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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildgebung in der Mikroskopie, insbesondere zur Hochdurchsatzbildgebung, wobei eine Bildebene eines zu untersuchenden Objekts definiert wird, wobei mehrere Bilder mit Fokus auf die Bildebene des Objekts bei entlang einem vorgebbaren Weg in einer X-Y-Ebene bewegtem Objekt mittels einer Kamera durch ein Objektiv aufgenommen werden und wobei ein Zeitpunkt der Bildaufnahmen wegabhängig über ein Triggersignal mit Auslösung einer Blitzbeleuchtung gesteuert wird.
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Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Bildgebung in der Mikroskopie, insbesondere zur Hochdurchsatzbildgebung, mit einer Einrichtung zur Erfassung und Definition einer Bildebene eines zu untersuchenden Objekts, mit einer Kamera zur Aufnahme mehrerer Bilder durch ein Objektiv mit Fokus auf die Bildebene des Objekts, mit einer Bewegungseinrichtung zur Bewegung des Objekts während der Bildaufnahmen entlang einem vorgebbaren Weg in einer X-Y-Ebene und mit Mitteln zum wegabhängigen Steuern eines Zeitpunkts der Bildaufnahmen über ein eine Blitzbeleuchtung auslösendes Triggersignal.
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Bei bekannten Bildgebungsverfahren und -vorrichtungen sind aufgrund des geringen Sichtfelds eines Mikroskopobjektivs – je nach Vergrößerungszahl wenige Quadratmikrometer – für großflächige Objekte wie Zellkulturgefäße – einige Quadratzentimeter – tausende von Einzelaufnahmen notwendig, um die gesamte Fläche zu erfassen. Bei gängigen Verfahren erfolgt die Bildaufnahme sequenziell und bei ruhendem Objekt. Problematisch beim Mikroskopieren dieser großen Flächen ist damit die Tatsache, dass für jedes Einzelbild ein extra Positioniervorgang erforderlich ist. Nach jeder Bilderfassung muss das Objekt beschleunigt, verfahren und abgebremst werden – Stop-and-go-Verfahren. Für alle Aufnahmen aufaddiert, ergibt dies einen beträchtlichen Zeitbedarf.
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Hinzu kommt, dass insbesondere bei hohen Vergrößerungen der Bereich der Tiefenschärfe stark limitiert ist. Dieser liegt beispielsweise bei einem handelsüblichen 10-fach Objektiv bei etwa 8 µm. Bei der Mikroskopie großflächiger Bereiche, die aus vielen Einzelaufnahmen bestehen, kann es durch Formabweichungen der Objektoberfläche zu unfokussierten, unscharfen Abbildungen kommen. Insbesondere bei spritzgegossenen Zellkulturgefäßen wie Mikrotiterplatten aus Kunststoff ist der Plattenboden, auf dem adhärente Zellen wachsen, niemals komplett eben. Höhenabweichungen der Zellebene im Bereich von 200 µm und mehr sind aufgrund von Unebenheiten und Dickenabweichungen des Plattenbodens nicht ungewöhnlich. Um jeden Bereich der Platte scharf aufnehmen zu können, muss ständig nachfokussiert werden, was nach dem Stand der Technik eine zeitaufwändige Fokusmessung voraussetzt. Insbesondere bei hochvergrößernder Mikroskopierung von großen Flächen kann die Dauer des Messprozesses aufgrund der Fokusproblematik stark ansteigen.
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Insbesondere bei in vitro Zellkulturprozessen werden zunehmend Lösungen für eine 100% Qualitätsprüfung und eine Hochdurchsatz-Mikroskopie gesucht. Bei der großflächigen Erfassung im Stop-and-go-Verfahren von Zellkulturgefäßen mit Flüssigkeiten, v. a. Zellkulturmedien, verursachen die Beschleunigungen Schwankungen des Flüssigkeitsspiegels, die insbesondere bei Phasenkontrastaufnahmen die Bildgebung erheblich beinträchtigen und zu inhomogen beleuchteten Aufnahmen führen. Daher muss nach jeder Aufnahme ein gewisses Zeitintervall abgewartet werden, bis die Flüssigkeitsschwankungen für eine artefaktfreie Bildaufnahme ausreichend gedämpft sind. Bei Bildgebungen mit tausenden von Einzelaufnahmen wirkt sich dieser Effekt gravierend auf den Gesamtzeitbedarf der Messung aus.
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Werden großflächig mikroskopische Strukturen erfasst, fallen große Datenmengen an. So entsteht bei einer Mikroskopierung einer gesamten Mikrotiterplatte mit einem 10-fach Objektiv und einer 16bit Auflösung ein unkomprimiertes Datenvolumen von mehreren Gigabytes. Neben der Speicherung liegt die Herausforderung in einer geeigneten Darstellung der Daten.
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Der Hauptzeitbedarf ergibt sich aus der erforderlichen Probenpositionierung. Das Positionieren geschieht bei einigen modernen automatisierten Mikroskopen durch einen motorischen Kreuztisch, der die Probe schrittweise verfährt. An jeder Stelle der Mikrotiterplatte hält der Tisch an und über die Optik wird ein vergrößertes Bild mit einer digitalen Kamera aufgezeichnet, bevor die Platte zur nächsten Position bewegt wird. Dieser Vorgang wiederholt sich für jede Mikrotiterplatte tausende Male. Um die auftretenden Positionierungenauigkeiten auszugleichen, wird der Mikroskoptisch häufig kürzer verfahren als die Kantenlänge des Objektiv-Sichtfeldes, sodass die aufgenommen Bilder überlappen und anschließend über einen Stitching-Algorithmus vor dem Zusammensetzen genau zueinander positioniert werden können. Ein zusätzliches Blending sorgt in diesem Falle noch dafür, dass die Übergänge der Einzelbilder verschwimmen, indem eine Intensitätsanpassung erfolgt.
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Zur Bestimmung und Messung der Fokusposition sind zwei Kategorien von Fokusmessverfahren bekannt, nämlich auf Software und auf Hardware basierte Verfahren.
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Bei einem Software-Autofokusverfahren werden mehrere Aufnahmen einer Stelle bei variablem Objekt-zu-Objektiv-Abstand erstellt. Nach einem bestimmten Fokuskriterium werden das schärfste Bild und darüber der richtige Fokusabstand bestimmt. Dieses Prozedere funktioniert nur bei einem statischen Objekt und kann für eine Hochgeschwindigkeitsmikroskopie sinnvollerweise nur zur Messung einiger Stützstellen verwendet werden, aus denen dann mittels Interpolation eine Höhenkarte beispielsweise einer Platte berechnet wird. Diese konventionellen Fokusmessungen sind allerdings sehr zeitaufwändig. Von daher stellt ein solches Software-Autofokusverfahren allenfalls eine Notlösung für eine Hochgeschwindigkeitsmikroskopie dar. Zudem sind bei hohen Vergrößerungen die Abweichungen der interpolierten zur tatsächlichen Fokuslage größer als die Schärfentiefe des Objektivs, womit es zu unscharfen Aufnahmen kommt.
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Deutlich schneller und präziser arbeiten Hardware-Autofokuseinrichtungen, die auf Auswertung von Bildern durch Bildverarbeitung verzichten. Stattdessen wird ein physikalisches Messprinzip verwendet. Häufig wird ein nah-infraroter Laserstrahl auf die Probe gelenkt, zurückreflektiert und durch einen Optik auf einen bestimmten Bereich eines Zeilensensors gelenkt. Über die Auslenkung des Messstrahls auf dem Zeilensensor kann der Abstand des Objekts ermittelt und die Objektivposition entsprechend nachgeführt werden. Allerdings können derartige Autofokussensoren lediglich den ersten Rückreflex des untersuchten Objekts auswerten. Bei invers mikroskopierten Zellkulturgefäßen, bei denen die adhärenten Zellen auf der Oberseite des Plattenbodens haften, interessiert allerdings weniger die Unterseite der Platte als vielmehr die Oberseite, also von unten betrachtet die zweite Grenzfläche. Diese steht aufgrund der Unregelmäßigkeiten der Plattenbodenstärke auch nicht in einem festen Verhältnis zur Unterseite, sodass nicht einfach ein fester Offset-Wert hinzu addiert werden kann. Die am Markt verfügbaren Autofokus-Sensoren, die nach dem Prinzip des reflektierten Messstrahls arbeiten, sind außerdem nicht darauf ausgelegt, schnelle Fokusmessungen zu ermöglichen. Ihr primärer Einsatzzweck dient dem Erhalt einer statischen Fokusposition bei Langzeitexperimenten im Rahmen einer Temperaturdriftkompensation. Das gleiche trifft auf Sensoren zu, die nach dem Prinzip der Nah-Infrarot-Gitterprojektion auf die Probe arbeiten. Durch einen gekippten Sensor können die scharf abgebildeten Bereiche des zurückreflektierten Gitters ermittelt werden, worüber die Fokusposition nachgeregelt werden kann. Auch diese Art von Sensoren ermöglicht keine schnellen Fokusmessungen an unbekannten mehrschichtigen Präparaten, was für die schnelle Mikroskopie von Zellkulturgefäßen unabdingbar ist.
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Prinzipiell geeignet für die Abstandsmessung mehrschichtiger transparenter Präparate sind konfokal chromatische Sensoren. Durch den Effekt der chromatischen Aberration werden die Wellenlängenanteile einer Weißlichtquelle durch eine dispersive Sammellinse auf unterschiedliche Punkte fokussiert. Durch eine Lochblende und ein Spektrometer können die Wellenlängen des an den unterschiedlichen Grenzflächen zurückreflektierten Lichts ausgewertet und darüber der Objektabstand bestimmt werden. Allerdings lässt sich dieses Messprinzip schlecht zur Fokusmessung bei inversen Lichtmikroskopen verwenden, da eine Einkopplung in den Mikroskopstrahlengang aus zwei Gründen problematisch ist. Zum einen basiert das Messprinzip auf der chromatischen Aberration, also einem Farbfehler optischer Linsen, der gerade bei Mikroskopobjekiven weitestgehend korrigiert ist. Die verwendeten Weißlichtquellen arbeiten zudem im sichtbaren Wellenlängenbereich. Damit lassen sie sich nicht so elegant über dichroitische Filter ein- und auskoppeln, was Fokusmessungen parallel zu einer mikroskopischen Aufnahme erschwert.
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Aus der
US 6 798 571 B2 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bildgebung in der Mikroskopie bekannt, wobei eine Bildebene eines zu untersuchenden Objekts definiert wird. Dabei werden mehrere Bilder mit Fokus auf die Bildebene des Objekts bei entlang einem vorgebbaren Weg in einer X-Y-Ebene bewegtem Objekt mittels einer Kamera durch ein Objektiv aufgenommen. Ein Zeitpunkt der Bildaufnahmen wird wegabhängig über ein Triggersignal mit Auslösung einer Blitzbeleuchtung gesteuert. Eine gepulste Blitzbeleuchtung stoppt quasi optisch die Bewegung des bewegten Objekts, während eine kontinuierliche physikalische Bewegung des Objekts erfolgt.
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Des Weiteren ist aus der
WO 2011/064609 A2 ein Software basiertes Autofokusverfahren bekannt. Das bekannte Verfahren nutzt die Technik des interpolierten Fokussierens und ist kein Echtzeit-Verfahren.
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Zur automatischen Fokussierung eines Abbildungssystems auf eine Z-Position wird gemäß der
WO 2012/016753 A1 bei Vorliegen einer unbewegten ausgedehnten Probe ein interferometrisches Autofokusverfahren beschrieben.
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Bei dem gattungsgemäßen, aus der
US 6 798 571 B2 bekannten Verfahren und bei der hieraus bekannten Vorrichtung ist problematisch, dass eine Bildgebung mit hohem Durchsatz in der heutzutage oft erforderlichen Weise nicht möglich ist.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art derart auszugestalten und weiterzubilden, dass eine sichere Bildgebung bei besonders hohem möglichem Durchsatz an zu untersuchenden Objekten auf konstruktiv einfache Weise ermöglicht ist.
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Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe zum einen durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und zum anderen durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 11 gelöst.
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Danach ist das in Rede stehende Verfahren gemäß Anspruch 1 derart ausgestaltet und weitergebildet, dass für die Bildaufnahmen eine automatische Einstellung des Fokus auf die Bildebene auf der Grundlage interferometrisch in einer Z-Richtung gewonnener Z-Positionsswerte des Objekts und/oder der Bildebene erfolgt.
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Des Weiteren ist die in Rede stehende Vorrichtung gemäß Anspruch 11 durch eine bei den Bildaufnahmen auf der Grundlage interferometrisch in einer Z-Richtung gewonnener Z-Positionsswerte des Objekts und/oder der Bildebene wirkende Einrichtung zur automatischen Einstellung des Fokus auf die Bildebene gekennzeichnet.
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In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass es zur Realisierung eines besonders hohen Durchsatzes an zu untersuchenden Objekten bei einem jeweils bewegten Objekt erforderlich ist, eine besonders schnelle Fokussierung auf die definierte Bildebene bei jeder Bildaufnahme zu ermöglichen. In weiter erfindungsgemäßer Weise ist dann erkannt worden, dass für die Bildaufnahmen eine automatische Einstellung des Fokus auf die Bildebene auf der Grundlage interferometrisch gewonnener Daten besonders günstig ist. Ein derartiges interferometrisches Verfahren ermöglicht sehr schnelle Tiefenscans in einer Z-Richtung und die sehr schnelle Gewinnung entsprechender exakter Abstandswerte zwischen der definierten Bildebene oder dem Objekt und einem Objektiv. Auf Basis dieser Messwerte kann der Objekt-zu-Objektiv-Abstand sehr schnell nachgeregelt werden. Dies erfolgt so schnell, dass eine sehr hohe Frequenz der Blitzbeleuchtung mit entsprechenden Bildaufnahmen ermöglicht wird und sich das Objekt dabei stets innerhalb des Schärfentiefebereichs des Objektivs befindet. Im Ergebnis sind eine sehr exakte Fokussierung und sehr schnelle Abfolgen von Bildaufnahmen mit scharfen Bildern und damit eine sehr schnelle Untersuchung und Messung einzelner bewegter Objekte sowie ein hoher Durchsatz bei mehreren zu untersuchenden bewegten Objekten ermöglicht.
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Im Ergebnis sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine sichere Bildgebung bei besonders hohem Durchsatz an zu untersuchenden Objekten auf konstruktiv einfache Weise ermöglicht.
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Im Hinblick auf eine besonders schnelle und sichere Bildgebung kann die Einstellung des Fokus während oder unmittelbar vor den Bildaufnahmen erfolgen. In weiter vorteilhafter Weise kann die Einstellung des Fokus während oder unmittelbar vor jeder einzelnen Bildaufnahme erfolgen. Hierdurch ist ein besonders hohes Maß an sicherer Bildgebung bei exakter Fokussierung auf die Bildebene gewährleistet.
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Im Konkreten kann hierzu eine Messung einer Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene während oder unmittelbar vor den Bildaufnahmen, vorzugsweise während oder unmittelbar vor jeder einzelnen Bildaufnahme, erfolgen. Aus dieser Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene kann eine sichere Bestimmung der erforderlichen Fokusposition vorgenommen werden.
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Neben einer Messung der Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene und damit der Fokusposition der Bildebene während oder unmittelbar vor den Bildaufnahmen oder jeder einzelnen Bildaufnahme kann diese Messung der Fokusposition auch bereits länger vor den Bildaufnahmen eines Objekts oder eines definierten Bereichs eines Objekts erfolgen. Dabei können mehrere oder sämtliche erforderlichen Fokuspositionen der Bildebenen im Bereich einer größeren definierbaren Fläche des Objekts oder des gesamten Objekts gemessen werden.
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Die hierbei gemessenen Werte können in einer Fokusmap oder Fokusdatei abgespeichert werden. Auf der Basis einer derartigen Fokusmap oder Fokusdatei kann dann die Einstellung des Fokus erfolgen. Insoweit kann auch in diesem Fall die Einstellung des Fokus während oder unmittelbar vor den Bildaufnahmen erfolgen, wobei die Messung der entsprechenden Z-Positionswerte oder Fokuspositionen des Objekts und/oder der Bildebene zu einem früheren Zeitpunkt erfolgt ist. Beispielsweise kann dies bei Vorliegen von Mikrotiterplatten als Objektträger sinnvoll sein, da viele Mikrotiterplatten keine willkürlichen Schwankungen in der Dicke aufweisen, sondern hinsichtlich der Dickenschwankungen einem konkreten Muster folgen, das herstellungsbedingt sein kann.
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Zur Erstellung einer derartigen Fokusmap oder Fokusdatei kann eine Messung einer Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene durch eine Vorabmessung oder einen Vorabscan des gesamten Objekts oder eines das Objekt tragenden Tischs oder Objektträgers erfolgen.
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In vorteilhafter Weise kann die Einstellung des Fokus mit Hilfe einer Fokusmap oder Fokusdatei beschleunigt werden. Dabei kann die aus der Fokusmap oder Fokusdatei gewonnene Information verwendet werden, um beispielsweise einen Z-Trieb eines Mikroskops bereits vor der nächsten Bildaufnahme nachzufokussieren. Dabei könnte eine Art Vorabeinstellung der Z-Position erfolgen, wobei eine exakte Fokusmessung zusätzlich erfolgen sollte, um eine besonders sichere Bildgebung zu gewährleisten. Sollte das gleiche Objekt im gleichen Behältnis oder auf dem gleichen Träger mehrmals mikroskopiert werden, so kann eine während eines Mikroskopiervorgangs erstellte Fokusmap verwendet werden, um eine Fokusmessung bei den nachfolgenden Messungen ganz zu erübrigen.
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Zur Gewährleistung einer besonders sicheren Bildgebung kann die Messung der Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene und/oder die Gewinnung der Z-Positionswerte des Objekts und/oder der Bildebene mittels eines interferometrischen Verfahrens erfolgen, wobei vorzugsweise ein OCT-Verfahren oder ein FD-OCT-Verfahren zum Einsatz kommen kann. Grundsätzlich kann also die optische Kohärenztomografie eingesetzt werden und im bevorzugten konkreten Fall eine Messung nach dem Prinzip der Fourier-Domain optischen Kohärenztomografie.
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Zur Steigerung der Genauigkeit der Messung kann die Messung der Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene und/oder die Gewinnung der Z-Positionswerte des Objekts und/oder der Bildebene mit einer Wiederholrate von mehrfach pro Sekunde bis hin zu einigen 100 kHz, vorzugsweise bis zu 500 kHz, erfolgen. Dabei können die gewonnenen Messdaten gemittelt werden. Mit einem entsprechenden Algorithmus kann eine Messunsicherheit der Positionsbestimmung von etwa 0,1 μm erreicht werden.
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Bei einem konkreten Ausführungsbeispiel kann die Messung der Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene und/oder die Gewinnung der Z-Positionswerte des Objekts und/oder der Bildebene koaxial zur Bildaufnahme erfolgen. Mit anderen Worten verläuft ein Messstrahl einer entsprechenden Messeinrichtung koaxial zu einem Beleuchtungslichtstrahl durch dasselbe Objektiv eines geeigneten Mikroskops. Dies gewährleistet eine kompakte Bauweise eines Mikroskops und eine sichere Bildgebung.
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Zur sicheren Erfassung einer Z-Position bei stark unebenen Probenoberflächen kann zur Messung der Z-Position des Objekts und/oder der Bildebene und/oder zur Gewinnung der Z-Positionswerte des Objekts und/oder der Bildebene ein Messstrahl vervielfältigt werden. Zur Auswertung der hierbei erhaltenen Messwerte erfolgt üblicherweise eine Mittelung der Messsignale.
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Hinsichtlich einer besonders sicheren Bildgebung kann die Bewegung des Objekts während der Bildaufnahmen kontinuierlich erfolgen. Dabei ist von Bedeutung, dass diese kontinuierliche Bewegung insbesondere in Phasen der Bildaufnahme erfolgt.
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Im Hinblick auf eine sichere Aufnahme aus der Bewegung heraus auch bei Fluoreszenzaufnahmen kann die TDI-Kameratechnik verwendet werden. Dabei erfolgt eine zeitverzögerte Mehrfachbelichtung eines bewegten Objekts, wodurch eine wesentlich höhere Lichtempfindlichkeit als mit herkömmlichen Zeilen- oder Matrixkameras erreichbar ist.
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Im Hinblick auf einen besonders hohen Durchsatz an zu untersuchenden Objekten können Geometrien verschiedener Objekttypen erfasst und in einer Datenbank gespeichert werden. Hierdurch lassen sich spezifische geometrische Daten individueller Objektträger und Objekttypen verwenden, um beispielsweise Objektpositionen ohne manuelle Voreinstellungen ansteuern zu können.
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Zur Darstellung eines Messfortschritts während einer Messung kann ein komprimiertes Bild eines zuletzt gemessenen Bildsegments mittels eines geeigneten Algorithmus erstellt werden. Dies erleichtert das Verfolgen des Messvorgangs für einen Nutzer.
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Bei einem konkreten Ausführungsbeispiel kann die Kamera mittels eines Strahlteilers parallel zur Einkopplung eines Messsignals betrieben werden. Durch die Verwendung von dichroitischen Spiegeln lässt sich das Messsignal artefaktfrei von der Bildgebung trennen.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Anspruch 1 nachgeordneten Ansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen.
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1 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines Aufbaus einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bildgebung in der Mikroskopie und
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2 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bildgebung in der Mikroskopie am Beispiel einer 6-Well-Mikrotiterplatte.
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Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung umfasst ein Messsystem und ein Verfahren, das eine hochdurchsatzbasierte Mikroskopie mit einer Fokussierung einer beliebigen Bildebene ohne Zeitverlust ermöglicht. Die Einzigartigkeit des Verfahrens basiert dabei auf einem kontinuierlichen Messprozess aus der Bewegung in Kombination mit einem System zur interferometrischen Fokusdetektion und direkten Nachregelung. Dabei kann nicht nur, wie im Stand der Technik verbreitet, auf die erste Grenzschicht, sondern auf eine beliebige physikalische Grenzfläche des Proben- oder Objektsystems fokussiert werden. Durch einen modularen Ansatz und einheitliche Schnittstellen ist das System nahezu kompatibel zu jedem handelsüblichen Mikroskop, das sich so zu einem Hochdurchsatz-Gerät umwandeln lässt.
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Die Messstrategie basiert auf der Kombination eines optischen Systems zur Erfassung der Abbildungsebene oder Bildebene und vollautomatischen Regelung der Fokusposition sowie eines Verfahrens, das eine Bildgebung aus dem bewegten Objekt heraus ermöglicht. Diese Hochdurchsatzmethodik kann für die Funktionsmodi Hellfeld-, Phasenkontrast- sowie Fluoreszenzmessung angewendet werden. Um eine Erfassung der Bilddaten aus der Bewegung heraus ohne Bewegungsunschärfe zu ermöglichen, wird über ein wegsynchrones Triggersignal eine Blitzbeleuchtung im Mikrosekundenbereich ausgelöst. Die Bilderfassung kann mittels Zeilen- oder Matrixkameras erfolgen.
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1 zeigt hierzu einen schematischen Aufbau einer Vorrichtung zur Bildgebung in der Mikroskopie, wobei eine unebene Objektoberfläche 1 in Form beispielsweise adhärenter Zellen mit einem Medium untersucht wird. Die Bildebene verläuft damit entlang der Objektoberfläche 1. Zur Bewegung der Probe ist ein X-Y-Tisch-Achsensystem 2 vorgesehen. Ein Objektiv 3 fokussiert einen Messstrahl 4 zur Objektoberfläche 1 hin. Das zu untersuchende Objekt ist in einer Mikrotiterplatte, MTP, 5 aufgenommen. Die Vorrichtung weist eine Lichtquelle 6a für eine Fluoreszenzmessung und eine Lichtquelle 6b für eine Durchlichtmessung auf. Der Messstrahl 4 wird über eine Tubuslinse 7 und über einen dichroitischen Spiegel zum Objektiv 3 hin geleitet. Vor der Tubuslinse 7 ist ein C-Mount Strahlteiler 8 angeordnet, wobei der Strahlengang zur Kamera 9 und der Strahlengang der Strahleinkopplung 10 durch den C-Mount-Strahlteiler 8 verlaufen.
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Das in 1 gezeigte Ausführungsbeispiel weist des Weiteren ein System 11 zur Erfassung der Bildebene, eine Referenzsteuerung 12, eine Regelung 13 der Z-Achse 14 und eine Steuerung 15 in Form beispielsweise eines PC oder Controllers auf.
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Um das Konzept der Aufnahme aus der Bewegung heraus auch bei Fluoreszenzaufnahmen, die im Allgemeinen höhere Belichtungszeiten benötigen, anwenden zu können, kann die TDI – time delay and integration – Kameratechnik zum Einsatz kommen. Das TDI-Prinzip basiert auf einer zeitverzögerten Mehrfachbelichtung eines bewegten Objekts und ermöglicht dadurch eine wesentlich höhere Lichtempfindlichkeit als sie mit herkömmlichen Zeilen- oder Matrixkameras erreichbar ist.
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Neben der Erfassung von Messdaten über die gesamte Objektgröße können über Usereigaben oder Systemvorgaben definierte Bereiche, z.B. im Fall von MTPs nur bestimmte Einzelwells, ausgewählt werden. Weiter ist es auch möglich, durch den User definierte Bereiche, Region of Interests, ROI, zu definieren. Die Reduktion der Messaufgabe auf nur selektierte Bereiche ermöglicht eine deutliche Effizienzsteigerung.
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Unterschiedliche Plattenkonfigurationen, z.B. 6 Well oder 24 Well, werden in einer Nutzerdatenbank gespeichert. Zum Einkalibrieren neuer Objekttypen, kann ein schneller Scan des gesamten Messbereiches zur Erfassung der Objektgeometrie erfolgen. Über geeignete Bildverarbeitungsalgorithmen wird die vorliegende Plattengeometrie erkannt und für jedes Well oder für jeden Slide markante Koordinaten gespeichert. Dieses Verfahren ermöglicht eine maximale Benutzerfreundlichkeit ohne manuelles Einkalibrieren der Objektpositionen.
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Sobald der Messprozess ausgelöst wird, werden aus den zuvor definierten Messbereichen die Positionen für die Bildtrigger und die Achspositionen berechnet. Ein Algorithmus entscheidet dabei, in welcher Achsenorientierung, ob in x- oder y-Ausrichtung, der kontinuierliche Scan erfolgt. Neben der Berechnung von Start und Endpunkt der Messungen wird für jede Zeile vor und nach den Positionen ein Offset definiert, der ein Anfahren und Abstoppen der Objekte außerhalb des aufgenommenen Bereichs ermöglicht. Dadurch können Bildartefakte durch Flüssigkeitsschwankungen minimiert werden. Der Messprozess erfolgt mäanderförmig über die zuvor definierten Bereiche. Dadurch werden Tischbewegungen, bei denen nicht mikroskopiert wird, minimiert.
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2 zeigt in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines Verfahrens zur Bildgebung in der Mikroskopie gemäß der Erfindung. 2 zeigt ein Messobjekt 16 in Form einer Mikrotiterplatte mit 6 Wells 17. Selektierte Messbereiche 18 weisen Bildfelder 19 auf. Ausgehend von einer Startposition 20 erfolgt gemäß der Bezugsziffer 21 ein mäanderförmiges Abscannen des Messbereichs 18. Dabei liegt zunächst eine Beschleunigungsphase 22 vor. Anschließend erfolgt eine Messphase 23 mit konstanter Geschwindigkeit, gefolgt von einer Abbremsphase 24. Ein wegsynchroner Trigger 25 dient der Auslösung der Blitzbeleuchtung sowie der Kamera für die Bildaufnahme.
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Beim Messprozess fahren die Achsen zunächst auf eine Startposition 20. Anschließend erfolgt eine Beschleunigungsphase 22. In einem dritten Bereich verfährt das Achssystem bei kontinuierlich geregeltem Z-Fokus mit einer konstanten Geschwindigkeit und löst über einen wegsynchronen Trigger 25 ein Blitzlicht gekoppelt mit einer Datenerfassung der Kamera aus. Die erfassten Daten werden chronologisch in einem Speicher – Datenbank oder Arbeitsspeicher – zur späteren Prozessierung abgespeichert. Um den Messfortschritt darzustellen, extrahiert ein Algorithmus ein komprimiertes Bild des zuletzt gemessenen Bildsegmentes und stellt es auf dem Bildschirm an der letzten Messposition dar.
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Nach dem Messprozess erfolgt die Zusammensetzung – auch Stitching genannt – der Bildsegmente, mit oder ohne Überlappung. Anschließend lassen sich Teilsegmente, z.B. Einzelwells, abspeichern.
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Ein zentrales Element des Ausführungsbeispiels dieser Erfindung ist die Kombination der Bildgebung aus der Bewegung mit einem System zur Erfassung der Bildebene, gekoppelt mit einer aktiven Regelung der Fokusebene. Dieses System arbeitet unabhängig vom Messprozess und regelt kontinuierlich in Echtzeit die Fokusebene. Das optische Messsystem arbeitet koaxial und ermöglicht die Detektion von Reflexionen aus dem Objektstrahlengang. Durch diese absolute Abstandsmessung ist es möglich, dass der Nutzer eine beliebige Ebene definiert, die bei Veränderung der Höhenposition verfolgt wird.
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Das modulare System zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass eine Verwendung mit nahezu jedem gängigen Mikroskop möglich ist. Dabei erfolgt die Einkopplung des Messsignals über dichroitische Spiegel in den optischen Strahlengang, entweder in der Unendlich-Ebene zwischen Objektiv und Tubuslinse oder über den C-Mount Kamera-Port. In Form eines Zwei-Wege-Splitters kann die Kamera parallel zur Einkopplung des Messsignals betrieben werden. Durch die Verwendung von dichroitischen Spiegeln lässt sich artefaktfrei das Messsignal von der Bildgebung trennen.
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Der Sensor zur Erfassung der Bildebene ist ein höchst sensitives, echtzeitfähiges und ohne bewegte Teile arbeitendes Messsystem, das sich in den Strahlengang von Lichtmikroskopen einkoppeln lässt und Fokusmessungen mehrschichtiger Präparate durch das Objektiv hindurch ermöglicht.
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Der Sensor arbeitet nach dem Prinzip der Fourier-Domain optischen Kohärenztomografie, FD-OCT. Dabei wird ein hochauflösendes Tiefenprofil des zurückgestreuten Lichtechos gemessen. Die hohe Messgeschwindigkeit von einigen Messungen in der Sekunde bis einige 100 kHz ermöglicht Inline Messungen. Den Kern des Systems bildet ein hochauflösendes Spektrometer, welches die spektral kodierte Tiefeninformation auswertet. Die Signalverarbeitung der Roh-Daten erfolgt in Echtzeit, wobei ein Grafikprozessor als Co-Prozessor benutzt werden kann. Bei der Vermessung handelsüblicher Mikrotiterplatten sind im Signal die beiden ersten Grenzschichten – Luft-Kunststoff und Kunststoff-Medium/Zellen – deutlich zu erkennen.
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Die Fokuspositionen für die gesamte MTP können wie beschrieben simultan während des kontinuierlichen Mikroskopievorgangs oder alternativ durch einen sehr schnellen Vorabscan des Tisches gewonnen werden.
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Um unterschiedliche optische Weglängen bei einem Objektivwechsel kompensieren zu können, enthält die Referenzstrecke eine motorisierte Achse. Um eine kompakte Bauweise zu erreichen, werden für Referenz- und Messstrecke unterschiedliche Faserlängen verwendet.
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Zur Steigerung der Genauigkeit erfolgt die Messroutine mehrfach pro Sekunde bis hin zu einigen 100 kHz. Dabei werden die gewonnenen Messdaten gemittelt. Die Messroutine umfasst einen Peakfit, der eine Subpixelgenauigkeit ermöglicht. Mit diesem Algorithmus wird eine Messunsicherheit der Positionsbestimmung von ca. 0,1 µm erreicht. Diese Genauigkeit reicht aus, um selbst bei einem 100x Objektiv mit dem Piezo-Tisch exakt nachfokussieren zu können.
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Um bei stark unebenen Probenoberflächen die Position genau erfassen zu können, kann über ein DMD, Digital Micromirror Device, einen SLM, Spatial Light Modulator, einen Mehrfachstrahlteiler oder eine entsprechende diffraktive Optik der Messstrahl vervielfältigt werden. Zur Auswertung der Messdaten erfolgt eine Mittelung der Messsignale. Reicht in begrenzten Bereichen der Probe die Messung über das optische System nicht aus, werden lokal durch einen Algorithmus automatisch Bilddaten für mehrere z-Positionen aufgenommen – dynamic auto stacking.
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Für den Fall, dass in der Bewegung des Messobjektes die reflektierende Schicht verschwindet, z.B. zwischen den Wells bei vielen gängigen MTPs, detektiert ein Algorithmus diese Änderung im Signal und hält den Fokus konstant, bis wieder ein Messsignal detektiert wird.
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Neben der digitalen Verarbeitung der Messdaten kann der Abstandswert in einer abstandsproportionalen Analogspannung ausgegeben werden. Eine aktive Regelung der Z-Position erfolgt über verschiedende Verfahreinrichtungen, beispielsweise Piezoachse, integrierter Z-Trieb, nachrüstbare Motorisierung der Z-Achse.
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Beim kontinuierlichen Abscannen von MTPs wird für jedes Bildfeld die Fokuslage bestimmt, daher generiert sich nach und nach eine Fokusmap der zu vermessenden MTP. Viele MTPs haben keine willkürlichen Schwankungen in der Dicke, sondern die Dickenschwankungen folgen einem konkreten Muster. Dieses Muster kann verwendet werden, um den Fokussiervorgang zu beschleunigen. Ein intelligenter Algorithmus erkennt die Muster z.B. in einer MTP und nutzt die gewonnene Information dazu, den Z-Trieb bereits vor der nächsten Messung nachzufokussieren. Dieser Vorgang kann die Fokusmessung nicht ersetzten, ist aber hilfreich, um z.B. unscharfe Bilder an sich wiederholenden Unstetigkeitsstellen in einer MTP zu vermeiden, die sonst durch die Trägheit des Z-Triebes entstehen würden. Die während des Mikroskopievorgangs erstellte Fokusmap kann zusätzlich genutzt werden, um das Fokussieren zu erübrigen, sollte der Benutzer die gleiche Probe im gleichen Behältnis mehrmals mikroskopieren.
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Eine weitere Möglichkeit, den Fokus aktiv während der Mikroskopie-Aufnahme besser nachregeln zu können, ist es den Messtrahl des Fokussensors an unterschiedlichen Positionen im Bildfeld zu positionieren. Sinnvoll ist es, die Fokusmessung um einige Mikrometer bis Millimeter – je nach Größe des Bildfeldes – in Richtung der Fahrtrichtung des Tisches zu verschieben. Dadurch kann die Fokusmessung bereits vor der nächsten Bildaufnahme erfolgen. Damit ist gewährleistet, dass der Z-Trieb genügend Zeit zum Nachfokussieren hat. Die Positionierung des Messstrahls kann durch Galvospiegel, MEMS-Spiegel, SLM, DMD und Polygonspiegel erfolgen. Ein Zylinderspiegel im Strahlengang ermöglicht es ebenfalls, den Messstrahl abzulenken. Die Zylindrizität bewirkt dabei, dass je nach Drehung des Spiegels, der Messstrahl in eine andere Richtung abgelenkt wird – je nach Fahrtrichtung des Tisches.
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Das System ist so modular gestaltet, dass es kompatibel zu den gängigen Mikroskopen ist. Alle Algorithmen sowie die Ansteuerung der Geräte und Module erfolgen über ein integriertes System mit einem Embedded Board. Die Erfassung der Bildebene wird durch ein autarkes Modul als ein selbstregulierendes System durchgeführt. Die gewonnen Bilddaten werden in einer Datenbank abgespeichert. Das Betrachten der Daten kann optional durch einen Multiresolution Viewer durchgeführt werden. Um eine maximale Flexibilität zu erreichen, lässt sich das System in Form eines Plug-in in die weit verbreitete Steuerungssoftware für Mikroskope, µ-Manager, einbinden. Durch die Kombination mit automatisierten Probenbeladungslösungen lassen sich so vollautomatisierte Hochdurchsatzanwendungen umsetzen.
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Über das direkt in den Strahlengang eingekoppelte nahinfrarote Fokusmesssignal kann in Sekundenbruchteilen durch Auswertung der Lichtreflexe ein Abstandswert zur Fokusebene ermittelt werden. Der Vorteil dieses schnellen Autofokus-Messsystems liegt darin, Proben in der Bewegung in der Fokusebene des Objektivs zu mikroskopieren, indem der Objekt-zu-Objektiv-Abstand kontinuierlich nachgeregelt wird. Während eines Messprozesses kann so eine Fokuskorrektur in Echtzeit ohne Fokuspunkte, die vorab erfasst werden müssen, durchgeführt werden.
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Das Hochdurchsatz-Mikroskopieren basiert auf einer exakten Synchronisation der Tischbewegung – in allen drei Raumrichtungen – mit einer Kamera, beispielsweise Flächen oder Zeilenkamera, ggf. nach TDI Prinzip, einer Blitzbeleuchtung sowie einer echtzeitfähigen Autofokusmessung.
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Die wegsynchron getriggerte Blitzbeleuchtung im Mikrosekundenbereich vermeidet dabei sämtliche Bewegungsunschärfe. Die Fokusmessung erfolgt durch das beschriebene interferometrische Messprinzip, wobei der nahinfrarote Messstrahl in das Mikroskop eingekoppelt wird und durch das Objektiv hindurch absolute Abstandsmessungen an mehrschichtigen Präparaten erlaubt. Das Nachfokussieren in Z-Richtung wird durch einen Piezo-Einsatz oder den integrierten Z-Trieb realisiert, über den die Entfernung des Objekts zum Objektiv variiert wird.
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Durch die Erfindung profitieren generell Anwendungsgebiete, in denen mikroskopische Hochdurchsatzverfahren eingesetzt werden. Alternativ lässt sich dieses Verfahren auch in klassischen Laborgeräten einsetzten.
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In der Labortechnik und in der Pathologie wäre es möglich, in einem hohen Durchsatz Histologien und Slides zu digitalisieren. Insbesondere in der Kombination mit einem automatisierten Beladesystem lassen sich große Mengen an Slides und Histologien in kürzester Zeit digitalisieren und so Kosten sparen.
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Von dieser Art der Mikroskopie profitiert im Bereich der Zellkultur insbesondere die automatisierte Zellproduktion. In solchen Produktionsszenarien besteht oft die Notwendigkeit, hunderte von Mikrotiterplatten tagtäglich für die Prozesskontrolle und steuerung zu mikroskopieren. Hier stößt herkömmliche Mikroskopie aufgrund des Zeitbedarfs pro Platte an ihre Grenzen. Aber auch im Bereich der manuellen Zellkultur ist es vorteilhaft, Zellen in kurzer Zeit zu mikroskopieren, sodass sie möglichst kurzzeitig außerhalb des Inkubators mit idealen Wachstumsbedingungen –37° C und 5% CO2 – lagern.
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Neben dem Mikroskopieren von Zellen in Zellkulturgefäßen kann die entwickelte Hochdurchsatzmikroskopie auch in anderen Bereichen wie der Materialwissenschaft oder der Qualitätskontrolle im Halbleiterbereich ganz neue Möglichkeiten eröffnen.
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Im Bereich der industriellen Mikroskopie kann so eine 100%-Prüfung realisiert werden.
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Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Ansprüche verwiesen.
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Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Objektoberfläche
- 2
- X-Y-Tisch-Achsensystem
- 3
- Objektiv
- 4
- Messstrahl
- 5
- Mikrotiterplatte
- 6a
- Fluoreszenzlichtquelle
- 6b
- Duchlichtlichtquelle
- 7
- Tubuslinse
- 8
- C-Mount-Strahlteiler
- 9
- Kamera
- 10
- Strahleinkopplung
- 11
- System zur Erfassung der Bildebene
- 12
- Referenzsteuerung
- 13
- Regelung der Z-Achse
- 14
- Z-Achse
- 15
- Steuerung
- 16
- Messobjekt
- 17
- Well
- 18
- Messbereiche
- 19
- Bildfelder
- 20
- Startposition
- 21
- mäanderförmiges Abscannen
- 22
- Beschleunigungsphase
- 23
- Messphase mit konstanter Geschwindigkeit
- 24
- Abbremsphase
- 25
- wegsynchroner Trigger
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- US 6798571 B2 [0012, 0015]
- WO 2011/064609 A2 [0013]
- WO 2012/016753 A1 [0014]
