DE102013113578A1 - Controlled supply of cell culture in cell culture container with medium during culture supply at air-liquid barrier layer for improving cell growth in cultures, comprises carrying out medium circulation within container - Google Patents

Controlled supply of cell culture in cell culture container with medium during culture supply at air-liquid barrier layer for improving cell growth in cultures, comprises carrying out medium circulation within container Download PDF

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Abstract

Controlled supply of at least one cell culture in a cell culture container (3) with a medium, e.g. respiratory tract during culture supply at an air-liquid barrier layer for improving cell growth and differentiating the cells in long-term cultures, comprises carrying out medium circulation within the cell culture container. An independent claim is also included for a device for carrying out the above mentioned method, comprising the cell culture container, which is divided into an upper chamber containing a cell culture and a lower chamber containing the medium.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff von Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung hierfür. The invention relates to a method according to the preamble of claim 1 and an apparatus therefor.

Sie betrifft insbesondere eine in vitro Vorrichtung und ein Verfahren zur automatisierten, reproduzierbaren Langzeitversorgung von Zellkulturen auf mikroporösen Membranen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht mit Medium. It relates in particular to an in vitro device and a method for the automated, reproducible long-term supply of cell cultures on microporous membranes at the air-liquid boundary layer with medium.

Stand der Technik State of the art

Die Ansprüche und Anforderungen an Zellsysteme hinsichtlich ihrer Komplexität (Monokulturen bis hin zu 3-dimensionalen mehrschichtigen Kulturen, aus wenigstens 2 unterschiedlichen Zelltypen) und Aussagekraft in Bezug auf toxikologische Fragestellungen, erfordern die Bereitstellung stabiler, reproduzierbarer Zellkulturen für Wirkstoffuntersuchungen, wie z.B. in Prescreening Verfahren. Dies gilt insbesondere für Zell-Kulturen, die zur Simulation der in vivo Situation eine vergleichbare Zell-Differenzierung aufweisen. Die dominierende Einflussgröße bei der Anlage und Züchtung der Kulturen ist deren Mediumversorgung über die mikroporöse Membran, nicht nur mit Nährstoffen für das Wachstum, sondern auch mit Substanzen, die eine Differenzierung der Zellen steuern. Dies ist von besonderer Bedeutung für Kulturen zur Untersuchung inhalationstoxikologisch relevanter Fragestellungen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht (Air-Liquid Interface, ALI). Hier werden die Zellen basal mit Nährstoffen versorgt, während der apikale Anteil mit der umgebenden Atmosphäre in Kontakt steht. Eine optimale Versorgung der gesamten Zellpopulation – über die basale Kontaktfläche (Membran) bis hin zu den apikalen Zellschichten – ist die unabdingbare Voraussetzung für die Generierung stabiler und reproduzierbarer Zellkulturen. The demands and demands on cell systems with regard to their complexity (monocultures up to 3-dimensional multilayered cultures, from at least 2 different cell types) and their relevance with regard to toxicological issues require the provision of stable, reproducible cell cultures for drug investigations, such as e.g. in prescreening procedures. This is especially true for cell cultures that have comparable cell differentiation to simulate the in vivo situation. The dominant factor in planting and growing crops is their medium supply via the microporous membrane, not only with nutrients for growth, but also with substances that control cell differentiation. This is of particular importance for cultures for the investigation of inhalation-toxicologically relevant issues at the air-liquid interface (Air-Liquid Interface, ALI). Here, the cells are basally supplied with nutrients, while the apical portion is in contact with the surrounding atmosphere. An optimal supply of the entire cell population - across the basal contact surface (membrane) to the apical cell layers - is the indispensable prerequisite for the generation of stable and reproducible cell cultures.

Der Mediumaustausch für Langzeitkulturen erfolgt unter konventionellen Bedingungen manuell und in Abhängigkeit vom Zelltyp z.B. alle 24–48 Stunden über einen Zeitraum von mehreren Wochen. Der manuelle Austausch des Mediums unterliegt Personen-abhängigen Schwankungen (vor allem Ungenauigkeiten beim Pipettieren), die bei dem normalerweise geringen Mediumvolumen unterhalb der Zellkulturgefäße zwangsläufig die Mediumversorgung beeinflussen (Konzentration der Nährstoffe). Ein weiterer Unsicherheitsfaktor ist darüber hinaus die reproduzierbare Generierung der Zellkulturen während der Wachstumsphase (Inkubation) im Zellinkubator. Zur Erhaltung der Vitalität der Zellen ist eine Temperatur von 37°C (±0,1°C) bei einer Luftfeuchte von 95% (±1%) erforderlich. Beim manuellen Austausch des Mediums außerhalb des Zellinkubators kommt es vorübergehend zu einem Absinken der Temperatur und der Luftfeuchte. Während der Inkubationsphase kommt es zur Verdampfung von Medium, d.h. zu einer weiteren Beeinflussung der verfügbaren Nährstoffkonzentrationen, wodurch die Morphologie und Physiologie der Zellen erkennbar beeinflusst werden. Ebenso reagieren Zellkulturen empfindlich auf mechanische Irritationen, die sich bei der Handhabung der Kulturen ergeben. The medium exchange for long-term cultures is carried out under conventional conditions manually and depending on the cell type e.g. every 24-48 hours over a period of several weeks. The manual exchange of the medium is subject to person-dependent fluctuations (especially inaccuracies in pipetting), which inevitably affect the medium supply (concentration of nutrients) in the normally small volume of medium below the cell culture vessels. Another uncertainty factor is the reproducible generation of cell cultures during the growth phase (incubation) in the cell incubator. In order to maintain the vitality of the cells, a temperature of 37 ° C (± 0,1 ° C) at a humidity of 95% (± 1%) is required. When replacing the medium manually outside the cell incubator, the temperature and the humidity are temporarily reduced. During the incubation phase, evaporation of medium, i. to further influence the available nutrient concentrations, thereby noticeably affecting the morphology and physiology of the cells. Similarly, cell cultures are sensitive to mechanical irritation resulting from handling the cultures.

Über die erwähnten technischen Nachteile hinaus ist die manuelle Versorgung der Zellkulturen mit erheblichem personellem Aufwand verbunden. In addition to the technical disadvantages mentioned, the manual supply of the cell cultures is associated with considerable personnel expenditure.

In der DE 19801763 ist eine Kulturvorrichtung beschrieben, welche Füllstandsabweichungen durch Zupumpen oder Abpumpen von Medium automatisch korrigiert oder auch programmgesteuert verschiedene Medium-Füllstände zulässt. Darüber hinaus ist jedoch ein regelmässiger oder kontinuierlicher Austausch von Medium notwendig, wobei wichtig ist, dass die gesamte Zellkultur gleichmässig und reproduzierbar mit frischen Nährstoffen versorgt wird. Es sind Vorrichtungen bekannt, beispielsweise aus der CH 631207 , welche bei submerser Kulturführung für eine gleichmässige Verteilung von durchströmendem Kulturmedium sorgen. Bei Kulturführung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht (ALI) ist die gleichmässige und reproduzierbare Zuführung von Nährstoffen zu den Zellen anspruchsvoller als bei submerser Kulturführung, da sich die Kultur naturgemäss an der Grenzschicht des Fluids befindet und oft nur ein Teil des Mediums, z.B. ein Drittel, ausgetauscht werden soll. Erschwerend kommt hinzu, dass sich die ausgewechselten Mediummengen in vielen Fällen nur im Bereich einiger Milliliter bewegen, so dass sich strömungsmechanische Effekte beim Zuführen des frischen Mediums kaum zur Durchmischung des Mediums nutzen lassen. In the DE 19801763 a culture device is described, which automatically corrects level deviations by pumping or pumping out of medium or programmatically allows different medium levels. In addition, however, a regular or continuous exchange of medium is necessary, whereby it is important that the entire cell culture is supplied evenly and reproducibly with fresh nutrients. There are devices known, for example from the CH 631207 which provide a submerged culture guide for a uniform distribution of the culture medium flowing through. In culture control at the air-liquid boundary layer (ALI), the uniform and reproducible supply of nutrients to the cells is more demanding than submerged culture, since the culture is naturally at the boundary layer of the fluid and often only a part of the medium, eg Third, to be replaced. To make matters worse, that the exchanged medium quantities move in many cases only in the range of a few milliliters, so that fluid mechanical effects when feeding the fresh medium can hardly be used for mixing the medium.

Aufgabe der Erfindung Object of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, die mit der manuellen Zellversorgung verbundenen Nachteile durch automatisierte Versorgung von Air-liquid-Kulturen von insbesondere epithelialen Zellen z. B. des Respirationstraktes zu beheben, so dass vergleichbare Kulturen unter definierten Versorgungsbedingungen bereitgestellt werden können und reproduzierbare toxikologische Untersuchungen möglich werden. Zentrale Bestandteile der Aufgabe sind neben der Konstanthaltung des Mediumspiegels durch eine Regeleinrichtung auf 2 bis 3 Zehntelmillimeter genau, die regelmässige reproduzierbare Durchmischung des Mediums zur Gewährleistung eines homogenen Nährstoffangebots, der Regelung der Zellproliferation sowie der Zelldifferenzierung durch Adjustierung der Dauer, Frequenz und Amplitude von biomechanischem Stress als auch der vollständige oder teilweise Tausch des Mediums in Abständen von zum Beispiel 12 bis 48 Stunden über einen Zeitraum bis zu 6 Wochen, ohne dass es beim Mediumtausch zu einer Änderung der Mediumtemperatur oder der Luftfeuchte kommt. The object of the invention is the disadvantages associated with the manual cell supply by automated supply of air-liquid cultures of particular epithelial cells z. B. the respiratory tract, so that comparable cultures can be provided under defined supply conditions and reproducible toxicological studies are possible. Central components of the task are in addition to the constant maintenance of the medium level by a control device to 2 to 3 tenths of a millimeter, the regular reproducible mixing of the medium to ensure a homogeneous nutrient supply, the regulation of cell proliferation and cell differentiation by adjusting the duration, frequency and amplitude of biomechanical stress as well as the complete or partial exchange of the medium at intervals of, for example, 12 to 48 hours over a period of up to 6 weeks, without that at the Medium exchange leads to a change in the medium temperature or the humidity.

Lösung der Aufgabe Solution of the task

Zur Lösung der Aufgabe führt der kennzeichnende Teil von Anspruch 1. To achieve the object of the characterizing part of claim 1.

Damit soll die Vorrichtung das Medium, zwecks Homogenisierung oder zur Stimulation der Zellen durch mechanische Reize, umwälzen können. Das Umwälzen erfolgt, indem Strömungen im Medium erzeugt werden, was durch eine Pumpe und eine oder mehrere Düsen oder auch durch andere denkbare Einrichtungen geschehen kann. Dies geschieht völlig unabhängig von der eigentlichen Zufuhr und Abführung des Mediums. In order for the device to the medium, for the purpose of homogenization or stimulation of the cells by mechanical stimuli, can circulate. The circulation is done by currents are generated in the medium, which can be done by a pump and one or more nozzles or by other conceivable devices. This happens completely independently of the actual supply and discharge of the medium.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Medium hierbei durch ein Lochblech in eine geschlossene und zur Zellkultur hin offene Kammer eingebracht. Die Umwälzung wird durch Erzwingen einer Volumenänderung der geschlossenen Kammer und dadurch entstehendem Freistrahl an jedem Loch erzeugt (synthetic jet). Die Volumenänderung wird durch eine Membrane oder einen Kolben erzwungen. Die zum Erzwingen einer Volumenänderung notwendige Energie wird durch einen Elektromagneten oder einen Elektromotor in das System eingeleitet. Das Umwälzen wird durch die Volumenänderung oder ein im Medium bewegtes Teil, beispielsweise durch einen Propeller oder einen Magnetrührstab, erreicht. Der Umwälzvorgang erfolgt programmgesteuert und die Parameter des Umwälzvorganges sind einstellbar. Im Rahmen der Erfindung können auch mehrere Zellkulturbehälter gemeinsam durch ein Medium versorgt werden. Das Medium wird durch einen angetriebenen scheibenförmigen Körper umgewälzt. Das Medium wird zur Durchmischung umgepumpt oder zwecks Durchmischung in einen anderen Behälter abgepumpt und wieder zugepumpt. In a preferred embodiment, the medium is introduced through a perforated plate in a closed and cell culture open towards the chamber. The circulation is produced by forcing a volume change of the closed chamber and thereby resulting free jet at each hole (synthetic jet). The volume change is forced through a diaphragm or piston. The energy required to force a volume change is introduced into the system by an electromagnet or an electric motor. The circulation is achieved by the volume change or a moving part in the medium, for example by a propeller or a magnetic stir bar. The circulation process is program-controlled and the parameters of the circulation process are adjustable. In the context of the invention, several cell culture containers can be supplied together by a medium. The medium is circulated through a driven disc-shaped body. The medium is pumped for mixing or pumped out for mixing into another container and pumped back.

Die Erfindung betrifft vor allem auch eine Vorrichtung zur Versorgung von Zellkulturen bei einer Kulturführung an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht (ALI). Der Mediumspiegel unter dem Zellkulturbehälter, wie aus dem Stand der Technik bekannt, über einen Zeitraum von mehreren Wochen innerhalb weniger Zehntelmillimeter genau einem vorgegebenen Sollwert angepasst und das Medium ausgewechselt und umgewälzt, d.h. durchmischt. Wenige Zehntelmillimeter bedeuten bevorzugt 2 bis 3 Zehntelmillimeter. Der angesprochene Zeitraum von mehreren Wochen bedeutet bevorzugt 3 bis 6 Wochen. Above all, the invention also relates to a device for supplying cell cultures to a culture guide at an air-liquid boundary layer (ALI). The medium level under the cell culture vessel, as known in the art, over a period of several weeks within a few tenths of a millimeter exactly adapted to a predetermined setpoint and the medium exchanged and circulated, i. mixed. A few tenths of a millimeter preferably means 2 to 3 tenths of a millimeter. The mentioned period of several weeks means preferably 3 to 6 weeks.

Dabei soll der Mediumspiegel durch eine Regeleinrichtung, wie ebenfalls nach dem Stand der Technik, einem vorgegebenen Sollwert nachgeführt werden. Weiter soll die Regeleinrichtung eine elektronische Regeleinrichtung sein. Die Höhe des Mediumspiegels soll bevorzugt durch einen Ultraschallsensor neben dem Kulturträger erfasst werden. Neben dem Kulturträger bedeutet, dass der Ultraschallsensor nicht direkt auf den Kulturträger gerichtet ist. Daneben bedeutet, dass der Ultraschallsensor derart gestellt ist, dass der Mediumspiegel unmittelbar neben dem Umfang des Kulturträgers erfasst werden kann. In this case, the medium level is to be tracked by a control device, as also according to the prior art, a predetermined desired value. Next, the control device should be an electronic control device. The height of the medium level should preferably be detected by an ultrasonic sensor next to the culture support. In addition to the culture support, this means that the ultrasound sensor is not aimed directly at the culture support. In addition, means that the ultrasonic sensor is set such that the medium level can be detected immediately adjacent to the circumference of the culture carrier.

Die bei manueller Versorgung einer Air-Liquid-Kultur vorhandenen Probleme werden mit einer Vorrichtung gelöst, welche den Mediumfüllstand mit einem wegmessenden Ultraschallsensor erfasst und durch Zupumpen und Abpumpen von Medium mittels zweier Peristaltikpumpen auf einen vorgegebenen Sollwert regelt. Die Pumpen dienen auch dazu, in vorgegebenen Zeitabständen das Medium oder Teile davon abzupumpen und durch Zupumpen von frischem Medium zu ersetzen. In die Vorrichtung integriert wurde ein Mechanismus zur Erzeugung definierter Strömungen im Medium, da sich überraschend gezeigt hat, dass damit nicht nur eine homogene Verteilung der Mediumbestandteile erreicht wird, sondern auch eine Regelung der Zellproliferation und Zelldifferenzierung möglich ist. Als vorteilhaft hat sich erwiesen, den zur Füllstandsmessung eingesetzten Ultraschallsensor unmittelbar neben den Zellkulturgefässen anzuordnen. Dadurch wird eine höhere Prozesssicherheit erreicht als zum Beispiel bei der indirekten Messung in einem kommunizierenden Rohr oder Gefäss ( DE 198 01 763 C2 ), wo Schaum oder Luftblasen leicht zu falschen Messwerten führen können. Die Vorgabe von Sollwerten und Zeitintervallen sowie die Verarbeitung der Sensorsignale erfolgt über eine speicherprogrammierbare Steuerung (SPS). The problems associated with manual supply of an air-liquid culture are solved by means of a device which detects the level of the medium with a path-measuring ultrasonic sensor and regulates it by pumping and pumping off medium by means of two peristaltic pumps to a predetermined desired value. The pumps also serve to pump the medium or parts thereof at predetermined intervals and to replace them by pumping fresh medium. Integrated into the device was a mechanism for generating defined flows in the medium, since it has surprisingly been found that not only a homogeneous distribution of the medium components is achieved, but also a regulation of cell proliferation and cell differentiation is possible. It has proven to be advantageous to arrange the ultrasonic sensor used for level measurement directly next to the cell culture vessels. As a result, a higher process reliability is achieved than, for example, in the case of indirect measurement in a communicating tube or vessel ( DE 198 01 763 C2 ), where foam or air bubbles can easily lead to incorrect readings. The specification of setpoints and time intervals as well as the processing of the sensor signals is carried out via a programmable logic controller (PLC).

Eine Weiterentwicklung der beschriebenen Vorrichtungen besteht darin, frisches Medium unmittelbar vor der Zuführung mit Hilfe eines Wärmetauschers auf die Temperatur, bei welcher die Zellen kultiviert werden, üblicherweise 37°C, vorzuwärmen. Dies erlaubt es, den Mediumvorrat gekühlt bereitzustellen, was das Risiko einer ungewollten Veränderung von Mediumkomponenten reduziert. Durch die Vorwärmung des Mediums kann trotzdem eine gleichbleibende Temperatur der Zellkultur beim Mediumwechsel gewährleistet werden. Eine bevorzugte Form des Wärmetauschers besteht aus einem mit Wasser gefüllten Behälter in welchem die Wassertemperatur durch ein Heizelement auf einen Sollwert geregelt wird. Das Medium wird in einem Spiralrohr durch den Wasserbehälter geführt, wobei sich das Medium im Durchlaufen erwärmt. Eine besonders gute Wärmeübertragung wird erreicht, wenn das zur Temperierung dienende Wasser im Behälter in Zirkulation gesetzt wird, beispielsweise durch einen Magnetrührstab. A further development of the devices described is to preheat fresh medium immediately prior to delivery by means of a heat exchanger to the temperature at which the cells are cultivated, usually 37 ° C. This makes it possible to provide the medium supply cooled, which reduces the risk of unwanted alteration of medium components. By preheating the medium still a constant temperature of the cell culture can be guaranteed when changing the medium. A preferred form of the heat exchanger consists of a water-filled container in which the water temperature is controlled by a heating element to a desired value. The medium is passed through the water tank in a spiral tube, whereby the medium heats up as it passes through. A particularly good heat transfer is achieved when the serving for temperature control water is placed in the container in circulation, for example by a magnetic stir bar.

Allen Ausführungsbeispielen ist gemein, dass die Häufigkeit und Intensität von Medumwechsel- und Mischvorgängen mit der externen Steuerung (nicht dargestellt) in weiten Bereichen variiert und den Erfordernissen der vorhandenen Zellkultur angepasst werden kann. Anhand der Zeichnungen werden Beispiele von Vorrichtungen zur automatisierten Langzeitversorgung von Zellkulturen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht erläutert. All embodiments have in common that the frequency and intensity of Medumwechsel- and mixing operations with the external control (not shown) varies widely and can be adapted to the requirements of the existing cell culture. Examples of devices for the automated, long-term supply of cell cultures to the air-liquid boundary layer will be explained with reference to the drawings.

Es zeigt: It shows:

1: Eine Gesamtansicht einer Langzeitversorgungsvorrichtung mit 3 Probenaufnahmemodulen 1 : An overall view of a long term supply device with 3 sample receiving modules

2: Einen Vertikalschnitt durch eine Langzeitversorgungsvorrichtung 2 : A vertical section through a long-term supply device

3: Einen Vertikalschnitt durch ein Probenaufnahmemodul 3 : A vertical section through a sample receiving module

4: Ein Probenaufnahmemodul mit Mischpropeller 4 : A sample receiving module with mixing propeller

5: Eine Langzeitversorgungsvorrichtung mit gemeinsamer Mediumversorgung mehrerer Zellkulturbehälter 5 : A long-term supply device with common medium supply of several cell culture containers

1 zeigt eine Gesamtansicht einer beispielhaften Ausführung der erfindungsgemässen Vorrichtung. Die Vorrichtung besteht aus einem Versorgungsteil 1 und drei abnehmbaren, autoklavierbaren Probeaufnahmemodulen 2. Jedes Probeaufnahmemodul bietet Platz für einen handelsüblichen Zellkulturbehälter 3, welcher mit einem abnehmbaren Deckel 4 vor Fremdkörpern und Zugluft geschützt werden kann. Die drei Zellkulturen können in dieser Ausführung unabhängig voneinander bewirtschaftet werden. 1 shows an overall view of an exemplary embodiment of the inventive device. The device consists of a supply part 1 and three detachable, autoclavable sample receiving modules 2 , Each sample receiving module provides space for a commercially available cell culture container 3 , which comes with a removable lid 4 Can be protected from foreign bodies and drafts. The three cell cultures can be managed independently in this version.

Der Versorgungsteil 1 weist eine Kupplung 5 auf, an welcher ein externer Vorratsbehälter (nicht dargestellt) mit frischem Medium angeschlossen wird. Verbrauchtes Medium wird über die Kupplung 6 in einen externen Entsorgungsbehälter oder Abfluss (nicht dargestellt) gepumpt. Die Mediumzuführung vom Versorgungsteil 1 zu den Probeaufnahmemodulen 2 erfolgt über die Schläuche 7, die Mediumabführung über die Schläuche 8. Steckverbinder 9 dienen zur Verbindung der elektrischen Komponenten mit einer externen Steuereinheit (nicht dargestellt), beispielsweise einer speicherprogrammierbaren Steuerung (SPS). The supply part 1 has a coupling 5 on which an external reservoir (not shown) is connected to fresh medium. Consumed medium is via the coupling 6 pumped into an external disposal container or drain (not shown). The medium supply from the supply part 1 to the sample receiving modules 2 takes place via the hoses 7 , the medium discharge via the hoses 8th , Connectors 9 are used to connect the electrical components with an external control unit (not shown), such as a programmable logic controller (PLC).

2 zeigt einen Schnitt durch die Vorrichtung gemäss 1. Im Versorgungsteil 1 ist zur Bewirtschaftung jedes Probenaufnahmemoduls 2 je eine Zuführpumpe 10 und eine Abführpumpe 11 eingebaut. Aus hygienischen Gründen haben sich Peristaltikpumpen als vorteilhaft erwiesen. Die Mediumumwälzung als auch die Induktion von biomechanischem Stress durch gezielte Strömungen im Probenaufnahmemodul erfolgt in der dargestellten Ausführung durch Hubbewegungen, welche durch den im Versorgungsteil 1 eingebauten Elektromagnet 12 erzeugt und über den Primärstössel 13 in das Probenaufnahmemodul 2 eingeleitet werden. 2 shows a section through the device according to 1 , In the supply section 1 is for the management of each sample receiving module 2 one feed pump each 10 and a drainage pump 11 built-in. For reasons of hygiene, peristaltic pumps have proved to be advantageous. The medium circulation as well as the induction of biomechanical stress by targeted flows in the sample receiving module takes place in the illustrated embodiment by lifting movements, which by the in the supply part 1 built-in electromagnet 12 generated and over the primary plunger 13 into the sample receiving module 2 be initiated.

3 zeigt das Probenaufnahmemodul 2, dessen Grundstruktur aus einem Grundkörper 14, einem Aufnahmering 15 und einem zwischen diesen beiden Teilen eingeklemmten Glasrohr 16 besteht. In den Aufnahmering 15 ist ein Zellkulturbehälter 3 eingehängt, welcher durch den bereits erwähnten, abhebbaren Deckel 4 geschützt wird. 3 shows the sample receiving module 2 whose basic structure consists of a basic body 14 , a recording ring 15 and a glass tube clamped between these two parts 16 consists. In the recording ring 15 is a cell culture container 3 mounted, which by the already mentioned, liftable lid 4 is protected.

Die Zellkultur befindet sich auf einer mikroporösen Membrane 3a, welche Bestandteil des Zellkulturbehälters 3 ist. Das Probenaufnahmemodul ist bis auf das Niveau der Membrane 3a mit Medium 17 befüllt. Je nach Kultur kann ein um mehrere Zehntelmillimeter über Membranniveau oder unter Membranniveau stehender Mediumspiegel vorteilhaft sein, wobei ein unter Membranniveau stehender Mediumspiegel durch vorgängige kurzzeitige Überfüllung an die Membrane angedockt wird. Der Mediumspiegel liegt in diesem Fall also nur an der freien Oberfläche unter Membranniveau. Die Oberflächenspannung des Mediums ermöglicht die Einstellung des Mediumspiegels in unterschiedlichen Höhen innerhalb bestimmter Grenzen. The cell culture is on a microporous membrane 3a , which is part of the cell culture container 3 is. The sample receiving module is down to the level of the membrane 3a with medium 17 filled. Depending on the culture, a medium level that is several tenths of a millimeter above the membrane level or below the membrane level may be advantageous, with a medium level that is below the membrane level being docked to the membrane by previous brief overfilling. The medium level in this case is therefore only at the free surface below the membrane level. The surface tension of the medium allows the adjustment of the medium level at different heights within certain limits.

Von grosser Bedeutung ist, dass der Mediumspiegel auf 2 bis 3 Zehntelmillimeter genau eingestellt werden kann. Abweichungen, beispielsweise durch Verdunstung, müssen erkannt und durch Nachregelung ausgeglichen werden. Als besonders zweckmässig hat sich erwiesen, die Höhe des Mediumspiegels durch einen wegmessenden Ultraschallsensor zu erfassen und den Mediumspiegel mit Hilfe der Zuführ- oder Abführpumpe auf den Sollwert zu regeln. Im Ausführungsbeispiel gemäss 3 ist ein Ultraschallsensor 18 auf einer Schalldüse 19 montiert. Die Schalldüse erlaubt die Begrenzung der abgetasteten Fläche. Of great importance is that the medium level up 2 to 3 Tenths of a millimeter can be set exactly. Deviations, for example due to evaporation, must be detected and compensated for by readjustment. It has proved particularly expedient to detect the height of the medium level by means of a distance-measuring ultrasonic sensor and to regulate the medium level with the aid of the supply or discharge pump to the desired value. In the embodiment according to 3 is an ultrasonic sensor 18 on a sonic nozzle 19 assembled. The sonic nozzle allows the boundary of the scanned area.

Wichtig ist ausserdem eine periodische Durchmischung des Mediums, z.B. im Abstand von 60 Minuten. Die Durchmischung ist einerseits notwendig, um verbrauchtes Medium aus der zellnahen Mediumschicht mit dem noch nährstoffreicheren restlichen Medium zu durchmischen sowie um nach einer teilweisen Erneuerung von Medium den frischen Anteil mit dem verbleibenden Anteil zu durchmischen. Andrerseits hat sich aber auch überraschend gezeigt, dass auf strömungsmechanischem Wege das Wachstum und die Differenzierung der Zellen entscheidend reguliert werden können. Hierbei ist es aber wesentlich, dass die Zellkulturen in reproduzierbarer Weise angeströmt werden. Also important is a periodic mixing of the medium, eg at intervals of 60 minutes. The mixing is on the one hand necessary to mix spent medium from the cell-near medium layer with the more nutrient-rich remaining medium and to mix after a partial renewal of medium, the fresh portion with the remaining portion. On the other hand, it has also surprisingly been found that the growth and differentiation of the cells can be decisively regulated by fluid mechanics. Here it is but essential that the cell cultures are flown in a reproducible manner.

Im Ausführungsbeispiel gemäss 3 erfolgt die Erzeugung definierter Strömungen im Medium wie folgt:
Das Medium 17 befindet sich in einer oberen Kammer 17a und einer unteren Kammer 17b. Zwischen den beiden Kammern befindet sich ein Lochblech 20, welches beispielsweise 36 Löcher mit Durchmesser 0.8 mm enthält. Im Boden der unteren Kammer 17b befindet sich ein in vertikaler Richtung beweglicher Sekundärstössel 21, welcher mit Hilfe einer Membrane 22 dicht eingebaut ist. Durch Betätigung des Sekundärstössels 21 nach oben wird Medium aus der unteren Kammer 17b verdrängt und strömt durch die Lochplatte 20 nach oben in die Kammer 17a. Die Löcher wirken dabei als Düsen und lassen das verdrängte Medium bis gegen die Mediumoberfläche bzw. Membrane 3a strömen (synthetic jet). Bei Bewegung des Primärstössels nach unten wird Medium von der oberen Kammer 17a in die untere Kammer 17b gesaugt, wobei das angesaugte Medium naturgemäss aus der unmittelbaren Umgebung der Löcher stammt und somit nicht dem vorher von unten nach oben geförderten Medium entspricht. Auf diese Weise entsteht durch wenige Hübe des Sekundärstössels 21 eine gute Durchmischung. Die strömungsmechanischen Effekte können durch Anzahl und Durchmesser der Löcher in der Lochplatte, sowie durch Einstellung von Dauer, Frequenz und Amplitude der Hübe in weiten Bereichen variiert werden, was für die entdeckte Regulierbarkeit der Zellproliferation und Zelldifferenzierung durch biomechanischen Stress von besonderer Bedeutung ist. In the embodiment according to 3 the creation of defined flows in the medium takes place as follows:
The medium 17 is located in an upper chamber 17a and a lower chamber 17b , Between the two chambers is a perforated plate 20 which, for example 36 Contains holes with a diameter of 0.8 mm. In the bottom of the lower chamber 17b There is a vertically movable secondary plunger 21 , which with the help of a membrane 22 is tightly installed. By actuating the secondary plunger 21 upward is medium from the lower chamber 17b displaces and flows through the perforated plate 20 up into the chamber 17a , The holes act as nozzles and leave the displaced medium up against the medium surface or membrane 3a to flow (synthetic jet). Moving the primary plunger downwards becomes medium from the upper chamber 17a into the lower chamber 17b sucked, the sucked medium naturally comes from the immediate vicinity of the holes and thus does not correspond to the previously promoted from bottom to top medium. This is achieved by a few strokes of the secondary tappet 21 a good mix. The fluidic effects can be varied by the number and diameter of the holes in the perforated plate, as well as by adjusting the duration, frequency and amplitude of the strokes in a wide range, which is for the discovered adjustability of cell proliferation and cell differentiation by biomechanical stress of particular importance.

Die Betätigung des Sekundärstössels 21 erfolgt wie in der Beschreibung zu 2 erwähnt durch den Elektromagnet 12 und den mit diesem verbundenen Primärstössel 13. Die Rückstellung des Sekundärstössels wird durch Federn (in den Figuren nicht sichtbar) sichergestellt. Die Hubbewegungen können statt mit einem Elektromagnet beispielsweise auch durch eine Pleuelstange/Kurbelwelle erzeugt werden. Die Zuführung und Abführung von Medium erfolgt durch Bohrungen (in den Figuren nicht sichtbar) im Grundkörper 14. Die Bohrungen führen in die untere Kammer 17b. The operation of the secondary plunger 21 takes place as in the description 2 mentioned by the electromagnet 12 and the primary pusher connected thereto 13 , The provision of the secondary plunger is ensured by springs (not visible in the figures). The strokes can be generated instead of an electromagnet, for example, by a connecting rod / crankshaft. The supply and removal of medium takes place through holes (not visible in the figures) in the main body 14 , The holes lead into the lower chamber 17b ,

4 zeigt eine Alternativlösung zum in 3 dargestellten Mischprinzip. Die Durchmischung des Mediums und die Stimulierung der Zellen erfolgt dabei durch einen Propeller 23, welcher auf einer Welle 24 sitzt und über einen Mitnehmerstift 25 angetrieben wird. Der Antrieb erfolgt durch einen Elektromotor (nicht dargestellt), welcher an Stelle des Elektromagnets 12 im Versorgungsteil 1 eingebaut ist. 4 shows an alternative solution to the in 3 illustrated mixing principle. The mixing of the medium and the stimulation of the cells is carried out by a propeller 23 which is on a wave 24 sits and over a driving pin 25 is driven. The drive is effected by an electric motor (not shown), which instead of the electromagnet 12 in the supply section 1 is installed.

5 zeigt eine weitere Variante einer erfindungsgemässen Vorrichtung. Im Unterschied zu den Ausführungen gemäss 1 bis 4 wird hier eine Vielzahl von Zellkulturbehältern 3 – im Ausführungsbeispiel 24 Stück – in eine Aufnahmeplatte 26 eingehängt und durch einen gemeinsamen Mediumteich 27 versorgt. Die Durchmischung des Mediums und die Stimulierung der Zellen zur Zellproliferation und Zelldifferenzierung erfolgt durch eine permanent oder periodisch rotierende Mischscheibe 28. Durch Aussparungen 28a in der Mischscheibe 28 lässt sich der Durchmischungseffekt verstärken. Damit bei stillstehender Mischscheibe alle Zellkulturbehälter gleiche Bedingungen haben, empfiehlt sich in der Mischscheibe ein mit der Zellkulturbehälter-Anordnung korrespondierendes Aussparungsmuster. Es können aber auch andere Scheibenformen verwendet werden, wobei gleiche Bedingungen für alle Zellkulturbehälter auch durch häufiges kurzes oder permanentes langsames Bewegen der Mischscheibe geschaffen werden können. 5 shows a further variant of an inventive device. In contrast to the statements according to 1 to 4 Here is a variety of cell culture containers 3 - In the embodiment 24 Piece - in a receiving plate 26 hooked and by a common medium pond 27 provided. The mixing of the medium and the stimulation of the cells for cell proliferation and cell differentiation is carried out by a permanently or periodically rotating mixing disc 28 , Through recesses 28a in the mixing disk 28 the mixing effect can be increased. So that all cell culture containers have the same conditions when the mixing plate is stationary, a recess pattern corresponding to the cell culture container arrangement is recommended in the mixing plate. But it can also be used other disc shapes, with the same conditions for all cell culture containers can also be created by frequent short or permanent slow moving the mixing disk.

Der Antrieb der Mischscheibe 28 erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel durch einen Elektromotor 29. Ausserdem ist die Aufnahmeplatte 26 über Säulen 30 höhenverstellbar, was beispielsweise nach der Mediumbefüllung ein kurzzeitiges Absenken der Zellkulturbehälter 3 und damit eine sichere Benetzung bei gleichzeitig sparsamem Mediumeinsatz ermöglicht. The drive of the mixing disc 28 takes place in this embodiment by an electric motor 29 , In addition, the receiving plate 26 over columns 30 adjustable in height, which, for example, after the medium filling a short-term lowering of the cell culture container 3 and thus enables safe wetting with at the same time economical use of medium.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11
Versorgungsteil  supply part
22
Probenaufnahmemodul  Samples recording module
33
Zellkulturbehälter  Cell culture vessel
3a3a
Membrane  membrane
44
Deckel  cover
55
Kupplung  clutch
66
Kupplung  clutch
77
Schlauch  tube
88th
Schlauch  tube
99
Steckverbinder  Connectors
1010
Zuführpumpe  feed pump
1111
Abführpumpe  discharge pump
1212
Elektromagnet  electromagnet
1313
Primärstössel  primary plunger
1414
Grundkörper  body
1515
Aufnahmering  receiving ring
1616
Glasrohr  glass tube
1717
Medium  medium
17a17a
obere Kammer  upper chamber
17b17b
untere Kammer  lower chamber
1818
Ultraschallsensor  ultrasonic sensor
1919
Schalldüse  sonic
2020
Lochblech  perforated sheet
2121
Sekundärstössel  secondary plunger
2222
Membrane  membrane
2323
Propeller  propeller
2424
Welle  wave
25 25
Mitnehmerstift  Carrier pin
2626
Aufnahmeplatte  mounting plate
2727
Mediumteich  medium pond
2828
Mischscheibe  mixing disk
28a28a
Aussparungen  recesses
2929
Elektromotor  electric motor
3030
Säule  pillar

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • DE 19801763 [0006] DE 19801763 [0006]
  • CH 631207 [0006] CH 631207 [0006]
  • DE 19801763 C2 [0013] DE 19801763 C2 [0013]

Claims (20)

Verfahren zur kontrollierten Versorgung einer oder mehrerer Zellkulturen in Zellkulturbehältern (3) mit einem Medium (17), z.B. des Respirationstraktes bei einer Kulturführung an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht, dadurch gekennzeichnet, dass insbesondere zur Verbesserung des Zellwachstums und der Differenzierung der Zellen in Langzeitkulturen eine Mediumumwälzung innerhalb des Zellkulturbehälters (3) erfolgt. Method for the controlled supply of one or more cell cultures in cell culture containers ( 3 ) with a medium ( 17 ), for example of the respiratory tract in a culture guide at an air-liquid boundary layer, characterized in that in particular for improving the cell growth and the differentiation of the cells in long-term cultures, a medium circulation within the cell culture container ( 3 ) he follows. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Medium ein biomechanischer Stress mittels definierter Strömung im Medium hervorgerufen wird. A method according to claim 1, characterized in that in the medium, a biomechanical stress is caused by means of a defined flow in the medium. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellkulturbehälter (3) in eine obere Kammer (17a) mit der Zellkultur und eine untere Kammer (17b) mit dem Medium unterteilt wird. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell culture container ( 3 ) in an upper chamber ( 17a ) with the cell culture and a lower chamber ( 17b ) is divided with the medium. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die untere Kammer (17b) eine zur Zellkultur hin durch ein Lochblech (20) offene Kammer ist und Strömungen durch Erzwingen einer Volumenänderung der unteren Kammer und dadurch entstehenden Freistrahl durch jedes Loch erzeugt wird (synthetic jet). Method according to claim 3, characterized in that the lower chamber ( 17b ) one for cell culture through a perforated plate ( 20 ) is open chamber and flows are generated by forcing a change in volume of the lower chamber and resulting free jet through each hole (synthetic jet). Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenänderung durch eine Membrane (22) oder einen Kolben (21) erzwungen wird. Method according to claim 4, characterized in that the volume change through a membrane ( 22 ) or a piston ( 21 ) is enforced. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Erzwingen einer Volumenänderung notwendige Energie durch einen Elektromagneten oder einen Elektromotor in das System eingeleitet wird. A method according to claim 4 or 5, characterized in that the force necessary to force a volume change is introduced by an electromagnet or an electric motor into the system. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mediumumwälzungen oder definierte Strömungen durch ein im Medium bewegtes Teil erfolgen. A method according to claim 1 or 2, characterized in that the medium recirculation or defined flows are effected by a moving part in the medium. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mediumumwälzungen oder definierten Strömungen durch ein im Medium rotierendes Teil erfolgen. A method according to claim 7, characterized in that the medium recirculation or defined flows are effected by a rotating part in the medium. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das im Medium rotierende Teil ein Propeller (23) ist. Method according to claim 8, characterized in that the part rotating in the medium is a propeller ( 23 ). Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der sich im Medium befindliche Körper scheibenförmig ist und Mediumumwälzungen oder definierte Strömungen durch Rotation des scheibenförmigen Körpers erzeugt werden. A method according to claim 7, characterized in that the body located in the medium is disc-shaped and medium circulation or defined currents are generated by rotation of the disc-shaped body. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Erzeugen von Mediumumwälzungen oder definierten Strömungen durch Aussparungen im scheibenförmigen Körper verstärkt wird. A method according to claim 10, characterized in that the production of medium recirculation or defined flows is enhanced by recesses in the disc-shaped body. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Zellkulturbehälter (3) durch einen gemeinsamen Mediumteich (27) versorgt werden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that a plurality of cell culture containers ( 3 ) through a common medium pond ( 27 ) are supplied. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zugeführtes Medium in einem Wärmetauscher vorgewärmt wird. Method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the supplied medium is preheated in a heat exchanger. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet dass der Wärmetauscher ein Spiralrohrwärmetauscher ist.  A method according to claim 13, characterized in that the heat exchanger is a spiral tube heat exchanger. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zugeführtes Medium im Durchlaufverfahren vorgewärmt wird. A method according to claim 13, characterized in that the supplied medium is preheated in a continuous process. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach wenigstens einem der Ansprüche 1–15, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellkulturbehälter (3) in eine obere Kammer (17a), in der sich die Zellkultur befindet, und eine untere Kammer (17b), in der sich das Medium befindet unterteilt ist. Device for carrying out the method according to at least one of claims 1-15, characterized in that the cell culture container ( 3 ) in an upper chamber ( 17a ), in which the cell culture is located, and a lower chamber ( 17b ), in which the medium is located is divided. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der unteren Kammer (17b) und der oberen Kammer (17a) eine Umwälzung bzw. Strömung erzeugbar ist. Device according to claim 16, characterized in that between the lower chamber ( 17b ) and the upper chamber ( 17a ) a circulation or flow can be generated. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der unteren Kammer (17b) und der oberen Kammer (17a) eine für das Medium durchlässige Membran oder Wand angeordnet ist. Device according to claim 16 or 17, characterized in that between the lower chamber ( 17b ) and the upper chamber ( 17a ) is arranged for the medium permeable membrane or wall. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der unteren Kammer (17b) und der oberen Kammer (17a) ein Lochblech vorgesehen ist. Device according to claim 18, characterized in that between the lower chamber ( 17b ) and the upper chamber ( 17a ) A perforated plate is provided. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 16–19, dadurch gekennzeichnet, dass in der unteren Kammer (17b) zumindest ein bewegbarer Körper (22, 23, 28) vorgesehen ist. Device according to at least one of claims 16-19, characterized in that in the lower chamber ( 17b ) at least one movable body ( 22 . 23 . 28 ) is provided.
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