DE102014202079B4

DE102014202079B4 - Method for laser microdissection

Info

Publication number: DE102014202079B4
Application number: DE102014202079.4A
Authority: DE
Inventors: Falk Schlaudraff; Christian Woditschka
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2014-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2034-02-06
Also published as: DE102014202079A1; WO2015118006A1

Abstract

Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem ein Probenbereich (216) einer auf einer laserschneidbaren Membran (110) befindlichen Probe (112) durch einen auf die Membran (110) fokussierten Laserstrahl (104) von der umgebenden Probe (112) gelöst wird, wobei die Membran (110) von einem Deckglas (107) gehalten und unter Ausbildung eines Zwischenraums (120) zwischen Membran (110) und Deckglas (107) von einem Rahmen (320) getragen wird, der auf dem Deckglas (107) aufliegt, und wobei vor und/oder bei dem Ablösen des Probenbereichs (216) ein Fluid in den Zwischenraum (120) zwischen Membran (110) und Deckglas (107) eingebracht wird und in den Zwischenraum (120) ein Überdruck erzeugt wird, der eine Druckkraft bewirkt, die ein Herauslösen des Probenbereichs (216) aus der Probe (112) begünstigt, wobei als Fluid ein Gas oder Gasgemisch verwendet wird, und wobei durch das Fluid der mittels Laserstrahl abgelöste Probenbereich (216) mitgenommen und/oder dessen Ablösung unterstützt wird, um anschließend in einen Auffangbehälter (114) transportiert zu werden.A method for laser microdissection in which a sample area (216) of a sample (112) located on a laser-cutable membrane (110) is released from the surrounding sample (112) by a laser beam (104) focused on the membrane (110) (110) is held by a cover glass (107) and supported to form a gap (120) between the membrane (110) and cover glass (107) by a frame (320) resting on the cover glass (107), and wherein before and or upon detachment of the sample area (216), a fluid is introduced into the space (120) between the membrane (110) and cover glass (107) and an overpressure is created in the space (120) causing a compressive force to cause dislodgement the sample region (216) from the sample (112) favors, wherein as the fluid, a gas or gas mixture is used, and wherein the fluid removed by the laser beam detached sample region (216) and / or the separation is assisted to ans to be transported in a collecting container (114).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem ein Probenbereich einer auf einer Membran befindlichen Probe durch einen auf die Membran fokussierten Laserstrahl von der umgebenden Probe gelöst wird. The present invention relates to a method for laser microdissection, in which a sample area of a sample located on a membrane is released from the surrounding sample by a laser beam focused onto the membrane.

Stand der Technik State of the art

Biologische Proben sind von Interesse beispielsweise bei der Untersuchung histologischer Schnitte, aus denen bestimmte Gewebe- oder Zelltypen zur weiteren Analyse herauspräpariert werden sollen, oder von Zellkulturen, denen lebende Einzelzellen zu entnehmen sind. Für die Entnahme eines Probenbereichs aus einer biologischen Probe (histologischer Gewebeschnitt, Zellteppich, usw.) ist die Lasermikrodissektion Stand der Technik. Dabei wird die Probe auf eine Membran (Folie) aufgebracht, die über einen Rahmen mit den Abmessungen eines Standardobjektträgers gespannt ist, und in einer Lasermikrodissektionsvorrichtung entsprechend positioniert. Ein fokussierter Laserstrahl schneidet sodann einen Probenbereich aus der Probe heraus. Die ausgeschnittene Probe (Dissektat) fällt nach dem vollständigen Durchtrennen der Verbindung zwischen Dissektat und der übrigen Probe unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen unterhalb der Probe angebrachten, geeigneten Dissektatauffangbehälter und steht für eine weitere Untersuchung bzw. Aufbereitung zur Verfügung. Biological samples are of interest, for example in the study of histological sections from which certain tissue or cell types are to be prepared for further analysis, or of cell cultures to which living single cells are to be taken. For the removal of a sample area from a biological sample (histological tissue section, cell carpet, etc.) laser microdissection is state of the art. The sample is applied to a membrane (foil) stretched over a frame of the dimensions of a standard slide and appropriately positioned in a laser microdissection device. A focused laser beam then cuts a sample area out of the sample. The dissected sample (dissectate), after complete separation of the dissectate-to-residual sample, falls under the force of gravity into a suitable dissectate collection container located below the sample and is available for further study or preparation.

Hierbei können jedoch elektrostatische Kräfte oder Kohäsionseffekte, welche der Gravitationskraft entgegenwirken, das Lösen des Abschnitts von der übrigen Probe erschweren. Elektrostatische Kräfte entgegen der Gravitationskraft können beispielsweise durch eine Ionisierung der Membran bei der Probenvorbereitung (z.B. Reibung am Baumwollstoffkittel) entstehen. Luftströme und andere äußere Einflüsse können zudem dafür sorgen, dass das Dissektat nach Heraustrennen nicht nach unten fällt, sondern nach oben umklappt und auf der Membran zu liegen kommt. Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren zur Lasermikrodissektion bereitzustellen, welches die vorstehend beschriebenen Nachteile vermeidet. In this case, however, electrostatic forces or cohesion effects, which counteract the gravitational force, make it difficult to detach the section from the rest of the sample. For example, electrostatic forces against gravitational force may result from ionization of the membrane during sample preparation (e.g., rubbing on the cotton gown). Air currents and other external influences can also ensure that the dissectate does not fall down after being cut out, but folds upwards and comes to rest on the membrane. It is therefore desirable to provide a method of laser microdissection which avoids the disadvantages described above.

Die WO 2012/159822 A1 beschreibt eine Objektträgeranordnung, mit der Zellen aus einer flüssigen Probe ausfiltriert werden, indem die Flüssigkeit auf eine als Filter wirkende, poröse Membran aufgebracht wird, die auf einem Stützkörper aufgelegt ist. Dabei weist der Stützkörper auf der der Membran zugewandten Seite Kanäle auf, durch welche die durch die Membran hindurch tretende Flüssigkeit abgeführt werden kann. Die ausgefilterten Zellen verbleiben auf der porösen Filter-Membran und können beispielsweise mittels Lasermikrodissektion einer weiteren Untersuchung zugeführt werden. The WO 2012/159822 A1 describes a slide assembly used to filter cells out of a liquid sample by applying the liquid to a porous filter membrane acting as a filter placed on a support body. In this case, the support body on the side facing the membrane on channels through which the passing through the membrane liquid can be removed. The filtered cells remain on the porous filter membrane and can be supplied to a further investigation, for example by means of laser microdissection.

Offenbarung der Erfindung Disclosure of the invention

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Lasermikrodissektion gemäß dem Patentanspruch 1 vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. According to the invention, a method for laser microdissection according to claim 1 is proposed. Advantageous embodiments will become apparent from the dependent claims and the description below.

Eine geeignete Objektträgeranordnung weist eine Membran zum Tragen einer Probe sowie ein Deckglas zur Halterung der Membran auf. Das Deckglas kann aus Glas oder Kunststoff gefertigt sein. Die Membran liegt entweder ganz oder zum Teil auf dem Deckglas auf oder ist über ein Halteelement mit dem Deckglas verbunden. Ein solches Halteelement kann ein Rahmen sein, auf den die Membran gespannt ist, wobei der Rahmen seinerseits auf dem Deckglas aufliegt. Der Rahmen kann aber auch umgekehrt in Richtung Deckglas geführt werden, so dass die Probe zwischen Membran und Deckglas liegt, wobei dann die Membran bzw. der Rahmen auf andere Art und Weise relativ zu dem Deckglas positioniert wird. Diese Art der Positionierung soll ausdrücklich unter den Begriff "Halterung" fallen. Zwischen Membran und Deckglas ist eine Zuführung für ein Fluid angebracht. Je nach Anordnung der Probe relativ zum Deckglas trifft ein zugeführtes Fluid entweder auf die der Probe zugewandten Membranfläche oder auf die der Probe abgewandten Membranfläche. A suitable slide assembly has a membrane for carrying a sample and a cover glass for holding the membrane. The cover glass can be made of glass or plastic. The membrane is either completely or partially on the cover glass or is connected via a holding element with the cover glass. Such a holding element may be a frame on which the membrane is stretched, wherein the frame in turn rests on the cover glass. However, the frame can also be guided in the direction of the coverslip so that the sample lies between the membrane and cover glass, with the membrane or frame then being positioned in a different manner relative to the cover glass. This type of positioning should explicitly fall under the term "bracket". Between membrane and coverslip a supply for a fluid is attached. Depending on the arrangement of the sample relative to the cover glass, a supplied fluid strikes either on the membrane surface facing the sample or on the membrane surface facing away from the sample.

Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Lasermikrodissektion wird ein Probenbereich einer auf einer laserschneidbaren Membran befindlichen Probe durch einen auf die Membran fokussierten Laserstrahl von der umgebenden Probe gelöst, wobei die Membran von einem Deckglas gehalten bzw. positioniert wird (vergleiche Ausführungen oben), und wobei vor und/oder bei dem Ablösen des Probenbereichs zwischen Membran und Deckglas ein Fluid eingebracht wird. In a method according to the invention for laser microdissection, a sample area of a sample located on a laser-cutable membrane is detached from the surrounding sample by a laser beam focused on the membrane, the membrane being held or positioned by a cover glass (compare above), and where before and / In the detachment of the sample area between the membrane and cover glass, a fluid is introduced.

Vorteile der Erfindung Advantages of the invention

Die vorliegende Anmeldung schlägt insbesondere ein spezielles Deckglas mit zumindest einer an das Deckglas gekoppelten Zuführung zur Auflage auf eine laserschneidbare Membran zum Tragen einer Probe vor, wobei die Zuführung zumindest an einer Seite der Membran eine Zuführung für ein Fluid erlaubt. Dies kann entweder die Oberseite oder die Unterseite sein. In particular, the present application proposes a special coverslip having at least one feeder coupled to the coverslip for support on a laser-cutable membrane for carrying a sample, the feeder allowing at least one side of the membrane to be supplied to a fluid. This can be either the top or the bottom.

Mit der anmeldungsgemäßen Objektträgeranordnung ist es möglich, eine auf einer laserschneidbaren Membran befindliche Probe oder einen abgelösten Probenbereich berührungslos zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Dies wird mittels der Zuführung eines Fluids durch die Zuführung ermöglicht bzw. gegen die genannten ungünstige Einflüsse stark erleichtert. Das Fluid nimmt den abgelösten Probenbereich mit und/oder unterstützt dessen Ablösung aus der Probe. With the slide assembly according to the application, it is possible to transport a sample located on a laser-cutable membrane or a detached sample area without contact to a collecting device. This is made possible by means of the supply of a fluid through the supply or greatly facilitated against the said unfavorable influences. The fluid takes the detached sample area with and / or supports its detachment from the sample.

Dabei ist es besonders vorteilhaft, die Zuführung als Schlauch oder Kapillare auszugestalten. It is particularly advantageous to design the feed as a hose or capillary.

Besonders zweckmäßig ist es auch, die Zuführung mit einer Fluidversorgung, wie ein Gasvorratsbehälter, eine Gasflasche, ein Flüssigkeitsbehälter oder dergleichen, zu verbinden und in der Zuführung Mittel zum Einstellen des Volumenstroms, des Druckes und/oder der Temperatur des Fluids vorzusehen. Hierdurch können die vorstehend genannten Eigenschaften des Fluids vom Benutzer anwendungsspezifisch angepasst werden. It is also particularly expedient to connect the supply to a fluid supply, such as a gas storage container, a gas bottle, a liquid container or the like, and to provide means in the supply for adjusting the volume flow, the pressure and / or the temperature of the fluid. As a result, the above-mentioned properties of the fluid can be adapted by the user in an application-specific manner.

Besonders bevorzugt sind Objektträgeranordnungen, bei welchen zumindest ein Teil der Zuführung von der Membran und dem Deckglas umgeben oder umschlossen ist. Beispielsweise liegt die Zuführung mit ihrem einen Ende zwischen dem Deckglas und der Membran und ist von der Membran so umschlossen, dass eine zugfeste Verbindung zwischen Zuführung (Schlauch) und Deckglas entsteht. Bei kontinuierlicher Zuführung eines Fluids (Gas) kann ein Zwischenraum zwischen Membran und Deckglas geschaffen werden, wobei das Fluid an geeigneter Stelle wieder austritt. Alternativ kann die Objektträgeranordnung so ausgestaltet sein, dass die Membran erst vor Verwendung vom Anwender aufgebracht wird, bzw. das Deckglas mit Zufuhrleitung erst direkt vor der Anwendung auf die Membran aufgelegt wird und somit immer wieder auch für verschiedene Präparate verwendet werden kann. Particularly preferred are slide assemblies in which at least a portion of the feed is surrounded or enclosed by the membrane and the coverslip. For example, the feed is at one end between the coverslip and the membrane and is surrounded by the membrane so that a high-tensile connection between the feed (tube) and cover glass is formed. With continuous supply of a fluid (gas), a gap between the membrane and cover glass can be created, wherein the fluid exits at a suitable location again. Alternatively, the slide assembly may be configured so that the membrane is applied by the user only before use, or the cover glass with supply line is placed on the membrane just before application and thus can be repeatedly used for various preparations.

Die Zuführung für das Fluid ist an verschiedenen Stellen der Objektträgeranordnung anbringbar. The delivery for the fluid is attachable to various locations of the slide assembly.

Erfindungsgemäß ist die Membran von einem Rahmen getragen, auf dem seinerseits das Deckglas aufliegt. Die Membran besitzt dann einen (geringen) Abstand zum Deckglas und verläuft im Wesentlichen parallel zu diesem. Der Rahmen kann zumindest eine Aussparung aufweisen, in welche die Zuführung zwischen Deckglas und Membran eingebracht werden kann. Damit ist es auf besonders einfache Weise möglich, eine Bewegungsrichtung des Fluids parallel zur Membran einzustellen. According to the invention the membrane is supported by a frame, on which in turn rests the cover glass. The membrane then has a (small) distance to the cover glass and runs substantially parallel to this. The frame may have at least one recess into which the supply between cover glass and membrane can be introduced. This makes it possible in a particularly simple manner to set a direction of movement of the fluid parallel to the membrane.

Die Zuführung kann auch durch eine Aussparung in dem Deckglas verlaufen. Die Aussparung kann an einem Rand des Deckglases auf der Seite der Membran vorgesehen sein, wobei die Zuführung in der Aussparung liegt und diese fluiddicht ausfüllt. The feed can also run through a recess in the cover glass. The recess may be provided on an edge of the cover glass on the side of the membrane, wherein the feed is located in the recess and fills this fluid-tight.

Alternativ kann die Zuführung in einer Perforierung der Membran angebracht sein. Alternatively, the feeder may be mounted in a perforation of the membrane.

Es können auch mehrere Zuführungen vorgesehen sein. It can also be provided several feeds.

Mit einer derartigen Objektträgeranordnung ist es demnach möglich, zwischen dem Deckglas und der Membran, auf welcher die Probe aufgebracht ist, ein Fluid einzubringen und somit zwischen Deckglas und Membran einen Überdruck zu erzeugen. Der Überdruck bewirkt eine Druckkraft, welche das Herauslösen eines Probenbereichs aus der Probe begünstigt bzw. sicherstellt. With such a slide arrangement, it is therefore possible to introduce a fluid between the cover glass and the membrane on which the sample is applied, and thus to generate an overpressure between the cover glass and the membrane. The overpressure causes a compressive force, which promotes or ensures the detachment of a sample area from the sample.

Die Objektträgeranordung wird erfindungsgemäß für die Lasermikrodissektion verwendet. Bei entsprechender der Objektträgeranordnung in einer Lasermikrodissektionseinrichtung verstärkt die Druckkraft des Fluids die Gravitationskraft und begünstigt somit ein Herauslösen eines Dissektats. Das Herauslösen des Probenausschnitts kann beispielsweise durch elektrostatische Kräfte erschwert sein. Elektrostatische Kräfte können beispielsweise aus einer Ionisierung der Probe und/oder des Objektträgers durch Reibung, etwa durch Putzen des Objektträgers, oder umgebungsbedingt, zum Beispiel durch zu hohe Luftfeuchtigkeit oder Strahlungsquellen wie in der Nähe befindliche alte Monitore, resultieren. Auch eine Luftströmung, welche von einer Klimaanlage induziert sein kann, kann einen Überdruck erzeugen, welcher das Herauslösen des Dissektats aus der Probe verhindert oder zu einem ungünstigen Umklappen der Probe entgegen der Gravität führt. The slide arrangement is used according to the invention for the laser microdissection. With corresponding slide assembly in a laser microdissection device, the pressure force of the fluid enhances the gravitational force and thus favors disseparation. The detachment of the sample section may be difficult, for example, by electrostatic forces. Electrostatic forces can result, for example, from ionization of the sample and / or the slide by friction, such as by cleaning the slide, or by ambient conditions, such as excessive humidity or radiation sources, such as nearby old monitors. Also, an airflow that may be induced by an air conditioner may create an overpressure which prevents disseparation of the sample or results in unfavorable collapse of the sample against gravity.

Es ist vorgesehen, als zugeführtes Fluid, welches den Überdruck zwischen Deckglas und Membran induziert, ein Gas oder Gasgemisch zu verwenden. It is envisaged to use a gas or gas mixture as supplied fluid which induces the overpressure between coverslip and membrane.

Besonders vorteilhaft ist die Zuführung von Luft, da diese nicht gesondert bereitgestellt werden muss. Particularly advantageous is the supply of air, as this does not have to be provided separately.

Des Weiteren ist es zweckmäßig, die Temperatur des Fluids, vor seiner Zuführung zwischen Deckglas und Membran, auf einen gewünschten Wert einzustellen. Dadurch kann die Probe, je nach Bedarf, gekühlt oder erwärmt werden. Beispielsweise ist es vorteilhaft, lebende Proben (Zellkulturen) zu erwärmen, da solche Proben oberhalb Raumtemperatur besser gedeihen oder ihre Eigenschaften beibehalten, ohne intrazelluläre Reaktionen einzuleiten, die nachfolgende Analysereaktionen verfälschen oder Rekultivierungen beeinflussen. Furthermore, it is expedient to set the temperature of the fluid to a desired value before it is fed between cover glass and membrane. This allows the sample to be cooled or heated as needed. For example, it is advantageous to heat living samples (cell cultures) as such samples above room temperature will thrive or retain their properties without inducing intracellular reactions that will falsify subsequent analysis reactions or affect recultivation.

Zum Schutz vor thermalen Veränderungsprozessen bietet sich Kühlen für Proben an, aus welchen später Nukleinsäuren, Proteine oder Metabolite analysiert werden sollen. For protection against thermal change processes, cooling is recommended for samples from which nucleic acids, proteins or metabolites are later to be analyzed.

Mit einem erfindungsgemäßen Verfahren ist es insbesondere auch möglich, den Druck und/oder Volumenstrom zwischen Deckglas und Membran auf einen gewünschten Wert so einzustellen, dass sich das Dissektat leicht aus der Probe herauslöst. Somit kann der Druck insbesondere an die Beschaffenheit der Probe angepasst werden. Zweckmäßig ist es auch, ein ionisiertes Fluid zu verwenden. Falls notwendig kann die elektrostatische Ladung der Probe somit neutralisiert werden. In particular, it is also possible with a method according to the invention to set the pressure and / or volume flow between cover glass and membrane to a desired value in such a way that the dissectate easily dissolves out of the sample. Thus, the pressure can be adapted in particular to the nature of the sample. It is also expedient to use an ionized fluid. If necessary, the electrostatic charge of the sample can thus be neutralized.

Die Erfindung ist anhand von Ausführungsbeispielen in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben. The invention is illustrated schematically by means of exemplary embodiments in the drawing and will be described in detail below with reference to the drawing.

Figurenbeschreibung figure description

1 zeigt eine Anordnung einer Probe auf einer Objektträgeranordnung in einer Lasermikrodissektionsvorrichtung zu Beginn eines laserinduzierten Schneidvorgangs in einer schematischen Schnittansicht, 1 shows an arrangement of a sample on a slide assembly in a laser microdissection device at the beginning of a laser-induced cutting process in a schematic sectional view,

2 zeigt eine Anordnung nach 1 nach dem Ablösen eines Dissektats in einer schematischen Schnittansicht, 2 shows an arrangement after 1 after detaching a dissectate in a schematic sectional view,

3 zeigt eine Objektträgeranordnung in einer schematischen Schnittansicht, 3 shows a slide arrangement in a schematic sectional view,

4 zeigt eine weitere Objektträgeranordnung in einer schematischen Schnittansicht und 4 shows a further slide arrangement in a schematic sectional view and

5 zeigt eine weitere Objektträgeranordnung in einer schematischen Schnittansicht. 5 shows a further slide arrangement in a schematic sectional view.

1 stellt eine Anordnung 100 einer Probe auf einer Objektträgeranordnung 106 in einer Lasermikrodissektionsvorrichtung zu Beginn eines laserinduzierten Schneidvorgangs schematisch dar. Die Lasermikrodissektionsvorrichtung weist ein Objektiv 102, einen auf eine Probe 112 fokussierten Laserstrahl 104 sowie einen Dissektatauffangbehälter 114 auf. Die erfindungsgemäße Objektträgeranordnung 106 weist ein Deckglas 107 auf, das sich oberhalb einer laserschneidbaren Membran 110 befindet, auf der die Probe 112 aufgebracht ist. Die Zuführung 108 ist hier als Schlauch ausgebildet. Die Membran 110, auf welcher sich die Probe 112 befindet, ist beispielsweise über einen hier nicht dargestellten Rahmen (vgl. Erläuterungen zu den 3 bis 5) auf dem Deckglas 107 positioniert. Zwischen Membran 110 und Deckglas 107 ist der Schlauch 108 angebracht. Um ein leichtes Einbringen des Schlauches 108 in den Zwischenraum 120 zu ermöglichen, weist die Objektträgeranordnung 106 an einer Stelle wenigstens eine Aussparung oder Unterbrechung auf. Hierzu siehe die 3 bis 5. Die 1 zeigt zudem, dass während des laserinduzierten Schneidvorgangs der Zwischenraum 120 zwischen Membran 110 und Deckglas 107 mit einem Gas 118 beaufschlagt wird. Das beispeilsweise ionisierte Gas 118 soll die mögliche elektrostatische Aufladung der Probe neutralisieren. Alternativ oder zusätzlich kann kontinuierlich Luft zugeführt werden. Das zugeführte Fluid kann an den Rändern, an denen das Deckglas 107 auf der Membran 110 oder dem Halterahmen der Membran 110 aufliegt, entweichen. 1 represents an arrangement 100 a sample on a slide assembly 106 in a laser microdissection device at the beginning of a laser-induced cutting operation. The laser microdissection device has an objective 102 , one on a sample 112 focused laser beam 104 and a dissektate catcher 114 on. The slide assembly according to the invention 106 has a cover glass 107 on top of a laser-cutable membrane 110 is located on the the sample 112 is applied. The feeder 108 is designed here as a hose. The membrane 110 on which the sample is 112 is, for example, via a frame not shown here (see Explanatory Notes to the 3 to 5 ) on the coverslip 107 positioned. Between membrane 110 and cover glass 107 is the hose 108 appropriate. For easy insertion of the hose 108 in the gap 120 to allow the slide assembly 106 at least one recess or interruption at one point. For this see the 3 to 5 , The 1 also shows that during the laser-induced cutting process the gap 120 between membrane 110 and cover glass 107 with a gas 118 is charged. The example ionized gas 118 should neutralize the possible electrostatic charge of the sample. Alternatively or additionally, air can be continuously supplied. The added fluid may be at the edges, where the cover glass 107 on the membrane 110 or the support frame of the membrane 110 rests, escape.

In 2 ist eine Anordnung 200 entsprechend der Anordnung 100 gemäß 1 nach einem laserinduzierten Schneidvorgang schematisch dargestellt. Ebenso wie in 1 wird hier der Zwischenraum 120, beispielsweise mit ionisiertem Gas und/oder mit Luft 218 beaufschlagt. Der im Zwischenraum 120 bestehende Überdruck wirkt (auch) in Gravitationsrichtung und unterstützt somit das Herauslösen des Dissektats 216 aus der Probe 112. Nachdem das Dissektat 216 sich aus der Probe 112 herausgelöst hat, fällt es durch die Gravitationskraft in den Dissektatauffangbehälter 114 und hinterlässt ein Loch in der Probe 112. Das Deckglas 107, das für die Aufrechterhaltung des Luftdrucks nach unten notwendig ist, ermöglicht zudem den Einsatz von Immersionsobjektiven, da das Immersionsmedium auf der Oberseite des Deckglases 107 verbleibt und nicht auf die Membran 110 gelangt und somit keine Kapillarkräfte und Oberflächenspannungen des Immersionsmediums ein Ablösen des Dissektats 216 verhindern. In 2 is an arrangement 200 according to the arrangement 100 according to 1 shown schematically after a laser-induced cutting process. As well as in 1 here is the gap 120 , for example with ionized gas and / or with air 218 applied. The one in the gap 120 existing overpressure (also) acts in the direction of gravity and thus supports the dissolution of the dissecting 216 from the sample 112 , After the dissecting 216 get out of the rehearsal 112 it has been released by the force of gravity into the dissected collecting container 114 and leaves a hole in the sample 112 , The cover glass 107 , which is necessary for the maintenance of the air pressure down, also allows the use of immersion objectives, since the immersion medium on the top of the cover glass 107 remains and not on the membrane 110 and thus no capillary forces and surface tensions of the immersion medium, a detachment of the dissectate 216 prevent.

In 3 ist eine mögliche Ausführungsform einer Objektträgeranordnung 300 schematisch dargestellt. Die Objektträgeranordnung 300 weist ein Deckglas 107 auf. An dem Deckglas 107 ist ein Rahmen 320 angebracht, welcher die Membran 110 trägt. Der Rahmen 320 weist eine Aussparung 322 auf, durch welche die Zuführung 108 verläuft. Auf der gegenüberliegenden Seite befindet sich in dem Rahmen 320 eine weitere Aussparung 324, durch welche das zugeführte Fluid entweichen kann. In 3 is a possible embodiment of a slide assembly 300 shown schematically. The slide assembly 300 has a cover glass 107 on. On the cover glass 107 is a frame 320 attached, which is the membrane 110 wearing. The frame 320 has a recess 322 on, through which the feeder 108 runs. On the opposite side is in the frame 320 another recess 324 through which the supplied fluid can escape.

In 4 ist eine weitere Ausführungsform einer Objektträgeranordnung 400 schematisch dargestellt. Die Objektträgeranordnung 400 weist ein Deckglas 107, einen Rahmen 320 mit Membran 110 sowie eine Zuführung 108 auf. Die Zuführung 108 ist in einer beispielsweise halbkreisförmigen Aussparung 422 im Deckglas 107 angebracht. Zusätzlich oder alternativ kann auch der Rahmen 320 eine beispielsweise halbkreisförmige Aussparung aufweisen. Alternativ kann die Zuführung 108 auch von oben durch das Deckglas 107 hindurch geführt werden. In 4 is another embodiment of a slide assembly 400 shown schematically. The slide assembly 400 has a cover glass 107 a frame 320 with membrane 110 as well as a feeder 108 on. The feeder 108 is in a for example semicircular recess 422 in the cover glass 107 appropriate. Additionally or alternatively, the frame may also 320 have a semicircular recess, for example. Alternatively, the feeder 108 also from above through the cover glass 107 be guided through.

In 5 ist eine weitere Ausführungsform einer Objektträgeranordnung 500 schematisch dargestellt. Gemäß den 3 und 4 weist die Objektträgeranordnung 500 ein Deckglas 107, einen Rahmen 320, eine Membran 110 sowie eine Zuführung 108 auf. Die Zuführung 108 verläuft durch eine Perforierung 522 der Membran 110. Der Rahmen 320 weist auf der gegenüberliegenden Seite eine Aussparung 324 auf, durch welche das zugeführte Fluid entweichen kann. In 5 is another embodiment of a slide assembly 500 shown schematically. According to the 3 and 4 has the slide assembly 500 a cover glass 107 a frame 320 , a membrane 110 as well as a feeder 108 on. The feeder 108 passes through a perforation 522 the membrane 110 , The frame 320 has a recess on the opposite side 324 on, through which the supplied fluid can escape.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

100 100: Anordnung einer Probe in einer Lasermikrodissektionsvorrichtung zu Beginn eines laserinduzierten Schneidvorgangs Arrangement of a sample in a laser microdissection device at the beginning of a laser-induced cutting process
102 102: Objektiv lens
104 104: Laserstrahl laser beam
106 106: Objektträgeranordnung Slide assembly
107 107: Deckglas cover glass
108 108: Schlauch, Zuführung Hose, feeder
110 110: Membran membrane
112 112: Probe sample
114 114: Dissektatauffangbehälter Dissektatauffangbehälter
118 118: ionisiertes Gas, Fluid ionized gas, fluid
120 120: Zwischenraum zwischen Deckglas und Membran Space between coverslip and membrane
200 200: Anordnung einer Probe in einer Lasermikrodissektionsvorrichtung nach einem laserinduzierten Schneidvorgang Arrangement of a sample in a laser microdissection device after a laser-induced cutting process
216 216: Dissektat Dissektat
218 218: Luft, Fluid Air, fluid
300 300: Objektträgeranordnung Slide assembly
320 320: Rahmen frame
322 322: Aussparung recess
324 324: Aussparung recess
400 400: Objektträgeranordnung Slide assembly
422 422: Aussparung im Deckglas Recess in the cover glass
500 500: Objektträgeranordnung Slide assembly
522 522: Perforierung der Membran Perforation of the membrane

Claims

Method for laser microdissection, in which a sample area ( 216 ) one on a laser-cutable membrane ( 110 ) ( 112 ) through one on the membrane ( 110 ) focused laser beam ( 104 ) from the surrounding sample ( 112 ), wherein the membrane ( 110 ) from a coverslip ( 107 ) and forming a gap ( 120 ) between membrane ( 110 ) and cover glass ( 107 ) of a frame ( 320 ) carried on the coverslip ( 107 ) and wherein before and / or during the detachment of the sample area ( 216 ) a fluid in the space ( 120 ) between membrane ( 110 ) and cover glass ( 107 ) and into the space ( 120 ) an overpressure is generated, which causes a compressive force which causes a detachment of the sample area ( 216 ) from the sample ( 112 ), wherein a gas or gas mixture is used as the fluid, and wherein the fluid region of the laser beam-detached sample area ( 216 ) and / or its detachment is assisted, and then into a collecting container ( 114 ) to be transported.

A method according to claim 1, characterized in that as the gas mixture air ( 218 ) is used.

Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the temperature of the fluid is adjusted to a desired value.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that an ionized fluid ( 118 ) is used.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the pressure and / or the volume flow of the fluid are set to a respectively desired value.