DE102014119299A1

DE102014119299A1 - scanning microscope

Info

Publication number: DE102014119299A1
Application number: DE102014119299.0A
Authority: DE
Inventors: Jonas Fölling
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2016-06-23

Abstract

Beschrieben ist ein Rastermikroskop (100) mit einem Objektiv (112), das einen Beleuchtungsstrahl (102) auf eine Probe (115) fokussiert, einem dem Objektiv (112) vorgeordneten Rasterelement (104), das zur zeitlich veränderlichen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls (102) verstellbar ist, um den fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) in einer Rasterbewegung über die Probe (115) zu führen, und einem Bildsensor (122), auf den das Objektiv (112) einen Detektionsstrahl (114) fokussiert, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) beleuchteten Probe (115) ausgeht. Der Bildsensor (122) weist mehrere durch eine Steuerung (126) einzeln auslesbare Sensorelemente (124) auf, über die der Detektionsstrahl (114) in einer der Rasterbewegung des fokussierten Beleuchtungsstrahls (102) entsprechenden Bewegung geführt wird. Es ist ein dispersives Element (120) vorbestimmter Dispersionswirkung vorgesehen, das verschiedene spektrale Anteile des Detektionsstrahl (114) auf dem Bildsensor (122) räumlich voneinander trennt. Die Steuerung (126) erfasst die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes (104), ordnet in Abhängigkeit dieser Verstellung den Sensorelementen (124) des Bildsensors (122) die spektralen Anteile des Detektionsstrahls (114) unter Berücksichtigung der vorbestimmten Dispersionswirkung des dispersiven Elementes (120) zu und liest die den jeweiligen spektralen Anteilen zugordneten Sensorelemente (124) aus.A scanning microscope (100) with a lens (112) which focuses an illumination beam (102) onto a sample (115), a raster element (104) preceding the objective (112), which is used for the time-varying deflection of the illumination beam (102), is described. is adjustable to guide the focused illumination beam (102) in a raster motion over the sample (115), and an image sensor (122) on which the lens (112) focuses a detection beam (114) that of the focused with the focused illumination beam (102) illuminated sample (115) goes out. The image sensor (122) has a plurality of sensor elements (124), which can be individually read out by a controller (126), via which the detection beam (114) is guided in a movement corresponding to the raster movement of the focused illumination beam (102). A dispersive element (120) of predetermined dispersion effect is provided, which spatially separates different spectral components of the detection beam (114) on the image sensor (122). The controller (126) detects the temporally variable adjustment of the raster element (104), assigns the spectral components of the detection beam (114) as a function of this adjustment to the sensor elements (124) of the image sensor (122) taking into account the predetermined dispersion effect of the dispersive element (120). and reads out the sensor elements (124) assigned to the respective spectral components.

Description

Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einem Objektiv, das einen Beleuchtungsstrahl auf ein Objekt fokussiert, einem dem Objektiv vorgeordneten Rasterelement, das zur zeitlich veränderlichen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls verstellbar ist, um den fokussierten Beleuchtungsstrahl in einer Rasterbewegung über das Objekt zu führen, und einem Bildsensor, auf den das Objektiv ggf. im Zusammenhang mit weiterer Optik einen Detektionsstrahl abbildet bzw. fokussiert, der von dem mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl beleuchteten Objekt ausgeht, wobei der Bildsensor mehrere durch eine Steuerung einzeln auslesbare Sensorelemente aufweist, über die der Detektionsstrahl in eine der Rasterbewegung des fokussierten Beleuchtungsstrahls entsprechenden Bewegung geführt wird.The invention relates to a scanning microscope with a lens which focuses an illumination beam onto an object, a raster element arranged upstream of the objective, which is adjustable for time-varying deflection of the illumination beam in order to guide the focused illumination beam in a raster motion over the object, and an image sensor. on which the lens, possibly in conjunction with further optics, images or focuses a detection beam emanating from the object illuminated by the focused illumination beam, wherein the image sensor has a plurality of sensor elements individually readable by a control via which the detection beam enters one of the scanning movement of the focused illumination beam corresponding movement is performed.

In der Rastermikroskopie wird mindestens ein Beleuchtungsstrahl mittels eines Objektivs auf eine Probe fokussiert. Um den Beleuchtungsstrahl in einer Raster- oder Abtastbewegung über die Probe zu führen, ist dem Objektiv ein Rasterelement (wie z.B. einen oder mehrere bewegliche Spiegel, ein AOD, d.h. ein Acousto Optical Deflector o.ä.) vorgeordnet, das den Beleuchtungsstrahl derart ablenkt, dass dieser auf der Probe die gewünschte Rasterbewegung ausführt. Üblicherweise umfasst das Rasterelement einen oder mehrere Spiegel, deren Kippbewegung durch die optische Abbildung in eine laterale Bewegung des auf der Probe durch den Beleuchtungsstrahl erzeugten Lichtpunktes umgesetzt wird. Der fokussierte Beleuchtungsstrahl rastert so die Probe Punkt für Punkt ab. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht wird dann für jeden Rasterpunkt detektiert. Schließlich wird das so erfasste Detektionssignal in einer Recheneinheit zu einem Bild zusammengesetzt.In scanning microscopy, at least one illumination beam is focused onto a sample by means of an objective. In order to guide the illumination beam in a raster or scanning movement over the sample, the objective is preceded by a raster element (such as, for example, one or more movable mirrors, an AOD, ie an Acousto Optical Deflector or the like), which deflects the illumination beam in such a way that that this performs the desired raster motion on the sample. Usually, the grid element comprises one or more mirrors whose tilting movement is converted by the optical imaging into a lateral movement of the light spot generated on the sample by the illumination beam. The focused illumination beam thus scans the sample point by point. The detection light emanating from the sample is then detected for each halftone dot. Finally, the detection signal thus detected is assembled into an image in a computing unit.

Auf dem Gebiet der Rastermikroskopie stellt die Konfokalmikroskopie ein besonders bevorzugtes Mikroskopieverfahren dar. Die grundlegende Funktionsweise dieses Mikroskopieverfahrens wird im Folgenden unter Bezugnahme auf 1 erläutert, in der ein allgemein mit 10 bezeichnetes Konfokalmikroskop rein schematisch dargestellt ist.In the field of scanning microscopy, confocal microscopy represents a particularly preferred microscopy method. The basic operation of this microscopy method will be described below with reference to FIG 1 explains in which a general with 10 Confocal microscope is shown purely schematically.

Das Konfokalmikroskop 10 hat eine in 1 nicht gezeigte Lichtquelle, die einen Beleuchtungsstrahl 12 auf einen dichroitischen Strahlteilerspiegel 14 aussendet. Der Strahlteilerspiegel 14 ist so ausgeführt, dass er Licht mit der Wellenlänge des Beleuchtungsstrahls 12 durchlässt. Der Beleuchtungsstrahl 12 geht somit durch den Strahlteilerspiegel 14 und fällt auf einen Abtastspiegel 16. Wie in 1 durch den Doppelpfeil angedeutet, ist der Abtastspiegel 16 kippbar. Durch die Kippbewegung des Abtastspiegels 16 wird der Beleuchtungsstrahl 12 entsprechend der gewünschten Rasterbewegung abgelenkt.The confocal microscope 10 has an in 1 not shown light source, the illumination beam 12 to a dichroic beam splitter mirror 14 sending out. The beam splitter mirror 14 is designed to light with the wavelength of the illumination beam 12 pass through. The lighting beam 12 thus goes through the beam splitter mirror 14 and falls on a scanning mirror 16 , As in 1 indicated by the double arrow, is the Abtastspiegel 16 tiltable. By the tilting movement of the scanning mirror 16 becomes the illumination beam 12 deflected according to the desired grid movement.

Nach Reflexion an dem Abtastspiegel 16 tritt der Beleuchtungsstrahl 12 durch eine Abtastlinse 18 der Brennweite f3, eine Tubuslinse 20 der Brennweite f2 und ein Objektiv 22 der Brennweite f1. Das Objektiv 22 fokussiert den Beleuchtungsstrahl 12 schließlich auf eine Probe 24. Durch die Kippbewegung des Abtastspiegels 16 rastert der fokussierte Beleuchtungsstrahl 12 die Probe 24 Punkt für Punkt ab. After reflection on the scanning mirror 16 occurs the illumination beam 12 through a scanning lens 18 the focal length f3, a tube lens 20 the focal length f2 and a lens 22 the focal length f1. The objective 22 focuses the illumination beam 12 finally to a trial 24 , By the tilting movement of the scanning mirror 16 the focused illumination beam is scanned 12 the sample 24 Point by point.

Ein in 1 mit 26 bezeichneter Detektionsstrahl, der von einem mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl 12 beleuchteten Rasterpunkt ausgeht, gelangt zurück in das Objektiv 22 und durchläuft den vorstehend beschriebenen Strahlengang in entgegengesetzter Richtung, bis er auf den Strahlteilerspiegel 14 fällt. Letzterer ist so ausgebildet, dass er Licht mit der Wellenlänge des Detektionsstrahls 26 reflektiert. Der Strahlteilerspiegel 14 lenkt den Detektionsstrahl 26 somit auf eine Linse 28, die den Detektionsstrahl 26 auf eine konfokal angeordnete Lochblende 30 fokussiert. Durch die Lochblende 30 wird aus dem Detektionsstrahl 26 sämtliches Licht herausgefiltert, das aus Bereichen der Probe 24 stammt, die außerhalb des durch den Beleuchtungsstrahl 12 auf der Probe 24 erzeugten Lichtpunktes stammt. Das Licht, das die Lochblende 30 passiert, gelangt schließlich auf einen Bildsensor 32, der sich über eine Steuerung 34 auslesen lässt. Das von der Probe 24 ausgehende Licht kann so für jeden einzelnen Rasterpunkt detektiert und das so erzeugte Detektionssignal zu einem Bild zusammengesetzt werden. An in 1 With 26 designated detection beam, the one with the focused illumination beam 12 illuminated grid point goes back into the lens 22 and traverses the beam path described above in the opposite direction until it reaches the beam splitter mirror 14 falls. The latter is designed to emit light at the wavelength of the detection beam 26 reflected. The beam splitter mirror 14 directs the detection beam 26 thus on a lens 28 that the detection beam 26 on a confocal arranged aperture 30 focused. Through the pinhole 30 gets out of the detection beam 26 all light filtered out of areas of the sample 24 which comes outside of the illumination beam 12 on the test 24 produced light spot originates. The light that the pinhole 30 happens, finally reaches an image sensor 32 that is about a controller 34 read out. That from the sample 24 Outgoing light can thus be detected for each individual grid point and the detection signal thus generated can be combined to form an image.

Ein für das Konfokalmikroskop 10 nach 1 im vorliegenden Kontext wesentliches Merkmal ist nun darin zu sehen, dass der von der Probe 24 ausgehende Detektionsstrahl 26 zurück auf den Abtastspiegel 16 geleitet wird, so dass der Detektionsstrahl 26 durch den Abtastspiegel 16 in gleicher Weise beeinflusst wird wie der Beleuchtungsstrahl 12. Dies hat zur Folge, dass der Detektionsstrahl 26 ortsfest auf den Bildsensor 32 fällt, während der Beleuchtungsstrahl 12 durch die Abtastbewegung des Abtastspiegels 16 eine Rasterbewegung auf der Probe 24 ausführt. Der Detektionsstrahl 26 wird durch diese Rückführung auf den Abtastspiegel 16 auf dem Bildsensor 32 gleichsam stationär gehalten. Stationär bedeutet in diesem Zusammenhang, dass zwar der Einfallswinkel, unter dem der Detektionsstrahl 26 auf den Bildsensor 32 fällt, variieren kann (im Ausführungsbeispiel gemäß 1 ist dieser Einfallswinkel stationär), nicht jedoch der Ort des Lichteinfalls. One for the confocal microscope 10 to 1 In the present context, an essential feature is to be seen in that of the sample 24 outgoing detection beam 26 back to the scanning mirror 16 is directed so that the detection beam 26 through the scanning mirror 16 is influenced in the same way as the illumination beam 12 , This has the consequence that the detection beam 26 stationary on the image sensor 32 falls while the lighting beam 12 by the scanning movement of the scanning mirror 16 a raster motion on the sample 24 performs. The detection beam 26 is due to this feedback on the scanning mirror 16 on the image sensor 32 kept as it were stationary. Stationary in this context means that although the angle of incidence, below which the detection beam 26 on the image sensor 32 falls, may vary (in the embodiment according to 1 is this angle of incidence stationary), but not the place of light.

Das Prinzip, den Detektionsstrahl 26 durch Rückführung auf das Rasterelement 16 auf dem Bildsensor 32 in vorstehend erläutertem Sinne stationär zu halten, wird auf dem vorliegenden technischen Gebiet auch als „descanning“ bezeichnet. Um ein solches „descanning“ zu ermöglichen, ist bei dem Konfokalmikroskop nach 1 der Abtastspiegel 16 in einer Ebene 36 angeordnet, die eine zu der in 1 mit 38 bezeichneten Objektebene optisch konjugierte Ebene darstellt. In 1 sind ferner eine Zwischenbildebene 40 und 42 dargestellt. Die Zwischenbildebene 40 entspricht optisch der Ebene 36 und ist zur Objektebene 38 optisch konjugiert. Die Zwischenbildebene 42 entspricht optisch der Objektebene 38 und ist optisch konjugiert zur Ebene 36.The principle, the detection beam 26 by returning to the grid element 16 on the image sensor 32 to be kept stationary in the above-explained sense, is also referred to in the present technical field as "descanning". To enable such a "descanning" is in the confocal microscope after 1 the scanning mirror 16 in a plane 36 arranged one to the in 1 With 38 Designated object plane represents optically conjugate level. In 1 are also an intermediate image plane 40 and 42 shown. The intermediate image plane 40 visually corresponds to the plane 36 and is at the object level 38 optically conjugated. The intermediate image plane 42 visually corresponds to the object plane 38 and is optically conjugate to the plane 36 ,

Für viele Anwendungen in der Mikroskopie ist es nun wichtig, eine möglichst kontinuierlich variable spektrale Detektion zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass das Detektionslicht möglichst beliebig nach Wellenlängen differenziert in verschiedene Detektionskanäle unterteilt werden kann. Dies ist beispielsweise nötig, um die von verschiedenen Farbstoffen herrührenden Detektionssignale möglichst gut voneinander zu trennen. Ebenso lassen sich unterschiedliche Bedingungen in der Probe durch Variationen im Emissionsspektrum eines Farbstoffes erkennen. Sind diese Variationen durch eine gut aufgelöste spektrale Detektion messbar, so kann der Anwender die unterschiedlichen Bedingungen in der Probe rekonstruieren. For many applications in microscopy, it is now important to enable as continuously variable as possible spectral detection. This means that the detection light can be divided into different detection channels as differentiated as possible by wavelength. This is necessary, for example, in order to separate the detection signals originating from different dyes as well as possible from each other. Similarly, different conditions in the sample can be detected by variations in the emission spectrum of a dye. If these variations can be measured by a well-resolved spectral detection, the user can reconstruct the different conditions in the sample.

Eine solche Spektraldetektion ließe sich bei einem Konfokalmikroskop der in 1 gezeigten Art vergleichsweise einfach realisieren. Hierzu wird auf 2 verwiesen, die das Konfokalmikroskop 10 in einer Abwandlung zeigt, die eine Spektraldetektion ermöglicht. Bei der Abwandlung nach 2 ist in dem Strahlengang lichtstromabwärts der Lochblende 30 ein dispersives Element 44 vorgesehen, das den Detektionsstrahl 26 in seine verschiedenen spektralen Anteile zerlegt und diese Anteile dem Bildsensor 32 zuführt. Der Bildsensor 32 weist eine Vielzahl von Sensorelementen auf, die sich über eine Steuerung 34 einzeln auslesen lassen. Die verschiedenen spektralen Anteile sind in 2 durch Teilstrahlen 26-1 bis 26-7 veranschaulicht. Dem dispersiven Element 44 ist eine Sammellinse 46 vorgeordnet, die den durch die Lochblende 30 tretenden Detektionsstrahl 26 auf das dispersive Element 44 bündelt. Such a spectral detection could be done with a confocal microscope of the 1 shown kind comparatively easy to realize. This is on 2 referenced the confocal microscope 10 in a modification that allows spectral detection. In the modification to 2 is in the beam path downstream of the pinhole 30 a dispersive element 44 provided that the detection beam 26 decomposed into its different spectral components and these components the image sensor 32 supplies. The image sensor 32 has a plurality of sensor elements, which are connected via a controller 34 read out individually. The different spectral components are in 2 by partial beams 26-1 to 26-7 illustrated. The dispersive element 44 is a condensing lens 46 preceded by the pinhole 30 passing detection beam 26 on the dispersive element 44 bundles.

Die Abwandlung nach 2 macht sich das in dem Konfokalmikroskop 10 angewandte descanning-Prinzip zunutze. Da nämlich der Detektionsstrahl 26 die Lochblende 30 als stationärer Strahl verlässt, lassen sich die verschiedenen spektralen Anteile des Detektionsstrahls 26 ungeachtet des gerade abgebildeten Rasterpunktes auf der Probe 24 durch das dispersive Element 44 leicht in der in 2 veranschaulichten Weise räumlich voneinander trennen. Beispielsweise über eine in 2 nicht gezeigte Blende kann dann exakt der interessierende spektrale Anteil aus dem Detektionsstrahl 26 herausgefiltert und dem Bildsensor 32 zugeführt werden.The modification after 2 This is done in the confocal microscope 10 Utilizing the applied descanning principle. Because the detection beam 26 the pinhole 30 As a stationary beam leaves, the different spectral components of the detection beam can be 26 regardless of the screen dot currently being displayed on the sample 24 through the dispersive element 44 easy in the 2 spatially separated from each other. For example, an in 2 not shown aperture can then exactly the spectral component of interest from the detection beam 26 filtered out and the image sensor 32 be supplied.

Anders verhält es sich bei dem sogenannten „non-descanned“-Prinzip, wie es auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie etwa bei einem Multiphotonenmikroskop in der in 3 veranschaulichten Art zur Anwendung kommt. 3 zeigt ein Multiphotonenmikroskop 50, bei dem eine nicht gezeigte Lichtquelle einen Beleuchtungsstrahl 52 auf einen kippbaren Abtastspiegel 54 richtet, an dem der Beleuchtungsstrahl 52 reflektiert wird und anschließend durch eine Abtastlinse 56 der Brennweite f3, eine Tubuslinse 58 der Brennweite f2, einen dichroitischen Strahlteilerspiegel 60 und schließlich ein Objektiv 62 der Brennweite f1 tritt, um auf eine Probe 64 fokussiert zu werden. Ein Detektionsstrahl 66, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl 52 beleuchteten Probe 64 ausgeht, gelangt zurück in das Objektiv 62 und wird dann durch den dichroitischen Spiegel 60 auf einen Bildsensor 68 gerichtet, der mit einer Steuerung 70 gekoppelt ist. Der Abtastspiegel 54 befindet sich in einer Ebene 72, die optisch konjugiert zu einer Bildebene 74 ist, in der sich die Probe 64 befindet. In 3 sind weitere Ebenen 76 und 78 gezeigt. Die Ebene 76 stellt eine Zwischenbildebene dar, die optisch der Ebene 72 entspricht und zur Objektebene 74 optisch konjugiert ist. Die Ebene 78 ist wiederum eine Zwischenbildebene, die optisch der Objektebene 74 entspricht und zur Ebene 72 optisch konjugiert ist. The situation is different with the so-called "non-descanned" principle, as in the field of fluorescence microscopy, for example in a multiphoton microscope in the in 3 illustrated type is used. 3 shows a multiphoton microscope 50 in which a light source, not shown, an illumination beam 52 on a tiltable scanning mirror 54 directed at which the illumination beam 52 is reflected and then through a Abtastlinse 56 the focal length f3, a tube lens 58 the focal length f2, a dichroic beam splitter mirror 60 and finally a lens 62 the focal length f1 occurs to a sample 64 to be focused. A detection beam 66 that of the focused with the illumination beam 52 illuminated sample 64 goes out, gets back into the lens 62 and then through the dichroic mirror 60 on an image sensor 68 directed, with a control 70 is coupled. The scanning mirror 54 is in a plane 72 that is optically conjugate to an image plane 74 is where the sample is 64 located. In 3 are more levels 76 and 78 shown. The level 76 represents an intermediate image plane that is optically the plane 72 corresponds to and to the object level 74 is optically conjugated. The level 78 is again an intermediate image plane, which is optically the object plane 74 corresponds and to the level 72 is optically conjugated.

Im Unterschied zum Konfokalmikroskop 10 nach den 1 und 2 wird bei dem Multiphotonenmikroskop 50 der Detektionsstrahl 66 durch den dichroitischen Strahlteilerspiegel 60 aus dem auf den Abtastspiegel 54 führenden Strahlengang ausgekoppelt und direkt dem Bildsensor 70 zugeführt, bevor er den Abtastspiegel 54 erreicht. Dementsprechend variiert der Detektionsstrahl 66 sowohl in seinem Einfallswinkel als auch in seinem Einfallsort auf dem Bildsensor 70, wenn der Beleuchtungsstrahl 52 seine Rasterbewegung auf der Probe 64 ausführt. Die spektrale Detektion nach 2 ist somit auf das Konfokalmikroskop 50 nach 3, das nach dem non-descanned-Prinzip arbeitet, nicht anwendbar.In contrast to the confocal microscope 10 after the 1 and 2 becomes with the multiphoton microscope 50 the detection beam 66 through the dichroic beam splitter mirror 60 out of the on the scanning mirror 54 leading beam path and coupled directly to the image sensor 70 supplied before the scanning mirror 54 reached. Accordingly, the detection beam varies 66 both in its angle of incidence and in its place of incidence on the image sensor 70 when the lighting beam 52 his grid movement on the sample 64 performs. The spectral detection after 2 is thus on the confocal microscope 50 to 3 , which works on the non-descanned principle, not applicable.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Rastermikroskop eingangs genannter Art so weiterzubilden, dass es eine einfache und zuverlässige spektrale Detektion eines auf einen Bildsensor fallenden Detektionsstrahls ermöglicht.The object of the invention is to develop a scanning microscope of the type mentioned so that it allows a simple and reliable spectral detection of a falling on an image sensor detection beam.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch das Rastermikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1.The invention solves this problem by the scanning microscope with the features of claim 1.

Erfindungsgemäß ist in dem Rastermikroskop ein dem Bildsensor vorgeordnetes dispersives Element vorbestimmter Dispersionswirkung vorgesehen, das verschiedene spektrale Anteile des Detektionsstrahls auf dem Bildsensor räumlich voneinander trennt. Die Steuerung erfasst die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes, ordnet in Abhängigkeit dieser Verstellung den Sensorelementen des Bildsensors die räumlich voneinander getrennten spektralen Anteile des Detektionsstrahl unter Berücksichtigung der vorbestimmten Dispersionswirkung des dispersiven Elementes zu und liest die den jeweiligen spektralen Anteilen zugeordneten Sensorelemente aus, um die spektral aufgelöste Erfassung des Detektionsstrahls zu ermöglichen.According to the invention, a dispersive element of predetermined dispersion effect, which separates the different spectral components of the detection beam spatially from one another on the image sensor, is provided in the scanning microscope. The controller detects the time-varying adjustment of the grid element, assigns the sensor elements of the image sensor spatially from each other in dependence on this adjustment separated spectral components of the detection beam in consideration of the predetermined dispersion effect of the dispersive element and reads out the respective spectral components associated sensor elements to enable the spectrally resolved detection of the detection beam.

Die erfindungsgemäße Lösung sieht vor, die räumliche Aufspaltung des Detektionsstrahls, die durch die spektrale Trennung mithilfe des dispersiven Elementes bewirkt wird, von der räumlichen Bewegung des Detektionsstrahls zu trennen, die von dem Rasterelement bewirkt wird. Hierzu erfasst die Steuerung die gerade vorliegende Verstellung des Rasterelementes, also beispielsweise den oder die Kippwinkel einer das Rasterelement bildenden Abtastspiegelanordnung, die aus einem oder mehreren Spiegeln gebildet sein kann. Die Steuerung berücksichtigt ferner die vorbekannte Dispersionswirkung des dispersiven Elementes. Anhand dieser beiden Informationen, nämlich der Verstellung des Rasterelementes und der Dispersionswirkung des dispersiven Elementes, ist es der Steuerung zu jedem Zeitpunkt möglich, eine exakte Zuordnung zwischen den Sensorelementen und den verschiedenen spektralen Anteilen des auf den Bildsensor fallenden Detektionsstrahls vorzunehmen. Die Art und Weise, wie die Steuerung die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes erfasst, ist in keiner Weise beschränkt. So ist es beispielsweise denkbar, dass das Rasterelement selbst eine entsprechende Information beispielsweise über einen Winkelgeber direkt an die Steuerung ausgibt. Ebenso kann aber auch ein eigener Sensor vorgesehen sein, der die aktuelle Verstellung des Rasterelementes erfasst und der Steuerung mitteilt. Was die vorbekannte Dispersionswirkung des dispersiven Elementes betrifft, so kann diese beispielsweise in einem Speicher vorgehalten werden, auf den die Steuerung zugreift, um die Dispersionswirkung bei der spektralen Detektion in Anrechnung zu bringen.The solution according to the invention provides for the spatial splitting of the detection beam, which is caused by the spectral separation by means of the dispersive element, to be separated from the spatial movement of the detection beam which is effected by the grid element. For this purpose, the controller detects the currently present adjustment of the raster element, that is, for example, the tilt angle or angles of a scanning element arrangement forming the raster element, which can be formed from one or more mirrors. The controller also takes into account the previously known dispersion effect of the dispersive element. On the basis of these two pieces of information, namely the adjustment of the raster element and the dispersion effect of the dispersive element, it is possible for the controller at any time to make an exact assignment between the sensor elements and the different spectral portions of the detection beam incident on the image sensor. The manner in which the controller detects the temporally variable adjustment of the raster element is in no way limited. So it is conceivable, for example, that the grid element itself outputs a corresponding information, for example via an angle encoder directly to the controller. Likewise, however, a separate sensor can be provided which detects the current adjustment of the grid element and notifies the controller. As far as the previously known dispersion effect of the dispersive element is concerned, it can for example be kept in a memory which is accessed by the controller in order to take into account the dispersion effect in the spectral detection.

Vorzugsweise ist das dispersive Element in einer Ebene angeordnet, die optisch konjugiert zu einer Ebene ist, in der die Probe angeordnet ist. Die Ebene, in der das dispersive Element angeordnet ist, ist vorzugsweise optisch äquivalent zu einer Ebene, in der das Rasterelement angeordnet ist. Mit „optisch äquivalent“ ist in diesem Kontext gemeint, dass die beiden genannten Ebenen in einer Weise einander optisch entsprechen, dass die räumliche Variation des Beleuchtungsstrahls am Ort des Rasterelementes in eine entsprechende räumliche Variation des Detektionsstrahls am Ort des dispersiven Elementes übersetzt wird. Besteht etwa die räumliche Variation des Beleuchtungsstrahls am Ort des Rasterelementes darin, dass der Beleuchtungsstrahl zwar in seinem Einfallswinkel, nicht jedoch in seiner Einfallsposition variiert, so gilt dies auch für den Detektionsstrahl am Ort des dispersiven Elementes, d.h. auch der Detektionsstrahl variiert seinen Einfallswinkel, nicht jedoch seine Einfallsposition. Ist in diesem Sinne die genannte optische Äquivalenz gegeben, so ist es besonders einfach, das dispersive Element geeignet zu realisieren, da sich die Einfallsposition des Detektionsstrahls am dispersiven Element nicht ändert.Preferably, the dispersive element is disposed in a plane that is optically conjugate to a plane in which the sample is disposed. The plane in which the dispersive element is arranged is preferably optically equivalent to a plane in which the raster element is arranged. By "optically equivalent" is meant in this context that the two said planes correspond in a manner to each other optically that the spatial variation of the illumination beam at the location of the grid element is translated into a corresponding spatial variation of the detection beam at the location of the dispersive element. If, for example, the spatial variation of the illumination beam at the location of the raster element is such that the illumination beam varies in its angle of incidence, but not in its incident position, this also applies to the detection beam at the location of the dispersive element, i. The detection beam also varies its angle of incidence, but not its position of incidence. If the said optical equivalence is given in this sense, then it is particularly easy to suitably realize the dispersive element, since the incidence position of the detection beam at the dispersive element does not change.

Vorzugsweise führt das Rasterelement den Beleuchtungsstrahl in einer ersten Abtastrichtung über die Probe. In diesem Fall ist das Rasterelement beispielsweise ein einzelner Spiegel, der um eine feste Achse gedreht wird, um den Beleuchtungsstrahl vorzugsweise geradlinig in der ersten Abtastrichtung über die Probe zu bewegen. Preferably, the raster element guides the illumination beam over the sample in a first scanning direction. In this case, for example, the raster element is a single mirror that is rotated about a fixed axis to move the illumination beam preferably straight across the sample in the first scanning direction.

Das Rasterelement kann den Beleuchtungsstrahl zusätzlich in einer zur ersten Abtastrichtung senkrechten zweiten Abtastrichtung über die Probe führen, wobei die Bewegung des Beleuchtungsstrahls in der ersten Abtastrichtung schneller als in der zweiten Abtastrichtung ist. In dieser Ausführung umfasst das Rasterelement beispielsweise zwei separate Abtastspiegel, von denen ein erster Spiegel die Rasterbewegung in der ersten Abtastrichtung und der zweite Abtastspiegel die Rasterbewegung in der zweiten Abtastrichtung bewirkt. Es kann jedoch ebenso ein einziger Abtastspiegel vorgesehen sein, der in beiden Abtastrichtungen bewegt wird. Diejenige Abtastrichtung, in der sich der Beleuchtungsstrahl auf der Probe schneller als in der anderen Abtastrichtung bewegt, wird im Folgenden einfach als schnelle Abtastrichtung bezeichnet. Dementsprechend wird die andere Richtung als langsame Abtastrichtung bezeichnet. The raster element may additionally guide the illumination beam across the sample in a second scanning direction normal to the first scanning direction, the movement of the illumination beam being faster in the first scanning direction than in the second scanning direction. For example, in this embodiment the raster element comprises two separate scanning mirrors, of which a first mirror effects raster motion in the first scanning direction and the second scanning mirror effects raster motion in the second scanning direction. However, it may also be provided a single scanning mirror, which is moved in both scanning directions. The one scanning direction in which the illumination beam on the sample moves faster than in the other scanning direction will be referred to simply as a fast scanning direction. Accordingly, the other direction is referred to as a slow scan direction.

Vorzugsweise ist die Dispersionswirkung des dispersiven Elementes derart vorbestimmt, dass die spektralen Anteile des Detektionsstrahls auf dem Bildsensor in einer Richtung räumlich voneinander getrennt werden, die senkrecht zu einer Richtung ist, in die der Detektionsstrahl über den Bildsensor geführt wird, wenn der Beleuchtungsstrahl in der ersten Abtastrichtung über die Probe geführt wird. Bei dieser Ausgestaltung ist also die Ebene, in der der Detektionsstrahl durch das dispersive Element spektral aufgespalten wird, parallel zur langsamen Abtastrichtung. Das dispersive Element erzeugt durch die spektrale Aufspaltung gleichsam einen „spektralen Fächer“, in dem die Spektralinformation in einer Winkelinformation codiert ist. Indem die Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlänge das dispersive Element mit unterschiedlichen Austrittswinkeln verlassen, wird also die spektrale Information in eine Winkelinformation übersetzt. Da der Scheitelpunkt des Abtastwinkels des Rasterelementes vorzugsweise in der zur Objektebene optisch konjugierten Ebene liegt, ist gleichzeitig der Abtastwinkel bezogen auf die langsame Abtastrichtung dem Winkel der spektralen Aufspaltung überlagert. Dies bedeutet, dass in dieser Ausführungsform der vorstehend genannte spektrale Fächer um den auf die langsame Abtastrichtung bezogenen Abtastwinkel hin- und herkippt. Gleichzeitig kippt der spektrale Fächer auch mit dem auf die schnelle Abtastrichtung bezogenen Abtastwinkel hin und her. Die Kippbewegung in der schnellen Abtastrichtung verläuft senkrecht zur Kippbewegung in der langsamen Abtastrichtung und ist somit von dieser entkoppelt. Preferably, the dispersion effect of the dispersive element is predetermined such that the spectral components of the detection beam on the image sensor are spatially separated in a direction perpendicular to a direction in which the detection beam is passed over the image sensor when the illumination beam in the first Scanning over the sample is performed. In this embodiment, therefore, the plane in which the detection beam is spectrally split by the dispersive element, parallel to the slow scan direction. As a result of the spectral splitting, the dispersive element generates a "spectral fan" in which the spectral information is encoded in an angle information. Since the light components of different wavelengths leave the dispersive element with different exit angles, the spectral information is thus translated into angle information. Since the vertex of the scan angle of the raster element is preferably in the plane optically conjugate to the object plane, the scanning angle is superimposed on the angle of the spectral splitting with respect to the slow scan direction. That is, in this embodiment, the above-mentioned spectral Trays will tilt back and forth around the scan angle relative to the slow scan direction. At the same time, the spectral fan also tilts back and forth with the scan angle related to the fast scan direction. The tilting movement in the fast scanning direction is perpendicular to the tilting movement in the slow scanning direction and is thus decoupled from this.

In einer besonders bevorzugten Ausführung befindet sich zwischen dem dispersiven Element und dem Bildsensor eine Detektionsoptik, die den durch das dispersive Element spektral aufgespalteten Detektionsstrahl bei jeder Verstellung der Rasterelementes in seiner Gesamtheit auf dem Bildsensor bündelt. Da zu jedem Zeitpunkt zu gewährleisten ist, dass der Detektionsstrahl, der eine der Rasterbewegung des Beleuchtungsstrahls entsprechende Bewegung auf dem Bildsensor ausführt und zudem durch das dispersive Element räumlich aufgefächert wird, in seiner Gesamtheit auf den Bildsensor fällt, trägt eine bündelnde Detektionsoptik vorstehend genannter Art dazu bei, den Bildsensor nicht zu groß werden zu lassen.In a particularly preferred embodiment is located between the dispersive element and the image sensor detection optics, which bundles the spectrally split by the dispersive detection beam at each adjustment of the grid element in its entirety on the image sensor. Since it is to be ensured at all times that the detection beam, which performs a movement corresponding to the raster movement of the illumination beam on the image sensor and is also fanned out spatially by the dispersive element, falls in its entirety onto the image sensor, a bundling detection optical system of the type mentioned above contributes thereto at, not to let the image sensor too big.

In einer Ausführungsform ist die Detektionsoptik eine Linse, in deren Brennebene das dispersive Element angeordnet ist. Eine solche Ausführungsform kann insbesondere dann gewählt werden, wenn der Bildsensor ein Flächensensor ist. In one embodiment, the detection optics is a lens in whose focal plane the dispersive element is arranged. Such an embodiment can be selected in particular when the image sensor is an area sensor.

Die Detektionsoptik kann auch ausgebildet sein, den spektral aufgespalteten Detektionsstrahl bei jeder Verstellung des Rastelementes längs einer vorgegebenen Linie auf den Bildsensor zu bündeln. In diesem Fall kann ein Liniensensor als Bildsensor verwendet werden.The detection optics can also be designed to focus the spectrally split detection beam with each adjustment of the locking element along a predetermined line on the image sensor. In this case, a line sensor can be used as the image sensor.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Detektionsoptik eine gekreuzte Anordnung von drei Zylinderlinsen, deren mittlere Zylinderlinse einen brechungswirksamen Schnitt aufweist, der in einer ersten Ebene liegt, während die brechungswirksamen Schnitte der beiden anderen Zylinderlinsen in einer zur ersten Ebene senkrechten zweiten Ebene liegen. Mit einer solchen Zylinderlinsenanordnung lässt sich der spektral aufgespaltete Detektionsstrahl besonders einfach unabhängig von der gerade vorliegenden Verstellung des Rasterelementes auf einen Liniensensor bündeln. In a particularly preferred embodiment, the detection optics comprises a crossed arrangement of three cylindrical lenses whose central cylindrical lens has a refractive effective section lying in a first plane, while the refractive cuts of the other two cylindrical lenses lie in a second plane perpendicular to the first plane. With such a cylindrical lens arrangement, the spectrally split detection beam can be particularly easily bundled on a line sensor independently of the currently present adjustment of the raster element.

Die Steuerung kann ausgebildet sein, mindestens einen der spektralen Anteile auszuwählen und nur diejenigen Sensorelemente auszulesen, die diesem ausgewählten spektralen Anteil zugeordnet sind. Dies ermöglicht eine besonders effiziente Spektraldetektion. The controller may be configured to select at least one of the spectral components and to read only those sensor elements which are assigned to this selected spectral component. This allows a particularly efficient spectral detection.

Das dispersive Element ist beispielsweise ein Prisma oder ein Gitter. Es ist jedoch nicht auf solche Ausführungsformen beschränkt. Beispielsweise kann auch ein akustooptisches Bauelement wie etwa ein AOTF als dispersives Element eingesetzt werden.The dispersive element is, for example, a prism or a grating. However, it is not limited to such embodiments. For example, an acousto-optical component such as an AOTF can also be used as a dispersive element.

Die erfindungsgemäße Lösung lässt sich gewinnbringend in jeder Art von Rastermikroskop anwenden, insbesondere jedoch in Mikroskopen, die nach dem non-descanned-Verfahren arbeiten, d.h. in denen der Detektionsstrahl auf den Bildsensor ausgekoppelt wird, bevor er das Rasterelement erreicht.The solution according to the invention can be used profitably in any type of scanning microscope, but in particular in microscopes which work according to the non-descanned method, i. in which the detection beam is coupled to the image sensor before it reaches the grid element.

Eine besonders bevorzugte Anwendung legt in der der Multiphotonenmikroskopie, bei der im Unterschied zur Konfokalmikroskopie zugunsten eines verbesserten Signal-Rausch-Verhältnisses darauf verzichtet wird, den Detektionsstrahl auf das Rasterelement zurückzuführen und anschließend durch eine Lochblende zu leiten. So wird die Multiphotonenmikroskopie häufig in stark streuenden Proben angewandt. Dies hat zur Folge, dass das Detektionslicht so stark gestreut wird, dass es gar nicht mehr aus dem zentralen Fokusbereich zu stammen scheint. Dennoch sollte dieses Licht durch den Bildsensor aufgefangen werden, um ein besseres Detektionssignal zu erreichen.A particularly preferred application is in multiphoton microscopy, in contrast to confocal microscopy in favor of an improved signal-to-noise ratio is omitted, due to the detection beam to the grid element and then to pass through a pinhole. Thus, multiphoton microscopy is often used in highly scattering samples. As a result, the detection light is scattered so much that it no longer seems to originate from the central focus area. Nevertheless, this light should be captured by the image sensor to achieve a better detection signal.

Ferner sieht der Erfindung ein Verfahren zur rastermikroskopischen Abbildung einer Probe mit den Merkmalen des Anspruchs 15 vor.Furthermore, the invention provides a method for scanning microscopic imaging of a sample with the features of claim 15.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:The invention will be explained in more detail below with reference to FIGS. Show:

1 eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Konfokalmikroskops; 1 a schematic representation of a conventional Konfokalmikroskops;

2 eine zum Zwecke der Spektraldetektion abgewandelte Ausführungsform des Konfokalmikroskops nach 1; 2 a modified for the purpose of spectral detection embodiment of the confocal microscope 1 ;

3 eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Multiphotonenmikroskops; 3 a schematic representation of a conventional multiphoton microscope;

4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Rastermikroskops; 4 a schematic representation of an embodiment of the scanning microscope according to the invention;

5 eine schematische Darstellung einer bei dem erfindungsgemäßen Rastermikroskop verwendbaren Detektionsoptik in verschiedenen Abwandlungen; und 5 a schematic representation of a usable in the scanning microscope according to the invention detection optics in various modifications; and

6 die Detektionsoptik nach 5 in einer anderen Schnittansicht. 6 the detection optics 5 in another sectional view.

4 zeigt in einer rein schematischen Darstellung ein Rastermikroskop 100, das nach dem non-descanned-Prinzip arbeitet. Bei dem Rastermikroskop 100 sendet ein in 4 nicht gezeigte Lichtquelle einen Beleuchtungsstrahl 102 auf einen Abtastspiegel 104. Wie durch den Doppelpfeil in 4 angedeutet, ist der Abtastspiegel 104 zur variablen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls 102 kippbar. In 4 sind rein schematisch eine erste Kippstellung mit durchgezogener Linie und eine zweite Kippstellung mit einer gestrichelter Linie dargestellt. Dementsprechend ist in dem Strahlengang lichtstromabwärts des Abtastspiegels 104 der Beleuchtungsstrahl 102 für die erste Kippstellung mit durchgezogener Linie und für die zweite Kippstellung mit gestrichelter Linie dargestellt. 4 shows in a purely schematic representation of a scanning microscope 100 that works on the non-descanned principle. In the raster microscope 100 sends in 4 not shown light source an illumination beam 102 on one scanning 104 , As indicated by the double arrow in 4 indicated, is the Abtastspiegel 104 for variable deflection of the illumination beam 102 tiltable. In 4 are purely schematically shown a first tilted position with a solid line and a second tilted position with a dashed line. Accordingly, in the beam path is downstream of the scanning mirror 104 the illumination beam 102 shown for the first tilted position with a solid line and for the second tilted position with a dashed line.

Der an dem Abtastspiegel 104 reflektierte Beleuchtungsstrahl durchläuft nacheinander eine Abtastlinse 106 der Brennweite f3, eine Tubuslinse 108 der Brennweite f2, einen dichroitischen Strahlteilerspiegel 110 und ein Objektiv 112 der Brennweite f1, der den Beleuchtungsstrahl 102 auf eine Probe 115 fokussiert. Entsprechend den beiden Kippstellungen des Abtastspiegels 104 sind in 4 zwei Rasterpunkte gezeigt, in denen der durch das Objektiv 112 fokussierte Beleuchtungsstrahl 102 jeweils zusammenläuft. The at the scanning mirror 104 Reflected illumination beam passes successively through a scanning lens 106 the focal length f3, a tube lens 108 the focal length f2, a dichroic beam splitter mirror 110 and a lens 112 the focal length f1, which is the illumination beam 102 on a sample 115 focused. According to the two tilt positions of the scanning mirror 104 are in 4 Two grid points are shown, in which the through the lens 112 focused illumination beam 102 each converges.

Ein Detektionsstrahl 114, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl 102 beleuchteten Probe 115 ausgeht, gelangt zurück in das Objektiv 112 und fällt anschließend auf den dichroitischen Strahlteilerspiegel 110. Der dichroitische Strahlteilerspiegel 110 ist so ausgeführt, dass er Licht mit der Wellenlänge des Beleuchtungs- bzw. Anregungsstrahls 102 durchlässt, jedoch Licht mit der Wellenlänge des Detektions- bzw. Fluoreszenzstrahls 114 reflektiert. Somit wird der Detektionsstrahl 114 am Ort des dichroitischen Strahlteilerspiegels 110 aus dem Strahlengang des Beleuchtungsstrahls 102 ausgekoppelt. Wiederum ist der Detektionsstrahl 114 in 4 für die beiden Kippstellungen des Abtastspiegels 104 mit einer durchgezogenen Linie und mit einer gestrichelten Linie dargestellt. A detection beam 114 that of the focused with the illumination beam 102 illuminated sample 115 goes out, gets back into the lens 112 and then falls on the dichroic beam splitter mirror 110 , The dichroic beam splitter mirror 110 is designed to emit light at the wavelength of the illumination or excitation beam 102 but transmits light at the wavelength of the detection or fluorescence beam 114 reflected. Thus, the detection beam 114 at the location of the dichroic beam splitter mirror 110 from the beam path of the illumination beam 102 decoupled. Again, the detection beam 114 in 4 for the two tilt positions of the scanning mirror 104 shown by a solid line and a dashed line.

Nach Reflexion an dem dichroitischen Strahlteilerspiegel 110 durchläuft der Detektionsstrahl 114 zwei Linsen 116, 118 und fällt anschließend auf ein dispersives Element 120, das einem Bildsensor 122 vorgeordnet ist. Der Bildsensor 122 weist eine Vielzahl von Sensorelementen 124 auf, die durch eine Steuerung 126 einzeln auslesbar sind. After reflection at the dichroic beam splitter mirror 110 the detection beam passes through 114 two lenses 116 . 118 and then falls on a dispersive element 120 that is an image sensor 122 is upstream. The image sensor 122 has a plurality of sensor elements 124 on that by a controller 126 are individually readable.

Das dispersive Element 120 ist in einer Zwischenbildebene 128 angeordnet, die optisch äquivalent zu einer Ebene 130 ist, in der sich der Abtastspiegel 104 befindet. Die Zwischenbildebene 128 ist zudem optisch konjugiert zu einer in 4 mit 132 bezeichneten Objektebene, in der sich die Probe 115 befindet. In 4 sind ferner Zwischenbildebenen 134, 136 und 138 dargestellt. Die Zwischenbildebene 134 ist eine Ebene, die optisch äquivalent zur Ebene 130 und optisch konjugiert zur Objektebene 132 ist. Die Zwischenbildebene 136 ist wie auch die Zwischenbildebene 138 optisch äquivalent zur Objektebene 132 und optisch konjugiert zur Ebene 130. The dispersive element 120 is in an intermediate image plane 128 arranged, the optically equivalent to a plane 130 is in which the scanning mirror 104 located. The intermediate image plane 128 is also optically conjugated to an in 4 With 132 designated object plane in which the sample 115 located. In 4 are also intermediate image planes 134 . 136 and 138 shown. The intermediate image plane 134 is a plane that is optically equivalent to the plane 130 and optically conjugate to the object plane 132 is. The intermediate image plane 136 is like the intermediate picture plane 138 optically equivalent to the object plane 132 and optically conjugate to the plane 130 ,

Da die Zwischenbildebene 128, in der sich das dispersive Element 120 befindet, optisch äquivalent zur Ebene 130 ist, in der der Abtastspiegel 104 angeordnet ist, variiert der Detektionsstrahl 114 mit Verkippen des Abtastspiegels 104 lediglich in seinem Einfallswinkel, nicht jedoch in seiner Einfallsposition am Ort des dispersiven Elementes 120. Die räumliche Variation des Detektionsstrahls 114 am Ort des dispersiven Elementes 120 entspricht insoweit der räumlichen Variation des Beleuchtungsstrahls 102 am Ort des Abtastspiegels 104. Der Detektionsstrahl 114 ist also am Ort des dispersiven Elementes 120 stationär. Since the intermediate image plane 128 in which the dispersive element 120 is optically equivalent to the plane 130 is where the scanning mirror 104 is arranged, the detection beam varies 114 with tilting of the scanning mirror 104 only in its angle of incidence, but not in its incidence position at the location of the dispersive element 120 , The spatial variation of the detection beam 114 at the location of the dispersive element 120 corresponds to the extent of the spatial variation of the illumination beam 102 at the location of the scanning mirror 104 , The detection beam 114 is thus at the place of the dispersive element 120 stationary.

Das dispersive Element 120 hat eine vorbestimmte Dispersionswirkung, die dazu führt, dass der Detektionsstrahl 114 in seine verschiedenen spektralen Anteile aufgespalten wird. Die spektralen Anteile sind in der Darstellung nach 4 in Form von Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 veranschaulicht. Wiederum sind die Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 für die beiden in 4 dargestellten Kippstellungen des Abtastspiegels 104 einmal mit durchgezogenen Linien und einmal mit gestrichelten Linien dargestellt. The dispersive element 120 has a predetermined dispersion effect, which causes the detection beam 114 is split into its different spectral components. The spectral components are shown in the illustration 4 in the form of partial beams 114-1 to 114-7 illustrated. Again, the partial beams 114-1 to 114-7 for the two in 4 shown tilt positions of the scanning mirror 104 once shown with solid lines and once with dashed lines.

Wie man der Darstellung nach 4 entnehmen kann, bilden die Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 gleichsam einen spektralen Fächer, in dem die Spektralinformation in einer Winkelinformation codiert ist. Diese Winkelinformation ist durch die Winkel gegeben, unter denen die verschiedenen Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 aus dem dispersiven Element 120 austreten und dann auf die einzelnen Sensorelemente 124 des Bildsensors 122 treffen. How to follow the diagram 4 can take, form the partial beams 114-1 to 114-7 as it were a spectral fan in which the spectral information is encoded in an angle information. This angle information is given by the angles under which the different partial beams 114-1 to 114-7 from the dispersive element 120 emerge and then on the individual sensor elements 124 of the image sensor 122 to meet.

In der Ausführungsform nach 4 soll der Beleuchtungsstrahl 102 die Probe 115 in zwei zueinander senkrechten Abtastrichtungen abtasten. Dabei erfolgt die Abtastung in einer Richtung schneller als in der anderen Richtung. Die beiden Abtastrichtungen werden in zwei entsprechende Richtungen auf dem Bildsensor 122 umgesetzt. Diese entsprechenden Richtungen werden im Folgenden der Einfachheit halber auch als Abtastrichtungen bezeichnet. In the embodiment according to 4 should the lighting beam 102 the sample 115 in two mutually perpendicular scanning directions. The scanning takes place in one direction faster than in the other direction. The two scanning directions are in two corresponding directions on the image sensor 122 implemented. These respective directions are hereinafter also referred to as scanning directions for the sake of simplicity.

In dem Ausführungsbeispiel nach 4 ist das dispersive Element 120 so ausgeführt, dass die Ebene, in der der Detektionsstrahl 114 durch das dispersive Element 120 spektral aufgespalten wird, parallel zur langsamen Abtastrichtung liegt. Dabei ist die Ebene der spektralen Aufspaltung in der Darstellung nach 4 durch die Zeichenebene gegeben. Somit bewegt sich der durch das dispersive Element 120 gebildete, aus den Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 gebildete spektrale Fächer in der Zeichenebene, wenn der Abtastspiegel 114 in der langsamen Abtastrichtung bewegt wird. Gleichzeitig kippt der durch die Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 gebildete spektrale Fächer in der schnellen Abtastrichtung senkrecht zur Zeichenebene nach 4., wenn der Abtastspiegel in der schnellen Abtastrichtung bewegt wird.In the embodiment according to 4 is the dispersive element 120 so executed that the plane in which the detection beam 114 through the dispersive element 120 spectrally split, is parallel to the slow scan direction. The level of the spectral splitting is shown in the illustration 4 given by the drawing plane. Thus, the moves through the dispersive element 120 formed, from the partial beams 114-1 to 114-7 formed spectral fan in the drawing plane when the scanning mirror 114 is moved in the slow scan direction. At the same time it tilts through the partial beams 114-1 to 114-7 formed spectral fan in the fast scanning direction perpendicular to the plane after 4 ., When the scanning mirror is moved in the fast scanning direction.

Um eine spektral aufgelöste Erfassung des Detektionsstrahls 114 zu ermöglichen, erfasst die Steuerung 126 die gerade vorliegende Verkippung des Abtastspiegels 104 und ermittelt daraus unter Berücksichtigung der vorgegebenen dispersiven Wirkung des dispersiven Elementes 120 diejenigen Sensorelemente 124, die gerade einen zu betrachtenden spektralen Anteil des Detektionsstrahls 114 in Form eines der Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 empfangen. Diese Sensorelemente 124 liest die Steuerung 126 dann zum jeweiligen Zeitpunkt aus, um zu diesem Zeitpunkt den betrachteten spektralen Anteil des Detektionsstrahls 114 zu erfassen. To a spectrally resolved detection of the detection beam 114 to enable capture the control 126 the currently present tilt of the scanning mirror 104 and determines therefrom, taking into account the predetermined dispersive effect of the dispersive element 120 those sensor elements 124 , which is just a spectral portion of the detection beam to be considered 114 in the form of one of the partial beams 114-1 to 114-7 receive. These sensor elements 124 reads the controller 126 then at the respective time to at this time the considered spectral component of the detection beam 114 capture.

5 zeigt in einer rein schematischen Darstellung eine Detektionsoptik 140, die zwischen dem dispersiven Element 120 und dem Bildsensor 122 angeordnet ist. Das Ausführungsbeispiel nach 4 kann durch die Detektionsoptik 140 ergänzt werden. 5 shows in a purely schematic representation of a detection optics 140 that is between the dispersive element 120 and the image sensor 122 is arranged. The embodiment according to 4 can through the detection optics 140 be supplemented.

In einer ersten Ausführungsform ist die Detektionsoptik 140 allein aus einer Sammellinse 142 gebildet, die eine Brennebene 144 aufweist. Die Sammellinse 142 bündelt die den spektralen Anteilen des Detektionsstrahls 114 entsprechenden Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 so auf den Bildsensor 122, dass diese senkrecht auf den Bildsensor 122 fallen. In dem Beispiel nach 5 bewegt sich der in der x-z-Ebene in die Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 aufgespaltene Detektionsstrahl 114 in x-Richtung, wenn der Beleuchtungsstrahl 102 die Probe 115 in der langsamen Abtastrichtung abtastet. Demgegenüber bewegt er sich auf dem Bildsensor 122 in y-Richtung, wenn der Beleuchtungsstrahl 102 die Probe 115 in der schnellen Abtastrichtung abtastet. In dieser Ausführungsform ist der Bildsensor 122 infolge der vorstehend beschriebenen Bewegungen des Detektionsstrahls 114 vorzugsweise als Flächensensor ausgebildet, in dem die einzelnen Sensorelemente 124 matrixartig in Zeilen (x-Richtung) und Spalten (y-Richtung) angeordnet sind. Da die in einer bestimmten Spalte (y-Richtung) angeordneten Sensorelemente 124 jeweils den gleichen spektralen Anteil empfangen, können die aus den Sensorelementen 124 dieser Spalte ausgelesenen Signale bei der spektralen Detektion integriert werden.In a first embodiment, the detection optics 140 solely from a condensing lens 142 formed a focal plane 144 having. The condenser lens 142 This bundles the spectral components of the detection beam 114 corresponding partial beams 114-1 to 114-7 so on the image sensor 122 that these are perpendicular to the image sensor 122 fall. In the example below 5 moves in the xz-plane in the sub-beams 114-1 to 114-7 split detection beam 114 in the x-direction when the illumination beam 102 the sample 115 scans in the slow scan direction. In contrast, he moves on the image sensor 122 in the y direction when the illumination beam 102 the sample 115 scans in the fast scan direction. In this embodiment, the image sensor is 122 due to the above-described movements of the detection beam 114 preferably designed as an area sensor in which the individual sensor elements 124 matrix-like in rows (x-direction) and columns (y-direction) are arranged. Since arranged in a certain column (y-direction) sensor elements 124 each receive the same spectral component, the from the sensor elements 124 This column read signals are integrated in the spectral detection.

Anstelle eines Flächensensors kann auch ein Liniensensor als Bildsensor 122 verwendet werden. In diesem Fall ist die Detektionsoptik 140 so ausgebildet, dass sie die Teilstrahlen 114-1 bis 114-7 auf eine einzelne Linie fokussiert. Die lässt sich beispielsweise mit einer Anordnung aus drei Zylinderlinsen realisieren. Auch für die Ausführungsform wird im Folgenden auf 5 Bezug genommen. Die Linse 142 ist in diesem Fall als Zylinderlinse ausgebildet, die den durch sie hindurchtretenden Detektionsstrahl 114 nur in der x-z-Ebene brechungswirksam beeinflusst. Zudem sind zwei weitere Zylinderlinsen 144 und 146 vorgesehen, von denen sich die Linse 144 lichtstromaufwärts und die Linse 146 lichtstromabwärts der mittleren Zylinderlinse 142 befindet. Die Zylinderlinsen 144 und 146 sind mit ihren Zylinderachsen senkrecht zur mittleren Zylinderlinse 142 angeordnet. Demnach beeinflussen die Zylinderlinsen 144 und 146 den durch sie hindurchtretenden Detektionsstrahl 114 brechungswirksam nur in der y-z-Ebene, wie die Darstellung nach 6 veranschaulicht, die einen y-z-Schnitt durch die Detektionsoptik 140 zeigt. In den 5 und 6 wirken also die jeweils gestrichelt dargestellten Linsen nur auf die senkrecht zur Zeichenebene orientierte Achse. Durch eine geeignete Wahl der Linsenabstände lässt sich so erreichen, dass der Detektionsstrahl 114, der durch diese gekreuzte Anordnung der Zylinderlinsen 142, 144, 146 tritt, in y-Richtung nur noch in seinem Einfallswinkel, nicht jedoch in seiner Einfallsposition variiert. Dies erlaubt den Einsatz einen Liniensensors, d.h. eines einzeiligen Detektors, der zu jedem Zeitpunkt die gesamte Lichtmenge detektiert. Instead of a surface sensor can also be a line sensor as an image sensor 122 be used. In this case, the detection optics 140 designed so that they are the partial beams 114-1 to 114-7 focused on a single line. This can be realized, for example, with an arrangement of three cylindrical lenses. Also for the embodiment is hereinafter on 5 Referenced. The Lens 142 is formed in this case as a cylindrical lens, which passes through the detection beam 114 only affected in the xz-plane. There are also two other cylindrical lenses 144 and 146 provided, of which the lens 144 light upstream and the lens 146 downstream of the middle cylindrical lens 142 located. The cylindrical lenses 144 and 146 are with their cylinder axes perpendicular to the middle cylinder lens 142 arranged. Accordingly, the cylindrical lenses influence 144 and 146 the detection beam passing through them 114 refractive effect only in the yz plane, as the representation after 6 illustrates a yz-section through the detection optics 140 shows. In the 5 and 6 Thus, the lenses shown in dashed lines act only on the axis oriented perpendicular to the plane of the drawing. By a suitable choice of the lens spacings can be achieved so that the detection beam 114 , by this crossed arrangement of cylindrical lenses 142 . 144 . 146 occurs, in the y-direction only varies in its angle of incidence, but not in its incidence position. This allows the use of a line sensor, ie a single-line detector, which detects the total amount of light at all times.

Claims

Scanning microscope with a lens ( 112 ), which has a lighting beam ( 102 ) to a sample ( 115 ), the lens ( 112 ) upstream grid element ( 104 ), the time-varying deflection of the illumination beam ( 102 ) is adjustable to the focused illumination beam ( 102 ) in a raster motion over the sample ( 115 ) and an image sensor ( 122 ) to which the lens ( 112 ) a detection beam ( 114 ), which differs from that with the focused illumination beam ( 102 ) illuminated sample ( 115 ), the image sensor ( 122 ) several by a controller ( 126 ) individually readable sensor elements ( 124 ), over which the detection beam ( 114 ) in one of the raster motion of the focused illumination beam ( 102 ) is guided, characterized by a the image sensor ( 122 ) upstream dispersive element ( 120 ) predetermined dispersion effect, the different spectral components of the detection beam ( 114 ) on the image sensor ( 122 ) spatially separated, whereby the controller ( 126 ) for the spectrally resolved detection of the detection beam ( 114 ) the temporally variable adjustment of the grid element ( 104 ), depending on this adjustment the sensor elements ( 124 ) of the image sensor ( 122 ) the spatially separated spectral components of the detection beam ( 114 ) taking into account the predetermined dispersion effect of dispersive element ( 120 ) and assigns the sensor elements assigned to the respective spectral components ( 124 ).

Scanning microscope according to claim 1, characterized in that the dispersive element ( 120 ) in one level ( 128 ) which is optically conjugate to a plane ( 132 ) in which the sample ( 115 ) is arranged.

Scanning microscope according to claim 2, characterized in that the plane ( 128 ), in which the dispersive element ( 120 ) is optically equivalent to a plane ( 130 ) in which the raster element ( 104 ) is arranged.

Scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the raster element ( 104 ) the illumination beam ( 102 ) in a first scanning direction over the sample ( 115 ) leads.

Scanning microscope according to claim 4, characterized in that the grid element ( 104 ) the illumination beam ( 102 ) additionally in a second scanning direction perpendicular to the first scanning direction over the sample ( 115 ), whereby the movement of the illumination beam ( 102 ) is faster in the first scanning direction than in the second scanning direction.

Scanning microscope according to claim 4 or 5, characterized in that the dispersion effect of the dispersive element ( 120 ) is predetermined such that the spectral components of the detection beam ( 114 ) on the image sensor ( 122 ) are spatially separated in a direction which is perpendicular to a direction in which the detection beam ( 114 ) via the image sensor ( 122 ) is guided when the illumination beam ( 102 ) in the first scanning direction over the sample ( 115 ) to be led.

Scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized by a between the dispersive element ( 120 ) and the image sensor ( 122 ) arranged detection optics ( 140 ) passing through the dispersive element ( 120 ) Spectrally split detection beam ( 114 ) with each adjustment of the grid element ( 104 ) in its entirety on the image sensor ( 122 ) bundles.

Scanning microscope according to claim 7, characterized in that the detection optics is a lens in the focal plane of the dispersive element ( 120 ) is arranged.

Scanning microscope according to claim 7 or 8, characterized in that the detection optics ( 140 ), the spectrally split detection beam ( 114 ) with each adjustment of the grid element ( 104 ) along a predetermined line on the image sensor ( 122 ) to bundle.

Scanning microscope according to claim 9, characterized in that the detection optics ( 140 ) a crossed array of three cylindrical lenses ( 142 . 144 . 146 ) whose middle cylindrical lens ( 142 ) has a refractive cut located in a first plane while the refractive cuts of the other two cylindrical lenses ( 144 . 146 ) lie in a second plane perpendicular to the first plane.

Scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the controller ( 126 ) selects at least one of the spectral components and only those sensor elements ( 124 ), which are assigned to this selected spectral component.

Scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the image sensor ( 122 ) is an area sensor or a line sensor.

Scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the dispersive element ( 120 ) is a prism or a grid.

Scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that it is used for the spectrally resolved detection of the detection beam ( 114 ) formed in the non-descanned method.

Method for scanning microscopic imaging of a sample ( 114 ), in which a lighting beam ( 102 ) by means of a lens ( 112 ) to the test ( 114 ), the lens ( 112 ) upstream raster element ( 104 ) for the time-varying deflection of the illumination beam ( 102 ) is adjusted to the focused illumination beam ( 102 ) in a raster motion over the sample ( 114 ) and by means of the lens ( 112 ) a detection beam ( 114 ), which differs from that with the focused illumination beam ( 102 ) illuminated sample ( 114 ), to an image sensor ( 122 ), wherein the image sensor ( 122 ) several by a controller ( 126 ) individually readable sensor elements ( 124 ), over which the detection beam ( 114 ) in one of the raster motion of the focused illumination beam ( 102 ) corresponding movement, characterized in that different spectral components of the detection beam ( 114 ) on the image sensor ( 122 ) by means of an image sensor ( 122 ) upstream dispersive element ( 120 ) predetermined dispersion effect are spatially separated from each other, wherein for the spectrally resolved detection of the detection beam ( 114 ) by means of the controller ( 126 ) the temporally variable adjustment of the grid element ( 104 ) is detected, depending on this adjustment the sensor elements ( 124 ) of the image sensor ( 122 ) the spatially separated spectral components of the detection beam ( 114 ) taking into account the predetermined dispersion effect of the dispersive element ( 120 ) and the sensor elements associated with the respective spectral components ( 124 ).