleic acid target region in a plant cell by mechanical methods, inter alia, particle bombardment, microinjection and electroporation, can or induced endocytosis, suitable vectors, direct transfection, and the like are introduced. In einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Partikelbeschuss in die Zielzelle oder pflanzliche Zielstruktur eingebracht. In one embodiment of the present disclosure, the vectors and / or recombinant constructs by particle bombardment into the target cell or plant target structure are introduced. Hierbei werden die Vektoren zunächst z. Here, the vectors are first z. B. auf Gold- oder Wolframpartikel präzipitiert und die Zielzelle/pflanzliche Zielstruktur wird dann mit den so erhaltenen ggf. weiter prozessierten Partikeln durch eine geeignete Apparatur bombardiert. B. precipitated onto gold or tungsten particles and the target cell / target plant structure is then bombarded with the thus obtained, if necessary, further processed particles by a suitable apparatus. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Mikroinjektion in die Zielzelle oder pflanzliche Zielstruktur direkt oder indirekt eingebracht. In a further embodiment of the present disclosure, the vectors and / or recombinant constructs by microinjection into the target cell or target plant structure can be introduced directly or indirectly. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Besprühen mit anschließender Aufnahme, z. In another embodiment of the present disclosure, the vectors and / or recombinant constructs by spraying with subsequent recording are, for. B. im Zuge einer viralen Infektion, oder Infiltration in die Zielzelle oder pflanzliche Zielstruktur eingebracht. B. introduced in the course of a viral infection or infiltration into the target cell or target plant structure.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Partikel-Beschuss in eine meristematische Zelle eingebracht. According to one embodiment, the vectors and / or recombinant constructs by particle bombardment into a meristematic cell are introduced. Diese Methode eignet sich sowohl zur Einbringung von rekombinanten Konstrukten umfassend doppelsträngige Plasmid-DNA, lineare einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, und von Polypeptiden sowie von Kombinationen davon bei allen Arten von pflanzlichen Meristemen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien einer Pflanze. This method is suitable for introducing the recombinant constructs comprising double-stranded plasmid DNA, linear single-stranded or double-stranded DNA, single-stranded or double-stranded RNA, and polypeptides, as well as combinations thereof with all types of plant meristems in different stages of development of a plant. Als Trägermaterial für die rekombinanten Konstrukte können unter anderem Gold und Wolfram verwendet werden. Suitable support materials for the recombinant constructs, inter alia, gold, and tungsten can be used.
  • In einer weiteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder der rekombinanten Konstrukte durch Mikroinjektion direkt in die Zielzelle oder das gewünschte Kompartiment einer Zielzelle. In a further embodiment according to the present disclosure, the introduction of the vectors of the invention and / or the recombinant constructs by microinjection directly into the target cell or the desired compartment of a target cell.
  • Gemäß dieser weiteren Ausführungsform werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Mikroinjektion in eine meristematische Zelle eingebracht. According to this further embodiment, the vectors and / or recombinant constructs by microinjection into a meristematic cell are introduced. Diese Art der Einbringung eignet sich für alle Arten von Meristemen (s. Beispiel 2 unten). This type of contribution is suitable for all kinds of meristems (s. Example 2 below). Zudem eignet sich die Einbringung gemäß dieser Ausführungsform sowohl zur Einbringung von rekombinanten Konstrukten, umfassend doppelsträngige Plasmid-DNA, lineare einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, und von Polypeptiden sowie von Kombinationen davon. In addition, the introduction of this embodiment, both for the introduction of recombinant constructs comprising double-stranded plasmid DNA, linear single-stranded or double-stranded DNA is, single-stranded or double-stranded RNA, and polypeptides, as well as combinations thereof.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren durch Elektroporation durch Hochspannungspulse. In yet another embodiment according to the present disclosure, the introduction of the vectors of the invention by electroporation by high voltage pulses is performed.
  • In noch einer anderen Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren durch Endozytose, dh einen zelleigenen Mechanismus, durch welchen zellfremdes Material in die Zelle aufgenommen werden kann. In yet another embodiment according to the present disclosure, the introduction of the vectors of the invention by endocytosis takes place, ie, a cell's own mechanism, can be taken into the cell through which the cell foreign material.
  • In einer Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor, welcher das mindestens eine rekombinante Konstrukt umfasst. In one embodiment, the vector is a viral vector comprising at least one recombinant construct. Die Einbringung durch einen viralen Vektor bietet die Möglichkeit der Ausbreitung des Vektors und des umfassten mindestens einen rekombinanten Konstrukts. The introduction of a viral vector offers the possibility of propagation of the vector and the included at least one recombinant construct. Geeignete virale Vektoren, welche zur Anwendung gemäß der vorliegenden Offenbarung eingesetzt oder modifiziert werden können, sind ausgewählt aus der Gruppe, umfassend, aber nicht beschränkt auf SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38 und umfassen auch solche Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen. Suitable viral vectors which can be used or for use according to the present disclosure are modified, chosen from the group comprising, but not limited to SEQ ID NOs: 12-15 and 25-38 and also include those sequences with at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass die Sequenz eine natürlich vorkommenden Virus, welcher als viraler Vektor eingesetzt werden soll, entsprechend an das gewünschte einzubringende rekombinante Konstrukt sowie die pflanzliche Zielstruktur von Interesse angepasst werden muss. It is known to those skilled in the art that the sequence to be introduced according to the desired recombinant construct and the target plant structure has to be adapted of interest is a naturally-occurring virus which is to be used as a viral vector.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die rekombinanten Konstrukte durch Agrobacterium spp. In another embodiment, the recombinant constructs by Agrobacterium spp. -vermittelter Transformation, insbesondere Agrobacterium tumefaciens- oder Agrobacterium rhizogenes-vermittelter Transformation, in eine pflanzliche Zielstruktur eingebracht. -mediated transformation, in particular Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation is introduced into a plant target. Diese Art der Einbringung ist dem Fachmann auf dem Gebiet für unterschiedliche Zielpflanzen sowie unterschiedliche pflanzliche Zielstrukturen davon wohlbekannt. This type of contribution is the expert in the field for different target plants and different plant targets them well known.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass die Wahl der Einbringungsart ua von der entsprechenden pflanzlichen Zielzelle sowie dem einzubringenden Konstrukt abhängen kann, weshalb je nach Zielzelle eine andere Einbringungsart erforderlich sein kann. Those skilled in the art will appreciate that the choice of Einbringungsart may depend partly on the appropriate target plant cell and the introduced construct, which is why another Einbringungsart may be required depending on the target cell.
  • In einer weiteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch eine Kombination der oben genannten Einbringungsmethoden. In a further embodiment according to the present disclosure, the introduction of the vectors of the invention and / or recombinant constructs by a combination of the above introduction methods are used. So kann beispielsweise ein viraler Vektor, welcher das mindestens eine rekombinante Konstrukt von Interesse enthält, durch Agrobacterium tumefaciens als weiteren Vektor, oder etwa durch Partikel-Beschuss oder Mikroinjektion, in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht werden. For example, a viral vector, which contains at least one recombinant construct of interest introduced by Agrobacterium tumefaciens as another vector, or for example by particle bombardment or microinjection, into the target plant structure.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden spezielle Verfahren zur Einbringung von Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung in meristematische Pflanzenzellen und -gewebe offenbart. In one aspect of the present invention, specific methods for introducing vectors and / or recombinant constructs according to the present invention in meristematic plant cells and tissues are disclosed. Für die Transformation oder Transfektion meristematischer Zellen und Gewebe ist deren Zugänglichkeit ein entscheidender Faktor, wobei sich die Zugänglichkeit der unterschiedlichen pflanzlichen Meristemtypen in den verschiedenen Entwicklungsstadien einer Pflanze erheblich unterscheiden. their accessibility is a crucial factor for the transformation or transfection of meristematic cells and tissues, with significantly different accessibility of the different vegetable Meristemtypen in the various development stages of a plant.
  • In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Bereitstellung einer pflanzlichen Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, offenbart, wobei in die pflanzliche Zielstruktur mindestens ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung eingebracht werden kann. In one embodiment according to the present invention, therefore, is a method for providing a target plant structure comprising at least a meristematic cell is disclosed, wherein at least one recombinant construct according to the present disclosure may be introduced into the target plant structure. Das Verfahren gemäß dieser Ausführungsform umfasst als entscheidenden Schritt das Zugänglichmachen einer meristematischen Struktur von Interesse, welche noch nicht ausdifferenzierte meristematische Zellen umfasst. The method according to this embodiment, as a determining step comprises making available a meristematic structure of interest, which comprises not yet differentiated meristematic cells. Handelt es sich bei der pflanzlichen Zielstruktur um Meristeme im Embryo, ist es wesentlich, einen pflanzlichen Embryo der richtigen Größe zu wählen und die tieferen, dh im Inneren liegenden, meristematischen Zellen als Ziel einer Transformation oder Transfektion mit mindestens einem rekombinanten Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung anzusteuern, da die in den äußeren Schichten befindlichen meristematischen Zellen bereits einen gewissen Grad der Differenzierung erreicht haben können und somit nicht mehr gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind. If it is in the target plant structure around meristems in the embryo, it is essential to choose a plant embryo of the right size and the deeper, ie located in the interior, meristematic cells as the target of transformation or transfection with at least one recombinant construct according to the present invention to control, as the located in the outer layers meristematic cells may have already reached a certain degree of differentiation and thus not according to the present invention are useful. Vorzugsweise sind die pflanzlichen Embryonen hinsichtlich ihrer Größe so auszuwählen, dass sie mit einem exponierteren Meristem ausgestattet sind. Preferably, the plant embryos are selected in size so that they are equipped with a more exposed meristem. Für Maisembryonen bedeutet das, dass Embryonen von weniger als 1,5 mm maximalen Durchmesser, bevorzugt von weniger als 1 mm maximalen Durchmesser, besonders bevorzugt von weniger als 0,7 mm maximalen Durchmesser und ganz besonders bevorzugt von weniger als 0,5 maximalen Durchmesser in vorteilhafter Weise erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Maize embryos, this means that embryos of less than 1.5 mm maximum diameter, preferably less than 1 mm maximum diameter, more preferably less than 0.7 mm maximum diameter, and most preferably of less than 0.5 in maximum diameter advantageously can be used according to the invention. Eine meristematische Zelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist somit eine meristematische Zelle, deren Differenzierungsgrad es noch gestattet, dass aus der Zelle nach er gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Region von Interesse noch alle gewünschten Typen von Pflanzenzellen, insbesondere solche Typen, aus welchen direkt oder indirekt eine fertile Pflanze regeneriert werden kann, entstehen können. A meristematic cell in the sense of the present invention is thus a meristematic cell, the degree of differentiation still allows that, from the cell after he targeted modification of a nucleic acid region of interest or all the desired types of plant cells, particularly those types from which, directly or indirectly a fertile plant may be regenerated may arise.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Bereitstellung einer pflanzlichen Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, in die mindestens ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung eingebracht werden kann, offenbart, wobei es sich bei der meristematischen Zelle um eine Zelle eines Keimlings oder einer älteren Pflanze handelt. In a further embodiment, a method for providing a target plant structure comprising at least a meristematic cell, a recombinant construct according to the present disclosure may be incorporated at least in the disclosed, which is earlier in the meristematic cell is a cell of an embryo or a plant is.
  • Gemäß dieser Ausführungsform muss das Meristem vollständig oder nahezu vollständig freipräpariert werden. According to this embodiment, the meristem has to be dissected completely or almost completely. Zudem muss beachtet werden, dass die tiefer liegenden, dh im Inneren liegenden, meristematischen Zellen als Ziel einer Transformation oder Transfektion mit mindestens einem rekombinanten Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung angesteuert werden, da die in den äußeren Schichten befindlichen meristematischen Zellen bereits einen gewissen Grad der Differenzierung erreicht haben können und somit nicht mehr gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind. It must also be noted that the deeper, ie located in the interior, meristematic cells are controlled as the target of transformation or transfection with at least one recombinant construct according to the present invention, since the located in the outer layers meristematic cells already a certain degree of differentiation may have achieved and are therefore no longer suitable according to the present invention. Gemäß dieser Ausführungsform sind die freigelegten Meristeme einer Oxidation ausgesetzt. According to this embodiment, the exposed meristems are exposed to oxidation. Um eine Schädigung der meristematischen Zellen zu verhindern, werden daher vorzugsweise geeignete antioxidative Schutzmaßnahmen angewendet, wie z. In order to prevent damage to the meristematic cells, therefore, preferably contain suitable antioxidant protection measures are applied such. B. der Einsatz eines Anti-Oxidationsmittels oder weiterer schützender Maßnahmen, um eine weitere Entwicklung der pflanzlichen Zielstruktur umfassend mindestens eine meristematische Zelle, zu gewährleisten. As the use of an anti-oxidant or other protective measures to ensure a further development of the plant comprising at least one target structure meristematic cell.
  • Sequenzprotokoll – freier Text Sequence Listing - free text
  • Die folgenden Angaben geben die deutsche Übersetzung der im Sequenzprotokoll als freier Text (Numerische Kennzahl <223>) enthaltenen Angaben, jeweils aufgeführt für die entsprechende Sequenzkennzahl, wieder. The following figures give the German translation of the sequence listing as free text (numeric identifier <223>) contained herein, each mentioned in the corresponding sequence identifier again.
  • Figure DE102015006335A1_0002
  • Beispiele Examples
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht als limitierend anzusehenden, Beispiele erläutert. The present invention is further illustrated by the following non-be regarded as limiting examples.
  • Beispiel 1: Herstellung von CRISPR/Cas-Konstrukten Example 1: Preparation of CRISPR / Cas constructs
  • Die Erstellung der Konstrukte erfolgt auf Grundlage der Publikation von The preparation of the constructs is based on the publication by . , Die Promotoren wurdengezielt gegen spezifische pflanzliche Promotoren ersetzt und die gRNA den jeweiligen Zielgenen angepasst. The promoters was targeted against specific plant promoters replaced and the gRNA adapted to the respective target genes.
  • Konstrukte für monolotyledone Pflanzen: Constructs monolotyledone plants:
  • Als Promotoren wurden unter anderem der Mais-Ubi-Intron Promotor (SEQ ID NO: 7), der Mais U3 Promotor (SEQ ID NO: 10), der Weizen U6 Promotor (SEQ ID NO: 8), der Reis U3 Promotor (SEQ ID NO: 9) und der Brachipodium EF1 Promotor (SEQ ID NO: 40) verwendet. As promoters, inter alia, the maize Ubi-intron promoter (SEQ ID NO: 7), the maize U3 promoter (SEQ ID NO: 10), the wheat U6 promoter (SEQ ID NO: 8), the rice U3 promoter (SEQ ID NO: 9) and the Brachipodium EF1 promoter (SEQ ID NO: 40) was used. Ein beispielhaftes verwendetes Konstrukt hat die SEQ ID NO: 23 (Vektor1_TaU6 standard). An exemplary construct used has the SEQ ID NO: 23 (Vektor1_TaU6 standard).
  • Konstrukte für dicotyledone Pflanzen: Constructs to dicotyledonous plants:
  • Hier wurden als Promotoren ein Parsley-Ubi4 (SEQ ID NO: 5) und ein Arabidopsis U6 Promotor (SEQ ID NO: 6) verwendet. Here were as promoters Parsley-Ubi4 (SEQ ID NO: 5) and an Arabidopsis U6 promoter (SEQ ID NO: 6). Ein beispielhaftes verwendetes Konstrukt hat die SEQ ID NO: 24 (Vektor1_ZmU3 standard). An exemplary construct used has the SEQ ID NO: 24 (Vektor1_ZmU3 standard).
  • Die unterschiedlichen gRNAs wurden für die jeweiligen Zielgene spezifisch erstellt und in die entsprechende Position in den oben angegebenen Vektoren kloniert. The different gRNAs were specifically created for the respective target genes and cloned into the appropriate position in the above vectors. Die Position der gRNA Sequenz entspricht den als „n” gekennzeichneten Nukleotiden in SEQ ID NOs: 23 und 24. The position of the sequence corresponds to the gRNA designated as "n" nucleotides in SEQ ID NOs: 23 and 24th
  • Beispiel 2: Einbringung von CRISPR/Cas-Konstrukten Example 2: Incorporation of CRISPR / Cas constructs
  • Die oben in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukte wurden mittels unterschiedlicher Methoden in die Meristeme eingebracht. The constructs described above in Example 1 was introduced by means of different methods in the meristems. Grundlage dafür ist die Zugänglichkeit der Meristeme, die abhängig von dem verwendeten Material durch unterschiedliche Methoden gewährleistet wurde (siehe Beispiel 4) This is based on the accessibility of the meristems was ensured depending on the material used by different methods (see Example 4)
  • Folgende Methoden wurden verwendet: The following methods were used:
  • – Partikel-Beschuss: - Particle bombardment:
  • Partikel-Beschuss kann bei allen verwendeten Meristemen angewendet werden. Particle bombardment can be applied to all used meristems. Es wird mit dsPlasmid-DNA, linearer dsDNA, RNA und Protein beschossen. It is bombarded with dsPlasmid DNA, linear dsDNA, RNA and protein. Als Trägermaterial können Gold und Wolfram verwendet werden. As support material gold and tungsten can be used. Als Test wurden Beschösse von Embryo-Meristemen ( As a test Beschösse were (from embryonic meristems ) und „Tassel”-Meristemen ( ) And "Tassel" -Meristemen ( ) gemacht, Mit Hilfe des rot fluoreszierenden Proteins konnte nachgewiesen werden, dass es möglich ist, DNA durch Partikel-Beschuss in diese Zellen einzubringen. ) Made by means of the red fluorescent protein could be demonstrated that it is possible to introduce DNA by particle bombardment into these cells.
  • – Mikroinjektion: - microinjection:
  • Die Mikroinjektion kann bei allen Meristemen stattfinden, vorzugsweise unter Verwendung eines Mikroskops mit Mikromanipulator. The microinjection can take place at all meristems, preferably using a microscope with a micromanipulator. Auf Grund der Größe bestimmter Meristemstrukturen wie präparierten „Tassel”- und „Ear”-Meristemen kann diedie Mikroinjektion aber auch unter mikroskopischer Kontrolle durchgeführt werden. Due to the size of certain Meristemstrukturen as prepared "Tassel" - and "Ear" -Meristemen can diedie microinjection also be carried out under microscopic control. Die Injektion kann über unterschiedliche Methoden stattfinden und wie schon beim Partikel-Beschuss (Beispiel 1) angegeben mit unterschiedlichen Molekülen. The injection can take place through different methods and like with the particle bombardment (Example 1) indicated with different molecules. Zum einen werden dsPlasmid-DNA, linearer dsDNA, RNA und Protein in flüssiger Lösung durch eine Mikro- oder Nano-Kanüle in die meristematischen Zellen injiziert, zum anderen werden dsPlasmid-DNA, linearer dsDNA, RNA und Protein auf Mikro- oder Nano-Nadeln aufgebracht und durch anstechen der meristematischen Zellen mit den Nadeln übertragen. Firstly dsPlasmid DNA are linear dsDNA, RNA and protein in liquid solution injected through a micro- or nano-cannula into the meristematic cells, on the other hand are dsPlasmid DNA, linear dsDNA, RNA and protein in micro or nano-needles applied and transmitted through the puncture meristematic cells with the needles.
  • Beispiel 3: Transiente meristematische Transformation von Maiskeimlingen und/oder Embryonen/erfindungsgemäße Behandlung der meristematischen Gewebe Example 3: Transient transformation of meristematic maize seedlings and / or embryos / treatment of the invention the meristematic tissue
  • Die Zugänglichkeit der Meristeme in den einzelnen Stadien unterscheidet sich erheblich. The accessibility of meristems in the individual stages is very different. So sind im Embryo ( Thus, in the embryo ( 1 1 und and 2 2 ) die Meristeme relativ gut zugänglich, vorausgesetzt man verwendet Embryonen der richtigen Größe. ) The meristems relatively well accessible, provided one uses embryos of the correct size. Wichtig ist es, die tiefer gelegenen Zellen der Meristeme zu transformieren, da die oberen Zellen bereits eine gewisse Differenzierung durchlaufen haben und nicht mehr geeignet sind. to transform the cells of the meristems deeper because the upper cells have already undergone some differentiation and are no longer suitable is important.
  • Meristeme in Keimlingen und älteren Pflanzen müssen vollständig frei präpariert werden, da sie schon von so vielen Schichten Gewebe umgeben sind, dass sie nicht für einen Beschuss oder eine Mikroinjektion zugänglich sind. Meristems in seedlings and older plants must be fully dissected, as they are already surrounded by so many layers of tissue that they are not accessible to a bombardment or microinjection. 3 3 und and 4 4 zeigen die präparierten Meristeme, die für die Transformation verwendet werden können. Show the prepared meristems, which can be used for transformation. Auch hier gilt wie bei den Embryo-Meristemen, dass die oberen Zellen bereits eine gewisse Differenzierung durchlaufen haben und nicht mehr geeignet sind. Again, as with the embryo meristem that the upper cells have already undergone some differentiation and are no longer suitable. Es müssen also die Zellen weiter innen in den Meristemen transformiert werden. It must be transformed further inside the meristems cells. Da die isolierten Meristeme frei liegen und dadurch einer starken Oxidation und eines daraus resultierenden Absterben ausgesetzt sind, wurden sie mit einem Anti-Oxidationsmittel, um eine weitere Entwicklung des Keimlings zur Pflanze zu ermöglichen. Since the isolated meristems are exposed and thereby subjected to a strong oxidation and a resulting die, they were treated with an anti-oxidant, in order to allow a further development of the embryo to the plant.
  • Um die „Tassel”-Meristeme zugänglich zu machen, haben wir eine Methode entwickelt um die Pflanze und die Meristeme möglichst wenig zu schädigen. To make the "Tassel" -Meristeme accessible, we have developed a method to the plant and damaging the meristems as little as possible. Dazu wird auf der Höhe der „Tassel”-Meristeme eine Art Fenster durch die Blätter hindurch geschnitten ( For this purpose, at the level of "Tassel" -Meristeme a kind of window (through the leaves through cut 6 6 ). ). Dies gewährleistet, dass die Blätter nicht absterben und sich die Pflanze ganz normal weiterentwickelt und, dass das Meristem von den restlichen Blättern geschützt bleit. This ensures that the leaves do not die and the plant developed normally and that the meristem bleit protected from the remaining leaves.
  • Zusätzlich schiebt das Meristem sehr zügig (innerhalb weniger Stunden/Tage) weiter nach oben, so dass es dann wieder vollständig geschützt ist. In addition, the meristem moves very quickly (within hours / day) further up, so it is then fully protected again. Dies reduziert die Wahrscheinlichkeit eines Oxidierens und damit eines Absterben des Meristems. This reduces the likelihood of oxidizing and a withering away of the meristem.
    • – Die Transfektion findet dann mittels der oben angegebenen Methoden (s. Beispiel 2) statt. - Transfection then takes place by means of the methods indicated above instead of (see Example 2.). Die Embryonen keimen aus und Pflanzen werden kultiviert bis zur Selbstung und Ernte. The embryos germinate and plants are grown to selfing and harvesting. Vergleichbar bei den Keimlingen und den adulten Pflanzen, nur ohne Keimung. Comparable with the seedlings and adult plants, only without germination.
  • Beispiel 4: Nachweis der erfolgten gezielten gentechnischen Veränderung Example 4: Detection of the targeted genetic modification performed
  • Der Nachweis ist über unterschiedliche Verfahren und zu unterschiedlichen Zeitpunkten möglich: The detection is possible by various methods and at various time points:
    Die Anwesenheit der gewünschten gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion kann in frühen Phasen des Keimlings, der sich entwickelnden Pflanzen und der Pollen analysiert werden, so dass man bereits Hinweise auf die erfolgten Mutationen erhält. The presence of the desired targeted modification of a nucleic acid target region can be analyzed in early stages of the embryo, the developing plants and the pollen, so that is already obtained evidence that occurred mutations. Ein eindeutiges Ergebnis erhält man aber nur, wenn man die Nachkommen der Selbstung analysiert, da dies den Nachweis für eine vererbte Mutation erbringt. A clear result is obtained but only if one analyzes the descendants of selfing, as this provides evidence for an inherited mutation.
  • – Enrichment PCR: - Enrichment PCR:
  • Diese Methode kommt zur Anwendung, wenn durch die gezielte Mutation eine Restiktionsenzymschnittstelle zerstört wird. This method is used when a Restiktionsenzymschnittstelle is destroyed by the targeted mutation. Man verdaut dann isolierte genomische oder extrachromosomale DNA mit dem Enzym, welches an dieser Stelle schneidet, so dass Wildtyp-DNA geschnitten wird. It then digested isolated genomic or extrachromosomal DNA with the enzyme, which cuts at this point, so that wild-type DNA is cut. Anschließend folgt eine PCR mit Primern die genomisch upstream und downstream der Restiktionsenzymschnittstelle liegen. Followed by a PCR with primers are the upstream and downstream genomic the Restiktionsenzymschnittstelle. Man bekommt im Idealfall also nur ein Produkt, wenn eine Mutation stattgefunden hat und die DNA an der Stelle nicht geschnitten wurde. So you only get a product ideally, if a mutation has occurred and the DNA was not cut in place. Da der Verdau der genomischen oder der extrachromosomalen DNA in der Regel nicht 100% ist, wird das erhaltene PCR-Amplifikat erneut mit dem Enzym verdaut um sicher zustellen, dass eine Mutation stattgefunden hat und die Restiktionsenzymschnittstelle mutiert ist. Since the digestion of the genomic or extra-chromosomal DNA is not 100%, as a rule, the resulting PCR amplicon is re-digested with the enzyme to safely determine that a mutation has occurred and the Restiktionsenzymschnittstelle is mutated. Die unverdauten Fragmente werden anschließen kloniert und sequenziert, um eine genaue Analyse der Mutation durchzuführen. The undigested fragments are cloned and sequenced connect to perform an accurate analysis of mutation. Sollte die Nukleinsäure-Zielregion eine RNA sein, kann diese zunächst durch dem Fachmann bekannte Verfahren in DNA umgeschrieben werden, bevor eine Enrichment PCR erfolgt. If the nucleic acid-target region to be a RNA, this first known method in DNA can be rewritten by the skilled person, before a Enrichment PCR.
  • – Sequenzierung: - Sequencing:
  • Sollte eine Enrichment PCR nicht möglich sein, wird über einen Next Generation Sequencing(NGS)-Ansatz die spezifische Region sequenziert und die erhaltenen Sequenzen hinsichtlich ihrer Mutationen untersucht. If any Enrichment PCR is not possible, a Next Generation Sequencing (NGS) approach is sequenced the specific region and examines the sequences obtained in terms of their mutations.
  • – Sequenzierung ganzer Genome (WGS) zur Identifikation von Off-Target Effekten: - whole genome sequencing (WGS) to identify off-target effects:
  • Um auszuschließen, dass es zu unerwünschten Mutationen gekommen ist, wird von den Kandidaten mit den gewünschten Mutationen eine WGS durchgeführt. To rule out that there have been unwanted mutations is carried out by the candidates with the desired mutations a WGS.
  • Zusätzliche Analysen sind der Abwesenheits-Nachweis von den verwendeten Konstrukten und Viren mittels spezifischer PCR- und qPCR-Systeme. Additional analyzes of the absence detection of the constructs used and virus by specific PCR and qPCR systems.
  • Beispiel 5: Virale Vektoren Example 5: Viral vectors
  • Viren bieten den Vorteil, dass sie als fertige Viruspartikel, aber auch als DNA oder RNA in eine pflanzliche Zielstruktur eingebracht werden können. Viruses have the advantage that they can be introduced as a ready viral particles, as well as DNA or RNA into a plant target structure. Zusätzlich bieten sie die Möglichkeit der Ausbreitung in den Zellen, falls diese Funktion durch die Modifikation ihrer RNA/DNA-Sequenz nicht zerstört wurde. In addition, they offer the possibility of spreading to the cells if this feature has not been destroyed by the modification of their RNA / DNA sequence. Dies hat den Vorteil, dass man zum einen nicht direkt das Meristem infizieren muss, oder es ausreichen kann, nur wenige Zellen zu infizieren und es trotzdem zur Ausbreitung in mehrere Zellen- oder Gewebetypen kommt. This has the advantage that you do not have to directly infect the meristem for one, or may be sufficient to infect only a few cells, and it still comes to the spread into multiple cell or tissue types. Zusätzlich bieten DNA-Viren den Vorteil, eine große Menge an DNA-Templates für die HR zur Verfügung zu stellen. Additionally, DNA viruses have to provide a large amount of DNA templates for HR available the advantage.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden. It follows a sequence listing by WIPO St. 25 This can be downloaded from the official publication of the DPMA platform.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. This list of references cited by the applicant is generated automatically and is included solely to inform the reader. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. The list is not part of the German patent or utility model application. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen. The DPMA is not liable for any errors or omissions.
  • Zitierte Patentliteratur Cited patent literature
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    • WO 2015/026885 A1 [0010] WO 2015/026885 A1 [0010]
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    • Mali et al. Mali et al. 2003 [0126] 2003 [0126]

Claims (15)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen einer pflanzlichen Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst, wobei die mindestens eine meristematische Zelle mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst; A method for producing a plant, a plant material or a plant cell, comprising the steps of: (i) providing a target plant structure which comprises at least a meristematic cell, wherein the at least one meristematic cell comprises at least one nucleic acid target region; (ii) Bereitstellen mindestens einer gRNA oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinante(n) Konstrukt(e) (a) mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, und (b) optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, und Bereitstellen mindestens einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinanten) Konstrukt(e) (a) mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz, und (b) optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, wobei die gRNA dazu in der Lage ist, sowohl an einen Abschnitt der Nukleinsäure-Zielregion zu hybridisieren als auch mit der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne zu intera (Ii) providing at least one gRNA or providing one or more recombinant construct / constructs, wherein the or recombinant (s) construct (s) (a) at least one gRNA or a sequence encoding a gRNA sequence, and (b) optionally at least a regulatory sequence and / or a localization sequence comprises, and providing at least one Cas nuclease and / or an effector domain or providing one or more recombinant construct / constructs, wherein the or recombinant) construct (s) (a) at least one Cas nuclease optionally includes at least a regulatory sequence and / or a localization sequence, or a sequence encoding a Cas nuclease sequence and / or at least one effector domain or a sequence coding for an effector domain sequence, and (b), wherein the gRNA to is able to hybridize to a portion of the nucleic acid-target region as well as with the Cas-nuclease and / or the effector domain to intera gieren; yaw; wobei wenn die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz durch ein oder mehrere rekombinante Konstrukts/Konstrukte bereitgestellt werden, die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf oder in dem gleichen, oder auf oder in unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten lokalisiert sind; wherein when the gRNA or the sequence of the gRNA coding and the Cas nuclease or provided by one or more recombinant construct / constructs, the Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain, or the sequence coding for an effector domain sequence, the gRNA or the gRNA coding sequence and the Cas nuclease or the Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain, or the sequence coding for an effector domain sequence or in the same, or on or in different recombinant constructs are located; (iii) Einbringen der gRNA, der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne oder des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte in die pflanzliche Zielstruktur; (Iii) introducing the gRNA, the Cas nuclease and / or the effector domain, or of or of the recombinant construct / constructs into the target plant structure; (iv) Kultivieren der pflanzlichen Zielstruktur unter Bedingungen, welche die Aktivierung der eingeführten gRNA, Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne oder des bzw. der eingeführten rekombinanten Konstrukts/Konstrukte und dadurch eine gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur gestatten, um eine pflanzliche Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, die die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst, zu erhalten; (Iv) culturing the plant target structure under conditions permitting the activation of the introduced gRNA, Cas nuclease and / or the effector domain, or of or of the recombinant construct / constructs introduced and thereby a targeted modification of the nucleic acid-target region in the target plant structure allow to obtain at least one comprising meristematic cell comprising the targeted alteration of nucleic acid-target region, a plant target structure; (v) Gewinnen einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle, wobei die Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle direkt durch Zellteilung und Differenzierung und optional einer Fremdbefruchtung oder Selbstung aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle gewonnen wird, und wobei die gewonnene Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst. (V) obtaining a plant, plant material or a plant cell from the selectively modified at least a meristematic cell, wherein the plant, plant material or the plant cell targeted modified directly by cell division and differentiation, and, optionally, a cross-pollination or selfing of the at least one meristematic cell is obtained, and wherein the plant-derived, plant material or the plant cell comprises the selective modification of the nucleic acid-target region.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in der Pflanze, dem Pflanzenmaterial oder der pflanzlichen Zelle aus Schritt (v) das bzw. die rekombinanten) Konstrukt(e), welche (a) mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, oder (b) mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz umfassen, nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert werden/sind. The method of claim 1, wherein in the plant, the plant material or the plant cell of step (v) or recombinant) construct (s) comprising (a) at least one gRNA or a sequence encoding a gRNA sequence, or (b ) comprise at least one Cas nuclease or a sequence encoding a Cas nuclease sequence and / or at least one effector domain or a sequence coding for an effector domain sequence are not integrated chromosomally or extrachromosomally / are.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (ii) die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und/oder die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf die Anwendung in einer pflanzlichen Zelle hin angepasst sind. A method according to claim 1 or 2, wherein in step (ii) the gRNA or the gRNA coding sequence and / or the Cas nuclease or the Cas nuclease coding sequence and / or the effector domain, or for an effector domain coding sequence are adapted to use in a plant cell out.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zwischen Schritt (ii) und (iii) das Bereitstellen mindestens eines Vektors zur Einbringung des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte erfolgt. Process according to one of claims 1 to 3, wherein between step (ii) and (iii) is carried out providing at least one vector for introducing the recombinant construct or the / constructs.
  5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zwischen Schritt (ii) und (iii) das Bereitstellen mindestens eines weiteren rekombinanten Konstrukts umfassend einen rekombinanten Nukleinsäure-Abschnitt zur gezielten Homologie-gerichteten Reparatur der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur oder Insertion in die Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur und optional mindestens eines weiteren Vektors zur Einbringung des mindestens einen weiteren rekombinanten Konstrukts erfolgt. A method according to any of the preceding claims, wherein between step (ii) and (iii) providing at least one further recombinant construct comprising a recombinant nucleic acid segment for targeted homology-directed repair of the nucleic acid target region in the target plant structure or insertion into the nucleic acid occurs target region in the target plant structure and optionally at least one further vector for introducing the at least one further recombinant construct.
  6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die meristematische Zelle eine reife oder unreife pflanzliche Zelle eines pflanzlichen Embryos oder eines Keimlings oder einer Pflanze, umfassend mindestens eine meristematische Zelle oder meristematisches Gewebe, ist. A method according to any of the preceding claims, wherein the meristematic cell is a mature or immature plant cell of a plant embryo or seedling or a plant comprising at least one meristematic cell or meristematic tissue is.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die meristematische Zelle eine Zelle einer monokotyledonen oder einer dikotyledonen Pflanze ist. A method according to any one of claims 1 or 2 wherein the meristematic cell is a cell of a monocotyledonous or a dicotyledonous plant.
  8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Agrobacterium spp., einem Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, oder einem Agens, das zur Transfektion einer Peptid- oder Polypeptidsequenz oder von Nukleinsäuresequenzen geeignet ist, oder einer Kombination davon. A method according to any of the preceding claims, wherein the at least one vector is selected from the group consisting of Agrobacterium spp, a virus selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12-15. And 25-38, as well as sequences having at least 66% , 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to said sequences, or an agent which is suitable for transfection of a peptide or polypeptide sequence or nucleic acid sequences, or a combination thereof.
  9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die gRNA direkt als natürliche oder synthetische Nukleinsäure und/oder die Cas-Nuklease direkt als Polypeptid und/oder die Effektor-Domäne direkt als Nukleinsäure oder Polypeptid in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht wird. A method according to any of the preceding claims, wherein the gRNA is directly introduced as a natural or synthetic nucleic acid and / or the Cas nuclease directly as a polypeptide and / or the effector domain directly as a nucleic acid or polypeptide in the plant target structure.
  10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz oder die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz oder die Effektor-Domäne oder die die Effektor-Domäne kodierende Sequenz zusätzlich eine Lokalisationssequenz umfasst, ausgewählt aus einer Kernlokalisationssequenz, einer Plastidenlokalisationssequenz, vorzugsweise einer Mitochondrienlokalisationssequenz und einer Chloroplastenlokalisationssequenz. A method according to any of the preceding claims, wherein the gRNA or the gRNA coding sequence or the Cas nuclease or which additionally comprises Cas nuclease coding sequence or the effector domain or the effector domain coding sequence, a localization sequence, selected from a nuclear localization sequence, a Plastidenlokalisationssequenz, preferably a mitochondrial localization sequence and a Chloroplastenlokalisationssequenz.
  11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zusätzlich ein Inhibitor des endogen non-homologous end joining (NHEJ) Reperaturmechanismus in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht wird. A method according to any of the preceding claims, wherein additionally an inhibitor of the endogenous non-homologous end joining (NHEJ) repair mechanism is introduced in the target plant structure.
  12. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Konstrukt ausgewählt ist aus SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen. A method according to any of the preceding claims, wherein the recombinant construct is selected from SEQ ID NOs: 23 and 24, as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences.
  13. Pflanze, Pflanzenmaterial oder pflanzliche Zelle, erhältlich oder erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche. Plant, plant material or plant cell, obtainable or obtained by a method according to any one of the preceding claims.
  14. Rekombinantes Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu den vorgenannten Sequenzen. Recombinant construct comprising a nucleic acid selected from SEQ ID NOs: 23 and 24, as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to the aforementioned sequences.
  15. Verwendung mindestens eines rekombinanten Konstrukts gemäß Anspruch 14 oder eines Vektors, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen zur gezielten Veränderung mindestens einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst, wobei die mindestens eine meristematische Zelle mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst. Using at least one recombinant construct according to claim 14 or a vector comprising a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12-15 and 25-38, as well as sequences having at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence homology to these sequences for the targeted modification of at least one nucleic acid target region in a target plant structure which comprises at least a meristematic cell, wherein the at least one meristematic cell comprises at least one nucleic acid target region.
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