DE102013112601A1

DE102013112601A1 - Microscopic imaging device

Info

Publication number: DE102013112601A1
Application number: DE102013112601.4A
Authority: DE
Inventors: Arthur Degen; Matthias Wald; Lars-Christian Wittig; David Shafer
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2015-05-21
Also published as: WO2015071359A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine mikroskopische Abbildungseinrichtung mit einem Objektiv (7), das durch eine transparente Abdeckung hindurch auf einen abzubildenden Bereich einer Probe (1) gerichtet ist, insbesondere einer in einem Probenbehälter (3) befindlichen und von einem Immersionsmedium (2) umschlossenen Probe (1), wobei der Strahlengang die transparente Abdeckung, mindestens eine Wandungen des Probenbehälters (3) und das Immersionsmedium (2) durchdringt. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine mikroskopische Abbildungseinrichtung der genannten Art so weiterzubilden, dass sowohl bei senkrechter als auch schräger Durchstrahlung einer Probenbehälterwandung oder der transparenten Abdeckung Änderungen der Dicke oder Änderungen der Brechzahl der zu durchdringenden Medien oder des Immersionsmediums (2) schon während der Probenbeobachtung ausgeglichen werden. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass im Strahlengang der mikroskopischen Abbildungseinrichtung zwischen der Probe (1) und dem Objektiv (7) Mittel zur Kompensation von Abbildungsfehlern schon während der Probenbeobachtung vorgesehen sind, welche die beschriebenen Ursachen haben.The invention relates to a microscopic imaging device with an objective (7) which is directed through a transparent cover onto an area of a sample (1) to be imaged, in particular one located in a sample container (3) and surrounded by an immersion medium (2) Sample (1), wherein the beam path penetrates the transparent cover, at least one wall of the sample container (3) and the immersion medium (2). The object of the invention is to develop a microscopic imaging device of the type mentioned in such a way that changes in the thickness or changes in the refractive index of the media to be penetrated or of the immersion medium (2) during both vertical and oblique irradiation of a sample container wall or the transparent cover during the Sample observation are compensated. The object is achieved in that in the beam path of the microscopic imaging device between the sample (1) and the lens (7) means for compensating aberrations are already provided during the sample observation, which have the causes described.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine mikroskopische Abbildungseinrichtung mit einem Objektiv, das durch eine transparente Abdeckung hindurch auf einen abzubildenden Bereich einer Probe gerichtet ist. Vorzugsweise befindet sich die Probe in einem Probenbehälter und ist von einem Immersionsmedium umschlossenen, wobei der Strahlengang die transparente Abdeckung, das Immersionsmedium und gegebenenfalls eine Wandung des Probenbehälters und durchdringt. The invention relates to a microscopic imaging device with a lens which is directed through a transparent cover to a region of a sample to be imaged. Preferably, the sample is in a sample container and is surrounded by an immersion medium, wherein the beam path penetrates the transparent cover, the immersion medium and optionally a wall of the sample container and.

Nach Stand der Technik sind Abbildungseinrichtungen dieser Art mit sehr gut auf unendlich korrigierten Objektiven ausgestattet und bieten eine gute Abbildungsqualität. Nachteilig dabei ist jedoch, dass die Abbildungsqualität sehr empfindlich auf Veränderungen der optischen Bedingungen im Probenraum reagiert, wie zum Beispiel Änderungen der Dicke der zu durchdringenden Fenster oder Änderungen der Brechzahl des Fenstermaterials und des Immersionsmediums, insbesondere in Abhängigkeit von Temperatureinflüssen. Diese Empfindlichkeit besteht vor allem bei objektseitig sehr hoher numerischer Apertur, wie z.B. NA 1.2 in Wasser. According to the state of the art, imaging devices of this type are equipped with lenses that are very well corrected for infinity and offer good imaging quality. The disadvantage here, however, is that the imaging quality is very sensitive to changes in the optical conditions in the sample space, such as changes in the thickness of the windows to be penetrated or changes in the refractive index of the window material and the immersion medium, in particular as a function of temperature influences. This sensitivity exists above all with an object-side very high numerical aperture, such as e.g. NA 1.2 in water.

Infolge der stets wachsenden Anforderungen an die Abbildungsqualität bei mikroskopischen Abbildungseinrichtungen der beschriebenen Kategorie besteht das Bedürfnis, Abbildungsfehler, die aus den genannten Gründen während der Probenbeobachtung entstehen, zeitgleich oder zumindest zeitnah mit ihrer Entstehung zu kompensieren. Bei diesbezüglich bisher bekannten Kompensationsmitteln erfolgt der Ausgleich von Veränderungen im Probenraum, die solche Abbildungsfehler bzw. Aberrationen zur Folge haben, durch axiale Verschiebung und / oder radiale Drehung von einer oder mehreren in das Objektiv integrierten Korrekturlinsen oder Korrekturlinsengruppen. As a result of the ever-increasing demands on the imaging quality in microscopic imaging devices of the category described, there is a need to compensate for aberrations that arise during the observation of the samples at the same time or at least in a timely manner with their formation. Compensation means hitherto known in this respect compensate for changes in the sample space which result in such aberrations or aberrations by axial displacement and / or radial rotation of one or more correction lenses or correction lens groups integrated into the objective.

Ein Beispiel dafür ist in DE 43 23 721 C2 veröffentlicht. Hier weist ein Mikroskopobjektiv mehrere Linsengruppenfassungen auf, von denen eine als Korrekturfassung zur Anpassung an unterschiedliche Deckglasdicken ausgebildet ist. Diese Korrekturfassung ist zwischen relativ zu den anderen Linsengruppenfassungen axial verschiebbar und um die optische Achse des Mikroskopobjektivs verdrehbar angeordnet. Das Verschieben in axialer Richtung erfolgt zwecks Ausgleichs sich verändernder Deckglasdicken, die Drehung soll Verkippungen beim Verschieben vermeiden bzw. ausgleichen. Bekannt ist weiterhin, die Verschiebung der Korrekturfassungen in solchen Objektiven manuell oder motorisch auszulösen. An example of this is in DE 43 23 721 C2 released. Here, a microscope objective has a plurality of lens group holders, one of which is designed as a correction holder for adaptation to different cover glass thicknesses. This correction frame is axially displaceable relative to the other lens group holders and arranged rotatable about the optical axis of the microscope objective. The displacement in the axial direction takes place in order to compensate for changing cover glass thicknesses, the rotation should prevent or compensate for tilting when moving. It is also known to trigger the displacement of the correction frames in such lenses manually or by motor.

Eine manuell zu bedienende Vorrichtung zur Einstellung oder Justierung optischer Komponenten in einem Mikroskopobjektiv ist in DE 10 2007 002 863 B3 beschrieben. Dabei wird die per Hand vorgegebene Verstellkraft mit mechanischen Mitteln auf die optische Komponente übertragen. A manually operated device for adjusting or adjusting optical components in a microscope objective is in DE 10 2007 002 863 B3 described. In this case, the manually given adjusting force is transmitted by mechanical means to the optical component.

Bei einer Vorrichtung zum Antreiben eines Korrekturrings nach US 7,593,173 B2 ist ein Drehkranz an einer Objektivlinse angebracht. Ist eine Verstellung der Linse erforderlich, wird die Drehkraft eines Motors auf den Korrekturring übertragen und damit die Position der Linse korrigierend verändert. In a device for driving a correction ring after US 7,593,173 B2 a turntable is attached to an objective lens. If an adjustment of the lens is required, the torque of a motor is transmitted to the correction ring, thereby correcting the position of the lens.

In US 2013/0094016 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, die geeignet sind, sphärische Fehler eines Mikroskops-Abbildungsstrahlengangs bei der Abbildung einer Probe durch ein Deckglas hindurch zu erfassen. Dabei wird ein Meßstrahl durch das Objektiv auf die Probe gerichtet, der an einer Grenzfläche des Deckglases reflektierte Meßstrahl wird durch das Objektiv auf einen Detektor geleitet, der Intensitätsverlauf des Meßstrahles wird registriert und aus dem Intensitätsverlauf wird auf sphärische Abbildungsfehler geschlossen. In US 2013/0094016 A1 For example, a method and an apparatus are described which are suitable for detecting spherical aberrations of a microscope imaging beam path when imaging a specimen through a cover glass. In this case, a measuring beam is directed through the lens to the sample, the reflected at an interface of the cover glass measuring beam is passed through the lens to a detector, the intensity profile of the measuring beam is registered and from the intensity curve is closed to spherical aberrations.

Insbesondere dann, wenn das Deckglas oder eine sonstige transparente Abdeckung schief durchstrahlt wird, der Hauptstrahl des Achsbündels also nicht parallel zur Flächennormalen der Abdeckung verläuft, werden durch Änderungen der Dicke der zu durchdringenden Medien zusätzlich auch Abbildungsfehler infolge unsymmetrischer Aberrationen verursacht, die sich mit den bisher bekannten Korrekturmitteln, nämlich durch axiale oder radiale Bewegungen von Linsen oder Linsengruppen im Objektiv, nicht kompensieren lassen. In particular, when the cover glass or other transparent cover is obliquely irradiated, so the main beam of the axis bundle is not parallel to the surface normal of the cover, are caused by changes in the thickness of the media to be penetrated additionally aberrations due to asymmetrical aberrations, which are with the previously known correction means, namely by axial or radial movements of lenses or lens groups in the lens, can not compensate.

Davon ausgehend besteht die Aufgabe der Erfindung darin, eine mikroskopische Abbildungseinrichtung der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass sowohl bei senkrechter als auch schräger Durchstrahlung der transparenten Abdeckung schon während der Probenbeobachtung Abbildungsfehler kompensiert werden, die ihre Ursache in Änderungen der optischen Bedingungen im Probenraum haben, wie Änderungen der Temperatur und damit Änderungen der Dicke und der Brechzahl der zu durchdringenden Medien. On this basis, the object of the invention is to further develop a microscopic imaging device of the type mentioned above, that aberrations that are caused by changes in the optical conditions in the sample space are already compensated for during vertical and oblique irradiation of the transparent cover during the observation of the sample. such as changes in temperature and thus changes in the thickness and refractive index of the media to be penetrated.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass im Strahlengang der mikroskopischen Abbildungseinrichtung zwischen der Probe und dem Objektiv Mittel zur Kompensation solcher Abbildungsfehler vorgesehen sind, welche die vorbeschriebenen Ursachen haben. This object is achieved in that means for compensating such aberrations are provided in the beam path of the microscopic imaging device between the sample and the lens, which have the above causes.

Die Kompensationsmittel umfassen optische Komponenten, die für den Beleuchtungs- oder Abbildungsstrahlengang transparent sind und die zwei zu durchdringende Grenzflächen aufweisen, deren in Durchtrittsrichtung gemessener Abstand zueinander variierbar ist. Während einer Probenbeobachtung wird dieser Abstand in Abhängigkeit von auftretenden Abbildungsfehlern so eingestellt, dass diese Abbildungsfehler kompensiert werden. Die Brechzahl der optischen Komponenten ist mit der Brechzahl der sonstigen im Probenraum zu durchdringenden Medien entweder identisch oder weicht maximal um eine vorgegebene Toleranz, beispielsweise von 5%, davon ab. The compensation means comprise optical components that are transparent to the illumination or imaging beam path and the two have to be penetrated interfaces whose measured in the direction of passage distance is variable to each other. During a sample observation, this distance is set as a function of occurring aberrations, so that these aberrations are compensated. The refractive index of the optical components is either identical to the refractive index of the other media to be penetrated in the sample space or differs at most by a predetermined tolerance, for example of 5%, from it.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Abbildungseinrichtung sind zwei keilförmige optische Komponenten vorgesehen, bei denen der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen durch Verschiebung von mindestens einer dieser Komponenten senkrecht zur Durchstrahlungsrichtung relativ der zur anderen veränderbar ist. Dabei sind die optischen Komponenten sinngemäß als zwei identische Keile so im Strahlengang aufeinander folgend angeordnet, dass die zu durchdringenden Grenzflächen den äußeren Grenzflächen einer planparallelen Platte entsprechen. In unterschiedlichen Ausgestaltungen kann vorgesehen sein, dass entweder nur ein Keil relativ zu dem anderen bewegt wird oder beide Keile in entgegengesetzter Richtung bewegt werden, um den Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen in Abhängigkeit von zu kompensierenden Abbildungsfehlern zu verändern. Vorteilhaft kann zwischen den Keilen eine Zwischenschicht aus einem flüssigen Medium vorgesehen sein, dessen Brechzahl der Brechzahl des Keilmediums entspricht oder maximal um eine Toleranz von 10% davon abweicht, so dass die Keile leicht gegeneinander beweglich sind. Dieses Medium kann insbesondere bei Numerischen Aperturen im Abbildungssystems im Bereich von 1 und > 1 zugleich dazu dienen, das Auftreten von totalen inneren Reflexionen zu verhindern. Ein solches Medium kann beispielsweise Öl oder Wasser sein. Die Keilbewegung kann in unterschiedlichen Ausgestaltungen manuell oder auch motorisch ausgelöst werden. In a first preferred embodiment of the imaging device according to the invention two wedge-shaped optical components are provided, in which the distance of the interfaces to be penetrated by displacement of at least one of these components perpendicular to the transmission direction relative to the other is variable. In this case, the optical components are mutatis mutandis arranged as two identical wedges in the beam path successively, that correspond to the interfaces to be penetrated the outer boundary surfaces of a plane-parallel plate. In various embodiments, it can be provided that either only one wedge is moved relative to the other or both wedges are moved in the opposite direction in order to change the distance of the interfaces to be penetrated as a function of aberrations to be compensated. Advantageously, an intermediate layer of a liquid medium can be provided between the wedges, whose refractive index corresponds to the refractive index of the wedge medium or deviates from it by a tolerance of 10%, so that the wedges are easily movable relative to one another. In particular, in the case of numerical apertures in the imaging system in the range of 1 and> 1, this medium can at the same time serve to prevent the occurrence of total internal reflections. Such a medium may be, for example, oil or water. The wedge movement can be triggered manually or motorized in different configurations.

In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Abbildungseinrichtung erfolgt die Komponentenverschiebung hydraulisch indem ein Druckmedium, vorzugsweise ein Öl, aus einem Reservoir zwischen die Komponenten gedrückt wird, so dass sich der Abstand der Komponenten und damit auch der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen zueinander vergrößert, oder umgekehrt das Druckmedium aus dem Komponentenzwischenraum in das Reservoir gesaugt wird, so dass sich der Abstand verringert. Die Brechzahl des Öls ist mit der Brechzahl der zu durchdringenden Medien identisch oder weicht lediglich um eine vorgegebene Toleranz davon ab. Im Rahmen der Erfindung liegt es dagegen auch, zur Verschiebung einer Komponente einen elektromechanischen Antrieb vorzusehen, etwa auf der Basis eines hochauflösenden Schrittmotors oder von Piezoelementen. In a second preferred embodiment of the imaging device according to the invention, the component displacement is performed hydraulically by a pressure medium, preferably an oil, is pressed from a reservoir between the components, so that the distance between the components and thus the distance of the interfaces to be penetrated increases, or vice versa the pressure medium from the component gap is sucked into the reservoir, so that the distance is reduced. The refractive index of the oil is identical to the refractive index of the media to be penetrated or differs only by a predetermined tolerance thereof. In the context of the invention, on the other hand, it is also necessary to provide an electromechanical drive for displacing a component, for example on the basis of a high-resolution stepping motor or of piezoelectric elements.

In beiden dargestellten Fällen bilden die beiden optischen Komponenten aufgrund ihrer miteinander kommunizierenden Funktionsweise einen Kompensator zum Ausgleich von Abbildungsfehlern. In both illustrated cases, the two optical components form a compensator for compensating aberrations due to their communication with each other.

Vorteilhaft kann in drei weiteren unterschiedlichen Ausführungsformen der Erfindung vorgesehen sein, dass die optische Achse des Objektivs

– zu der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen parallel ausgerichtet ist,
– mit der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt, oder
– mit der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt und ein zusätzliches Korrekturelement vorgesehen ist.

Advantageously, it can be provided in three further different embodiments of the invention that the optical axis of the lens

- is aligned parallel to the surface normal of the interfaces to be penetrated,
- Includes with the surface normal of the interfaces to be penetrated a nonzero angle δ, or
- Includes with the surface normal of the interfaces to be penetrated a non-zero angle δ and an additional correction element is provided.

Im vorgenannten ersten bewirken die oben beschriebenen Kompensationsmittel die Kompensation der Abbildungsfehler, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen. In the aforesaid first, the compensation means described above cause the compensation of the aberrations which occur during the observation of the sample due to changes in the thickness and the refractive indices of the media to be penetrated.

Im zweiten Fall werden wiederum die Abbildungsfehler, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen, mit den oben beschriebenen Kompensationsmitteln kompensiert. Mittel für eine Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des schiefen Durchgangs entstehend, sind hier nicht vorgesehen. Diese Korrektur könnte beispielsweise außerhalb des Probenraumes mit einer entsprechend ausgelegten Abbildungsoptik vorgenommen werden. In the second case, in turn, the aberrations that occur during the sample observation due to changes in the thickness and the refractive indices of the media to be penetrated, compensated with the compensation means described above. Means for correcting aberrations due to the oblique passage are not provided here. This correction could, for example, be made outside the sample space with a correspondingly designed imaging optics.

Bei dem dritten Fall bewirken wiederum die erfindungsgemäßen Kompensationsmittel die Kompensation der Abbildungsfehler, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen, während mit dem zusätzlichen Korrekturelement nun dafür gesorgt ist, dass die aufgrund des schiefen Durchgangs entstehenden Aberrationen nun bereits im Probenraum korrigiert werden, und zwar je nach Ausgestaltung des Korrekturelementes entweder für eine bestimmte Objektebene oder für ein ganzes Objektvolumen. In the third case, in turn, the compensation means according to the invention cause the compensation of the aberrations that arise during the sample observation due to changes in the thickness and the refractive indices of the media to be penetrated, while the additional correction element now ensures that the aberrations resulting from the oblique passage now already be corrected in the sample space, depending on the design of the correction element either for a certain object level or for a whole object volume.

Soll die Korrektur nur für eine bestimmte Objektebene vorgenommen werden, umfasst das Korrekturelement eine optische Baugruppe, die nur diese Objektebene abbildet und dabei zugleich die Aberrationen korrigiert, die aufgrund des schiefen Durchgangs bei der Abbildung der betreffenden Objektebene entstehen. Die Korrektur dieser Aberrationen ist mit mindestens einem sphärischen, asphärischen oder optischen Freiformelement vorgesehen. If the correction is to be made only for a specific object plane, the correction element comprises an optical assembly which only images this object plane and at the same time corrects the aberrations that result from the oblique passage when imaging the relevant object plane. The correction of these aberrations is provided with at least one spherical, aspherical or optical free-form element.

Sollen dagegen die beim schiefen Durchgang entstehenden Aberrationen für ein ganzes Objektvolumen korrigiert werden, umfasst das Korrekturelement eine optische Baugruppe, die das Objektvolumen abbildet und dabei zugleich die Aberrationen korrigiert, die aufgrund des schiefen Durchgangs bei der Abbildung des betreffenden Objektvolumens entstehen. Die Korrektur dieser Aberrationen ist ebenfalls mit mindestens einem sphärischen, asphärischen oder optischen Freiformelement vorgesehen. Eine Volumenabbildung erfolgt, wenn die Vergrößerung durch die optische Baugruppe die Bedingung M=|n/n‘| erfüllt, mit M der Vergrößerung, n der Brechzahl des zu passierenden Mediums vor dem Korrekturelement und n‘ der Brechzahl des zu passierenden Mediums nach dem Korrekturelement. Eine solche Baugruppe wird in der Fachsprache als virtuelles Relay bezeichnet. If, on the other hand, the aberrations arising during the oblique passage are to be corrected for an entire object volume, the correction element comprises an optical module which images the object volume and at the same time corrects the aberrations that arise due to the oblique passage in the imaging of the relevant object volume. The correction of these aberrations is also provided with at least one spherical, aspheric or optical free-form element. A volume map occurs when the magnification through the optical assembly satisfies the condition M = | n / n '| satisfies, with M the magnification, n of the refractive index of the medium to be passed before the correction element and n 'the refractive index of the medium to be passed after the correction element. Such an assembly is referred to in the jargon as a virtual relay.

In zwei weiteren Ausführungsformen

– befindet sich die Probe in einem Probenbehälter, das mit einem Deckglas abgedeckt ist, durch das hindurch die Probe abzubilden ist, und die Kompensationsmittel sind zwischen dem Deckglas und dem Objektiv angeordnet, oder
– die Probe befindet sich in einem Probenbehälter, die Kompensationsmittel sind als Abdeckung des Probenbehälters ausgebildet und die Abbildung der Probe ist durch die Kompensationsmittel hindurch vorgesehen.

In two other embodiments

The sample is in a sample container covered with a cover glass through which the sample is to be imaged, and the compensation means are arranged between the cover glass and the objective, or
- The sample is located in a sample container, the compensation means are formed as a cover of the sample container and the image of the sample is provided through the compensation means.

In der ersten der vorgenannten Ausführungsformen wird eine Abweichung der Deckglasdicke durch eine Änderung der Dicke des Kompensators mit gleichem Betrag, aber umgekehrtem Vorzeichen kompensiert, so dass die Gesamtdicke von Deckglas und Kompensator wieder dem vorgegebenen optischen Designwert entspricht. In beiden Ausführungsformen ist es vorteilhaft, ein für die Dicke des Paketes aus Deckglas und Kompensator bzw. für die Dicke des Kompensators korrigiertes Objektiv zu verwenden. In the first of the aforementioned embodiments, a deviation of the cover glass thickness is compensated by a change in the thickness of the compensator with the same amount, but opposite sign, so that the total thickness of cover glass and compensator again corresponds to the predetermined optical design value. In both embodiments it is advantageous to use an objective corrected for the thickness of the cover glass and compensator package or for the thickness of the compensator.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße Abbildungseinrichtung entweder ausgebildet sein

– zur Lichtmikroskopie, wobei eine Beleuchtungsoptik zur Beleuchtung der Probe mit einem rotationssymmetrisch um die optische Achse der Beleuchtungsoptik ausgebreiteten Strahlengang im Auflicht oder Durchlicht vorgesehen ist, oder
– zur Lichtblattmikroskopie, umfassend eine Beleuchtungsoptik zur Beleuchtung der Probe im Auflicht mit einem Lichtblatt, das mit der optischen Achse der Beleuchtungsoptik in einer Ebene liegt, wobei die Beleuchtungsoptik und das Objektiv in Schwerkraftrichtung gesehen unterhalb des Probenbehälters angeordnet sind.

Furthermore, the imaging device according to the invention can either be formed

- For light microscopy, wherein an illumination optical system for illuminating the sample with a rotationally symmetric spread around the optical axis of the illumination optical system is provided in incident or transmitted light, or
- For light sheet microscopy, comprising an illumination optical system for illuminating the sample in incident light with a light sheet, which lies with the optical axis of the illumination optics in a plane, the illumination optics and the lens are arranged in the direction of gravity below the sample container.

Als Immersionsflüssigkeit kann Wasser, als Material für die zu durchdringende Probenbehälterwandung, für das Deckglas und / oder für die optischen Komponenten des Kompensators kann ein optisches Glas, PTFE, CYTOP^®, FEP, Teflon^® AF oder ein Polymer vorgesehen sein. As immersion liquid, water, as material for the sample container wall to be penetrated, for the cover glass and / or for the optical components of the compensator, an optical glass, PTFE, CYTOP ^® , FEP, Teflon ^® AF or a polymer may be provided.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführung kann die erfindungsgemäße Abbildungseinrichtung eine Regeleinrichtung zur Variation des Abstandes der zu durchdringenden Grenzflächen der optischen Komponenten in Abhängigkeit von Abbildungsfehlern umfassen, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien auftreten, so dass diese automatisch zeitnah zu ihrer Entstehung kompensiert werden. Dabei werden die Abbildungsfehler messtechnisch erfasst, aus dem Messergebnis wird eine Stellgröße ermittelt, und unter Vorgabe dieser Stellgröße wird die automatische Korrektur durch Veränderung des Abstandes der zu durchdringenden Grenzflächen der optischen Komponenten veranlasst. Regeleinrichtungen an sich sind prinzipiell aus dem Stand der Technik bekannt und müssen deshalb an dieser Stelle nicht näher erläutert werden. In a further advantageous embodiment, the imaging device according to the invention may comprise a control device for varying the distance of the interfaces to be penetrated of the optical components as a function of aberrations that occur during sample observation due to changes in thickness and refractive indices of the media to be penetrated, so that they automatically be compensated promptly for their emergence. The aberrations are detected by measurement, from the measurement result, a manipulated variable is determined, and under specification of this manipulated variable, the automatic correction is caused by changing the distance of the interfaces to be penetrated of the optical components. Control devices are in principle known from the prior art and therefore need not be explained in detail at this point.

In einer erweiterten Ausführungsform kann eine Einrichtung zum Ausgleichen eines Keilfehlers des Deckglases vorgesehen sein, wobei als Keilfehler des Deckglases eine Parallelitätsabweichung zwischen einer Normalen der erste Fläche zu der Normalen der zweite Fläche des Deckglases verstanden werden soll. Diesbezüglich können erfindungsgemäß der Kompensator bzw. die zu durchdringenden Grenzflächen des Kompensators mit einer dem Keilfehler des Deckglases entgegengesetzten Keilneigung versehen sein. In an extended embodiment, a device for compensating for a wedge error of the cover glass may be provided, wherein a wedge error of the cover glass is to be understood as a parallelism deviation between a normal of the first surface to the normal of the second surface of the cover glass. In this regard, according to the invention, the compensator or the interfaces of the compensator to be penetrated may be provided with a wedge inclination opposite to the wedge error of the cover glass.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne dass der Umfang der vorliegenden Erfindung verlassen wird. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the specified combinations but also in other combinations or alone, without departing from the scope of the present invention.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren können, noch näher erläutert. Es zeigen: The invention will be explained in more detail for example with reference to the accompanying drawings, which may disclose features essential to the invention. Show it:

1 ein Beispiel einer Einrichtung nach Stand der Technik des Sachgebietes, dem die vorbeschriebene Erfindung zuzuordnen ist, 1 an example of a device according to the prior art of the subject to which the invention described above,

2 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Einrichtung mit zwei keilförmigen optischen Komponenten als Kompensator und einem Deckglas, 2 An embodiment of the device according to the invention with two wedge-shaped optical components as compensator and a cover glass,

3 ein Ausführungsbeispiel mit zwei keilförmigen optischen Komponenten als Kompensator ohne Deckglas, 3 an embodiment with two wedge-shaped optical components as compensator without cover glass,

4 ein Ausführungsbeispiel mit zwei planparallelen optischen Komponenten als Kompensator und einem Deckglas, 4 an embodiment with two plane-parallel optical components as compensator and a cover glass,

5 ein Ausführungsbeispiel mit zwei planparallelen optischen Komponenten als Kompensator ohne Deckglas, 5 an embodiment with two plane-parallel optical components as compensator without cover glass,

6 ein Ausführungsbeispiel eines Kompensators mit zwei keilförmigen optischen Komponenten und einem zusätzlichen Korrekturelement, 6 An embodiment of a compensator with two wedge-shaped optical components and an additional correction element,

7 ein Ausführungsbeispiel eines Kompensators mit zwei planparallelen optischen Komponenten und einem zusätzlichen Korrekturelement, 7 An embodiment of a compensator with two plane-parallel optical components and an additional correction element,

8 ein Ausführungsbeispiel mit Auflichtbeleuchtung bei inversem Mikroskopaufbau. 8th an embodiment with incident illumination in inverted microscope construction.

In 1 ist der Stand der Technik zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung darstellt. Wie hieraus ersichtlich, befindet sich eine Probe 1, in eine Immersionsflüssigkeit 2 eingebettet, innerhalb eines Probenbehälters 3. Der mit einem Deckglas 4 abgedeckte Probenbehälter 3 ist auf einem Probentisch 5 abgelegt. Die Beleuchtung der Probe 1 erfolgt mittels eines Beleuchtungsobjektivs 6, hier beispielsweise im Durchlichtverfahren. Der Übersichtlichkeit halber ist von der Abbildungseinrichtung lediglich noch das Objektiv 7 dargestellt. Zum Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, gehören vergleichbare Anordnungen, bei denen die Probe 1 nicht in einem Probenbehälter 3 abgelegt, sondern lediglich mit einem Deckglas 4 abdeckt ist. In 1 is the prior art represents at the time of the present invention. As can be seen, there is a sample 1 into an immersion liquid 2 embedded within a sample container 3 , The one with a cover slip 4 covered sample containers 3 is on a sample table 5 stored. The illumination of the sample 1 takes place by means of a lighting objective 6 , here for example in the transmitted light method. For the sake of clarity, only the objective remains of the imaging device 7 shown. The prior art to which the invention relates includes comparable arrangements in which the sample 1 not in a sample container 3 but only with a coverslip 4 is covering.

Das vom Beleuchtungsobjektiv 6 kommende Beleuchtungslicht gelangt durch ein für die betreffende Wellenlänge transparentes Fenster im Boden des Probenbehälters 3 hindurch in die Probe 1. Die Detektion und Abbildung eines interessierenden Probenbereiches erfolgt mittels des Objektivs 7 durch das Deckglas 4 hindurch. The of the illumination lens 6 incoming illumination light passes through a transparent window for the wavelength in question in the bottom of the sample container 3 into the sample 1 , The detection and imaging of a sample area of interest takes place by means of the objective 7 through the cover glass 4 therethrough.

Ändern sich während der Probenbeobachtung die Deckglasdicke und/oder die Brechzahlen der zu durchdringenden Medien, so hat dies Abbildungsfehler zur Folge. Das trifft sowohl dann zu, wenn die optische Achse 9 des Objektivs 7 mit der Flächennormalen des Deckglases 4 identisch ist oder parallel dazu verläuft, besonders aber auch bei schräger Beobachtung der Probe 1 mit einem (gestrichelt dargestellten) Objektiv 10, wobei dessen optische Achse 11 mit der Flächennormalen des Deckglases 4 einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt. Treten im ersten Fall vorwiegend symmetrische, d.h. sphärische und höher sphärische Aberrationen auf, kommt es bei schräger Beobachtung zusätzlich auch zu unsymmetrischen Aberrationen, wie Koma und Astigmatismus. If the cover glass thickness and / or the refractive indices of the media to be penetrated change during the observation of the sample, this will result in aberrations. This is true both when the optical axis 9 of the lens 7 with the surface normals of the cover glass 4 is identical or parallel, but especially in oblique observation of the sample 1 with a lens (shown in broken lines) 10 , wherein the optical axis 11 with the surface normals of the cover glass 4 includes a non-zero angle δ. Occur in the first case mainly symmetric, ie spherical and higher spherical aberrations, it comes in oblique observation in addition to asymmetrical aberrations, such as coma and astigmatism.

Um dem abzuhelfen, ist erfindungsgemäß folgendes vorgesehen. In den zur Erläuterung dienenden Zeichnungen 2 bis 8 werden aus Gründen der Übersichtlichkeit für identische oder vergleichbare Baugruppen auch dieselben Bezugszeichen wie in 1 verwendet. To remedy this, the invention provides the following. In the illustrative drawings 2 to 8th For reasons of clarity, the same reference numerals are used for identical or comparable assemblies as in FIG 1 used.

In der in 2 beispielhaft dargestellten Ausführungsform der Erfindung sind im Unterschied zum Stand der Technik im Strahlengang zwischen der Probe 1 und dem Objektiv 7 Kompensationsmittel in Form zweier keilförmiger optischer Komponenten 12 und 13 vorhanden, bei denen der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen 14 und 15 durch Verschiebung der Komponente 13 senkrecht zur Flächennormalen des Deckglases 4 relativ der zur Komponente 12 veränderbar ist. Die Abstandänderung ergibt sich aus der Keilform beider Komponenten 12 und 13. In the in 2 illustrated embodiment of the invention are in contrast to the prior art in the beam path between the sample 1 and the lens 7 Compensating means in the form of two wedge-shaped optical components 12 and 13 present, where the distance of the interfaces to be penetrated 14 and 15 by shifting the component 13 perpendicular to the surface normal of the cover glass 4 relative to the component 12 is changeable. The distance change results from the wedge shape of both components 12 and 13 ,

Die Komponenten 12 und 13 bestehen aus einem Material oder weisen zumindest ein Fenster auf, das für den Abbildungsstrahlengang transparent ist, wobei dessen Brechzahl mit der Brechzahl des Materials identisch ist oder maximal um eine vorgegebene Toleranz davon abweicht, aus dem das Deckglas 4 gefertigt ist. So kann für die Komponenten 12 und 13 und für das Deckglas 4 zum Beispiel D263M, also ein farbloses Borosilikatglas mit extrem geringem Eisengehalt, vorgesehen sein. The components 12 and 13 consist of a material or have at least one window which is transparent to the imaging beam path, wherein its refractive index is identical to the refractive index of the material or deviates at most by a predetermined tolerance thereof, from which the cover glass 4 is made. So can for the components 12 and 13 and for the cover glass 4 For example, D263M, a colorless borosilicate glass with extremely low iron content, be provided.

Das optische Design dieser Anordnung sieht für das Deckglas 4 eine Dicke d1 vor, und bezüglich der Grenzflächen 14 und 15 einen Abstand d2. Das Paket aus dem Deckglas 4 und den Komponenten 12 und 13 hat damit eine Höhe d = d1 + d2. The optical design of this arrangement looks for the cover glass 4 a thickness d1 before, and with respect to the interfaces 14 and 15 a distance d2. The package from the cover glass 4 and the components 12 and 13 thus has a height d = d1 + d2.

Kommt es im Probenraum während der Probenbeobachtung zu Temperaturänderungen, ändern sich aufgrund ihrer Temperaturabhängigkeit die Dicken und die Brechzahlen von durchstrahlten Medien, und es treten Abbildungsfehler bzw. Aberrationen auf. If temperature changes occur in the sample space during sample observation, the thicknesses and refractive indices of irradiated media change due to their temperature dependence, and aberrations occur.

Vergrößert sich die Dicke d1 des Deckglases 4 um einen Betrag ∆d und führt diese Deckglasvergrößerung zu Abbildungsfehlern, wird die Komponente 13 in der dargestellten Pfeilrichtung relativ zur Komponente 12 soweit verschoben, bis der Abstand d2 der Grenzflächen 14 und 15 voneinander um den Betrag ∆d verringert ist, so dass im Ergebnis der Verschiebung das Paket aus Deckglas 4 und den Komponenten 12 und 13 wieder die ursprünglich vorgegebene Höhe d hat und damit die Ursache für Entstehung dieser Abbildungsfehler behoben ist. The thickness d1 of the cover glass increases 4 by an amount Δd and this coverslip magnification leads to aberrations, the component becomes 13 in the illustrated arrow direction relative to the component 12 moved as far as the distance d2 of the interfaces 14 and 15 is reduced from each other by the amount .DELTA.d, so that as a result of the shift, the package of cover glass 4 and the components 12 and 13 again has the originally given height d and thus the cause for emergence of these aberrations is resolved.

Etwaige Veränderungen der Höhe d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 12 und 13, werden ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 13 in der dargestellten Pfeilrichtung relativ zur Komponente 12 so ausgeglichen, dass die Höhe d konstant ihren vorgegeben Designwert behält bzw. diesen zeitnah wieder einnimmt. Any changes in height d2, for example due to material expansion of the components 12 and 13 , are also due to shift of the component 13 in the illustrated arrow direction relative to the component 12 so balanced that the height d constantly maintains its given design value or resumes it promptly.

Änderungen der Brechzahlen der durchstrahlten Medien können, insbesondere bei der Lichtmikroskopie, sphärische Aberrationen zur Folge haben. Erfindungsgemäß werden die daraus resultierenden Abbildungsfehler – zumindest in erster Näherung – durch Variation der Höhe d des Paketes aus Deckglas 4 und den Komponenten 12 und 13 kompensiert. Changes in the refractive indices of the irradiated media, in particular in light microscopy, can result in spherical aberrations. According to the invention, the resulting aberrations - at least in a first approximation - by varying the height d of the package of cover glass 4 and the components 12 and 13 compensated.

Um die Gleitreibung zwischen den Komponenten 12 und 13 möglichst gering zu halten und, insbesondere bei Numerischen Aperturen des Abbildungssystems im Bereich von 1 bis >1, das Auftreten von totalen inneren Reflexionen zu verhindern, ist eine Zwischenschicht 16 aus einem flüssigen Medium vorhanden, beispielweise Wasser oder Öl, wobei dessen Brechzahl der Brechzahl des Keilmediums entspricht oder maximal um eine Toleranz von 10% davon abweicht. To the sliding friction between the components 12 and 13 As low as possible and, in particular at numerical apertures of the imaging system in the range of 1 to> 1, to prevent the occurrence of total internal reflections is an intermediate layer 16 from a liquid medium present, for example, water or oil, wherein its refractive index corresponds to the refractive index of the wedge medium or deviates from it by a maximum of a tolerance of 10%.

Vom Umfang der Erfindung eingeschlossen sind selbstverständlich Ausgestaltungsvarianten, bei denen nicht die Komponente 13 gegen die Komponente 12, sondern die Komponente 12 relativ zur Komponente 13 verschoben wird oder auch beide Komponenten 12 und 13 gegeneinander verschiebbar sind. Die Verschiebeweite, die erforderlich ist, um den Betrag ∆d auszugleichen, hängt in allen Fällen ersichtlich von dem für die Komponenten 12 und 13 gewählten Keilwinkel ab. Die Verschiebung kann je nach Auslegung der Abbildungseinrichtung manuell oder auch motorisch ausgelöst werden. Auch kann eine Regeleinrichtung zur Verschiebung in Abhängigkeit von einer Messgröße vorgesehen sein, welche die jeweils aktuellen Abbildungsfehler definiert. Included in the scope of the invention, of course, are embodiments in which not the component 13 against the component 12 but the component 12 relative to the component 13 is moved or both components 12 and 13 are mutually displaceable. The amount of displacement required to equalize the amount Δd will in all cases depend on that for the components 12 and 13 selected wedge angle. The shift can be triggered manually or motorized depending on the design of the imaging device. It is also possible to provide a control device for shifting as a function of a measured variable, which defines the respective current aberrations.

In der beschriebenen Weise bilden die optischen Komponenten 12 und 13 prinzipiell einen Kompensator in Form einer planparallelen Platte mit variablem Abstand der Grenzflächen 14 und 15, der es ermöglicht, Abbildungsfehler zeitgleich oder zeitnah während der Probenbeobachtung zu kompensieren. In the manner described form the optical components 12 and 13 in principle, a compensator in the form of a plane-parallel plate with variable spacing of the interfaces 14 and 15 which makes it possible to compensate aberrations at the same time or in a timely manner during the observation of the sample.

Die vorstehend beschriebe Korrekturmöglichkeit gilt sowohl für Abbildungsfehler, die von Dickenabweichungen des Deckglases 4 oder Dickenabweichungen der Komponenten 12 und 13 verursacht sind, als auch für Abbildungsfehler, die aufgrund von Abweichungen der Brechzahlwerte im Probenraum entstehen, beispielsweise hervorgerufen durch Temperatureinflüsse. The above-described correction possibility applies both to aberrations that are caused by thickness variations of the cover glass 4 or thickness variations of the components 12 and 13 caused as well as aberrations that arise due to deviations of the refractive index values in the sample space, for example, caused by temperature influences.

3 zeigt eine von der Darstellung in 2 insofern abweichende Ausführungsform der Erfindung, als hier die beiden keilförmigen, einen Kompensator bildenden optischen Komponenten 12 und 13 anstelle des Deckglases unmittelbar auf dem Probenbehälter 3 aufsitzen und diesen abdecken. 3 shows one of the illustration in 2 insofar deviating embodiment of the invention, as here the two wedge-shaped, a compensator forming optical components 12 and 13 instead of the coverslip directly on the sample container 3 sit up and cover this.

Veränderungen der Höhe d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 12 und 13, werden beispielweise ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 13 in der dargestellten Pfeilrichtung relativ zur Komponente 12 ausgeglichen. Mit der Variation des Abstandes d2 sind ebenso auch Abbildungsfehler korrigierbar, die ihre Ursache in Abweichungen der Brechzahlwerte des Materials haben, aus dem der Probenbehälter 3 und die Komponenten 12 und 13 bestehen, sowie Abbildungsfehler aufgrund von Abweichungen der Brechzahl des Immersionsmediums. Changes in height d2, for example due to material expansion of the components 12 and 13 , for example, also by shifting the component 13 in the illustrated arrow direction relative to the component 12 balanced. With the variation of the distance d2 also aberrations are correctable, which have their cause in deviations of the refractive index values of the material from which the sample container 3 and the components 12 and 13 exist, as well as aberrations due to deviations of the refractive index of the immersion medium.

In 4 ist eine Ausführungsform der Erfindung dargestellt, bei der im Unterschied zum Stand der Technik im Strahlengang zwischen der Probe 1 und dem Objektiv 7 Kompensationsmittel in Form zweier planparalleler optischer Komponenten 17 und 18 vorgesehen und über Stege 19 und 20 mechanisch miteinander verbunden sind. Von den Komponenten 17 und 18 und den Stegen 19 und 20 hermetisch dicht umschlossen ist ein mit einem Druckmedium, vorzugsweise einem Öl, gefüllter Innenraum 21, der über eine Leitung 22 mit einem Reservoir 23 für das Druckmedium in Verbindung steht. Die Brechzahl dieses Öls ist mit der Brechzahl des Deckglases 4 identisch oder weicht lediglich um eine vorgegebene Toleranz davon ab. Wie in den Beispielen nach 2 und 3 weisen auch hier die Komponenten 17 und 18 zwei vom Strahlengang zu durchdringende Grenzflächen 14 und 15 auf. In 4 an embodiment of the invention is shown in which, in contrast to the prior art in the beam path between the sample 1 and the lens 7 Compensating means in the form of two plane-parallel optical components 17 and 18 provided and over bridges 19 and 20 mechanically interconnected. From the components 17 and 18 and the jetties 19 and 20 hermetically sealed is a filled with a pressure medium, preferably an oil, interior space 21 who has a lead 22 with a reservoir 23 for the pressure medium communicates. The refractive index of this oil is the refractive index of the cover glass 4 identical or deviates only by a predetermined tolerance thereof. As in the examples 2 and 3 also have the components here 17 and 18 two interfaces to be penetrated by the beam path 14 and 15 on.

Die Verbindung der Komponente 18 mit den Stegen 19 und 20 ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass die Komponente 18 an den Stegen 19 und 20 gleitend und von den Stegen 19 und 20 geführt in Richtung der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 bzw. des Deckglases 4 verschiebbar und mit dieser Verschiebung der Abstand d2 der Grenzflächen 14 und 15 voneinander variierbar ist. The connection of the component 18 with the jetties 19 and 20 is preferably designed such that the component 18 at the jetties 19 and 20 sliding and from the jetties 19 and 20 guided in the direction of the surface normals of the interfaces 14 and 15 or the cover glass 4 displaceable and with this displacement the distance d2 of the interfaces 14 and 15 is variable from each other.

Die Komponenten 17 und 18 bestehen aus einem Material oder weisen zumindest ein Fenster auf, das für den Abbildungsstrahlengang transparent ist, wobei dessen Brechzahl mit der Brechzahl des Materials identisch ist oder maximal um eine vorgegebene Toleranz davon abweicht, aus dem das Deckglas 4 gefertigt ist. So kann für die Komponenten 17 und 18 zum Beispiel auch hier D263M vorgesehen sein. The components 17 and 18 consist of a material or have at least one window which is transparent to the imaging beam path, wherein its refractive index is identical to the refractive index of the material or deviates at most by a predetermined tolerance thereof, from which the cover glass 4 is made. So can for the components 17 and 18 For example, here also D263M be provided.

Das optische Design dieser Anordnung sieht für das Deckglas 4 eine Dicke d1 vor, und bezüglich der Grenzflächen 14 und 15 einen Abstand d2 voneinander. Das Paket aus Deckglas 4 und den Komponenten 17 und 18 hat damit wiederum eine Höhe d = d1 + d2. The optical design of this arrangement looks for the cover glass 4 a thickness d1 before, and with respect to the interfaces 14 and 15 a distance d2 from each other. The package of cover glass 4 and the components 17 and 18 thus again has a height d = d1 + d2.

Kommt es im Probenraum während der Probenbeobachtung zu Temperaturänderungen, ändern sich – wie auch im bereits beschriebenen Ausführungsbeispiel nach 3 – aufgrund ihrer Temperaturabhängigkeit die Dicken und die Brechzahlen der durchstrahlten Medien, und es treten Abbildungsfehler bzw. Aberrationen auf. If temperature changes occur in the sample space during sample observation, they change as in the embodiment already described 3 Due to their temperature dependence, the thicknesses and the refractive indices of the irradiated media, and aberrations occur.

Im Falle von Abbildungsfehlern, die ihren Ursprung in einer Vergrößerung der Dicke d1 des Deckglases 4 um einen Betrag ∆d haben, wird die Komponente 18 in Richtung der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 bzw. des Deckglases 4 soweit verschoben, bis der Abstand d2 der Grenzflächen 17 und 18 voneinander um den Betrag ∆d verringert ist, so dass im Ergebnis der Verschiebung das Paket aus Deckglas 4 und Komponenten 17 und 18 wieder die ursprünglich vorgegebene Höhe d hat und damit die Ursache für diese Abbildungsfehler behoben ist. In the case of aberrations originating in an increase in the thickness d1 of the cover glass 4 by an amount Δd, the component becomes 18 in the direction of the surface normals of the interfaces 14 and 15 or the cover glass 4 moved as far as the distance d2 of the interfaces 17 and 18 is reduced from each other by the amount .DELTA.d, so that as a result of the shift, the package of cover glass 4 and components 17 and 18 again the originally given height d and thus the cause of these aberrations has been resolved.

Abbildungsfehler, die aus sphärischen Aberrationen aufgrund von Änderungen der Brechzahlen der durchstrahlten Medien resultieren, werden – wiederum zumindest in erster Näherung – durch Variation der Höhe d des Paketes aus Deckglas 4 und den Komponenten 17 und 18 kompensiert. Aberrations resulting from spherical aberrations due to changes in the refractive indices of the irradiated media are - again, at least to a first approximation - by varying the height d of the cover glass package 4 and the components 17 and 18 compensated.

Etwaige Veränderungen des Abstandes d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 17 und 18, werden ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 18 so ausgeglichen, dass die Höhe d konstant bleibt bzw. zeitnah ihr vorgegebenes Maß wieder einnimmt. Any changes in the distance d2, for example due to material expansion of the components 17 and 18 , are also due to shift of the component 18 balanced so that the height d remains constant or promptly resumes its predetermined level.

Die Verschiebung der Komponente 18 zwecks Vergrößerung oder Verringerung des Abstandes d2 wird mittels Variation des Druckes des zwischen den beiden Komponenten befindlichen Druckmediums mittels einer zeichnerisch nicht dargestellten Förderpumpe ausgelöst, der Druckausgleich erfolgt dabei über das Reservoir 23. The shift of the component 18 for the purpose of increasing or decreasing the distance d2 is triggered by means of a pressure medium of the pressure medium between the two components by means of a delivery pump, not shown, the pressure compensation takes place via the reservoir 23 ,

Die optischen Komponenten 17 und 18 bilden gemeinsam mit den Stegen 19 und 20 auch hier einen Kompensator in Form einer planparallelen Platte mit variablem Abstand der Grenzflächen 14 und 15, der es ermöglicht, Abbildungsfehler zeitgleich oder zeitnah während der Probenbeobachtung zu kompensieren. The optical components 17 and 18 form together with the webs 19 and 20 Again, a compensator in the form of a plane-parallel plate with variable spacing of the interfaces 14 and 15 which makes it possible to compensate aberrations at the same time or in a timely manner during the observation of the sample.

Die vorstehend beschriebene Korrekturmöglichkeit gilt auch hier sowohl für Abbildungsfehler, die von Dickenabweichungen des Deckglases 4 oder der Komponenten 17 und 18 verursacht sind, als auch für Abbildungsfehler, die aufgrund von Abweichungen der Brechzahlwerte im Probenraum entstehen. The above-described correction possibility also applies here for aberrations that are different from thickness variations of the cover glass 4 or the components 17 and 18 as well as aberrations that arise due to deviations of the refractive index values in the sample space.

Vergleichbar zu 3 zeigt 5 eine Ausführungsform, bei welcher der Kompensator, gebildet aus den planparallelen optischen Komponenten 17 und 18 und den Stegen 19 und 20, anstelle des Deckglases 4 (vgl. 4) unmittelbar auf dem Probenbehälter 3 aufsitzt und diesen abdeckt. Comparable to 3 shows 5 an embodiment in which the compensator formed from the plane-parallel optical components 17 and 18 and the jetties 19 and 20 , instead of the cover glass 4 (see. 4 ) directly on the sample container 3 sits up and covers this.

Veränderungen des Abstandes d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 17 und 18, werden hier ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 18 in Richtung der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 ausgeglichen. Mit der Variation des Abstandes d2 sind auch hierbei Abbildungsfehler korrigierbar, die ihre Ursache in Abweichungen der Brechzahlwerte des Materials haben, aus dem der Probenbehälter 3 und die Komponenten 17 und 18 bestehen, sowie Abbildungsfehler aufgrund von Abweichungen der Brechzahl des Immersionsmediums. Changes in the distance d2, for example due to material expansion of the components 17 and 18 , are also here by shifting the component 18 in the direction of the surface normals of the interfaces 14 and 15 balanced. With the variation of the distance d2 in this case aberrations are also correctable, which have their cause in deviations of the refractive index values of the material from which the sample container 3 and the components 17 and 18 exist, as well as aberrations due to deviations of the refractive index of the immersion medium.

Anders als bei den anhand 2 bis 5 beschriebenen Ausführungsformen fällt in den nachfolgenden Ausführungsformen nach 6 und 7 die optische Achse 9 des Objektivs 7 nicht mit der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 zusammen, sondern schließt mit dieser einen von Null verschiedenen Winkel δ ein, so dass die Probenbeobachtung aus schräger Blickrichtung erfolgt. Unlike the case 2 to 5 described embodiments will be apparent in the following embodiments 6 and 7 the optical axis 9 of the lens 7 not with the surface normals of the interfaces 14 and 15 together, but includes with this a non-zero angle δ, so that the sample observation is done from an oblique direction.

Mit einem aus zwei keilförmigen optischen Komponenten 12 und 13 (vgl. 2 und 3) oder einem aus zwei planparallelen optischen Komponenten 17 und 18 gemeinsam mit den Stegen 19 und 20 gebildeten Kompensator (vgl. 4 und 5) und der jeweils dort beschriebenen Funktionsweise allein lassen sich unsymmetrische Aberrationen, wie Koma und Astigmatismus, die bei schräger Beobachtung zusätzlich zu sphärischen und höher sphärischen Aberrationen auftreten, nicht kompensieren. With one of two wedge-shaped optical components 12 and 13 (see. 2 and 3 ) or one of two plane-parallel optical components 17 and 18 together with the jetties 19 and 20 formed compensator (see. 4 and 5 ) and the mode of operation described therein alone can not compensate for asymmetric aberrations, such as coma and astigmatism, which occur in oblique observation in addition to spherical and higher spherical aberrations.

Abbildungsfehler, die in diesem Fall aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen, werden ebenso wie in den anhand 2 bis 5 bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Kompensationsmitteln ausgeglichen. Aberrations that arise in this case due to changes in the thickness and the refractive indices of the media to be penetrated, as well as in the 2 to 5 already compensated compensating agents according to the invention.

Dagegen müssen Aberrationen, die aufgrund des schiefen Durchgangs entstehen, mit anderen als den anhand 2 bis 5 beschriebenen Kompensationsmitteln ausgeglichen werden. Erfindungsgemäß ist zu diesem Zweck, wie in den Ausführungsbeispielen nach 6 und 7 gezeigt, ein Korrekturelement 24 vorgesehen, das es je nach Ausgestaltung ermöglicht, die beim schiefen Durchgang entstehenden Aberrationen entweder nur für eine bestimmte Objektebene oder für ein ganzes Objektvolumen zu korrigieren. On the other hand, aberrations caused by the crooked passage must be based on others 2 to 5 be compensated described compensation means. According to the invention for this purpose, as in the embodiments according to 6 and 7 shown a correction element 24 provided that it allows, depending on the design, the aberration resulting from oblique passage either only for one correct certain object level or for a whole object volume.

In 6 und 7 wird beispielhaft davon ausgegangen, dass die beim schiefen Durchgang entstehenden Aberrationen für ein ganzes Objektvolumen korrigiert werden sollen. Dazu besteht das Korrekturelement 24 aus asphärischen Linsen 26 und 27, mit denen die Abbildung des zu untersuchenden Objektvolumens erfolgt und dabei zugleich die Korrektur dieser Aberrationen vorgenommen wird. In 6 and 7 By way of example, it is assumed that the aberrations arising during the oblique passage are to be corrected for a whole object volume. For this purpose, there is the correction element 24 from aspherical lenses 26 and 27 with which the image of the object volume to be examined takes place and at the same time the correction of these aberrations is carried out.

Das Korrekturelement 24 ist in 6 fest über dem Kompensator aus den zwei keilförmigen optischen Komponenten 12 und 13 platziert, in 7 dagegen fest über dem aus den planparallelen Komponenten 17 und 18 gemeinsam mit den Stegen 19 und 20 gebildeten Kompensator. The correction element 24 is in 6 firmly over the compensator from the two wedge-shaped optical components 12 and 13 placed in 7 but firmly above that from the plane-parallel components 17 and 18 together with the jetties 19 and 20 formed compensator.

In beiden Fällen befindet sich im Zwischenraum 25 zwischen dem Kompensator und der ersten Linse 26 des Korrekturelementes 24 ein Immersionsmedium, beispielsweise Wasser oder Luft. Die beiden Linsen 26 und 27 sind rotationssymmetrisch ausgeführt und durch einen fest vorgegebenen Luftspalt 28 voneinander getrennt. Das Korrekturelement 24 ist vorteilhaft so ausgestaltet, dass es einerseits die beim schiefen Durchgang durch den betreffenden Kompensator entstehenden Aberrationen korrigiert und andererseits gleichzeitig eine Vergrößerung der Abbildung verursacht, beispielsweise von n1/n2·ξ. Hierbei ist n1 der Brechungsindex des Probenmediums (in diesem Fall Wasser mit n = 1.32), n2 der Brechungsindex des Mediums zwischen den Linsen des Korrekturelementes 24 bzw. zwischen dem Objektiv 7 und dem Korrekturelement 24, in diesem Fall Luft mit n2 = 1. Der Wert ξ ist ein frei wählbarer Parameter zwischen 0.5 und 2. In both cases is in the space 25 between the compensator and the first lens 26 of the correction element 24 an immersion medium, for example water or air. The two lenses 26 and 27 are designed rotationally symmetric and by a fixed predetermined air gap 28 separated from each other. The correction element 24 is advantageously designed such that on the one hand it corrects the aberrations that occur during oblique passage through the respective compensator and on the other hand simultaneously causes an enlargement of the image, for example of n1 / n2 · ξ. Here, n1 is the refractive index of the sample medium (in this case water with n = 1.32), n2 is the refractive index of the medium between the lenses of the correction element 24 or between the lens 7 and the correction element 24 , in this case air with n2 = 1. The value ξ is a freely selectable parameter between 0.5 and 2.

Im Spezialfall ξ = 1 erzeugt das Korrekturelement 24 ähnlich einer Lupe ein korrigiertes virtuelles Volumenabbild der Probe auf der Probenseite. Das Objektiv 7 bildet dementsprechend ein Schnitt des virtuellen Volumenabbilds der Probe 1 ab, das sich im Medium mit dem Brechungsindex n2 (in diesem Fall Luft) befindet. Somit entfällt die Notwendigkeit Immersionsobjektive zu verwenden, wodurch die Handhabung einfacher wird. Denkbar ist diesbezüglich auch, ein Wasserobjektiv zu einem Ölobjektiv umzufunktionieren, wenn n2 Wasser und n1 Öl ist. In special case ξ = 1 generates the correction element 24 similar to a magnifying glass, a corrected virtual volume image of the sample on the sample side. The objective 7 Accordingly, it forms a section of the virtual volume image of the sample 1 which is in the medium with the refractive index n2 (in this case air). This eliminates the need to use immersion lenses, which makes handling easier. It is also conceivable in this regard, to reprogram a water lens to an oil objective, if n2 is water and n1 is oil.

Für die Fokussierung muss im Falle der Verwendung eines virtuellen Relais das Korrekturelement 24 nicht bewegt werden, sondern es genügt, das Objektiv 7 zu verschieben oder auch eine Innenfokussierung anzuwenden. Bei der Fokussierung unter Verwendung allgemeiner, sphärischer Linsenelemente zur Korrektur ist es vorteilhafter, diese zusammen mit dem Objektiv 7 zu bewegen. For focusing, in case of using a virtual relay, the correction element must 24 not be moved, but it is enough, the lens 7 to move or to apply an internal focus. When focusing using general spherical lens elements for correction, it is more advantageous to use them together with the objective 7 to move.

Zu den Ausführungsformen nach 2 bis 7 ist anzumerken, dass die jeweils dargestellte aufrechte Mikroskopanordnung lediglich beispielhaft ist. Die Korrekturfunktion der beschriebenen technischen Mittel ist ebenso auch bei anderen Beleuchtungsvarianten gegeben, wie zum Beispiel bei einer Ausführungsform der Erfindung mit Auflichtbeleuchtung und inversem Mikroskopaufbau, wie in 8 dargestellt. According to the embodiments according to 2 to 7 It should be noted that the illustrated upright microscope arrangement is merely exemplary. The correction function of the described technical means is also given in other lighting variants, such as in an embodiment of the invention with incident illumination and inverse microscope setup, as in 8th shown.

Hierbei erfolgt die sowohl die Beleuchtung als auch die Probenbeobachtung durch den Boden des Probenbehälters 3 hindurch, der nun als ein Deckglas wirkt. Insofern befinden sich die erfindungsgemäßen Kompensationsmittel auch hier im Strahlengang zwischen der Probe 1 und dem Objektiv 7. Das Korrekturelement 24 wird in diesem Fall auch zur Einkopplung der Beleuchtung in den Probenraum genutzt. In this case, both the illumination and the sample observation are carried out through the bottom of the sample container 3 through, which now acts as a cover glass. In this respect, the compensation means according to the invention are here in the beam path between the sample 1 and the lens 7 , The correction element 24 is used in this case also for coupling the illumination in the sample space.

Die Beleuchtungsoptik 6 und das Objektiv 7 sind unterhalb des Probenbehälters 3 angeordnet und dort so zur Probe 1 ausgerichtet, dass für die Winkel α + β = 90° gilt. Der Abstand zwischen der Beleuchtungsoptik 6 bzw. zwischen dem Objektiv 7 und der ersten Linse 26 des Korrekturelementes 24 kann frei eingestellt werden. Wenn es sich bei dem Korrekturelement 24 um ein dreidimensionales rotationssymmetrisches Element mit einer numerischen NA = 1.32 handelt, das innerhalb des gesamten Öffnungswinkels korrigiert ist, können die Winkel α bzw. β beliebig gewählt werden, solange α + β = 90° eingehalten wird und die optischen Achsen 8 und 9 der Beleuchtungsoptik 6 und des Objektivs 7 gemeinsam mit der Flächennormalen des Bodens des Probenbehälters 3 in einer Ebene liegen. The illumination optics 6 and the lens 7 are below the sample container 3 arranged and there for a rehearsal 1 aligned, that applies to the angles α + β = 90 °. The distance between the illumination optics 6 or between the lens 7 and the first lens 26 of the correction element 24 can be set freely. If it is the correction element 24 is a three-dimensional rotationally symmetric element with a numerical NA = 1.32, which is corrected within the entire opening angle, the angle α or β can be chosen arbitrarily, as long as α + β = 90 ° is maintained and the optical axes 8th and 9 the illumination optics 6 and the lens 7 together with the surface normal of the bottom of the sample container 3 lie in one plane.

Die Ausführungsform nach 8 ist ausdrücklich sowohl zur Lichtmikroskopie geeignet, wobei die Beleuchtung der Probe 1 mit rotationssymmetrisch um die optische Achse 8 der Beleuchtungsoptik 6 geformten Beleuchtungslicht erfolgt, als auch zur Lichtblattmikroskopie, bei der die Beleuchtung der Probe 1 mit einem zu einem Lichtblatt geformten Beleuchtungslicht erfolgt, das mit der optischen Achse 8 der Beleuchtungsoptik 6 in einer Ebene liegt. The embodiment according to 8th is expressly suitable both for light microscopy, the illumination of the sample 1 with rotational symmetry about the optical axis 8th the illumination optics 6 shaped illumination light, as well as for light sheet microscopy, in which the illumination of the sample 1 with an illumination light shaped into a light sheet, with the optical axis 8th the illumination optics 6 lies in one plane.

Bei der Beleuchtungsoptik 6 und dem Objektiv 7 handelt es sich in allen in 2 bis 8 beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung vorteilhaft um Trockenobjektive, eine Wasserimmersion ist möglich, aber nicht erforderlich. In the illumination optics 6 and the lens 7 is it in all in 2 to 8th described embodiments of the invention advantageously dry lenses, a Wasserimmersion is possible, but not required.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11: Probe sample
22: Immersionsmedium Immersion medium
33: Probenbehälter sample container
44: Deckglas cover glass
55: Probentisch sample table
66: Beleuchtungsoptik illumination optics
7 7: Objektiv lens
88th: optische Achse optical axis
99: optische Achse optical axis
10 10: Objektiv lens
11 11: optische Achse optical axis
12 12: optische Komponente optical component
13 13: optische Komponente optical component
14 14: Grenzfläche interface
15 15: Grenzfläche interface
16 16: Zwischenschicht interlayer
17 17: optische Komponente optical component
18 18: optische Komponente optical component
19 19: Steg web
20 20: Steg web
21 21: Innenraum inner space
22 22: Leitung management
23 23: Reservoir reservoir
24 24: Korrekturelement correction element
25 25: Zwischenraum gap
26 26: Linse lens
27 27: Linse lens
28 28: Luftspalt air gap

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

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DE 102007002863 B3 [0005]
US 7593173 B2 [0006]
US 2013/0094016 A1 [0007]

Claims

Microscopic imaging device comprising - a lens ( 7 ) through a transparent cover on a region of a sample to be imaged ( 1 ), characterized in that - in the beam path between the sample ( 1 ) and the lens ( 7 ) Means are provided for compensating aberrations that arise due to the passage of the beam path through the transparent cover.

Microscopic imaging device according to claim 1, in which - the sample ( 1 ) together with an immersion medium ( 2 ) in a covered sample container ( 3 ), and - the beam path the transparent cover of the sample container, at least one wall of the sample container ( 3 ) and the immersion medium ( 2 ), wherein - in the beam path of the microscopic imaging device between the sample ( 1 ) and the lens ( 7 ) Means for compensating aberrations are provided, which due to the passage of the illumination or imaging beam path through the transparent cover, through the wall of the sample container ( 3 ) and the immersion medium ( 2 ) arise.

Microscopic imaging device according to claim 1 or 2, characterized in that the compensating means comprise optical components ( 12 . 13 . 17 . 18 ), which are transparent at least in the passage region for the beam path, the refractive index of these optical components ( 12 . 13 . 17 . 18 ) with the refractive indices of the transparent cover and the wall of the sample container ( 3 ) is either identical or at most deviates from it by a certain value, and - the optical components ( 12 . 13 . 17 . 18 ) at least two interfaces ( 14 . 15 ) whose distance d 2 measured in the direction of passage can be varied relative to one another.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, characterized in that the compensation means comprise - two wedge-shaped optical components ( 12 . 13 ), in which the distance of the interfaces ( 14 . 15 ) by shifting at least one of these components ( 13 ) perpendicular to the direction of passage relative to the other components ( 12 ), or - two plane-parallel optical components ( 17 . 18 ), in which the distance d2 of the interfaces ( 14 . 15 ) by shifting at least one of these components ( 18 ) in the direction of passage relative to the other components ( 17 ) is changeable.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, characterized in that - as a transparent cover, a cover glass ( 4 ) and the compensation means between cover glass ( 4 ) and lens ( 7 ), or - the compensation means as a cover of the sample container ( 3 ) are formed.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, characterized in that the optical axis ( 9 ) of the lens ( 7 ) - to the surface normal of the interfaces ( 14 . 15 ) is aligned in parallel, - with the surface normal of the interfaces to be penetrated ( 14 . 15 ) includes an angle δ different from zero, or - includes a non-zero angle δ with the surface normal of the interfaces to be penetrated and an additional correction element ( 24 ) is provided.

Microscopic imaging device according to claim 6, in which the optical axis ( 9 ) of the lens ( 7 ) with the surface normal of the interfaces to be penetrated ( 14 . 15 ) includes a non-zero angle δ and an additional correction element ( 24 ) with at least one spherical lens or at least one aspherical lens ( 26 . 27 ) is provided.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, formed - for light microscopy, wherein an illumination optical system ( 6 ) with a rotationally symmetrical about the optical axis ( 8th ) spread illuminating beam for illuminating the sample ( 1 ) is provided in incident or transmitted light, or - for light-sheet microscopy, comprising an illumination optical system ( 6 ) for illuminating the sample ( 1 ) in reflected light by means of a light sheet which coincides with the optical axis ( 8th ) of the illumination optics ( 6 ) lies in one plane, the illumination optics ( 6 ) and the lens ( 7 ) seen in the direction of gravity below the sample container ( 3 ) are arranged.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, in which as immersion liquid ( 2 ), for example, water and as a material for the sample container wall to be penetrated, for the cover glass ( 4 ) and / or for the optical components ( 12 . 13 . 17 . 18 ) an optical glass, PTFE, CYTOP ^® , FEP, Teflon ^® AF or a polymer is provided.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, comprising a control device for varying the distance d2 of the interfaces to be penetrated ( 14 . 15 ) of the optical components ( 12 . 13 . 17 . 18 ) depending on aberrations.

Microscopic imaging device according to one of the preceding claims, in which the compensating means are provided with a wedge error of the cover glass ( 4 ) are provided opposite wedge inclination, so that the wedge error of the cover glass ( 4 ) is corrected by means of this wedge inclination.