DE102014205098A1

DE102014205098A1 - Method and means for detecting a dengue virus infection

Info

Publication number: DE102014205098A1
Application number: DE102014205098.7A
Authority: DE
Inventors: Sven Reiche; Christian Christian Jassoy; Awadalkareem Mohammed Adam
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2015-09-24
Anticipated expiration: 2034-03-20
Also published as: DE102014205098B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion sowie dessen Verwendungen. Das erfindungsgemäße Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion umfasst den Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe. Ein erfindungsgemäßer diagnostischer Kit zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe umfasst Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder Proteinfragmente davon und Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Mitteln zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion und die Verwendung von Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion.The invention relates to a method and means for the specific detection of a dengue virus infection and its uses. The method according to the invention for the specific detection of a dengue virus infection comprises the detection of antibodies against non-structural protein 2A from dengue virus from a biological sample. A diagnostic kit according to the invention for detecting a dengue virus infection from a biological sample comprises non-structural protein 2A from dengue virus or protein fragments thereof and means for detecting IgG or IgM antibodies from a biological sample. The invention also encompasses the use of means to detect dengue virus non-structural protein 2A for specific detection of dengue virus infection and the use of dengue virus non-structural protein 2A for specific detection of dengue virus infection.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion sowie dessen Verwendungen. Die Erfindung findet Anwendung in der medizinischen Diagnostik.The invention relates to a method and means for the specific detection of a dengue virus infection and its uses. The invention finds application in medical diagnostics.

Dengue ist eine durch Stechmücken übertragene tropische Krankheit, die durch ein 1951 isoliertes Virus verursacht wird. Das Denguevirus wurde in vier unterschiedliche antigene Typen eingeteilt, die als Typen 1 bis 4 bezeichnet werden. Das Denguevirus gehört zur Familie der Flaviviridae, Gattung Flavivirus. Eine Infektion mit Denguevirus verursacht eine fieberhafte Erkrankung mit Abgeschlagenheit, Gliederschmerzen und anderen Symptomen, das sogenannte Denguefieber. Gelegentlich kommt es zu schweren hämorrhagischen Verläufen mit Blutungen auf Haut und Schleimhäuten sowie in inneren Organen, die tödlich verlaufen können. Eine Infektion mit einem der Virustypen erzeugt eine lebenslange Immunität gegen diesen Virustyp. Es ist jedoch eine mehrmalige Erkrankung aufgrund unterschiedlicher Virustypen möglich. Dengue is a mosquito-borne tropical disease caused by a virus isolated in 1951. The dengue virus has been classified into four different antigenic types, referred to as types 1 to 4. The dengue virus belongs to the family of Flaviviridae, genus Flavivirus. An infection with dengue virus causes a feverish illness with fatigue, body aches and other symptoms, the so-called dengue fever. Occasionally, severe hemorrhagic events occur with bleeding on skin and mucous membranes, as well as internal organs that can be fatal. Infection with one of the virus types creates a lifelong immunity to this type of virus. However, a multiple disease due to different virus types is possible.

Das Denguefieber hat keine typische Symptomatik. Neben dem Denguevirus gibt es mehrere verwandte Viren, die ähnliche Krankheitssymptome hervorrufen können, ebenfalls durch Stechmücken übertragen werden und deren Verbreitungsgebiete mit dem des Denguevirus überlappen [1, 2]. Hierzu zählen andere Viren der Gattung Flavivirus, wie u.a. das Japanische-Enzephalitis-Virus, das Gelbfiebervirus und das West-Nil-Virus.Dengue fever has no typical symptoms. In addition to the dengue virus, there are several related viruses that can cause similar disease symptoms, are also transmitted by mosquitoes and their distribution areas overlap with that of the dengue virus [1, 2]. These include other viruses of the genus Flavivirus, such as u.a. Japanese Encephalitis Virus, Yellow Fever Virus and West Nile Virus.

Es ist somit aufgrund von Symptomen und klinischen Untersuchungen nicht möglich, eine eindeutige Diagnose einer Denguevirus-Infektion zu stellen. Dafür ist eine labordiagnostische Untersuchung erforderlich. In den ersten fünf Tagen nach Infektion ist die verlässlichste Methode der Nachweis von Denguevirus-Nukleinsäuren mit der Polymerase-Kettenreaktion oder von Denguevirus-Antigenen in immunologischen Tests. In den folgenden Krankheitstagen nimmt die Diagnosemöglichkeit mit diesen Tests ab, weil die Konzentration an Virus im Körper der Erkrankten abnimmt. Gleichzeitig nimmt die Konzentration von IgM und IgG-Antikörpern gegen das Virus im Blut zu. Thus, due to symptoms and clinical investigations, it is not possible to provide a clear diagnosis of dengue virus infection. This requires a laboratory diagnostic examination. In the first five days of infection, the most reliable method of detecting dengue virus nucleic acids using the polymerase chain reaction or dengue virus antigens is in immunological assays. In the following disease days, the diagnostic option decreases with these tests because the concentration of virus in the body of the patients decreases. At the same time, the concentration of IgM and IgG antibodies to the virus in the blood increases.

In Blutproben von Patienten werden daher als diagnostische Marker im frühen Stadium einer akuten Denguevirus-Infektion entweder Denguevirus-Nukleinsäuren in der Polymerase-Kettenreaktion oder Denguevirusantigene getestet, im späteren Stadium werden IgM-Antikörper gegen das Denguevirus in einfachen immunologischen Tests untersucht. Im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen zur Erfassung von Bevölkerungsteilen, die bereits eine Denguevirus-Infektion durchlaufen haben, werden IgG-Antikörper gegen das Denguevirus in Blutproben des Patienten untersucht. Therefore, in blood samples from patients, either Dengue virus nucleic acids in the polymerase chain reaction or dengue virus antigens are tested as diagnostic markers in the early stage of an acute dengue virus infection, and later IgM antibodies to the dengue virus are examined in simple immunological tests. In epidemiological surveys to survey populations that have already undergone dengue virus infection, IgG antibodies to the dengue virus are being examined in blood samples from the patient.

In etablierten Tests auf Antikörper gegen das Denguevirus werden Lysate des Denguevirus als Testantigen eingesetzt und die im Blut befindlichen Antikörper gegen das Dengevirus mit einem ELISA-Verfahren nachgewiesen. Zur Herstellung von Dengueviruslysaten wird das Virus im Speziallabor unter S3-Bedingungen herangezogen. Aufgrund des hohen Aufwands dieser Herstellungsmethode ist es wünschenswert, Viruslysate durch günstiger herzustellende Antigene zu ersetzen. Wichtiger ist noch, dass aufgrund der engen strukturellen Verwandtschaft des Denguevirus zu anderen Flaviviren unspezifische Reaktionen häufig sind, so dass eine Unterscheidung zwischen einer Erkrankung mit dem Denguevirus oder einem verwandten Virus in Fällen, in denen Viruslysat eingesetzt wird, nicht möglich ist. In established tests for antibodies against the dengue virus, lysates of the dengue virus are used as the test antigen and the antibodies in the blood against the dengue virus are detected by an ELISA method. For the production of dengue virus lysates, the virus is used in the special laboratory under S3 conditions. Due to the high expense of this method of preparation, it is desirable to replace viral lysates with cheaper antigens. More importantly, because of the close structural relationship of the dengue virus to other flaviviruses, non-specific responses are common, so that it is not possible to distinguish between a dengue virus or a related virus in cases where virus lysate is used.

Weitere Tests zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion basieren auf dem Einsatz einzelner Proteine des Denguevirus als Testantigen. Es sind Verfahren bekannt, in denen das Hüllglykoprotein des Denguevirus (envelope-Glykoprotein, E), das Nichtstrukturprotein 1 des Denguevirus (NS1) oder auch eine Kombination aus Hüllglykoprotein, Nichtstrukturprotein 1 und Nichtstrukturprotein 3 des Denguevirus (E, NS1, NS3) zum Nachweis des Denguevirus eingesetzt werden ( EP 1 190 257 B1 , [3, 4, 5]). Problematisch ist dabei, dass nicht alle Seren mit den Testantigenen reagieren und dadurch im Rahmen der Tests falsch negative Ergebnise zu erwarten sind. In einer Denguevirus-Studie [6] wurde beobachtet, dass das Hüllglykoprotein des Denguevirus in 94 % der Fälle erkannt wurde, das Nichtstrukturprotein 1 des Denguevirus in 40 % der Fälle, das Nichtstrukturprotein 3 lediglich in 26 % der Fälle. Further tests to detect a dengue virus infection are based on the use of individual proteins of the dengue virus as the test antigen. There are known methods in which the envelope glycoprotein of the dengue virus (envelope glycoprotein, E), dengue virus non-structural protein 1 (NS1) or else a combination of envelope glycoprotein, nonstructural protein 1 and dengue virus 3 (D, NS1, NS3) for detection of the dengue virus ( EP 1 190 257 B1 , [3, 4, 5]). The problem with this is that not all sera react with the test antigens and thus false negative results are to be expected in the context of the tests. In a dengue virus study [6] it was observed that the envelope glycoprotein of the dengue virus was detected in 94% of the cases, the dengue virus non-structural protein 1 in 40% of cases, the nonstructural protein 3 only in 26% of cases.

Es besteht somit weiterhin Bedarf, Testverfahren und Mittel zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion bereitzustellen, mit denen spezifisch eine Denguevirus-Infektion von einer Infektion mit anderen Flaviviren unterschieden werden kann. Gleichzeitig sollte die Denguevirus-Infektion bei hoher Sensitiviät und geringstmöglicher Falsch-Negativ- sowie Falsch-Positiv-Rate in einem einfachen Testverfahren nachgewiesen werden.Thus, there continues to be a need to provide test methods and means for detecting dengue virus infection that specifically discriminate dengue virus infection from infection with other flaviviruses. At the same time, the dengue virus infection should be detected at a high sensitivity and lowest possible false-negative as well as false-positive rate in a simple test procedure.

Die Aufgabe der Erfindung liegt daher in der Bereitstellung von verbesserten Verfahren und Mitteln zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion in Patientenproben. The object of the invention is therefore to provide improved methods and means for detecting dengue virus infection in patient samples.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion, umfassend den Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe. The object is achieved according to the invention by a method for the specific detection of a dengue virus infection, comprising the detection of antibodies against nonstructural protein 2A from dengue virus from a biological sample.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein diagnostischer Kit zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe. Erfindungsgemäß umfasst der diagnostische Kit:

– Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder Proteinfragmente davon und
– Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe.

Another aspect of the invention is a diagnostic kit for detecting a dengue virus infection from a biological sample. According to the invention, the diagnostic kit comprises:

Non-structural protein 2A from dengue virus or protein fragments thereof and
- Means for the detection of IgG or IgM antibodies from a biological sample.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Mitteln zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion. The invention also encompasses the use of means to detect dengue virus non-structural protein 2A for specific detection of dengue virus infection.

Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung von Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion.Further, the invention encompasses the use of dengue virus non-structural protein 2A for the specific detection of dengue virus infection.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist die Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion.Also included within the invention is the use of a method for detecting dengue virus non-structural protein 2A for specific detection of dengue virus infection.

Die Erfindung beruht auf der Beobachtung der Erfinder, dass der Nachweis einer Denguevirus-Infektion aufgrund von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A (hierin auch als „NS2A“ bezeichnet) eine sehr gute Unterscheidung des Denguevirus von anderen Flaviviren ermöglicht. Dies ist damit zu begründen, dass von allen Proteinen des Denguevirus Nichtstrukturprotein 2A die meisten strukturellen Unterschiede zu Proteinen anderer Flaviviren, insbesondere zu Proteinen aus Japanischem-Enzephalitis-Virus, Gelbfiebervirus und West-Nil-Virus, aufweist (vgl. Tabelle 2 in Ausführungsbeispiel 2). Damit werden mit der Erfindung unspezifische Reaktionen mit Seren von Patienten, die mit einem der vorgenannten anderen Flaviviren infiziert sind, im Vergleich zu bisherigen Nachweisverfahren, in denen andere Denguevirus-Proteine als Testantigen eingesetzt werden, minimiert. Aufgrund der Verwendung von NS2A als Testantigen im Vergleich zu anderen Denguevirus-Proteinen kann somit eine höhere Spezifität des Testverfahrens erzielt werden. The invention is based on the observation of the inventors that the detection of dengue virus infection due to antibodies to non-structural protein 2A (also referred to herein as "NS2A") allows a very good discrimination of dengue virus from other flaviviruses. This can be explained by the fact that of all the proteins of the dengue virus non-structural protein 2A has the most structural differences to proteins of other flaviviruses, in particular to proteins from Japanese encephalitis virus, yellow fever virus and West Nile virus (see Table 2 in Example 2 ). Thus, with the invention nonspecific reactions are minimized with sera from patients infected with one of the aforementioned other flaviviruses compared to previous detection methods in which other dengue virus proteins are used as the test antigen. Due to the use of NS2A as a test antigen in comparison to other dengue virus proteins, a higher specificity of the test method can thus be achieved.

Für einen zuverlässigen Nachweis der Denguevirus-Infektion ist nicht nur erforderlich, dass unspezifische Reaktionen mit Seren von Patienten vermieden werden, die Infektionen mit anderen Flaviviren haben. Es ist zudem wichtig, unspezifische Reaktionen zwischen dem Testantigen und Antikörpern aus Proben von Nichtinfizierten zu vermeiden, um keine falsch positiven Ergebnisse zu erhalten. Die Erfinder konnten demonstrieren, dass NS2A als Testantigen zu keinen unspezifischen Reaktionen mit Seren von Personen führt, die nicht akut mit Denguevirus infiziert sind bzw. die Infektion bereits durchlaufen haben. Dadurch wird mit der Erfindung eine geringe Falsch-Positiv-Rate ermöglicht (2). Reliable detection of dengue virus infection not only requires avoiding nonspecific reactions with sera from patients who have infections with other flaviviruses. It is also important to avoid nonspecific reactions between the test antigen and antibodies from samples of non-infected persons in order to avoid false-positive results. The inventors were able to demonstrate that NS2A as a test antigen does not lead to non-specific reactions with sera of persons who are not acutely infected with dengue virus or have already passed through the infection. As a result, the invention allows a low false positive rate ( 2 ).

Ferner wurde überraschend festgestellt, dass in allen von den Erfindern getesteten Blutproben von Dengevirus-Infizierten Antikörper gegen NS2A nachweisbar waren. Dies war nicht zu erwarten, da für andere Denguevirus-Proteine (insbesondere das Hüllglykoprotein und die Nichtstrukturproteine 1 und 3) bekannt ist, dass nicht alle Infizierten Antikörper gegen das jeweilige Protein ausbilden [6]. Dadurch wird mit der Erfindung der Nachweis der Denguevirus-Infektion mit besonders geringer Falsch-Negativ-Rate möglich.Further, it was surprisingly found that antibodies to NS2A were detectable in all of the blood samples of dengue virus infected tested by the inventors. This was not to be expected since it is known for other dengue virus proteins (in particular the envelope glycoprotein and the nonstructural proteins 1 and 3) that not all infected antibodies form antibodies against the respective protein [6]. As a result, the detection of the dengue virus infection with a particularly low false-negative rate is possible with the invention.

Nichtstrukturprotein 2A wird in der Literatur auch als nichtstrukturelles Glykoprotein 2A bezeichnet. Nichtstrukturproteine 2A der einzelnen Virustypen 1 bis 4 von Denguevirus unterscheiden sich in ihrer Aminosäuresequenz. Bekannte Aminosäuresequenzen für Nichtstrukturprotein 2A aus den Denguevirustypen 1 bis 4 (DENV1 bis DENV4) sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1

Non-structural protein 2A is also referred to in the literature as non-structural glycoprotein 2A. Nonstructural proteins 2A of the individual virus types 1 to 4 of dengue virus differ in their amino acid sequence. Known amino acid sequences for nonstructural protein 2A from dengue virus types 1 to 4 (DENV1 to DENV4) are shown in Table 1 below: TABLE 1

Innerhalb verschiedener Dengueviren der Virustypen 1 bis 4 variiert die Aminosäuresequenz von NS2A geringfügig. NS2A aus DENV1 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 1 besitzt. NS2A aus DENV2 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 2 besitzt. NS2A aus DENV3 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 3 besitzt. NS2A aus DENV4 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 4 besitzt. Besonders bevorzugt ist die Aminosäuresequenz von NS2A aus DENV1 bis DENV4 jeweils identisch zu SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, wie in Tabelle 1 dargestellt. Within various dengue viruses of virus types 1 to 4, the amino acid sequence of NS2A varies slightly. NS2A from DENV1 preferably has an amino acid sequence that has at least 90%, preferably at least 95%, amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 1. NS2A from DENV2 preferably has an amino acid sequence that has at least 90%, preferably at least 95%, amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 2. NS2A from DENV3 preferably has an amino acid sequence that has at least 90%, preferably at least 95%, amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 3. NS2A from DENV4 preferably has an amino acid sequence that has at least 90%, preferably at least 95%, amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 4. More preferably, the amino acid sequence of NS2A from DENV1 to DENV4 is identical to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, as shown in Table 1.

Nichtstrukturproteine 2A der unterschiedlichen Virustypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) weisen zueinander nur eine geringe Aminosäuresequenzidentität auf. Wie aus dem in Ausführungsbeispiel 1 und der zugehörigen 1 dargestellten Alignment hervorgeht, weisen die in Tabelle 1 genannten Nichtstrukturproteine 2A aus DENV1 bis DENV4 zueinander eine Aminosäuresequenzidentität im Bereich von 34–45 % auf. Non-structural proteins 2A of the different virus types of dengue virus (DENV1 to DENV4) have little amino acid sequence identity to each other. As in the embodiment 1 and the associated 1 As shown in Table 1, non-structural proteins 2A from DENV1 to DENV4 mentioned in Table 1 have an amino acid sequence identity in the range of 34-45%.

In einem erfindungsgemäßen Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion wird eine biologischen Probe, vorzugsweise eines Menschen, auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen NS2A (hierin auch als „anti-NS2A Antikörper“ bezeichnet) untersucht. Ergibt die Untersuchung, dass gegen NS2A gerichtete Antikörper in der biologischen Probe vorliegen, so zeigt dies spezifisch eine Denguevirus-Infektion an.In a method of specifically detecting dengue virus infection, a biological sample, preferably a human, is screened for the presence of antibodies to NS2A (also referred to herein as "anti-NS2A antibody"). If the investigation indicates that antibodies directed against NS2A are present in the biological sample, this indicates specifically a dengue virus infection.

Unter Antikörpern gegen NS2A werden dabei im Sinne der Erfindung Antikörper verstanden, die spezifisch NS2A aus Denguevirus binden. Dies sind alle Antikörper, die spezifisch ein Nichtstrukturprotein 2A aus einem der Denguevirustypen 1 bis 4 binden. For the purposes of the invention, antibodies against NS2A are understood to be antibodies which specifically bind NS2A from dengue virus. These are all antibodies that specifically bind a non-structural protein 2A from one of the dengue virus types 1 to 4.

Werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in der biologischen Probe anti-NS2A Antikörper des Isotypen IgM nachgewiesen, so zeigt dies eine akute Denguevirus-Infektion an. Werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in der biologischen Probe anti-NS2A Antikörper des Isotypen IgG nachgewiesen, so zeigt dies an, dass die biologische Probe von einem Individuum stammt, welches bereits eine Denguevirus-Infektion durchlaufen hat. If anti-NS2A antibodies of the isotype IgM are detected with the method according to the invention in the biological sample, this indicates an acute dengue virus infection. If anti-NS2A antibodies of the isotype IgG are detected in the biological sample by the method according to the invention, this indicates that the biological sample originates from an individual who has already undergone a dengue virus infection.

Bei der biologischen Probe, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wird, handelt es sich bevorzugt um eine flüssige Probe, insbesondere eine Blutprobe. The biological sample which is analyzed in the method according to the invention is preferably a liquid sample, in particular a blood sample.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmenten. The method according to the invention preferably comprises contacting the biological sample with nonstructural protein 2A from dengue virus or its protein fragments.

Dabei wird Nichtstrukturprotein 2A einer der vier Serotypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) eingesetzt. Dabei ist jedes der Nichtstrukturproteine 2A aus den vier Serotypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) geeignet, um eine Denguevirus-Infektion nachzuweisen. Es ist daher mit der Erfindung vorteilhaft möglich, mit dem Einsatz eines Nichtstrukturproteins 2A aus einem der vier Serotypen von Denguevirus eine Infektion mit jedem der Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) nachzuweisen. So wird beispielhaft beim Einsatz von NS2A aus DENV1 vorteilhaft neben einer Infektion mit Denguevirus Typ 1 auch eine Infektion mit Denguevirus Typ 2, Denguevirus Typ 3 oder Denguevirus Typ 4 angezeigt. Entsprechendes gilt für den Einsatz von NS2A aus DENV2, DENV3 oder DENV4. Bevorzugt wird bei der Erfindung NS2A aus Denguevirus Typ 2 eingesetzt. Nonstructural protein 2A is used in one of the four serotypes of dengue virus (DENV1 to DENV4). Each of the nonstructural proteins 2A from the four serovars of dengue virus (DENV1 to DENV4) is suitable for detecting dengue virus infection. It is therefore advantageously possible with the invention to detect an infection with each of the dengue virus types (DENV1 to DENV4) with the use of a non-structural protein 2A from one of the four serotypes of dengue virus. For example, with the use of NS2A from DENV1, in addition to an infection with dengue virus type 1, an infection with dengue virus type 2, dengue virus type 3 or dengue virus type 4 is also indicated. The same applies to the use of NS2A from DENV2, DENV3 or DENV4. Preferably, NS2A from dengue virus type 2 is used in the invention.

Bevorzugt wird zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe eine Mischung verschiedener NS2A Proteine aus mehreren (mindestens zwei) Serotypen von Denguevirus eingesetzt. Dadurch kann vorteilhaft eine stärkere Reaktion herbeigeführt werden. Preferably, a mixture of different NS2A proteins from several (at least two) serotypes of dengue virus is used to detect a dengue virus infection from a biological sample. This can advantageously be brought about a stronger reaction.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung wird zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe eine Mischung von NS2A-Proteinen aus Denguevirus Typ 1, Denguevirus Typ 2, Denguevirus Typ 3 und Denguevirus Typ 4 (oder Proteinfragmenten der jeweiligen NS2A-Proteine) eingesetzt. Dadurch wird besonders gut sichergestellt, dass Seren von Patienten mit Denguevirusinfektion von jedem der vier Serotypen des Denguevirus eine zuverlässige und deutlich nachweisbare Reaktion im erfindungsgemäßen Nachweis erzeugen. Da die einzelnen Denguevirustypen in unterschiedlichen Regionen der Welt in unterschiedlicher Häufigkeit vorkommen, wird mit dieser Ausführungsvariante ein Nachweis bereitgestellt, der überall in gleichermaßen zuverlässiger Weise eingesetzt werden kann.In a particularly preferred embodiment of the invention, a mixture of NS2A proteins from dengue virus type 1, dengue virus type 2, dengue virus type 3 and dengue virus type 4 (or protein fragments of the respective NS2A proteins) is used to detect a dengue virus infection from a biological sample , This will ensure particularly well that sera from patients with dengue viral infection from each of the four serotypes of dengue virus produce a reliable and clearly detectable response in the detection of the invention. Since the different types of dengue virus occur in different regions of the world in different frequencies, with this embodiment, a proof is provided, which can be used everywhere in equally reliable manner.

In einer weiter bevorzugten Ausfürgungsvariante der Erfindung wird zum Nachweis einer Infektion mit einem bestimmten Serotyp des Denguevirus (DENV1, DENV2, DENV4 oder DENV4) als Testantigen jeweils ein NS2A aus Denguevirus Typ 1, Denguevirus Typ 2, Denguevirus Typ 3 und Denguevirus Typ 4 in einem Vergleichstest eingesetzt. Dabei wird die biologische Probe in mindestens vier separaten Testverfahren jeweils mit einem Testantigen, im Speziellen jeweils NS2A aus Denguevirus Typ 1, NS2A aus Denguevirus Typ 2, NS2A aus Denguevirus Typ 3 und NS2A aus Denguevirus Typ 4 (oder dessen jeweiligen Proteinfragmenten), in Kontakt gebracht. Dadurch wird vorteilhaft eine Typisierung des Denguevirustyps, der die Infektion bei dem Patienten verursacht hat, möglich. Dabei deutet die im Vergleich zu den anderen Testantigenen (NS2A aus den verschiedenen Dengueviruszypen) stärkste Reaktion auf den die Infektion verursachenden Denguevirustyp hin.In a further preferred variant of the invention, an NS2A from dengue virus type 1, dengue virus type 2, dengue virus type 3 and dengue virus type 4 is used to detect infection with a specific serotype of the dengue virus (DENV1, DENV2, DENV4 or DENV4) in each case as test antigen Used comparison test. The biological sample is in at least four separate test procedures each with a test antigen, in particular each NS2A from dengue virus type 1, NS2A from dengue virus type 2, NS2A from dengue virus type 3 and NS2A from dengue virus type 4 (or its respective protein fragments) in contact brought. This advantageously makes it possible to characterize the type of dengue virus which has caused the infection in the patient. In comparison to the other test antigens (NS2A from the various dengue virus cells), the strongest reaction to the type of dengue virus causes the infection.

NS2A oder dessen Proteinfragmente werden bevorzugt in oberflächengebundener Form eingesetzt. NS2A or its protein fragments are preferably used in surface-bound form.

Die biologische Probe wird bevorzugt in verdünnter Form eingesetzt. Zum Verdünnen wird dabei beispielsweise gepufferte Salzlösung, z.B. PBS, eingesetzt, die ggf. mit einem inertem Protein, wie z.B. bovinem Serumalbumin, oder einem Gemisch inerter Proteine, wie z.B. Milchpulver, angereichert ist. The biological sample is preferably used in diluted form. For dilution, for example, buffered saline, e.g. PBS, optionally containing an inert protein, e.g. bovine serum albumin, or a mixture of inert proteins, e.g. Milk powder, is enriched.

Die biologische Probe wird mit NS2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmenten kontaktiert (inkubiert). Unter Proteinfragmenten von NS2A sind dabei im Sinne der Erfindung Fragmente von NS2A einer der vier Serotypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) zu verstehen. Die Proteinfragmente haben bevorzugt eine Größe von mindestens 20, bevorzugt mindestens 30, besonders bevorzugt mindestens 40, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 Aminosäureresten. Die Proteinfragmente von NS2A weisen bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die eine Aminosäuresequenzidentität zu einer gleich großen Teilsequenz der Aminosäuresequenz des entsprechenden Nichtstrukturproteins 2A (NS2A aus DENV1, DENV2, DENV3 oder DENV4) von mindestens 90 % besitzt. Bevorzugt weist ein Proteinfragment von NS2A eine Aminosäuresequenz auf, die eine Aminosäuresequenzidentität zu einer gleich großen Teilsequenz von NS2A aus DENV1, DENV2, DENV3 oder DENV4, wie gemäß Tabelle 1 durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 definiert, von mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 98 % besitzt. Weiter bevorzugt weist ein Proteinfragment eine identische Aminosäuresequenz zu einer gleich großen Teilsequenz von SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 auf. The biological sample is contacted (incubated) with NS2A from dengue virus or its protein fragments. For the purposes of the invention, protein fragments of NS2A are fragments of NS2A of one of the four serotypes of dengue virus (DENV1 to DENV4). The protein fragments preferably have a size of at least 20, preferably at least 30, more preferably at least 40, most preferably at least 50 amino acid residues. The protein fragments of NS2A preferably have an amino acid sequence which has an amino acid sequence identity to an equal partial sequence of the amino acid sequence of the corresponding non-structural protein 2A (NS2A from DENV1, DENV2, DENV3 or DENV4) of at least 90%. Preferably, a protein fragment of NS2A has an amino acid sequence which has an amino acid sequence identity to an equally sized partial sequence of NS2A from DENV1, DENV2, DENV3 or DENV4, as shown in Table 1 by SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4, of at least 90%, more preferably at least 95%, most preferably at least 98%. More preferably, a protein fragment has an identical amino acid sequence to an equally sized subsequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

Bei dem eingesetzten NS2A handelt es sich um entweder natives NS2A, welches aus nativem Denguevirus-Lysat isoliert wurde, oder um rekombinantes NS2A. Aufgrund der einfachen, kostengünstigen und vergleichsweise ungefährlichen Herstellung wird rekombinantes NS2A bevorzugt. Dieses wird vorzugsweise durch rekombinante Expression in Bakterienzellen oder Säugerzellen gewonnen. Besonders bevorzugt ist NS2A, welches durch rekombinante Expression in Bakterienzellen, insbesondere Escherichia coli, gewonnen wurde. The NS2A used is either native NS2A isolated from native dengue virus lysate or recombinant NS2A. Because of the simple, inexpensive and relatively harmless preparation, recombinant NS2A is preferred. This is preferably obtained by recombinant expression in bacterial cells or mammalian cells. Particularly preferred is NS2A, which was obtained by recombinant expression in bacterial cells, in particular Escherichia coli.

Im Anschluss an das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmenten erfolgt in einem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt eine anschließende Sichtbarmachung der Bindung der anti NS2A-Antikörper aus der biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente durch eine enzymatische Reaktion. Dabei erfolgt die die Bindung (der anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente) nachweisende enzymatische Reaktion durch ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt ist, der die anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe spezifisch bindet. Following the contacting of the biological sample with non-structural protein 2A from dengue virus or its protein fragments, a subsequent visualization of the binding of the anti-NS2A antibodies from the biological sample to NS2A or its protein fragments by an enzymatic reaction preferably takes place in a method according to the invention. In this case, the binding (the anti-NS2A antibody from the biological sample to NS2A or its protein fragments) detecting enzymatic reaction by an enzyme which is coupled to an antibody that specifically binds the anti-NS2A antibody from the biological sample.

Bevorzugt wird zur spezifischen Bindung der an NS2A oder dessen Proteinfragmente gebundenen anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe ein anti-IgM oder anti-IgG Antikörper eingesetzt. Für den Nachweis von anti-NS2A Antikörpern aus einer menschlichen Probe, vorzugsweise einer Blutprobe, werden anti-human IgM oder anti-human IgG eingesetzt. Die Antikörper sind bevorzugt mit einem Enzym (einem sogenannten Reporterenzym) konjugiert, bevorzugt mit Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase. Durch Kontaktieren des Enzyms mit einem Chromogen wird eine Farbreaktion erzeugt, anhand derer die Bindung der anti-NS2A Antikörper an NS2A nachgewiesen werden kann. Alternativ zur Konjugation mit einem Reporterenzym sind die anti-IgM oder anti-IgG Antikörper bevorzugt mit einem Fluorochrom konjugiert.An anti-IgM or anti-IgG antibody is preferably used for the specific binding of the anti-NS2A antibodies bound to NS2A or its protein fragments from the biological sample. For the detection of anti-NS2A antibodies from a human sample, preferably a blood sample, anti-human IgM or anti-human IgG are used. The antibodies are preferably conjugated with an enzyme (a so-called reporter enzyme), preferably with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase. By contacting the enzyme with a chromogen, a color reaction is generated by which the binding of anti-NS2A antibodies to NS2A can be detected. Alternatively to conjugation with a reporter enzyme, the anti-IgM or anti-IgG antibodies are preferably conjugated to a fluorochrome.

Der Nachweis der anti-NS2A Antikörper in der biologischen Probe erfolgt bevorzugt durch ein immunologisches Verfahren (Immunassay). Bevorzugt ist das immunologische Verfahren ausgewählt aus Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western-Blot und proteinbasierten Multiplex-Techniken (vorzugsweise beadbasierte Multiplex-Techniken, bevorzugt auf dem Luminex-Prinzip basierte beadbasierte Multiplex-Techniken). The detection of anti-NS2A antibodies in the biological sample is preferably carried out by an immunological method (immunoassay). Preferably, the immunological method is selected from enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot and protein-based multiplexing techniques (preferably bead-based multiplexing techniques, preferably bead based multiplexing techniques based on the Luminex principle).

Besonders bevorzugt ist das immunologische Verfahren ein ELISA. Most preferably, the immunological method is an ELISA.

Ein beispielhaftes erfindungsgemäßes ELISA-Verfahren umfasst folgende Schritte:

– Beschichtung: Mikrotiterplatten werden mit NS2A oder Proteinfragmenten davon beschichtet. Dabei werden NS2A oder dessen Proteinfragmente bevorzugt in einer Konzentration von 1 bis 10 μg/ml eingesetzt (Beschichtungslösung). Als Lösungsmittel wird bevorzugt eine Salzlösung eingesetzt, besonders bevorzugt PBS oder 0,2 M Natriumhydrogencarbonatlösung pH 9. Die Beschichtung erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–250 μl je Vertiefung der Mikrotiterplatte (Well), bevorzugt 50–100 μl. Die Beschichtung erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde.
– Blockierung: Die Beschichtungslösung wird entfernt und es erfolgt die Zugabe einer Blocklösung. Als Blocklösung wird eine mit einem inerten Protein angereichte Salzlösung eingesetzt. Bevorzugt wird als Salzlösung PBS eingesetzt. Als inertes Protein wird bevorzugt bovines Serumalbumin oder ein Proteingemisch, vorzugsweise Milchpulver, eingesetzt. Die Blockierung erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–300 μl je Well, bevorzugt 150–300 μl, wobei das Volumen der Blocklösung größer ist als das Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Blockierung erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde. Die Blockierung wird bevorzugt bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C durchgeführt.
– Inkubation mit der biologischen Probe: Die Blocklösung wird entfernt und es erfolgt die Zugabe der, vorzugsweise verdünnten, biologischen Probe. Als Verdünnungsmittel wird vorzugsweise eine mit einem inerten Protein angereichte Salzlösung eingesetzt, besonders bevorzugt die zur Blockierung eingesetzte Blocklösung. Die biologische Probe ist zweckmäßig verdünnt. Ist die biologische Probe eine menschliche Blutprobe, so ist diese vorzugsweise in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:5000 (Anteil biologische Probe: Anteil Verdünnungslösung), bevorzugt mindestens 1:1000, verdünnt. Die Inkubation erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–250 μl je Well, bevorzugt 50–100 μl, wobei das Volumen der biologischen Probe gleich oder kleiner ist als das Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Inkubation mit der biologischen Probe erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde. Die Inkubation mit der biologischen Probe wird bevorzugt bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C durchgeführt.
– Inkubation mit Nachweisantikörper: Die Lösung mit der biologischen Probe wird verworfen und anschließend werden die Wells der Mikrotiterplatte ausgewaschen. Bevorzugt wird Wasser oder Salzlösung als Waschlösung eingesetzt. Anschließend erfolgt die Zugabe des verdünnten Nachweisantikörpers. Bevorzugt ist der Nachweisantikörper enzymkonjugiert, vorzugsweise mit Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase. Als Nachweisantikörper werden vorzugweise anti-human IgM oder anti-human IgG Antikörper eingesetzt. Als Verdünnungsmittel wird vorzugsweise eine mit einem inerten Protein angereichte Salzlösung eingesetzt, besonders bevorzugt die zur Blockierung eingesetzte Blocklösung. Der Nachweisantikörper ist zweckmäßig verdünnt. Die Inkubation erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–250 μl je Well, bevorzugt 50–100 μl, wobei das Volumen des Nachweisantikörpers gleich oder kleiner ist als das Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Inkubation mit dem Nachweisantikörper erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde. Die Inkubation mit dem Nachweisantikörper wird bevorzugt bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C durchgeführt.
– Sichtbarmachung der Bindung des Nachweisantikörpers an die anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe durch enzymatische Reaktion: Die Lösung mit dem Nachweisantikörper wird entfernt und anschließend werden die Wells der Mikrotiterplatte ausgewaschen. Bevorzugt wird Wasser oder Salzlösung als Waschlösung eingesetzt. Es erfolgt die Zugabe eines Chromogens, welches bei Kontakt mit dem Enzym, welches an den Nachweisantikörper gekoppelt ist, in einer Farbumschlagreaktion reagiert. Das Chromogen wird in einem Volumen von 50–250 μl je Vertiefung der Mikrotiterplatte (Well), bevorzugt 50–100 μl, eingesetzt. Dabei entspricht das Volumen des Chromogens bevorzugt dem Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Kontaktierung mit dem Chromogen erfolgt bevorzugt im Dunkeln. Das Chromogen wird vorzugsweise so lang inkubiert, bis in einer Positivkontrolle eine Farbreaktion sichtbar ist. Die enzymatische Reaktion wird anschließend vorzugsweise abgestoppt, bevorzugt durch Säurezugabe (beispielsweise durch Schwefelsäure). Anschließend erfolgt eine photometrische Analyse.

An exemplary ELISA method according to the invention comprises the following steps:

Coating: Microtiter plates are coated with NS2A or protein fragments thereof. In this case, NS2A or its protein fragments are preferably used in a concentration of 1 to 10 μg / ml (coating solution). The preferred solvent used is a salt solution, more preferably PBS or 0.2 M sodium bicarbonate solution, pH 9. The coating is preferably carried out with a volume of 50-250 μl per well of the microtiter plate (well), preferably 50-100 μl. The coating is preferably carried out for a period of at least one hour.
Blocking: The coating solution is removed and a block solution is added. As a block solution, an enriched with an inert protein salt solution is used. PBS is preferably used as the salt solution. Bovine serum albumin or a protein mixture, preferably milk powder, is preferably used as the inert protein. The blocking is preferably carried out with a volume of 50-300 .mu.l per well, preferably 150-300 .mu.l, wherein the volume of the block solution is greater than the volume of the coating solution used for coating the microtiter plates. The blocking is preferably for a period of at least one hour. The blocking is preferably carried out at a temperature of 30 to 40 ° C.
Incubation with the biological sample: The block solution is removed and the addition of the, preferably diluted, biological sample takes place. The diluent used is preferably a salt solution enriched with an inert protein, more preferably the blocking solution used for blocking. The biological sample is appropriately diluted. If the biological sample is a human blood sample, it is preferably diluted in a ratio of 1: 100 to 1: 5000 (proportion of biological sample: proportion of dilution solution), preferably at least 1: 1000. The incubation is preferably carried out with a volume of 50-250 μl per well, preferably 50-100 μl, the volume of the biological sample being equal to or smaller than the volume of the coating solution used for coating the microtiter plates. The incubation with the biological sample is preferably carried out for a period of at least one hour. The incubation with the biological sample is preferably carried out at a temperature of 30 to 40 ° C.
Incubation with detection antibody: The solution containing the biological sample is discarded and then the wells of the microtiter plate are washed out. Preferably, water or saline solution is used as the washing solution. This is followed by the addition of the diluted detection antibody. Preferably, the detection antibody is enzyme conjugated, preferably with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase. The detection antibodies used are preferably anti-human IgM or anti-human IgG antibodies. The diluent used is preferably a salt solution enriched with an inert protein, more preferably the blocking solution used for blocking. The detection antibody is appropriately diluted. The incubation is preferably carried out with a volume of 50-250 μl per well, preferably 50-100 μl, the volume of the detection antibody being equal to or smaller than the volume of the coating solution used for coating the microtiter plates. The incubation with the detection antibody is preferably carried out for a period of at least one hour. The incubation with the detection antibody is preferably carried out at a temperature of 30 to 40 ° C.
- visualization of the binding of the detection antibody to the anti-NS2A antibodies from the biological sample by enzymatic reaction: The solution containing the detection antibody is removed and then the wells of the microtiter plate are washed out. Preferably, water or saline solution is used as the washing solution. There is the addition of a chromogen which reacts in a color change reaction upon contact with the enzyme which is coupled to the detection antibody. The chromogen is used in a volume of 50-250 μl per well of the microtiter plate (well), preferably 50-100 μl. The volume of the chromogen preferably corresponds to the volume of the coating solution used for coating the microtiter plates. The contacting with the chromogen is preferably carried out in the dark. The chromogen is preferably incubated until a color reaction is visible in a positive control. The enzymatic reaction is then preferably stopped, preferably by acid addition (for example by sulfuric acid). This is followed by a photometric analysis.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein diagnostischer Kit zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe. Erfindungsgemäß umfasst der Kit NS2A aus Denguevirus oder Proteinfragmente davon sowie Mittel zum Nachweis der Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus einer biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente. In der Anwendung wird mit einem erfindungsgemäßen diagnostischen Kit ein oben beschriebenes erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt. Another aspect of the invention is a diagnostic kit for detecting a dengue virus infection from a biological sample. According to the invention, the kit comprises NS2A from dengue virus or protein fragments thereof as well as means for detecting the binding of anti-NS2A antibodies from a biological sample to NS2A or its protein fragments. In the application, an inventive method described above is carried out with a diagnostic kit according to the invention.

Bei dem erfindungsgemäßen Kit sind die einzelnen Komponenten bevorzugt separat verpackt. Die einzelnen Komponenten des erfindungsgemäßen Kits sind bevorzugt bei Temperaturen zwischen 1 und 25 °C über mindestens mehrere Wochen lagerstabil. In the kit according to the invention, the individual components are preferably packaged separately. The individual components of the kit of the invention are preferably stable at temperatures between 1 and 25 ° C for at least several weeks.

In einem erfindungsgemäßen Kit liegen NS2A oder dessen Proteinfragmente vorzugsweise als Lyophilisat oder oberflächengebunden auf einem Träger vor. Bevorzugte Träger sind ausgewählt aus Mikrotiterplatten oder Beads. NS2A oder dessen Proteinfragmente werden wie oben zum erfindungsgemäßen Verfahren definiert eingesetzt. Bevorzugt kommt rekombinantes NS2A oder Proteinfragmente davon zum Einsatz, da diese besonders einfach, kostengünstig und vergleichsweise ungefährlich hergestellt werden können. In a kit according to the invention NS2A or its protein fragments are preferably present as lyophilisate or surface-bound on a carrier. Preferred carriers are selected from microtiter plates or beads. NS2A or its protein fragments are used as defined above for the method according to the invention. Recombinant NS2A or protein fragments thereof are preferably used, since they can be prepared in a particularly simple, cost-effective and relatively harmless manner.

Bevorzugt ist in einem erfindungsgemäßen Kit NS2A aus mindestens einem der Serotypen des Denguevirus (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) enthalten. Besonders bevorzugt enthält ein erfindungsgemäßer Kit mindestens NS2A aus Denguevirus Typ 2. Weiter besonders bevorzugt sind mindestens zwei verschiedene NS2A Proteine aus unterschiedlichen Serotypen des Denguevirus enthalten. Vorzugsweise handelt es sich dabei bei einem der NS2A Proteine um NS2A aus Denguevirus Typ 2. In a kit according to the invention, NS2A from at least one of the serotypes of the dengue virus (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) is preferably contained. More preferably, a kit according to the invention contains at least NS2A from dengue virus type 2. Further particularly preferred are at least two different NS2A proteins from different serotypes of the dengue virus. Preferably, one of the NS2A proteins is NS2A from dengue virus type 2.

In einem weiter bevorzugten erfindungsgemäßen Kit ist NS2A aus allen der vier Serotypen des Denguevirus (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) enthalten. Dies ermöglicht einerseits einen einzelnen Nachweistest mit den vier NS2A-Proteinen der unterschiedlichen Denguevirustypen als Testantigene und damit vorteilhaft einen universellen Einsatz des diagnostischen Kits. Andererseits ermöglicht diese Ausgestaltung einer Typisierung der biologischen Probe hinsichtlich eines bestimmten Denguevirustyps. Dafür werden in der Anwendung die vier NS2A-Proteine separat in einzelnen Tests als Testantigen eingesetzt.In a further preferred kit according to the invention NS2A is contained from all of the four serotypes of the dengue virus (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4). On the one hand, this allows a single detection test with the four NS2A proteins of the different dengue virus types as test antigens and thus, advantageously, a universal use of the diagnostic kit. On the other hand, this embodiment allows typing of the biological sample with respect to a particular type of dengue virus. For this purpose, the four NS2A proteins are used separately in individual tests as test antigen in the application.

Die einzelnen NS2A Proteine liegen im erfindungsgemäßen Kit entweder als Proteingemisch oder separat voneinander verpackt vor. Davon bevorzugt ist eine separate Bereitstellung der NS2A Proteine. The individual NS2A proteins are present in the kit according to the invention either as a protein mixture or packaged separately from one another. Of these, a separate provision of the NS2A proteins is preferred.

In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Kit sind als Mittel zum Nachweis der Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus einer biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente anti-IgM oder anti-IgG Antikörper enthalten. Diese liegen in einem diagnostischen Kit bevorzugt als Lyophilisat oder in gepufferter Lösung vor. Bevorzugt sind die im diagnostischen Kit enthaltenen Antikörper als Lyophilisat enthalten. Dieses wird in der Anwendung durch den Nutzer in Lösung gebracht. Auf diese Weise ist der diagnostische Kit vor der Anwendung besonders lang lagerstabil. Die anti-IgM oder anti-IgG Antikörper sind bevorzugt mit einem Enzym, vorzugsweise einem Reporterenzym, konjugiert. Besonders bevorzugte Reporterenzyme sind ausgewählt aus Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase. Alternativ dazu sind die anti-IgM oder anti-IgG Antikörper bevorzugt mit einem Fluorochrom konjugiert.In a preferred kit according to the invention, as means for detecting the binding of anti-NS2A antibodies from a biological sample to NS2A or its protein fragments, anti-IgM or anti-NS2A antibodies are used. Contain IgG antibodies. These are preferably present in a diagnostic kit as lyophilisate or in buffered solution. The antibodies contained in the diagnostic kit are preferably contained as lyophilisate. This is brought into solution by the user in the application. In this way, the diagnostic kit is particularly long-term storage stability before use. The anti-IgM or anti-IgG antibodies are preferably conjugated with an enzyme, preferably a reporter enzyme. Particularly preferred reporter enzymes are selected from horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase. Alternatively, the anti-IgM or anti-IgG antibodies are preferably conjugated to a fluorochrome.

In weiteren Ausgestaltungen eines erfindungsgemäßen diagnostischen Kits sind weitere Bestandteile enthalten, die zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens benötigt werden. In besonders bevorzugten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen diagnostischen Kits sind Pufferlösungen oder Salzgemische enthalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen diagnostischen Kits sind Salzgemische enthalten, die nach Zugabe einer definierten Menge (vorzugsweise sterilen) Wassers eine gepufferte Salzlösung ergeben. Ggf. ist den Salzgemischen ein inertes Protein oder Proteingemisch beigemengt. In further embodiments of a diagnostic kit according to the invention further constituents are included which are required for carrying out a method according to the invention. In particularly preferred embodiments of the diagnostic kit according to the invention, buffer solutions or salt mixtures are contained. In a preferred embodiment of a diagnostic kit according to the invention, salt mixtures are contained which give a buffered saline solution after addition of a defined amount (preferably sterile) of water. Possibly. is added to the salt mixtures an inert protein or protein mixture.

In einer weiteren Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen diagnostischen Kits ist als weitere Komponente ein Chromogen, vorzugsweise in gelöster Form, enthalten. In a further embodiment of a diagnostic kit according to the invention, a chromogen, preferably in dissolved form, is contained as further component.

Ein besonders bevorzugter diagnostischer Kit enthält Bestandteile zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens als ELISA. Dabei enthält das Kit die folgenden Bestandteile:

– als Testantigen: NS2A oder Proteinfragmente davon, vorzugsweise in oberflächengebundener Form in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte,
– mindestens eine Mikrotiterplatte,
– als Nachweisantikörper: mit einem Reporterenzym gekoppelter anti-IgG oder anti-IgM Antikörper, vorzugsweise anti-human IgG oder anti-human IgM Antikörper, vorzugsweise als Lyophilisat,
– bevorzugt Pufferlösungen oder Salzgemische zur Herstellung von Pufferlösungen,
– bevorzugt ein Chromogen, welches von dem Reporerenzym umgesetzt wird.

A particularly preferred diagnostic kit contains components for carrying out a method according to the invention as an ELISA. The kit contains the following components:

As test antigen: NS2A or protein fragments thereof, preferably in surface-bound form in the wells of a microtiter plate,
At least one microtiter plate,
As detection antibodies: anti-IgG or anti-IgM antibodies coupled with a reporter enzyme, preferably anti-human IgG or anti-human IgM antibodies, preferably as lyophilisate,
Preferably buffers or salt mixtures for the preparation of buffer solutions,
Preferably a chromogen which is reacted by the reporter enzyme.

Liegt der Antikörper als Lyophilisat vor, enthält das Kit vorzugsweise eine Salzlösung, vorzugsweise PBS, als Lösungsmittel. Das Reporterenzym, mit dem der Nachweisantikörper gekoppelt ist, ist bevorzugt ausgewählt aus Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase.If the antibody is present as a lyophilisate, the kit preferably contains a saline solution, preferably PBS, as a solvent. The reporter enzyme to which the detection antibody is coupled is preferably selected from horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase.

Als Pufferlösungen sind bevorzugt zumindest eine Blocklösung, wie oben definiert, enthalten. Alternativ dazu ist ein Salz-Protein-Gemisch enthalten, mit dem durch Zugabe einer definierten Menge Wasser eine Blocklösung, wie oben definiert, erhalten werden kann. Weiterhin ist in einem erfindungsgemäßen diagnostischen Kit als Waschlösung (zum Auswaschen der Vertiefungen der Mikrotiterplatte) bevorzugt steriles, destilliertes Wasser oder eine gepufferte Salzlösung (vorzugsweise PBS) enthalten. Zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion ist in einem diagnostischen Kit bevorzugt eine Säure, besonders bevorzugt Schwefelsäure, enthalten.As buffer solutions are preferably at least one block solution, as defined above, included. Alternatively, a salt-protein mixture is included which can be used to obtain a block solution as defined above by adding a defined amount of water. Furthermore, in a diagnostic kit according to the invention as a washing solution (for washing out the wells of the microtiter plate) preferably sterile, distilled water or a buffered saline solution (preferably PBS). To stop the enzymatic reaction, a diagnostic kit preferably contains an acid, particularly preferably sulfuric acid.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Mitteln zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus, bevorzugt aus einer biologischen Probe, zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion. Erfindungsgemäß bevorzugt werden Mittel zur Durchführung von Immunassays, insbesondere zur Durchführung von ELISA, Western-Blot und proteinbasierten Multiplex-Techniken (vorzugsweise beadbasierte Multiplex-Techniken, bevorzugt auf dem Luminex-Prinzip basierte beadbasierte Multiplex-Techniken), zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion verwendet. Bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Verwendung den Nachweis von spezifischen Antikörpern, insbesondere der Isotypen IgM oder IgG, gegen NS2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe. Das Vorliegen von anti-NS2A Antikörpern dient als Indikator für das Vorliegen einer Denguevirus-Infektion. Die erfindungsgemäße Verwendung erfolgt bevorzugt in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wie oben beschrieben. Another aspect of the invention is the use of means for detecting antibodies to non-structural protein 2A from dengue virus, preferably from a biological sample, for specific detection of dengue virus infection. According to the invention, means for carrying out immunoassays, in particular for performing ELISA, Western Blot and protein-based multiplexing techniques (preferably bead-based multiplexing techniques, preferably bead-based multiplexing techniques based on the Luminex principle) are preferred for the specific detection of a dengue virus infection used. The use according to the invention preferably comprises the detection of specific antibodies, in particular of the isotypes IgM or IgG, against NS2A from dengue virus from a biological sample. The presence of anti-NS2A antibodies serves as an indicator of the presence of dengue virus infection. The use according to the invention is preferably carried out in a method according to the invention, as described above.

Bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße Verwendung unter Einsatz eines diagnostischen Kits, der NS2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmente sowie Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe enthält. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßer diagnostischer Kit, wie oben definiert, eingesetzt. Preferably, the use according to the invention is carried out using a diagnostic kit containing NS2A from dengue virus or its protein fragments as well as means for detecting IgG or IgM antibodies from a biological sample. Preferably, a diagnostic kit according to the invention as defined above is used.

Ein weiterer Aspekt ist die Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis von Antikörpern gegen das NS2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion. Bevorzugt kommt dabei ein erfindungsgemäßes Verfahren, wie oben beschrieben, zum Einsatz. Another aspect is the use of a method of detecting antibodies to the dengue virus NS2A for the specific detection of dengue virus infection. A process according to the invention, as described above, is preferably used.

Mit der Erfindung ist es auch möglich, das Vorliegen einer Infektion mit einem der verschiedenen Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) nachzuweisen. Dies eignet sich besonders im Rahmen epidemiologischer Analysen, um das Vorkommen von Infektionen mit Denguevirus der jeweiligen Typen in der Bevölkerung zu analysieren und zu überwachen. With the invention it is also possible to detect the presence of an infection with one of the different dengue virus types (DENV1 to DENV4). This is particularly useful in epidemiological analyzes to analyze and monitor the incidence of dengue virus infections of the respective types in the population.

Um das Vorliegen einer Infektion mit einem der verschiedenen Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) nachzuweisen, erfolgt im Rahmen der Erfindung der Nachweis von Antikörpern gegen NS2A aus jedem der vier Denguevirustypen in einem Vergleichsversuch. Somit werden im Rahmen der Erfindung in einzelnen Tests Antikörper gegen NS2A aus jedem der Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) aus einer biologischen Probe nachgewiesen. Dies erfolgt, indem – beispielsweise in einem erfindungsgemäßen Verfahren – zumindest vier Analysen mit NS2A aus jedem der Denguevirustypen, bevorzugt parallel, durchgeführt werden und die Ergebnisse anschließend miteinander verglichen werden. Die im Vergleich zu den anderen Testantigenen (NS2A aus den verschiedenen Dengueviruszypen) stärkste Reaktion deutet auf den die Infektion verursachenden Denguevirustyp hin. So zeigt beispielsweise eine stärkere Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus der biologischen Probe bei dem Versuch mit NS2A aus DENV1 als Testantigen im Vergleich zu den jeweiligen Versuchen mit NS2A aus DENV2, DENV3 und DENV4 als Testantigen auf das Vorliegen einer Infektion mit Denguevirus Typ 1 hin. Analoges gilt, wenn die stärkere Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus der biologischen Probe bei dem Versuch mit NS2A aus DENV2, DENV3 oder DENV4 als Testantigen im Vergleich zu den jeweils anderen Versuchen nachgewiesen wird. Dies zeigt dann entsprechend das Vorliegen einer Infektion mit Denguevirus Typ 2, Typ 3 oder Typ 4 an. In order to detect the presence of an infection with one of the different dengue virus types (DENV1 to DENV4), the detection of antibodies against NS2A from each of the four dengue virus types in a comparative experiment takes place in the context of the invention. Thus, within the scope of the invention, antibodies against NS2A from each of the dengue virus types (DENV1 to DENV4) from a biological sample are detected in individual tests. This is done by performing, for example, in a method according to the invention, at least four analyzes with NS2A from each of the dengue virus types, preferably in parallel, and then comparing the results with each other. The strongest reaction compared to the other test antigens (NS2A from the various dengue virus cells) indicates the type of dengue virus causing the infection. Thus, for example, a stronger binding of anti-NS2A antibodies from the biological sample in the experiment with NS2A from DENV1 as a test antigen compared to the respective experiments with NS2A from DENV2, DENV3 and DENV4 as a test antigen for the presence of a dengue virus type 1 infection , The same applies if the stronger binding of anti-NS2A antibodies from the biological sample is detected in the experiment with NS2A from DENV2, DENV3 or DENV4 as test antigen in comparison to the respective other experiments. This then indicates the presence of a dengue virus type 2, type 3 or type 4 infection.

Mit der Erfindung werden Verfahren und Mittel zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion bereitgestellt, die eine sehr gute Unterscheidung einer Denguevirus-Infektion von Infektionen mit anderen Flaviviren ermöglichen. Es werden im Vergleich zu bisherigen Verfahren, in denen andere Denguevirus-Proteine als Testantigen eingesetzt werden, unspezifische Reaktionen vermindert. Dadurch bietet die Erfindung ein Testverfahren mit höherer Spezifität. Gleichzeitig werden unspezifische Reaktionen mit biologischen Proben von Nichtinfizierten vermieden, so dass mit der Erfindung eine verminderte Falsch-Positiv-Rate erzielt wird. Gleichzeitig erfolgt mit der Erfindung der Nachweis der Denguevirus-Infektion mit besonders geringer Falsch-Negativ-Rate, da alle getesteten Blutproben anti-NS2A Antikörper aufwiesen. Die Kombination dieser Vorteile hebt die Erfindung von allen bisher bekannten Testverfahren vorteilhaft ab. The invention provides methods and means for detecting dengue virus infection which allow a very good discrimination of dengue virus infection from infections with other flaviviruses. It will be compared to previous methods in which other dengue virus proteins are used as a test antigen, nonspecific reactions are reduced. As a result, the invention offers a test method with higher specificity. At the same time nonspecific reactions with biological samples of non-infected are avoided, so that with the invention, a reduced false-positive rate is achieved. At the same time with the invention, the detection of dengue virus infection with a particularly low false-negative rate, since all the blood samples tested anti-NS2A antibodies. The combination of these advantages advantageously differentiates the invention from all previously known test methods.

Folgendes Ausführungsbeispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne diese auf das Beispiel zu beschränken. The following embodiment is intended to explain the invention in more detail, without limiting it to the example.

1 Aminosäuresequenzvergleich zwischen NS2A aus einem der Denguevirustypen 1 bis 4 (DENV1 bis DENV4) als Referenz mit den NS2A der jeweils anderen Denguevirustypen. a) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV2, DENV3 und DENV4 zu NS2A aus DENV1. b) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV1, DENV3 und DENV4 zu NS2A aus DENV2. c) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV1, DENV2 und DENV4 zu NS2A aus DENV3. d) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV1, DENV2 und DENV3 zu NS2A aus DENV4. 1 Amino acid sequence comparison between NS2A from one of the dengue virus types 1 to 4 (DENV1 to DENV4) as a reference with the NS2A of the other dengue virus types. a) Alignment of the amino acid sequences of NS2A from DENV2, DENV3 and DENV4 to NS2A from DENV1. b) Alignment of the amino acid sequences of NS2A from DENV1, DENV3 and DENV4 to NS2A from DENV2. c) Alignment of the amino acid sequences of NS2A from DENV1, DENV2 and DENV4 to NS2A from DENV3. d) Alignment of the amino acid sequences of NS2A from DENV1, DENV2 and DENV3 to NS2A from DENV4.

2 Ergebnis einer ELISA-Untersuchung von Seren von Denguefieber-Patienten (A–I) und von Nichtinfizierten (J–S, als Vergleich), wie in Beispiel 1 beschrieben. Die waagerechte Linie kennzeichnet den Mittelwert plus 3 Standardabweichungen der negativen Seren. 2 Results of an ELISA study of sera from Dengue fever patients (A-I) and noninfected ones (J-S, for comparison) as described in Example 1. The horizontal line indicates the mean plus 3 standard deviations of the negative sera.

Ausführungsbeispiel 1: Vergleich der Aminosäuresequenzen von Nichtstrukturproteinen 2A aus Denguevirus der Typen 1 bis 4Exemplary Embodiment 1 Comparison of the Amino Acid Sequences of Nonstructural Proteins 2A from Dengue Virus Types 1 to 4

Es wurde ein Alignment der Aminosäuresequenzen der verschiedenen Nichtstrukturproteine 2A aus Dengevirus Typ 1 bis 4 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. An alignment of the amino acid sequences of the various nonstructural proteins 2A from dengue virus types 1 to 4 was performed. The results are in 1 shown.

Ausführungsbeispiel 2: Übersicht der Aminosäuresequenzidentiät zwischen Proteinen aus Dengevirus und korrespondierenden Proteinen anderer Flaviviren (West-Nil-Virus, Gelbfiebervirus, Japanisches Enzephalitis-Virus)Exemplary Embodiment 2: Overview of the Amino Acid Sequence Identity Between Proteins from Dengue Virus and Corresponding Proteins of Other Flaviviruses (West Nile Virus, Yellow Fever Virus, Japanese Encephalitis Virus)

Es wurde jeweils einzeln ein Alignment von je fünf Aminosäuresequenzen der Proteine (Capsidprotein, Membranprotein, Hüllprotein, Nichtstrukturproteine 1, 2A, 2B) pro Denguevirus Typ (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) mit je fünf korrespondierenden Proteinsequenzen aus West-Nil-Virus, Japanischem-Enzephalitis-Virus und Gelbfiebervirus durchgeführt. In each case, an alignment of five amino acid sequences of the proteins (capsid protein, membrane protein, envelope protein, nonstructural proteins 1, 2A, 2B) per dengue virus type (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) with in each case five corresponding protein sequences from West Nile virus, Japanese Encephalitis virus and yellow fever virus.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Protein Darstellung der Aminosäuresequenzidentität (%) als Mittelwerte der einzeln für die vier Denguevirus-Typen (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) durchgeführten Sequenzvergleiche mit korrespondierenden Proteinen von West-Nil-Virus Japanischem- Enzephalitis-Virus Gelbfiebervirus Capsid (C) 29.0 30.4 19.5 Membran (M) 33.6 35.1 37.3 Hüllprotein, (envelope) E 37.5 39.3 35.9 NS1 50.7 50.5 40.9 NS2A 21.8 18.3 21.7 NS2B 37.4 35.6 33.6 The results are shown in Table 2. Table 2: protein Representation of the amino acid sequence identity (%) as averages of the sequence comparisons carried out with the corresponding proteins of each of the four dengue virus types (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) West Nile Virus Japanese Encephalitis virus Yellow fever virus Capsid (C) 29.0 30.4 19.5 Membrane (M) 33.6 35.1 37.3 Envelope protein, (envelope) E 37.5 39.3 35.9 NS1 50.7 50.5 40.9 NS2A 21.8 18.3 21.7 NS2B 37.4 35.6 33.6

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, weist Nichtstrukturprotein 2A die geringste Sequenzidentität zu den korrespondierenden Proteinen aus anderen Flaviviren auf. As can be seen from Table 2, non-structural protein 2A has the least sequence identity to the corresponding proteins from other flaviviruses.

Ausführungsbeispiel 3: Nachweis von anti-NS2A Antikörpern aus humanen Blutproben im ELISA Exemplary embodiment 3: Detection of anti-NS2A antibodies from human blood samples in the ELISA

Als Testantigen wird rekombinantes NS2A aus Denguevirus gemäß SEQ ID Nr. 2 eingesetzt. Die rekombinante Expression erfolgt in E. coli. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung von NS2A mittels Affinitätschromatographie.The test antigen used is recombinant dense virus NS2A according to SEQ ID No. 2. Recombinant expression takes place in E. coli. Subsequently, a purification of NS2A by affinity chromatography.

In einem erfindungsgemäßen Verfahren werden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit jeweils 50 μl einer Lösung des rekombinanten NS2A in einer Konzentration von 4 μg/ml in 0,2 M Natriumhydrogencarbonat pH 9,0 befüllt. Nach mehrstündiger Inkubation wird die Beschichtungslösung verworfen und die Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden mit PBS/0,1% Tween 20 mehrfach gespült. Anschließend werden 250 μl einer Blocklösung (5 Gew.-% Milchpulver in PBS) in die Vertiefungen gefüllt. Nach 90minütiger Inkubation bei 37 °C wird die Blocklösung verworfen. In a method according to the invention, wells of a microtiter plate are filled with in each case 50 .mu.l of a solution of the recombinant NS2A in a concentration of 4 .mu.g / ml in 0.2 M sodium hydrogen carbonate pH 9.0. After several hours of incubation, the coating solution is discarded and the wells of the microtiter plate are rinsed several times with PBS / 0.1% Tween 20. Subsequently, 250 .mu.l of a block solution (5 wt .-% milk powder in PBS) are filled into the wells. After incubation at 37 ° C for 90 minutes, the block solution is discarded.

Seren von Donoren mit (Proben A–I in 2) bzw. ohne (Proben J–S in 2) akute Denguevirus-Infektion werden in Blocklösung 1:2000 verdünnt. Jeweils 50 μl des verdünnten Serums wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gefüllt. Nach 90minütiger Inkubation bei 37 °C werden die Proben aus der Mikrotiterplatte entfernt. Die Vertiefungen werden mehrfach mit Wasser und abschließend mit PBS/0,1% Tween 20 gespült. Sera from donors with (samples A-I in 2 ) or without (samples J-S in 2 ) acute dengue virus infection are diluted in block solution 1: 2000. Each 50 μl of the diluted serum is filled into the wells of the microtiter plates. After incubation at 37 ° C for 90 minutes, the samples are removed from the microtiter plate. The wells are rinsed several times with water and finally with PBS / 0.1% Tween 20.

Als Nachweisantikörper werden mit Meerrettichperoxidase-gekoppelte polyklonale Ziege anti-human IgM Antikörper eingesetzt, welche in Blocklösung aufgenommen werden. Jeweils 50 μl des verdünnten Antikörpers wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gefüllt. Nach 90minütiger Inkubation bei 37 °C werden die Antikörper aus der Mikrotiterplatte entfernt. Die Vertiefungen werden mehrfach mit Wasser und abschließend mit PBS/0,1% Tween 20 gespült. Es erfolgt eine anschließende Farbumschlagreaktion unter Verwendung von o-Phenylendiamin als Chromogen. Die Farbreaktion wird mit Schwefelsäure abgestoppt. Es erfolgt eine photometrische Messung bei 450 nm. The detection antibodies used are horseradish peroxidase-coupled polyclonal goat anti-human IgM antibodies, which are taken up in block solution. In each case 50 .mu.l of the diluted antibody is filled into the wells of the microtiter plates. After incubation for 90 minutes at 37 ° C, the antibodies are removed from the microtiter plate. The wells are rinsed several times with water and finally with PBS / 0.1% Tween 20. There is a subsequent color change reaction using o-phenylenediamine as a chromogen. The color reaction is stopped with sulfuric acid. There is a photometric measurement at 450 nm.

Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Die neun Seren A–I von Donoren mit Denguevirus-Infektion weisen sämtlich Antikörper gegen NS2A auf, wie an der höheren Lichtabsorption bei 450 nm abgelesen werden kann. Die zehn Seren J–S von Nichtinfizierten wurden in dem erfindungsgemäßen Verfahren negativ getestet. The results are in 2 shown. The nine sera A-I of donors with dengue virus infection all have antibodies to NS2A, as can be seen from the higher light absorbance at 450 nm. The ten sera J-S of non-infected were tested negative in the method according to the invention.

Zitierte Nichtpatentliteratur Quoted non-patent literature

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

EP 1190257 B1 [0007]

Claims

A method of specifically detecting dengue virus infection, comprising detecting antibodies to non-structural protein 2A from dengue virus from a biological sample.

The method of any one of the preceding claims, wherein the biological sample is a human blood sample.

Method according to one of the preceding claims, wherein the detection of antibodies against NS2A from the biological sample by an immunological process.

A method according to any one of the preceding claims comprising contacting a biological sample with non-structural protein 2A from dengue virus or protein fragments thereof.

The method of claim 4, which comprises subsequently visualizing the binding of antibodies from the biological sample to dengue virus non-structural protein 2A or its protein fragments by an enzymatic reaction.

A diagnostic kit for detecting a dengue virus infection from a biological sample, comprising: Non-structural protein 2A from dengue virus or protein fragments thereof and - Means for the detection of IgG or IgM antibodies from a biological sample.

A kit according to claim 6, wherein non-structural protein 2A of dengue virus or its protein fragments are used in surface-bound form.

Kit according to claim 6 or 7, wherein as a means for detecting IgG or IgM antibodies from a biological sample, a specific antibody against IgG or IgM is used for the detection.

Use of means for detecting antibodies to dengue virus non-structural protein 2A for specific detection of dengue virus infection.

Use of non-structural protein 2A from dengue virus for specific detection of dengue virus infection.

Use according to claim 9 or 10 in a method comprising the detection of antibodies to non-structural protein 2A from dengue virus from a biological sample, preferably according to one of claims 1 to 5.

Use according to any one of claims 9 to 11, using a diagnostic kit comprising dengue virus non-structural protein 2A or protein fragments thereof and means for detecting IgG or IgM antibodies from a biological sample, preferably using a diagnostic kit according to any one of claims 6 to 8.

Use of a method for detecting antibodies against dengue virus non-structural protein 2A for the specific detection of a dengue virus infection, preferably a method according to any one of claims 1 to 5.