DE102013014381A1

DE102013014381A1 - Bestimmung des präformierten Immunstatus bei aktiven Erkrankungen mit intrazellulären Erregern zur Rekonstruktion von Infektionswegen

Info

Publication number: DE102013014381A1
Application number: DE201310014381
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Lophius Biosciences De GmbH
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-03-05
Anticipated expiration: 2033-08-31
Also published as: DE102013014381B4; WO2015028635A1

Abstract

Verfahren zur Bestimmung des präformierten Immunstatus bei aktiven Erkrankungen mit intrazellulären Erregern zur Rekonstruktion von Infektionswegen mittels durchflusszytometrischer Analyse von Zytokine, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Genese einer aktiven Erkrankung, nämlich Primärinfekt oder Reaktivierung, durch eine spezifische Zytokinverschiebung kennzeichnet, bestehend aus folgenden Schritten: – Stimulierung von heparinisiertem Vollblut mit den Erreger-spezifischen Antigenen, mit Staphylococcus Enterotoxin B (SEB) als Positivkontrolle, sowie mit Lösungsmittel als Negativkontrolle mit oder ohne Zusatz von co-stimulatorischen Antikörpern anti-CD49d und anti-CD28. – Inkubation für 30 min bis 4 h Stunden bei 35 bis 39°C und 3 (5) bis 10% CO2. – Zugabe eines Sekretionsinhibitor, z. B. Brefeldin A – Inkubation für 2 bis 12 Stunden bei 35 bis 39°C und 3 (5) bis 10% CO2 – Lyse von Erythrozyten und Fixierung von Leukozyten – Mehrfache Waschschritte zur Isolierung der Leukozyten – Förderung der Zellmembrandurchlässigkeit durch Zugabe von Saponin oder einer anderen, die Zellmembran-Permeabilität erhöhenden Substanz. – Inkubation mit spezifischen fluorochrom-markierten Antikörpern gegen CD4, CD69, IFN-γ und IL-2 für mindestens 10 Minuten auf Eis oder bei Raumtemperatur- oder bei 35 bis 39°C – Erneute Waschschritte zur Entfernung von ungebunden Antikörpern – Analyse der Zellen an einem Durchflusszytometer Die Auswertung des Anteils und/oder des Verhältnisses von IFNγ-, IL-2- oder beide Zytokine produzierenden T-Zellen zur Ermittlung der Infektionsgenese im Sinne eines Primärinfekts oder einer Reaktivierung bei Patienten mit aktiver Infektionserkrankung.

Description

Bei der Immunantwort gegen intrazelluläre Erreger (Bakterien und Viren) spielt die T-zelluläre Immunantwort eine wesentliche Rolle. Mit neueren Techniken lassen sich erregerspezifische T-Zell-Immunantworten durch den Nachweis der Zytokinproduktion auf Einzelzellniveau nachweisen. Dies ist besonders bei Infektionserkrankungen hilfreich, bei denen eine Analyse der Antikörperantwort nur ungenaue oder verzögerte Analysen eines Infektionsstatus eines Individuums zulassen. Hierzu gehören beispielsweise die Infektionen mit Mycobakterien.
Die gängigen Tests basieren auf dem Nachweis einer T-lymphozytären Immunantwort durch Interferon-γ nach Stimulation mit dem von Mycobakterien abgeleiteten Antigengemisch Tuberkulin (PPD) oder M. tuberculosis spezifischen Antigenen [1]. Durch die kommerziell erwerblichen Tests ist jedoch keine Unterscheidung einer latenten Infektion und einer aktiven Tuberkulose möglich [2]. Einige Veröffentlichungen konnten nun zeigen, dass durch die Auswertung weitere Zytokine wie Interleukin-2 (IL-2) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), des sogenannten Zytokinprofils, eine Diskriminierung zwischen latenter Infektion und aktiver Erkrankung möglich zu sein scheint. So konnte bereits gezeigt werden, dass es im aktiven Geschehen zu einer Reduktion polyfunktionaler T-Zellen kommt [3–6].
Bei Analysen des Infektionsstatus und bei der Rekonstruktion von Infektionswegen mittels Antikörpern kann durch die Bestimmung verschiedener Immunglobulinklassen der Zeitpunkt einer Infektion abgeschätzt werden. So finden sich in der Frühphase besonders Immunglobuline der Klasse M (IgM), im weiteren Verlauf überwiegen dagegen die Immunglobuline der Klasse G (IgG). Bei der Analyse des Infektionsverlaufes mittels T-Zellen kann zwischenzeitlich zwischen stattgehabten Infektionen und noch aktiven Infektionen unterschieden werden [3–6]. Bei der Beurteilung aktiver Infektionen kann jedoch nicht zwischen einer Primärinfektion (= Erstkontakt mit dem Erreger) und einer Reaktivierung einer früheren Infektion bzw. einer Reinfektion nach initial erfolgreicher Kontrolle unterschieden werden.
Als Beispiel sei hier wiederum die Erkrankung mit Mycobakterien aufgeführt. Hierbei werden Erkrankungen mit Erregern des M. tuberculosis-Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum und M. microti) aufgrund ihres ähnlichen Verlaufes oft begrifflich nicht differenziert und mit dem Überbegriff Tuberkulose bezeichnet. Aufgrund des langsamen Verlaufes einer Tuberkulose kann bisher oft nur durch die Anamnese indirekt rückgeschlossen werden, ob es sich um einen Primärinfekt oder eine Reinfektion/Reaktivierung handelt.
Eine genauere Bestimmung, ob ein aktiv an Tuberkulose erkrankter Patient unter einer Primärinfektion leidet oder ob es sich um die Reaktivierung einer eventuell viele Jahre zurückliegenden, klinisch stummen, latenten Infektion handelt, brächte Vorteile im Rahmen von Umgebungsuntersuchungen zur schnelleren Identifizierung von Kontaktpersonen und somit der Eindämmung einer weiteren Ansteckung.
Die von uns gemachten Beobachtungen bei der Infektion mit einem abgeschwächten Stamm des M. bovis (Bacille Calmette Gutirin = BCG), welcher früher zur Impfung gegenüber Tuberkulose verwendet wurde ohne das klassische Bild einer Tuberkulose hervorzurufen, könnten bei Übertragbarkeit auf andere Infektionen mit intrazellulären Erregern eine bis heute bestehende diagnostische Lücke schließen.
Die Instillation der Blase mit einer definierten Menge von BCG erlaubte uns die genaue Beobachtung des Verlaufs einer T-zellulären Immunantwort gegen PPD bei Personen mit Primärinfektion (= diese Personen hatten vor Therapiebeginn keine nachweisbare Immunantwort gegen PPD) und bei Personen mit Reinfektion (= diese Personen hatten bereits vor Therapiebeginn eine nachweisbare Immunantwort gegen PPD). Bei beiden Gruppen war die Polyfunktionalität (Interferon-γ/Interleukin-2 doppelt-positive T-Zellen) der messbaren T-Zellen nach Stimulation mit PPD erwartungsgemäß eingeschränkt. Bei Patienten mit Primärinfekt zeigte sich jedoch ein Überwiegen von Interleukin-2 einfach-positiven T-Zellen, während sich bei Patienten mit vorbestehender Immunität ein Überwiegen von Interferon-γ einfach-positiven T-Zellen fand. Aus Vorarbeiten ist bekannt, dass Patienten mit stattgehabter, immunologisch gut kontrollierter Infektion hingegen ein Überwiegen Interferon-γ/Interleukin-2 doppelt-positiver T-Zellen aufweisen [4, 5, 7].
Neu ist somit, dass sich durch Veränderungen des Zytokinprofils ableiten lässt, ob es sich bei der aktiven Erkrankung um eine Primärinfektion oder eine Reaktivierung einer latenten Infektion handelt. Diese Erkenntnisse wurden im Rahmen der Instillationstherapie mit dem BCG-Stamm gewonnen. Da bei aktiven Erkrankungen mit vielen anderen intrazellulären Erregern Verschiebungen im Zytokinprofil beschrieben sind, kann diese Beobachtung ggf. auch von M. bovis auf andere Erreger (z. B. M. tuberculosis, Cytomegalievirus, HIV, HCV, Influenzaviren) übertragen werden. Die Unterscheidung zwischen beiden Prozessen könnte für seuchenhygienische Fragestellungen sowie für die Rekonstruktion von Infektionswegen eine hohe praktische Bedeutung erlangen.
Zitierte Nichtpatentliteratur:

1. Abubakar, I., et al., How should I interpret an interferon gamma release assay result for tuberculosis infection? Thorax, 2013. 68(3): p. 298–301.
2. Sester, M., et al., Interferon-{gamma} release assays for the diagnosis of active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J, 2011. 37(1): p. 100–11.
3. Petruccioli, E., et al., IFNgamma/TNFalpha specific-cells and effector memory phenotype associate with active tuberculosis. J Infect, 2013. 66(6): p. 475–86.
4. Millington, K. A., et al., Dynamic relationship between IFN-gamma and IL-2 profile of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells and antigen load. J Immunol, 2007. 178(8): p. 5217–26.
5. Sester, U., et al., Whole-blood flow-cytometric analysis of antigen-specific CD4 T-cell cytokine profiles distinguishes active tuberculosis from non-active States. PLoS One, 2011. 6(3): p. e17813.
6. Harari, A., et al., Dominant TNF-alpha+ Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+ T cell responses discriminate between latent infection and active disease. Nat Med, 2011. 17(3): p. 372–6.
7. Sargentini, V., et al., Cytometric detection of antigen-specific IFN-gamma/IL-2 secreting cells in the diagnosis of tuberculosis. BMC Infect Dis, 2009. 9: p. 99.

Claims

Verfahren zur Bestimmung des präformierten Immunstatus bei aktiven Erkrankungen mit intrazellulären Erregern zur Rekonstruktion von Infektionswegen mittels durchflusszytometrischer Analyse von Zytokine, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Genese einer aktiven Erkrankung, nämlich Primärinfekt oder Reaktivierung, durch eine spezifische Zytokinverschiebung kennzeichnet, bestehend aus folgenden Schritten: – Stimulierung von heparinisiertem Vollblut mit den Erreger-spezifischen Antigenen, mit Staphylococcus Enterotoxin B (SEB) als Positivkontrolle, sowie mit Lösungsmittel als Negativkontrolle mit oder ohne Zusatz von co-stimulatorischen Antikörpern anti-CD49d und anti-CD28. – Inkubation für 30 min bis 4 h Stunden bei 35 bis 39°C und 3 (5) bis 10% CO₂. – Zugabe eines Sekretionsinhibitor, z. B. Brefeldin A – Inkubation für 2 bis 12 Stunden bei 35 bis 39°C und 3 (5) bis 10% CO₂ – Lyse von Erythrozyten und Fixierung von Leukozyten – Mehrfache Waschschritte zur Isolierung der Leukozyten – Förderung der Zellmembrandurchlässigkeit durch Zugabe von Saponin oder einer anderen, die Zellmembran-Permeabilität erhöhenden Substanz. – Inkubation mit spezifischen fluorochrom-markierten Antikörpern gegen CD4, CD69, IFN-γ und IL-2 für mindestens 10 Minuten auf Eis oder bei Raumtemperatur- oder bei 35 bis 39°C – Erneute Waschschritte zur Entfernung von ungebunden Antikörpern – Analyse der Zellen an einem Durchflusszytometer Die Auswertung des Anteils und/oder des Verhältnisses von IFNγ-, IL-2- oder beide Zytokine produzierenden T-Zellen zur Ermittlung der Infektionsgenese im Sinne eines Primärinfekts oder einer Reaktivierung bei Patienten mit aktiver Infektionserkrankung.