DE102014116174A1

DE102014116174A1 - Method for generating an image of a sample

Info

Publication number: DE102014116174A1
Application number: DE102014116174.2A
Authority: DE
Inventors: Jörg Siebenmorgen; Helmut Lippert; Tiemo Anhut
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2016-05-12
Also published as: WO2016071033A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Probe, bei dem ein Probenbereich über einen Beleuchtungsstrahlengang in einer Lichtblattebene mit zu einem Lichtblatt (9) geformten Licht beleuchtet wird. Von dem Probenbereich abgestrahltes Licht wird entlang einer axialen Detektionsrichtung, die mit der Lichtblattebene einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, über ein Detektionsobjektiv (4) auf einen flächenförmigen Detektor (5) geleitet. Im Detektor (5) wird pixelweise die Intensität registriert und in Sätze von Eingabebilddaten von Bildern umgewandelt. Dabei wird ein erster Satz von Eingabebilddaten und mindestens ein zweiter Satz von Eingabebilddaten erzeugt. Aus den Sätzen von Eingabebilddaten wird durch Verrechnung ein Ausgabesatz von Ausgabebilddaten eines Ausgabebildes erzeugt, in welchem ein Hintergrundsignal gegenüber einzelnen Bildern aus den Eingabebilddaten reduziert ist. Der erste Satz von Eingabebilddaten wird dabei für ein erstes Lichtblatt (9) in der Fokusebene des Detektionsobjektivs (4), der zweite und der dritte Satz für ein zweites und drittes Lichtblatt oberhalb bzw. unterhalb der Fokusebene erzeugt. Der Dynamikumfang des Ausgabebildes ist gegenüber einzelnen Bildern aus den Eingabebilddaten nicht reduziert.The invention relates to a method for producing an image of a sample, in which a sample area is illuminated by means of an illumination beam path in a plane of the light sheet having light shaped into a light sheet (9). Light emitted by the sample area is guided via a detection objective (4) onto a planar detector (5) along an axial detection direction, which encloses a non-zero angle with the plane of the light sheet. In the detector (5), the intensity is registered pixel by pixel and converted into sets of input image data of images. In doing so, a first set of input image data and at least a second set of input image data are generated. From the sets of input image data, an output set of output image data of an output image in which a background signal is reduced to individual images from the input image data is generated by computation. The first set of input image data is generated for a first light sheet (9) in the focal plane of the detection objective (4), and the second and the third set for a second and third light sheet above or below the focal plane. The dynamic range of the output image is not reduced with respect to individual images from the input image data.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Probe. Bei einem solchen Verfahren wird ein Probenbereich in der Probe über einen Beleuchtungsstrahlengang in einer Lichtblattebene mit zu einem Lichtblatt geformtem Licht beleuchtet. Von dem Probenbereich abgestrahltes Licht wird entlang einer axialen Detektionsrichtung, die mit der Lichtblattebene einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, über ein Detektionsobjektiv auf einen flächenförmigen Detektor geleitet. Im Detektor wird pixelweise die Intensität registriert und in Sätze von Eingabebilddaten von Bildern umgewandelt. Dabei wird ein erster Satz von Eingabebilddaten und mindestens ein zweiter Satz von Eingabebilddaten erzeugt. Aus den Sätzen von Eingabebilddaten wird durch Verrechnung ein Ausgabesatz von Ausgabedaten eines Ausgabebildes erzeugt, in welchem ein Hintergrundsignal gegenüber Bildern aus den Eingabebilddaten reduziert ist. Die Eingabebilddaten können grundsätzlich zur Erzeugung von einzelnen Bildern verwendet werden, dieser Schritt ist jedoch aufgrund der Verrechnung nicht notwendig. Auch können mehrere Eingabebildsätze in einem Bild verschmolzen werden. The invention relates to a method for producing an image of a sample. In such a method, a sample area in the sample is illuminated by means of an illumination beam path in a light plane with light shaped into a light sheet. Light emitted by the sample area is guided via a detection objective onto a planar detector along an axial detection direction which encloses a non-zero angle with the plane of the light sheet. In the detector, the intensity is registered pixel by pixel and converted into sets of input image data of images. In doing so, a first set of input image data and at least a second set of input image data are generated. From the sets of input image data, an output set of output data of an output image in which a background signal is reduced from images from the input image data is generated by computation. The input image data can basically be used to generate individual images, but this step is not necessary due to the calculation. Also, multiple input image sets can be merged into one image.

Die Untersuchung biologischer Proben, bei der die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt erfolgt, dessen Ebene die optische Achse der Detektion in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet, hat in jüngster Zeit stark an Bedeutung gewonnen. Üblicherweise schließt das Lichtblatt dabei mit der Detektionsrichtung, die in der Regel der optischen Achse des Mikroskopobjektivs entspricht, einen von Null verschiedenen Winkel, oft einen rechten Winkel ein. Solche Untersuchungsverfahren werden überwiegend in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt und unter dem Begriff LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy) zusammengefasst. Ein Beispiel ist das in der DE 102 57 423 A1 und der darauf aufbauenden WO 2004/0535558 A1 beschriebene und als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichnete Verfahren, mit dem sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen lassen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zur Schnittebene ist eine bildliche/räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich. The study of biological samples, in which the illumination of the sample is carried out with a light sheet whose plane intersects the optical axis of the detection at a non-zero angle, has recently become very important. Usually, the light sheet includes with the detection direction, which usually corresponds to the optical axis of the microscope objective, a non-zero angle, often a right angle. Such examination methods are predominantly used in fluorescence microscopy and combined under the term LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy). An example is that in the DE 102 57 423 A1 and the building on it WO 2004/0535558 A1 described and referred to as SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) method, which can be used in a relatively short time to create spatial images of thicker samples. On the basis of optical sections combined with a relative movement in a direction perpendicular to the section plane, a pictorial / spatially extended representation of the sample is possible.

Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen-Mikroskopie weisen die LSFM-Verfahren mehrere Vorzüge auf. Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM-Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei dem Verfahren am geringsten, was die Gefahr des Ausbleichens einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird. Compared with other established methods such as confocal laser scanning microscopy or two-photon microscopy, the LSFM methods have several advantages. Since the detection can be done in the far field, larger sample areas can be detected. Although the resolution is somewhat lower than with confocal laser scanning microscopy, the LSFM technique allows thicker samples to be analyzed, since the penetration depth is higher. In addition, the light exposure of the samples in the process is the lowest, which reduces the risk of bleaching a sample, since the sample is illuminated only by a thin light sheet at a non-zero angle to the detection direction.

Anstelle eines rein statischen Lichtblatts kann auch ein quasi-statisches Lichtblatt erzeugt werden, indem die Probe mit einem Lichtstrahl schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, indem der Lichtstrahl einer sehr schnellen Relativbewegung zu der zu beobachtenden Probe unterworfen wird und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinander gereiht wird. Dabei wird die Integrationszeit der Kamera, auf deren Sensor die Probe abgebildet wird, so gewählt, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird. Instead of a purely static light sheet, a quasi-static light sheet can be generated by quickly scanning the sample with a light beam. The light sheet-like illumination is created by the light beam is subjected to a very rapid relative movement to the sample to be observed and this time sequentially repeatedly strung together. The integration time of the camera, on the sensor of which the sample is imaged, is selected so that the scan is completed within the integration time.

Aufgrund der Beleuchtung mit einem sehr dünnen Lichtblatt, die oft – aber nicht zwingend – rechtwinklig zur Detektionsachse erfolgt, wird nur ein kleiner axialer Teil der Probe im Detektionsvolumen beleuchtet und somit ein optischer Schnitt erzeugt. Um einen anderen Bereich der Probe zu beobachten, wird die Probe – unabhängig von der Optik – mit einer Positioniereinheit für die Probe durch das Lichtblatt gefahren. Diese Positioniereinheit kann beispielsweise einen ansteuerbaren Probentisch, der in allen drei Raumrichtungen beweglich ist, umfassen. Dabei werden entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs optische Schnitte an verschiedenen Probenpositionen aufgenommen. Anhand der Bildstapel lässt sich ein räumliches Bild der Probe rekonstruieren. Alternativ kann auch das Lichtblatt verfahren werden, wobei dann das Detektionsobjektiv nachfokussiert werden muss. Due to the illumination with a very thin light sheet, which is often - but not necessarily - perpendicular to the detection axis, only a small axial part of the sample is illuminated in the detection volume and thus produces an optical section. To observe another area of the sample, the sample is - regardless of the optics - driven through the light sheet with a positioning unit for the sample. This positioning unit may, for example, comprise a controllable sample table, which is movable in all three spatial directions. In this case, optical sections are recorded at different sample positions along the optical axis of the detection objective. Based on the image stacks, a spatial image of the sample can be reconstructed. Alternatively, the light sheet can be moved, in which case the detection lens must be refocused.

Das Lichtblatt liegt dabei im räumlichen Mittel in einer Lichtblattebene, weist jedoch selbst eine endliche Dicke, d.h. eine axiale Ausdehnung in einem Bereich ober- und unterhalb der Lichtblattebene auf, wobei seine Dicke in Ausbreitungsrichtung variieren kann, wenn beispielsweise Gaußstrahlen verwendet werden, und dann in der Regel im Bereich der optischen Achse des Detektionsobjektivs, dem Zentrum des Gesichtsfeldes, am dünnsten ist. Verwendet man Besselstrahlen oder Mathieustrahlen, so ist die Dicke des Lichtblatts konstant. Aufgrund des optischen Schnitts, d.h. der Lokalisierung des Lichtblatts in einer Lichtblattebene, werden keine Fluoreszenzsignale außerhalb des Fokusvolumens bzw. der Lichtblattebene detektiert und das Hintergrundsignal, d.h. das Signal fluoreszierender Bestandteile aus höher- oder tieferliegenden Schichten der Probe, ist reduziert. Gegenüber üblichen Weitfeldmikroskopen führt dies zu einer deutlichen Verbesserung im Signal-Rausch-Verhältnis. The light sheet lies in the spatial average in a Lichtblattebene, but even has a finite thickness, i. an axial extent in an area above and below the plane of the light sheet, wherein its thickness in the direction of propagation can vary, for example, when Gaussian be used, and then usually in the region of the optical axis of the detection lens, the center of the field of view is thinnest. If Bessel rays or Mathieu rays are used, the thickness of the light sheet is constant. Due to the optical section, i. the localization of the light sheet in a light sheet plane, no fluorescence signals are detected outside the focus volume and the light sheet plane, and the background signal, i. the signal of fluorescent constituents from higher or lower layers of the sample is reduced. Compared with conventional wide field microscopes, this leads to a significant improvement in the signal-to-noise ratio.

Das Lichtblatt regt nur einen schmalen Bereich in der Probe an und erzeugt somit einen optischen Schnitt (sectioning), welcher in Sichtrichtung des Detektionsobjektivs in einer hohen axialen Auflösung resultiert. Jedoch kommt es durch Streuung des Lichtblatts in der Probe zur Anregung auch in Bereichen außerhalb des Lichtblatts. Die in diesen Bereichen emittierte Fluoreszenz wird zusammen mit der das Signal tragenden Fluoreszenz als Hintergrundsignal detektiert und erzeugt außerfokales Licht. Dieses unscharf abgebildete außerfokale Licht führt zu einer Verringerung des Kontrasts und zu einem schlechteren optischen Schnitt. The light sheet stimulates only a narrow area in the sample and thus produces an optical sectioning which results in a high axial resolution in the direction of view of the detection objective. However, scattering of the light sheet in the sample also causes excitation in areas outside the sheet of light. The fluorescence emitted in these regions is detected together with the fluorescence carrying the signal as a background signal and produces extra-focal light. This out of focus imaged extra-focal light leads to a reduction in contrast and a poorer optical section.

Zur Erhöhung des Kontrasts bzw. zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses sind im Stand der Technik verschiedene Verfahren bekannt. In einem Artikel von P. J. Keller et al., „Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structuredillumination microscopy“, erschienen in Nature Methods im Juli 2010 (DOI: 10.1038/NMETH.1476) wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Probe mit einem strukturierten Lichtblatt beleuchtet wird. Das Lichtblatt weist eine streifenförmige Intensitätsmodulation in der Lichtblattebene und senkrecht zur Ausbreitungsrichtung auf. Durch die Aufnahme von mindestens drei Bildern bei unterschiedlicher Phasenlage der Intensitätsmodulation und anschließender Verrechnung der Bilder kann ein Bild der Probe mit reduziertem außerfokalem Anteil und damit höherem Kontrast erzeugt werden. To increase the contrast or to improve the signal-to-noise ratio, various methods are known in the prior art. In an article by PJ Keller et al., "Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured illumination microscopy", published in Nature Methods in July 2010 (DOI: 10.1038 / NMETH.1476) describes a method in which the sample is illuminated with a structured light sheet. The light sheet has a strip-shaped intensity modulation in the Lichtblattebene and perpendicular to the propagation direction. By recording at least three images at different phase angles of the intensity modulation and subsequent billing of the images, an image of the sample can be generated with a reduced non-focal proportion and thus a higher contrast.

Ein ähnliches Verfahren wird in einem Artikel von J. Mertz et al. „Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection“, erschienen im Jahr 2010 in Journal of Biometrical Optics 15(1), S. 016027-1 ff. , beschrieben. Hier werden zwei Bilder miteinander verrechnet. Das erste Bild wird mit einem strukturierten Lichtblatt mit streifenförmiger Intensitätsmodulation aufgenommen, ein weiteres Bild wird mit einem unmodulierten Lichtblatt aufgenommen. Nach Verrechnung beider Bilder kann ein Bild der Probe mit reduziertem außerfokalem Anteil und damit höherem Kontrast erzeugt werden. A similar process is described in an article by J. Mertz et al. "Scanning light-sheet microscopy in the whole brain with mouse brain rejection", published in 2010 in Journal of Biometric Optics 15 (1), pp 016027-1 ff. , described. Here are two images offset against each other. The first image is taken with a structured light sheet with strip-shaped intensity modulation, another image is taken with an unmodulated light sheet. After both images have been calculated, an image of the sample can be generated with reduced non-focal proportion and thus higher contrast.

In der DE 10 2013 208 872.8 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem erst ein Bild mit einem breiten Lichtblatt und im Anschluss ein zweites Bild mit einem dünnen Lichtblatt aufgenommen wird. Beide Lichtblätter liegen in der Fokusebene des Detektionsobjektivs. Das dünne Lichtblatt liegt vollständig innerhalb des dicken Lichtblatts. Das dünne Lichtblatt regt insbesondere den Teil der Probe an, der in der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegt und zu einem geringeren, aber störenden Teil auch außerfokale Bereiche aufgrund von Streuung. Das dicke Lichtblatt regt sowohl den fokalen Bereich an, aber aufgrund seiner Dicke auch verstärkt außerfokale Bereiche. Werden nun beide Bilder voneinander abgezogen, so kann ein Bild der Probe mit reduziertem außerfokalen Anteil und damit höherem Kontrast erzeugt werden. Hierbei muss beachtet werden, dass die Intensität des außerfokalen Anteils des dicken Lichtblatts der Intensität des außerfokalen Anteils des dünnen Lichtblatts entspricht, was entweder durch Einstellungen an der Laserleistung oder durch entsprechende Skalierungsfaktoren für die Intensität bei der Verrechnung berücksichtigt werden kann. Da außer dem außerfokalen Anteil zusätzlich auch der fokale Anteil des dicken Lichtblatts von dem dünnen Lichtblatt abgezogen wird, verringert sich der Dynamikumfang des resultierenden Bildes. In the DE 10 2013 208 872.8 describes a method in which first a picture is taken with a wide light sheet and then a second picture with a thin light sheet. Both light sheets lie in the focal plane of the detection lens. The thin light leaf lies completely within the thick light sheet. In particular, the thin light sheet excites the part of the sample which lies in the focal plane of the detection objective and, to a lesser but disturbing part, also extra-focal areas due to scattering. The thick light sheet stimulates both the focal area, but due to its thickness also enhances extra-focal areas. If both images are subtracted from each other, then an image of the sample can be generated with reduced non-focal proportion and thus higher contrast. It should be noted here that the intensity of the extrafocal portion of the thick sheet of light corresponds to the intensity of the extrafocal portion of the thin sheet of light, which can be taken into account either by adjustments to the laser power or by corresponding scaling factors for the intensity in the calculation. In addition, since the focal portion of the thick sheet of light is subtracted from the thin sheet of light in addition to the non-focal portion, the dynamic range of the resulting image is reduced.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art dahingehend zu verbessern, dass eine Reduzierung des Dynamikumfangs im resultierenden Bild möglichst nicht mehr auftritt. The object of the invention is to improve a method of the type described above such that a reduction of the dynamic range in the resulting image as possible no longer occurs.

Diese Aufgabe wird für ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass der erste Satz von Eingabebilddaten für ein erstes Lichtblatt in der Fokusebene des Detektionsobjektivs erzeugt wird. Der zweite Satz von Eingabebilddaten wird für ein zweites Lichtblatt oberhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs erzeugt. Außerdem wird ein dritter Satz von Eingabebilddaten für ein drittes Lichtblatt unterhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs erzeugt. Die Positionen der Lichtblätter können beispielsweise durch einen Abtastspiegel in einer Pupillenebene realisiert werden. Der Ausgabesatz von Ausgabebilddaten für das Ausgabebild kann dann auf verschiedene Weise erzeugt werden, je nachdem, wie die Eingabebilddaten registriert werden. This object is achieved for a method of the type described in the introduction by generating the first set of input image data for a first light sheet in the focal plane of the detection objective. The second set of input image data is generated for a second light sheet above the focal plane of the detection lens. In addition, a third set of input image data is generated for a third light sheet below the focal plane of the detection lens. The positions of the light sheets can be realized for example by a scanning mirror in a pupil plane. The output set of output image data for the output image can then be generated in various ways, depending on how the input image data is registered.

Werden die drei Sätze von Eingabebilddaten beispielsweise einzeln erzeugt bzw. aufgenommen, so lässt sich der Ausgabesatz erzeugen, indem pixelweise von dem ersten Satz von Eingabebilddaten der zweite und der dritte Satz von Eingabebilddaten abgezogen werden. Anders ausgedrückt, wird das Ausgabebild dann erzeugt, indem von dem ersten Bild mit dem Lichtblatt in der Fokusebene die beiden anderen Bilder mit den anderen Positionen des Lichtblatts abgezogen werden, wobei die beiden Bilder bzw. Eingabebilddatensätze, die abgezogen werden, auch mit einem vom Eingabebilddatensatz abhängigen Wichtungswert multipliziert werden können, zur Anpassung der Intensität. Zweites und drittes Lichtblatt werden dabei so geformt und positioniert, dass ihre Intensität in der Fokusebene des Detektionsobjektivs nahezu bei Null liegt. Erstes, zweites und drittes Lichtblatt weisen außerdem bevorzugt im Wesentlichen die gleich axiale Ausdehnung auf, sofern dies einstellbar ist. For example, when the three sets of input image data are individually generated, the output sentence can be generated by subtracting, pixel by pixel, the second and third sets of input image data from the first set of input image data. In other words, the output image is then generated by subtracting from the first image with the light sheet in the focal plane the other two images with the other positions of the light sheet, the two images or input image data sets being extracted, also with one from the input image data set dependent weighting value can be multiplied to adjust the intensity. Second and third light sheets are thereby formed and positioned so that their intensity in the focal plane of the detection lens is almost zero. First, second and third light sheets also preferably have substantially the same axial extent, if this is adjustable.

Der zweite und der dritte Satz von Eingabebilddaten können auch gemeinsam registriert werden, so dass die Summe beider bereits in der Kamera gebildet wird, entsprechend einem gemeinsamen Bild. Dazu findet der Wechsel zwischen dem Lichtblatt oberhalb und dem Lichtblatt unterhalb der Fokusebene zur Hälfte der Belichtungszeit der Kamera statt, so dass die Kamera direkt das Summenbild aufnimmt. Insgesamt müssen somit nur zwei Bilder aufgenommen werden, hier wird dann das Summenbild – optional mit einem Wichtungsfaktor – von dem Bild, welches aus dem ersten Satz von Eingabebilddaten erzeugt wurde, abgezogen. Die direkt in der Kamera gebildete pixelweise Summe des zweiten und dritten Eingabebilddatensatzes wird pixelweise von dem ersten Satz von Eingabebilddaten abgezogen. The second and third sets of input image data may also be registered together so that the sum of both is already formed in the camera, according to a common image. For this purpose, the change between the light sheet above and the light sheet below the focal plane at half the exposure time of the camera takes place, so that the camera takes directly the sum picture. Overall, therefore, only two images must be recorded, here is then the sum image - optionally with a weighting factor - deducted from the image, which was generated from the first set of input image data. The pixelwise sum of the second and third input image data sets formed directly in the camera is subtracted pixel by pixel from the first set of input image data.

Die drei Lichtblätter können prinzipiell unabhängig voneinander erzeugt werden. Um auf einen Abtastspiegel in der Pupillenebene zu verzichten, können das zweite und dritte Lichtblatt auch anders und insbesondere gleichzeitig erzeugt werden. Das zweite und dritte Lichtblatt werden dabei erzeugt, indem dem ersten Lichtblatt entlang der Detektionsrichtung ein Phasensprung um π in der Fokusebene des Detektionsobjektivs aufgeprägt wird. Auf diese Weise werden aus dem ursprünglichen ersten Lichtblatt zwei Teillichtblätter – das zweite und das dritte Lichtblatt – erzeugt, die sich auch als ein sogenanntes Doppellichtblatt, welches eine Nullstelle, bei der die Intensität Null ist, in der Fokusebene des Detektionsobjektivs aufweist, auffassen lassen. Zweiter und dritter Eingabebilddatensatz werden auch hier zweckmäßig gemeinsam registriert, da die Lichtblätter gleichzeitig erzeugt werden. Auch eine einzelne Registrierung bei entsprechender Ausblendung des jeweils anderen Lichtblatts ist grundsätzlich allerdings möglich und nicht ausgeschlossen. The three light sheets can in principle be generated independently of each other. In order to dispense with a scanning mirror in the pupil plane, the second and third light sheet can also be generated differently and in particular simultaneously. In this case, the second and third light sheets are generated by imparting to the first light sheet along the detection direction a phase jump of π in the focal plane of the detection lens. In this way, two partial light sheets - the second and the third light sheet - are generated from the original first light sheet, which can also be understood as a so-called double light sheet, which has a zero point at which the intensity is zero, in the focal plane of the detection lens. Second and third input image dataset are also appropriately registered together, since the light sheets are generated simultaneously. Even a single registration with corresponding suppression of each other leaflet is basically possible and not excluded.

Das ursprüngliche Lichtblatt spaltet in ein Doppellichtblatt aus zwei Teillichtblättern – dem zweiten und dem dritten Lichtblatt – auf, welche in ihrer Intensität gleich, in ihrer Phase jedoch verschieden sind. Durch destruktive Interferenz in der Fokalebene des Detektionsobjektivs kommt es dadurch zur Auslöschung. Beide Teillichtblätter, d.h. das zweite und das dritte Lichtblatt sind geeignet, Fluoreszenz anzuregen, da dieser Effekt von der Phase des Anregungslichts unabhängig ist. Der Phasensprung lässt sich auf verschiedene Weise realisieren. Beispielsweise kann dazu eine zweigeteilte Phasenplatte mit einem ersten und einem zweiten Teil verwendet werden, die einen Phasensprung um π aufweist. Diese kann in der Regel an einer beliebigen Stelle im Beleuchtungsstrahlengang eingesetzt werden, insbesondere aber in einer Pupillenebene oder in einer Zwischenbildebene. The original light sheet splits into a double light sheet of two partial light sheets - the second and the third light sheet - which are equal in their intensity but different in their phase. Destructive interference in the focal plane of the detection lens causes extinction. Both partial leaves, i. the second and third light sheets are suitable for exciting fluorescence, since this effect is independent of the phase of the excitation light. The phase jump can be realized in various ways. For example, a two-part phase plate with a first and a second part can be used, which has a phase jump of π. This can usually be used at any point in the illumination beam path, but in particular in a pupil plane or in an intermediate image plane.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird für den ersten Teil der Phasenplatte ein in Bezug auf eine Ebene senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs optisch isotropes Material und für den zweiten Teil ein optisch anisotropes Material verwendet. In a preferred embodiment, an optically isotropic material with respect to a plane perpendicular to the optical axis of the illumination beam path is used for the first part of the phase plate, and an optically anisotropic material is used for the second part.

Für den ersten Teil der Phasenplatte wird also beispielsweise ein Material verwendet, welches in Bezug auf die Ebene senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs nicht doppelbrechend ist. Beispielsweise kann Glas verwendet werden. Auch ein per se doppelbrechendes Material kann verwendet werden, welches jedoch dann so orientiert sein muss, dass die optische Achse der Anisotropie entlang der Ausbreitungsrichtung des Lichts liegt, so dass keine polarisationsabhängigen Effekte auftreten können. Thus, for example, a material is used for the first part of the phase plate, which is not birefringent with respect to the plane perpendicular to the optical axis of the illumination beam path. For example, glass can be used. Also, a per se birefringent material may be used, but which must then be oriented so that the optical axis of the anisotropy is along the direction of propagation of the light, so that no polarization-dependent effects can occur.

Für den zweiten Teil der Phasenplatte wird ein optisch anisotropes Material verwendet, beispielsweise Quarz. Dieses doppelbrechende Material ist dann so orientiert, dass sich bei beispielsweise horizontaler, linearer Polarisation die Phase des Lichts exakt um π relativ zum ersten Teil der Phasenplatte verschiebt und bei paralleler linearer Polarisation die Phase nicht ändert oder um ein Vielfaches von zwei 2π ändert. Um das erreichen zu können, muss ein Abgleich der optischen Dicken der isotropen und der anisotropen Materialien der Phasenplatten erfolgen. For the second part of the phase plate an optically anisotropic material is used, for example quartz. This birefringent material is then oriented so that, for example, horizontal, linear polarization, the phase of the light shifts exactly by π relative to the first part of the phase plate and in parallel linear polarization, the phase does not change or by a multiple of two 2π changes. In order to achieve this, an adjustment of the optical thicknesses of the isotropic and the anisotropic materials of the phase plates must be carried out.

In einer bevorzugten Ausgestaltung kann dann zur Auswahl des ersten Lichtblatts oder des zweiten und dritten Lichtblatts das Licht vor dem Durchtritt durch die Phasenplatte verschieden linear polarisiert werden. Durch Wahl der Polarisation – dies kann beispielsweise mit einer in den Strahlengang einschwenkbaren λ/2-Platte oder einer Pockels-Zelle realisiert werden – kann zwischen beiden Ausgestaltungen des Lichtblatts gewechselt werden. In a preferred embodiment, the light can then be differently linearly polarized before passing through the phase plate for selecting the first light sheet or the second and third light sheet. By choosing the polarization - this can be realized, for example, with a λ / 2 plate which can be pivoted into the beam path or a Pockels cell - it is possible to switch between the two configurations of the light sheet.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, anstelle einer zweigeteilten Phasenplatte zur Erzeugung des zweiten und des dritten Lichtblatts einen räumlichen Lichtmodulator (SLM – spatial light modulator) zu verwenden. Hierzu kann der räumliche Lichtmodulator außer im Fokus an beliebiger Stelle des Beleuchtungsstrahlengangs positioniert werden. Auf dem räumlichen Lichtmodulator wird dann das Phasenmuster der zweigeteilten Phasenplatte dargestellt, es wird sozusagen simuliert. Der Wechsel zwischen dem ersten Lichtblatt einerseits sowie dem zweiten und dritten Lichtblatt andererseits wird direkt mit dem räumlichen Lichtmodulator durchgeführt, indem zwischen dem Phasenmuster der zweigeteilten Phasenplatte und einem konstanten Phasenmuster entsprechend einer vollständig isotropen Phasenplatte bzw. gar keiner Phasenplatte gewechselt wird. Another possibility is to use a spatial light modulator (SLM) instead of a two-part phase plate for producing the second and third light sheets. For this purpose, the spatial light modulator can be positioned except in the focus at any point of the illumination beam path. On the spatial light modulator, the phase pattern of the two-part phase plate is then displayed, it is simulated so to speak. The change between the first light sheet on the one hand and the second and third light sheet on the other hand is performed directly with the spatial light modulator by switching between the phase pattern of the two-part phase plate and a constant phase pattern corresponding to a fully isotropic phase plate or no phase plate.

Werden nun zwei Bilder A und B der Probe aufgenommen, wobei A das mit dem einzelnen Lichtblatt aufgenommene, aus dem ersten Satz von Eingabebilddaten erzeugte Bild ist und B dem gleichzeitig mit zwei Teillichtblättern aufgenommenen, d.h. dem aus dem zweiten und dritten Eingabebilddatensatz erzeugten Bild entspricht, so kann ein Bild mit erhöhtem Kontrast mit C = A – sB erzeugt werden. Dabei kommt es im Gegensatz zum Stand der Technik nicht zu einer Dynamikverringerung des resultierenden Bildes C, da das aus dem zweiten und dritten Eingabebilddatensatz erzeugte Bild B keine fokalen Anteile enthält. s ist ein Skalierungsfaktor zur Anpassung der Intensitäten zwischen den beiden Bildern A und B, er ist größer als Null und nicht größer als 1. Now, two images A and B of the sample are taken, where A is the image taken with the single light sheet, generated from the first set of input image data, and B is the one recorded simultaneously with two partial light sheets, ie corresponds to the image generated from the second and third input image data sets, an image with increased contrast can be generated with C = A - sB. In contrast to the prior art, this does not result in a reduction in the dynamics of the resulting image C, since the image B generated from the second and third input image data sets contains no focal components. s is a scaling factor to adjust the intensities between the two images A and B, it is greater than zero and not greater than 1.

Für die Erzeugung des Lichtblatts lassen sich im Prinzip beliebig geformte Strahlen verwenden, beispielsweise klassische Strahlen mit dem Querschnittsprofil einer Gaußverteilung, sogenannte gaußförmige Strahlen, aber auch Bessel-Strahlen, Mathieu-Strahlen, oder sinc³-Strahlen können verwendet werden, insbesondere dann, wenn ein SLM verwendet wird. Das Phasenmuster dieses entsprechenden Strahls lässt sich dann mit dem Phasenmuster der zweigeteilten Phasenplatte direkt auf dem SLM kombinieren, es werden zum Wechsel zwischen den Lichtblättern nur die Phasenmuster gewechselt. Auch strukturierte Lichtblätter zur Erhöhung der Auflösung können verwendet werden. In principle, arbitrarily shaped beams can be used for the generation of the light sheet, for example classical beams with the cross-sectional profile of a Gaussian distribution, so-called Gaussian beams, but also Bessel beams, Mathieu beams, or sinc ³ beams can be used, in particular if an SLM is used. The phase pattern of this corresponding beam can then be combined with the phase pattern of the two-part phase plate directly on the SLM; only the phase patterns are changed to change between the light sheets. Also structured light sheets to increase the resolution can be used.

Das Lichtblatt lässt sich auch durch ein flächiges Abtasten eines Lichtstrahls erzeugen. Verwendet man dazu eine auf die Abtastfrequenz des Lichtstrahls abgestimmte strukturierte Detektion, beispielsweise eine konfokale linienförmige Detektion, so wird der Hintergrund besonders gut unterdrückt. Die konfokale linienartige Detektion kann beispielsweise realisiert werden, indem die Detektion auf einem zweiten Scanner de-scannt (descanning) wird oder durch eine elektronische Apertur, welche auf dem abbildenden Sensor mitläuft, im Sinne eines rolling shutter. Der Vorteil dieser Kombination besteht darin, dass die Punktspreizfunktion des Systems wiederum aus einem Produkt von Anregungs- und Detektions-Punktspreizfunktion gebildet wird. Die Veränderung der Beleuchtungs-Punktspreizfunktion zwischen dem einzelnen Lichtblatt in der Fokusebene und dem Doppellichtblatt führt dann zu einer starken Änderung der Gesamt-Punktspreizfunktion des Systems, welche die oben beschriebenen Bildoperationen besonders effektiv macht. Man kann hierbei die Signale mit beiden Beleuchtungsarten – Einzel- und Doppellichtblatt – je Scanner-Position aufnehmen, oder aber mit beiden Beleuchtungsarten Bilder machen und diese dann nach den Vorschriften, die oben eingeführt wurden, verarbeiten, in der Regel also voneinander abziehen. The light sheet can also be generated by a two-dimensional scanning of a light beam. If, for this purpose, one uses a structured detection matched to the scanning frequency of the light beam, for example a confocal linear detection, the background is suppressed particularly well. The confocal line-like detection can be realized, for example, by the detection on a second scanner de-scanning (descanning) or by an electronic aperture, which runs along on the imaging sensor, in the sense of a rolling shutter. The advantage of this combination is that the point spreading function of the system is again formed from a product of excitation and detection point spreading function. The change in the illumination point spreading function between the single light sheet in the focal plane and the double light sheet then leads to a sharp change in the overall point spread function of the system, which makes the above-described image operations particularly effective. You can hereby record the signals with both types of illumination - single and double light sheet - per scanner position, or take pictures with both types of lighting and then process them according to the rules that were introduced above, so usually subtract from each other.

Lichtblätter, welche durch das Abtasten einer Lichtverteilung generiert werden, können vorteilhaft auch derart realisiert werden, dass ein nichtlinearer Effekt für die Signalerzeugung genutzt wird. Beispielsweise kann eine Zwei-Photonen-Anregung der Fluoreszenz zur Signalerzeugung dienen. Dieser Prozess hängt quadratisch von der Intensität der Anregungsstrahlung ab. Light sheets, which are generated by scanning a light distribution, can advantageously also be realized in such a way that a nonlinear effect is used for the signal generation. For example, two-photon excitation of the fluorescence can be used to generate the signal. This process depends quadratically on the intensity of the excitation radiation.

Schließlich können in Verbindung mit Lichtblättern, die durch Abtasten einer Lichtverteilung wie vorangehend beschrieben erzeugt werden, auch anstelle in Bezug auf die optische Achse des Detektionsobjektivs axial unterschiedlich liegender Lichtblätter auch lateral in einer Richtung senkrecht zu der Detektionsrichtung unterschiedlich liegende Lichtblätter verwendet werden. In diesem Fall ist bei Verwendung eines phasenselektiven Elements wie einer Phasenplatte oder einem SLM der Phasensprung senkrecht zur Sichtrichtung und zur Beleuchtungsrichtung ausgelegt; analog kann dies auch mit drei einzelnen Lichtblättern, die nun nicht axial, sondern lateral verschoben sind, erfolgen. Auch in diesem Fall spaltet ein einzelner, abgetasteter Strahl auf, wobei jedoch die Aufspaltung senkrecht zur Detektionsrichtung und senkrecht zur Beleuchtungsrichtung liegt. In Verbindung mit einer konfokalen Detektion, wie einer Spaltblende, lässt sich auf diese Weise ein höherer Kontrast erzielen. Verwendet man eine Spaltblende, wird diese so positioniert, dass sie entlang des nicht aufgespaltenen Einzelstrahls liegt. Dies kann beispielsweise durch ein De-scannen des Strahls und eine feste Spaltblende realisiert werden. Der durch den nicht aufgespaltenen Einzelstrahl angeregte Bereich in der Probe wird detektiert. Zusätzlich wird auch die Fluoreszenz von gestreutem Anregungslicht von Bereichen außerhalb der Spaltblende detektiert. Wird nun der Strahl in zwei Strahlen aufgespalten, so handelt es sich bei der detektierten Fluoreszenz nur noch um gestreutes Licht. Auch hier lassen sich zwei Bilder aufnehmen, die entsprechend gewichtet voneinander – in der Regel pixelweise – abgezogen werden, um ein Bild mit höherem Kontrast zu erhalten. Finally, in connection with sheets produced by scanning a light distribution as described above, also in relation to the optical axis of the detection lens of axially different light sheets, sheets of light laterally different in a direction perpendicular to the detection direction may also be used. In this case, when using a phase selective element such as a phase plate or an SLM, the phase jump is made perpendicular to the viewing direction and the illumination direction; this can be done analogously with three individual sheets of light, which are now not axially but laterally displaced. In this case too, a single, scanned beam splits, but the splitting is perpendicular to the detection direction and perpendicular to the illumination direction. In conjunction with a confocal detection, such as a slit diaphragm, a higher contrast can be achieved in this way. If a slit diaphragm is used, it is positioned so that it lies along the non-split single beam. This can be realized for example by a de-scanning of the beam and a fixed slit diaphragm. The area excited by the un-split single beam in the sample is detected. In addition, the fluorescence of scattered excitation light from areas outside the slit is also detected. If the beam is split into two beams, the detected fluorescence is only scattered light. Here, too, two images can be taken, which are weighted accordingly from each other - usually pixel by pixel - deducted to obtain an image with higher contrast.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the specified combinations but also in other combinations or alone, without departing from the scope of the present invention.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen: The invention will be explained in more detail for example with reference to the accompanying drawings, which also disclose characteristics essential to the invention. Show it:

1 einen beispielhaften Aufbau einer Anordnung, die zur Erzeugung eines Bildes mit erhöhtem Kontrast verwendet werden kann, 1 an exemplary structure of an arrangement that can be used to produce an image with increased contrast,

2 die Anordnung aus 1 in einer anderen Perspektive, 2 the arrangement 1 in a different perspective,

3 die Wirkung einer Phasenplatte mit einem Phasensprung auf ein Lichtblatt, 3 the effect of a phase plate with a phase jump on a light sheet,

4 Lichtblätter im Querschnitt senkrecht zur Lichtblattebene mit und ohne Phasenplatte, und 4 Light sheets in cross section perpendicular to the Lichtblattebene with and without phase plate, and

5 ein Beispiel für eine Phasenplatte. 5 an example of a phase plate.

In 1 ist zunächst ein Aufbau zur lichtblattmikroskopischen Untersuchung einer Probe 1 gezeigt, mit welcher ein Bild einer Probe 1 erzeugt werden kann. Die Probe 1 befindet sich in einer Probenkammer 2, sie kann beispielsweise in ein Gel aus Agarose eingebettet sein, welches in einer Glaskapillare 3, die in der in 2 gezeigten Seitenansicht der Anordnung zu sehen ist, gehalten werden. Von der Probe 1 bzw. vom beleuchteten Probenbereich abgestrahltes Licht wird entlang einer axialen Detektionsrichtung, die hier der z-Richtung entspricht, über ein Detektionsobjektiv 4 auf einen flächenförmigen Detektor 5 geleitet. Gestreutes Anregungs-Licht kann gegebenenfalls über einen dichroitischen Spiegel 6 aus dem Detektionsstrahlengang ausgekoppelt werden, so dass es nicht auf den flächenförmigen Detektor 5 trifft. Auf dem flächenförmigen Detektor 5 wird pixelweise die Intensität registriert und in Sätze von Eingangsbilddaten von Bildern umgewandelt. Der flächenförmige Detektor 5 kann Teil einer Kamera 7 mit daran angeschlossener Auswerteeinheit 8 sein. In 1 is initially a structure for light sheet microscopic examination of a sample 1 shown with which a picture of a sample 1 can be generated. The sample 1 is located in a sample chamber 2 For example, it may be embedded in a gel of agarose which is in a glass capillary 3 in the in 2 shown side view of the arrangement can be kept. From the sample 1 or emitted by the illuminated sample area light is along an axial detection direction, which here corresponds to the z-direction, via a detection objective 4 on a planar detector 5 directed. Scattered excitation light may optionally be via a dichroic mirror 6 be coupled out of the detection beam path, so it does not affect the planar detector 5 meets. On the planar detector 5 the intensity is registered pixel by pixel and converted into sets of input image data of images. The planar detector 5 can be part of a camera 7 with connected evaluation unit 8th be.

Die Probe 1 bzw. ein Probenbereich der Probe 1 wird über einen Beleuchtungsstrahlengang in einer Lichtblattebene mit zu einem Lichtblatt 9 geformten Licht beleuchtet. Die Beleuchtungsrichtung, d.h. die Ausbreitungsrichtung des Lichtblatts entspricht der x-Richtung, die Lichtblattebene der x-y-Ebene. Im gezeigten Beispiel schließt die axiale Detektionsrichtung, die z-Richtung, mit der Lichtblattebene einen Winkel von 90° ein. Dieser Winkel ist für die Beobachtung vorteilhaft, jedoch ist es generell ausreichend, wenn der Winkel von 0° verschieden ist, d.h. die Detektionsrichtung nicht in der Lichtblattebene liegt. The sample 1 or a sample area of the sample 1 is via an illumination beam path in a Lichtblattebene with a light sheet 9 illuminated shaped light. The illumination direction, ie the propagation direction of the light sheet, corresponds to the x direction, the light sheet plane of the xy plane. In the example shown, the axial detection direction, the z-direction, encloses an angle of 90 ° with the plane of the light sheet. This angle is advantageous for the observation, but it is generally sufficient if the angle is different from 0 °, ie the detection direction is not in the plane of the light sheet.

Das Licht aus einer Lichtquelle 10, beispielsweise aus einem Faseranschluss, der Licht eines Lasers in den Beleuchtungsstrahlengang einkoppelt, wird über ein System von mehreren Linsen, umfassend u.a. beispielhaft eine Kollimationslinse 11 sowie eine Powell-Linse 12 und weitere Linsen 13, 14 und 15, zu einem statischen Lichtblatt 9 geformt. Alternativ ist auch eine Ausgestaltung, bei der das Lichtblatt nicht statisch, sondern mittels eines Abtast-Mechanismus erzeugt wird, verwendbar. The light from a light source 10 , For example, from a fiber connector, the light of a laser coupled into the illumination beam path, is a system of several lenses, including, for example, a collimating lens 11 and a Powell lens 12 and more lenses 13 . 14 and 15 , to a static light sheet 9 shaped. Alternatively, an embodiment in which the light sheet is not static, but by means of a scanning mechanism is used, usable.

Zur Erzeugung des Bildes wird nun ein erster Satz von Eingabebilddaten für ein erstes Lichtblatt 9 in der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4 erzeugt. Anschließend wird ein zweiter Satz von Eingabebilddaten für ein zweites Lichtblatt oberhalb und ein dritter Satz von Eingabebilddaten für ein drittes Lichtblatt unterhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4 erzeugt. Erstes, zweites und drittes Lichtblatt haben im Wesentlichen die gleiche axiale Ausdehnung. Selbstverständlich ist es auch möglich, erst das zweite und das dritte Lichtblatt und dann erst das erste Lichtblatt zu erzeugen und die Eingabebilddaten in anderer Reihenfolge zu erzeugen. To generate the image, a first set of input image data for a first light sheet is now displayed 9 in the focal plane of the detection lens 4 generated. Subsequently, a second set of input image data for a second light sheet above and a third set of input image data for a third light sheet below the focal plane of the detection lens 4 generated. First, second and third light sheets have substantially the same axial extent. Of course, it is also possible first to generate the second and third light sheets and then only the first light sheet and to generate the input image data in a different order.

Aus den Sätzen von Eingabebilddaten wird durch Verrechnung ein Ausgabesatz von Ausgabedaten eines Ausgabebildes erzeugt, wobei im Ausgabebild ein Hintergrundsignal gegenüber den einzelnen Bildern aus den Eingabebilddaten reduziert ist, d.h. ein im Vergleich zu Einzelbildern höherer Kontrast erzielt werden kann, so dass der optische Schnitt durch die Probe genauer wird, was insbesondere für eine räumliche Darstellung der Probe von Vorteil ist. Grundsätzlich lässt sich aus jedem der Eingabebilddatensätze ein eigenes Bild erzeugen, jedoch können der zweite und dritte Eingabebilddatensatz auch gemeinsam in einem Bild registriert werden, beispielsweise bei gleichzeitiger Erzeugung des zweiten und dritten Lichtblatts, oder bei sequenzieller Erzeugung, wenn die Integrationszeit der Kamera entsprechend eingestellt wird, so dass jedem der beiden Lichtblätter die Hälfte der Integrationszeit zur Verfügung steht. From the sets of input image data, an output set of output data of an output image is generated by computation, wherein in the output image, a background signal is reduced to the individual images from the input image data, i. a higher contrast can be achieved compared to individual images, so that the optical section through the sample becomes more accurate, which is advantageous in particular for a spatial representation of the sample. Basically, each of the input image data sets can be generated a separate image, however, the second and third input image data set can also be registered together in an image, for example, while generating the second and third sheets of light, or in sequential generation, if the integration time of the camera is set accordingly so that half of the integration time is available to each of the two light sheets.

Die einzelnen Lichtblätter können unabhängig voneinander erzeugt werden, in dem beschriebenen Beispiel wird jedoch zur Erzeugung der beiden Lichtblätter außerhalb der Fokusebene dem ersten Lichtblatt 9 entlang der Detektionsrichtung ein Phasensprung um π in der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4 aufgeprägt. The individual light sheets can be generated independently of each other, however, in the example described, the first light sheet is produced to produce the two light sheets outside the focal plane 9 along the detection direction a phase jump by π in the focal plane of the detection lens 4 impressed.

In der in den 1 und 2 aus – durch ein Koordinatensystem angedeuteten – verschiedenen Perspektiven gezeigten Anordnung wird dazu eine zweigeteilte Phasenplatte 16, die auch in 5 dargestellt ist, mit einem ersten und einem zweiten Teil verwendet. Die Trennung zwischen erstem und zweitem Teil der Phasenplatte 16 erfolgt so, dass der Phasensprung in der Fokusebene liegt. Im gezeigten Beispiel liegt der erste Teil der Phasenplatte beispielsweise oberhalb der Lichtblattebene und der zweite Teil der Phasenplatte unterhalb der Lichtblattebene, die Trennung erfolgt in der Lichtblattebene. In the in the 1 and 2 From - indicated by a coordinate system - shown different perspectives arrangement is to a two-part phase plate 16 that also in 5 is shown used with a first and a second part. The separation between the first and second part of the phase plate 16 is done so that the phase jump is in the focal plane. In the example shown, the first part of the phase plate lies, for example, above the plane of the light sheet and the second part of the phase plate lies below the plane of the light sheet, the separation taking place in the plane of the light sheet.

Für den ersten Teil der Phasenplatte wird ein in Bezug auf eine Ebene senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs optisch isotropes Material verwendet, für den zweiten Teil der Phasenplatte 16 ein optisch anisotropes Material. Beispielsweise kann für den ersten Teil Glas und für den zweiten Teil Quarz verwendet werden. Der Quarz ist dabei so orientiert, dass beispielsweise bei horizontaler linearer Polarisation die Phase des Lichts exakt um π relativ zum Glas verschoben wird und sich bei paralleler linearer Polarisation die Phase nicht ändert oder um ein Vielfaches von 2π verschiebt. Um das zu erreichen, muss ein Abgleich der optischen Dicken der isotropen und der anisotropen Teile erfolgen. Mit Hilfe eines polarisationsdrehenden Elements 17, beispielsweise einer λ/2-Platte, eines Polarisators oder einer Pockels-Zelle, kann die Polarisation beeinflusst und zwischen zwei Polarisationszuständen gewechselt werden, so dass zwischen dem einzelnen ersten Lichtblatt und dem Doppellichtblatt aus zweitem und drittem Lichtblatt gewechselt werden kann. Die λ/2-Platte kann in den Strahlengang eingebracht werden und aus diesem wieder entfernt werden, ohne dass aufwendige Justierungen notwendig sind, sofern die Platte nicht schaltbar ist. Selbstverständlich ist es auch möglich, auf ein polarisationsdrehendes Element 17 zu verzichten und die Phasenplatte 16 für die Erzeugung des einzelnen ersten Lichtblatts 9 ganz aus dem Strahlengang zu entfernen, bzw. sie für die Erzeugung des Doppellichtblatts in den Strahlengang einzubringen. Dies ist jedoch in der Regel mit einem gewissen zeitlichen Aufwand für die Justierung verbunden, da darauf geachtet werden muss, dass die Grenzfläche zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil der Phasenplatte in der Lichtblattebene liegt bzw. in einer Ebene, die der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4 entspricht. For the first part of the phase plate, a material optically isotropic with respect to a plane perpendicular to the optical axis of the illumination beam path is used for the second part of the phase plate 16 an optically anisotropic material. For example, glass may be used for the first part and quartz for the second part. The quartz is oriented so that, for example, in the case of horizontal linear polarization, the phase of the light is displaced exactly π relative to the glass and the phase does not change or shift by a multiple of 2π in the case of parallel linear polarization. To achieve this, a balancing of the optical thicknesses of the isotropic and anisotropic parts must be done respectively. With the help of a polarization-rotating element 17 For example, a λ / 2 plate, a polarizer or a Pockels cell, the polarization can be influenced and changed between two polarization states, so that between the single first light sheet and the double light sheet of the second and third light sheet can be changed. The λ / 2 plate can be introduced into the beam path and removed therefrom again, without the need for complicated adjustments, as long as the plate is not switchable. Of course, it is also possible to use a polarization-rotating element 17 to dispense and the phase plate 16 for the generation of the single first leaflet 9 Remove completely from the beam path, or to introduce them for the generation of the double light sheet in the beam path. However, this is usually associated with a certain amount of time for the adjustment, since care must be taken that the interface between the first part and the second part of the phase plate is in the Lichtblattebene or in a plane that the focal plane of the detection lens 4 equivalent.

Alternativ kann anstelle einer Phasenplatte 16 und einem optionalen polarisationsdrehenden Element 17 auch ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) verwendet werden. Dieser kann wie die Phasenplatte 16 auch an einer beliebigen Stellung im Beleuchtungsstrahlengang platziert werden, insbesondere in einer Pupillenebene oder in der Zwischenbildebene. Auf dem räumlichen Lichtmodulator ist dann das Phasenmuster der zweigeteilten Phasenplatte dargestellt und durch Ansteuern des räumlichen Lichtmodulators kann zwischen dem Phasenmuster der zweigeteilten Phasenplatte 16 und einem konstanten Phasenmuster gewechselt werden. Alternatively, instead of a phase plate 16 and an optional polarization rotating element 17 Also a spatial light modulator (SLM) can be used. This can be like the phase plate 16 also be placed at an arbitrary position in the illumination beam path, in particular in a pupil plane or in the intermediate image plane. On the spatial light modulator then the phase pattern of the two-part phase plate is shown and by driving the spatial light modulator can between the phase pattern of the two-part phase plate 16 and a constant phase pattern.

Die Wirkung der Phasenplatte wird im Folgenden im Zusammenhang mit 3 und 4 erläutert. Als Beispiel für einen Strahl wird hier ein Lichtstrahl mit einem Querschnittsprofil, welcher einer Gaußfunktion entspricht, verwendet. Jedoch lassen sich ohne weiteres auch andere Strahlformen, wie beispielsweise Strahlen basierend auf Bessel-Funktionen oder sinc³-Funktionen verwenden, bis hin zu strukturierter Beleuchtung. Ein sogenannter gaußförmiger Strahl hat jedoch eine einfache Form, die auch zur Lichtblatterzeugung verwendet werden kann und sich zur beispielhaften Erläuterung des Verfahrens gut eignet. The effect of the phase plate is related below 3 and 4 explained. As an example of a beam, a light beam with a cross-sectional profile which corresponds to a Gaussian function is used here. However, other beam forms, such as beams based on Bessel functions or sinc ³ functions, can be readily used, as well as structured illumination. However, a so-called Gaussian-shaped jet has a simple shape, which can also be used for generating light sheets and is well suited for exemplifying the method.

Die gestrichelte Kurve mit dem hohen Peak in der Mitte entspricht dem einzelnen ersten Lichtblatt 9. Idealerweise liegt das Maximum der Intensität in der Lichtblattebene, d.h. in der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4. Führt man nun den Phasensprung – hier beispielhaft durch die senkrechte, gerade Linie in der Mitte gekennzeichnet – ein, so wird die Form des Strahls verändert. Es findet eine Aufspaltung in zwei Teilstrahlen statt, das zweite und das dritte Lichtblatt, welche in ihrer Intensität gleich, in der Phase jedoch verschieden sind. In der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4 kommt es zu destruktiver Interferenz und Auslöschung. Die in der Fokusebene resultierende Strahlform ist in 3 mit durchgezogener Linie gezeichnet. Auch wenn das resultierende Gesamtlichtblatt in der Fokusebene eine Nullstelle besitzt, so ist doch die axiale Ausdehnung des resultierenden Lichtblatts, des Doppellichtblatts, aufgrund der Interferenz größer als die des einzelnen Lichtblatts. Im Ergebnis ergibt sich die in 4 gezeigte Darstellung im Querschnitt senkrecht zur Fokusebene des Detektionsobjektivs 4, wobei dessen optische Achse hier in der Blattebene liegt. Im oberen Teil ist ein einzelnes Lichtblatt gezeigt, im unteren Teil das Doppellichtblatt unter Einwirkung der Phasenplatte 16, welche in 5 gezeigt ist. The dashed curve with the high peak in the middle corresponds to the single first light sheet 9 , Ideally, the maximum of the intensity lies in the light-plane, ie in the focal plane of the detection objective 4 , If we now introduce the phase jump - here exemplified by the vertical, straight line in the middle -, the shape of the beam is changed. There is a splitting into two partial beams, the second and the third, which are the same in their intensity but different in phase. In the focal plane of the detection lens 4 it comes to destructive interference and extinction. The resulting in the focal plane beam shape is in 3 drawn with a solid line. Although the resulting total light sheet has a zero in the focal plane, the axial extent of the resulting sheet of light, the double sheet, is larger than that of the single sheet due to the interference. The result is the in 4 shown representation in cross section perpendicular to the focal plane of the detection lens 4 , wherein the optical axis is here in the leaf level. In the upper part of a single light sheet is shown in the lower part of the double light sheet under the action of the phase plate 16 , what a 5 is shown.

Der gleiche Effekt lässt sich in äquivalenter Weise auch mit zwei einzelnen Lichtblättern, die knapp oberhalb bzw. unterhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs ihre Lichtblattebenen haben, erzielen. Hier wären dann insgesamt drei Aufnahmen zu machen bzw. zwei, wenn für die beiden Lichtblätter ober- bzw. unterhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs 4 nur die Hälfte der Integrationszeit der Kamera verwendet wird. The same effect can be achieved in an equivalent manner with two individual sheets of light that have their light levels just above or below the focal plane of the detection lens. Here then a total of three shots would be made or two, if for the two light sheets above or below the focal plane of the detection lens 4 only half the integration time of the camera is used.

Die resultierenden Eingabebilddatensätze können dann voneinander pixelweise subtrahiert werden, dabei werden von der Intensität des einzelnen Lichtblatts, also des ersten Satzes von Eingabebilddaten diejenigen der übrigen Sätze von Eingabebilddaten abgezogen, wobei insbesondere die Bilddatensätze des Doppellichtblatts auch mit Skalierungsfaktoren zur Angleichung der Helligkeit multipliziert werden können. The resulting input image data records can then be subtracted from each other pixel by pixel, those of the remaining sets of input image data are deducted from the intensity of the individual sheet of light, ie the first set of input image data, wherein in particular the image data sets of the double sheet can also be multiplied by scaling factors for equalizing the brightness.

Auf diese Weise kann eine Dynamikverringerung des resultierenden Ausgabebildes vermieden werden, da das Bild des Doppellichtblatts keine fokalen Anteile enthält. In this way, a reduction in the dynamics of the resulting output image can be avoided, since the image of the double-sheet contains no focal portions.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1 1: Probe sample
2 2: Probenkammer sample chamber
3 3: Glaskapillare glass capillary
4 4: Detektionsobjektiv detection objective
5 5: flächenförmiger Detektor planar detector
6 6: dichroitischer Spiegel dichroic mirror
7 7: Kamera camera
8 8th: Auswerteeinheit evaluation
9 9: Lichtblatt light sheet
10 10: Lichtquelle light source
11 11: Kollimationslinse collimating lens
12 12: Powell-Linse Powell lens
13, 14, 15 13, 14, 15: Linse lens
16 16: Phasenplatte phase plate
17 17: polarisationsdrehendes Element polarization-rotating element

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 10257423 A1 [0002]
WO 2004/0535558 A1 [0002]
DE 102013208872 [0010]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

PJ Keller et al., "Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured illumination microscopy" published in Nature Methods in July 2010 (DOI: 10.1038 / NMETH.1476) [0008]
J. Mertz et al. "Scanning light-sheet microscopy in the whole brain with mouse brain rejection", published in 2010 in Journal of Biometric Optics 15 (1), pp 016027-1 ff. [0009]

Claims

Method for generating an image of a sample ( 1 ), in which - a sample area is conveyed via an illumination beam path in a plane of the light sheet to a light sheet ( 9 light emitted from the sample area, along an axial detection direction, which encloses a non-zero angle with the light sheet plane, via a detection objective (FIG. 4 ) on a planar detector ( 5 ), in the detector ( 5 pixel-wise registering the intensity and converting it into sets of input image data of images, - generating a first set of input image data and at least a second set of input image data, and - generating from the sets of input image data by computation an output set of output image data of an output image, in which a background signal is reduced from images from the input image data, characterized in that - the first set of input image data for a first leaf of light ( 9 ) is generated in the focal plane of the detection lens, - the second set of input image data is generated for a second light sheet above the focal plane of the detection lens, - a third set of input image data for a third light sheet is created below the focal plane of the detection lens.

A method according to claim 1, characterized in that the second and third sets of input image data are pixel-wise multiplied by a sentence-dependent weighting value and subtracted from the first set.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that the second and the third set of input image data are registered together.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the second and third light sheets are generated simultaneously by the first sheet of light ( 9 ) along the detection direction a phase jump by π in the focal plane of the detection objective ( 4 ) is imprinted.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a spatial light modulator is used to produce at least the second and third sheets of light.

Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that for generating the second and third leaflet a two-part phase plate ( 16 ) is used with a first and a second part.

Method according to claim 6, characterized in that for the first part of the phase plate ( 16 ) is used with respect to a plane perpendicular to the optical axis of the illumination beam path optically isotropic material and for the second part of an optically anisotropic material.

A method according to claim 7, characterized in that for selecting the first sheet of light or the second and third sheet of light, the light is differently linearly polarized before passing through the phase plate.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the light sheet ( 9 ) is generated by area scanning of a light beam and a matched to the sampling frequency of the light beam structured detection, preferably a confocal line-shaped detection takes place.

A method according to claim 9, characterized in that instead of axially different lying light sheets are used laterally in a direction perpendicular to the detection direction and perpendicular to the illumination direction different light sheets.