CN115083611A - 一种肿瘤原位免疫微环境的空间分析方法及其应用 - Google Patents

一种肿瘤原位免疫微环境的空间分析方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可用来评估免疫微环境的空间分析方法，在该方法中，我们创立了两个空间指标——“互作评分”和“互作百分比”，二者分别指代在肿瘤中心视野内，距离20um范围内，中心细胞（肿瘤细胞）与周边细胞（特定免疫细胞亚型）的配对数与中心细胞总细胞数的比值，以及以肿瘤细胞为中心，半径20um内，是否有免疫细胞亚型细胞存在，如果有记为1，如果没有记为0，然后比上所有中心细胞数量的比值。该方法可通过空间分析距离肿瘤细胞最近的免疫细胞数量，从空间分布来反映患者的免疫状态，进一步可分析其与免疫治疗疗效和预后的关系。

Description

一种肿瘤原位免疫微环境的空间分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学检测领域，更为具体的，本发明涉及一种肿瘤原位免疫微环境的空间分析方法及其应用。
背景技术
胃癌(gastric cancer, GC)是世界上第五大最常见的癌症和第二大癌症相关死亡原因。全球 47%以上的病例发生在中国。针对程序性细胞死亡蛋白 1(programmed celldeath protein 1, PD-1)和程序性死亡配体 1(programmed death-ligand 1, PD-L1)的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)的出现，使癌症治疗发生了革命性的变化，在胃癌患者中可获得持久获益。Pembrolizumab 或 Nivolumab 单药治疗的临床试验表明，在没有选择性生物标志物的晚期 GC 中缓解率仅为(10% -26%)。因此，为了提高抗 PD -1/PD-L1 治疗 GC 的疗效，迫切需要确定哪些患者最有可能从免疫治疗中获益。
肿瘤细胞存在于复杂的肿瘤免疫微环境中，包括多种免疫细胞（T淋巴细胞，B淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞）等肿瘤间质成分。肿瘤微环境在肿瘤发生发展，治疗抵抗，免疫逃逸和肿瘤复发中发挥重要作用。然而分析组织DNA、RNA、蛋白之前，将组织进行裂解（常常是成千乃至数百万个不同类型的细胞），进行生物样品制备时常常破坏了生物样本的空间结构丢失了重要空间位置信息以及互作信息。许多生物标志物，包括肿瘤突变负荷(TMB)、PD-L1 表达、微卫星不稳定性(MSI)和 Epstein-Barr 病毒(EBV)感染状态，可用于一定程度上区分 PD-1/PD-L1抑制剂的易感性。然而，在个体水平上使用这些生物标志物的几个临床试验的结果并不一致，有些甚至自相矛盾。
目前，对于肿瘤免疫微环境的分析，多集中在免疫细胞密度的分析。然而，即便免疫细胞密度相同，其空间分布可能大相径庭，进而，潜在影响患者预后和治疗疗效。肿瘤细胞如果跟免疫细胞相互交叉分布彼此靠近，则更能发挥抗肿瘤的作用；反之，如果肿瘤细胞跟免疫细胞，分布并没有充分交叉，而是互相单独聚集，形成界限，则限制了其发挥作用。因此，迫切需要开发一种更为科学有效的对肿瘤治疗反应，疗效和预后影响的计算和分析方法。
发明内容
为了填补现有技术的空白，本发明提供一种可用来评估免疫微环境的空间分析方法及其应用，具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种可通过细胞微环境空间分析来预测患者免疫治疗疗效的产品，所述产品包含对肿瘤细胞与特定免疫细胞亚型的“互作评分”和“互作百分比”进行检测的试剂和/或设备；
其中，
Figure 130509DEST_PATH_IMAGE001
；
在上述公式中，
“互作评分”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，中心细胞（肿瘤细胞）与周边细胞（特定免疫细胞亚型）的配对数与中心细胞总细胞数的比值；
“互作百分比”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，计算在以肿瘤细胞为中心，半径20um内，是否有相应免疫细胞亚型细胞存在，如果有记为1，如果没有记为0，然后比上所有中心细胞数量。
在一种实施方式中，上述治疗疗效是指免疫治疗是否有效。
本发明的第二个方面，提供一种细胞微环境空间分析方法在制备用于预测患者免疫治疗的产品中的应用，其中，所述产品包含对肿瘤细胞与特定免疫细胞亚型的“互作评分”和“互作百分比”进行检测的试剂和/或设备；
其中，
Figure 185053DEST_PATH_IMAGE002
；
在上述公式中，
“互作评分”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，中心细胞（肿瘤细胞）与周边细胞（特定免疫细胞亚型）的配对数与中心细胞总细胞数的比值；
“互作百分比”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，计算在以肿瘤细胞为中心，半径20um内，是否有相应免疫细胞亚型细胞存在，如果有记为1，如果没有记为0，然后比上所有中心细胞数量。
在一种实施方式中，上述治疗疗效是指免疫治疗是否有效。
在一种优选的实施方式中，所述产品包括试剂盒、电子设备。
本发明相对于现有技术获得了如下突出的进步：
1. 通过对细胞邻近性和数量的综合考量，我们创立了两个空间指标，分别为肿瘤细胞与特定免疫细胞亚型的“互作评分”和“互作百分比”。“互作评分”与“互作百分比”是在很大程度上保持了肿瘤原位的空间特征。得分越高，说明在一定距离内，肿瘤细胞周围的可能互作免疫细胞密度越高；
2. 这两种指标均能反应免疫细胞的空间分布，以及肿瘤微环境中的空间特点。同时这两种指标又有一些差异，作为空间评价的两个角度，可以相互补充来阐述肿瘤空间分布特征，从而更为精准的评价患者预后和治疗疗效。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1： 4个染色Panel的mIHC染色图分析流程及代表性图片， A.图像分割流程：包括HE对照-mIHC多色染色-组织拆分-细胞拆分-细胞亚型确定；B. 染色Panel通道示例；
图2：免疫细胞和肿瘤细胞空间分析示例以及互作评分以及互作百分比计算方法，其中虚线圆圈中间的为肿瘤细胞，虚线上的为免疫细胞，虚线圆圈代表半径范围20um；
图3：特定细胞亚型空间互作评分（ES）与细胞亚型空间互作百分比（EP）的相关性；
图4：特定细胞亚型空间互作评分（ES）与免疫相关无疾病进展期及总生存存在显著差异（胃癌患者接受免疫治疗60例）；
图5：特定细胞亚型空间互作百分比（EP）与免疫相关无疾病进展期及总生存存在显著差异（胃癌患者接受免疫治疗60例）；
图6：特定细胞亚型空间互作评分（ES）与胃癌总生存存在显著差异
（整体胃癌患者80例）；
图7：特定细胞亚型空间互作评分（EP）与胃癌总生存存在显著差异
（整体胃癌患者80例）。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1 多重免疫组化的免疫细胞亚型鉴定设计和分析流程
1. 标本采集
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)胃癌组织取自北京大学肿瘤医院病理科。胃癌组织包括从2018年3月至2020年12月收集的80例经组织学证实的胃癌患者样本（其中60例胃癌患者接受了抗PD-1/PD-L1为基础的免疫治疗）。本研究经北京大学肿瘤医院伦理委员会批准（伦理批准号：2020KT08）。所有参与者或其法定监护人签署知情同意书。
2. 多重免疫荧光染色
2.1胃癌原发灶肿瘤微环境检测
A. 免疫细胞亚型标记及免疫检查点Panel设计
肿瘤免疫panel包括如下：
第一，肿瘤组织及细胞结构化组成：用作肿瘤及间质分割，包括细胞角蛋白PanCytokeratin, 细胞核染色DAPI(nuclei)；第二，免疫细胞类型标记，包括CD4 (T-helper), CD8 (T-cytotoxic), FoxP3 (T-regulatory), CD68 (macrophages), HLA-DR(macrophages 1)，CD163(macrophages 2)；第三，免疫检查点/治疗靶点，包括PD-L1, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, STING。
B. 多色免疫荧光试验
我们对前述80例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本中进行4个Panel的免疫细胞亚型和免疫检查表达进行检测（Panel抗体目录如下表）。具体步骤如下：
烤片：FFPE样本65℃烤20分钟；脱蜡：二甲苯脱蜡（5分钟，重复3次）；水合：梯度乙醇浸片（100% 5分钟，95% 5分钟，70% 2分钟）；抗原修复：将脱蜡水合后的玻片置于碱性抗原修复液浸没(PANOVUE; Cat. 0019020500)，微波炉内高火煮沸，低火维持15分钟，取出自然冷却至室温；封闭：一抗封闭液(PANOVUE; Cat. 0018001120)，室温震荡10分钟；一抗孵育：以PD-1为例，PD-1 (CST43248, 1:100) ，室温孵育30分钟；二抗孵育：滴加HRP二抗工作液(PANOVUE; Cat.0013001010)，室温孵育10分钟；荧光染色放大信号：加入TSA染料PPD520TSA (1:100) ，室温震荡孵育10分钟。1×TBST buffer浸洗, 重复3次。可重复抗原修复，进行下一轮抗体染色。封片：滴加DAPI工作液，室温孵育；1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3分钟。用灭菌水洗片2分钟，待玻片微干，用移液器在玻片上滴加超强抗淬灭封片剂，浸没样本区域。加盖玻片，封片。读片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并进行判读。
每一个panel中，不同标记染色顺序、以及荧光搭配在预实验中均进行优化。
Panel 1:
Figure 349318DEST_PATH_IMAGE003
Panel 2:
Figure 122102DEST_PATH_IMAGE004
Panel 3:
Figure 670327DEST_PATH_IMAGE005
Panel 4:
Figure 110536DEST_PATH_IMAGE006
染色结束以后，使用Vectra 3.0 显微镜进行扫描(Perkin Elmer)，多通道染色及单通道染色结果如图1所示。
C. 图像免疫微环境分析
使用inForm软件(Perkin Elmer)对图像进行基本拆分。基于CK表达，对肿瘤、间质进行组织分割。根据染色标记进行如下进一步的双阳、三阳共表达的数据分析：细胞坐标数据来源于inform导出的cell_seg_data文件，其中Cell X Position和Cell Y Position两列分别为细胞在视野图像中的横坐标和纵坐标。
3. 视野选取及勾画
由专业的病理学家选择具有代表性的视野，并在20×处尽可能选择多个视野进行分析。选择肿瘤中心-根据之前获得的全片扫描图像，在表型图(PerkinElmer)中用固定大小的图章选择肿瘤中心。在每个标本中选择尽可能多的区域，尽量减少重叠。
4.空间指标计算方法
考虑细胞邻近性和数量，我们创立了两个空间指标，分别为肿瘤细胞与特定免疫细胞亚型的“互作评分”和“互作百分比”。空间指标的计算公式为：
Figure 789910DEST_PATH_IMAGE007
在上述公式中， “互作评分”（Effective score, ES）定义为：在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，中心细胞（肿瘤细胞）与周边细胞（特定免疫细胞亚型）的配对数与中心细胞总细胞数的比值。“互作百分比”(Effective percent, EP)定义为：在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，计算在以肿瘤细胞为中心，半径20um内，是否有相应免疫细胞亚型细胞存在，如果有记为1，如果没有记为0，然后比上所有中心细胞数量。示意图如图2。
“互作评分”与“互作百分比”是在很大程度上保持了肿瘤原位的空间特征。得分越高，说明在一定距离内，肿瘤细胞周围的可能互作免疫细胞密度越高。在80例胃癌患者中，我们对“互作评分”与“互作百分比”进行了相关性分析（图3）。分析发现，在多种免疫细胞亚型中，两种评分呈现正相关。进一步说明，我们提出的两种评分，均能反应免疫细胞的空间分布，反应肿瘤微环境中的空间特点。而又有存在差异，可以相互补充，在空间的两个角度，阐述肿瘤空间分布特征。
5. 结果分析：
我们回顾性分析了80例胃癌患者（其中60例胃癌患者接受了免疫治疗）。我们使用“互作评分”和“互作百分比”在胃癌患者中进行实践验证。
研究发现，在60例胃癌接受免疫治疗患者中，患者PD-L1+免疫细胞、CD4+FOXP3-CTLA4-PD-L1+免疫细胞“互作评分（ES）”较高，与延长的免疫治疗相关无疾病进展期（Immune related progression-free survival, irPFS）相关。患者具有较高的CD68+巨噬细胞的“互作评分（ES）”，预后较差，免疫相关无疾病进展期（irPFS）较短。同时，CD68+巨噬细胞的“互作评分（ES）”与胃癌免疫治疗患者总生存（Immune related overall survival,irOS）相关，巨噬细胞“互作评分（ES）”高的患者接受免疫治疗总生存较短（图4）。
随后，我们在60例接受免疫治疗的胃癌中，进行了“互作百分比（EP）”与生存的相关实践验证（图5）。实践验证发现，患者的PD-L1+免疫细胞，CD8+LAG3-PD1+TIM3-免疫细胞的“互作百分比（EP）”与胃癌患者接受免疫治疗后的无疾病进展期相关：具有较高PD-L1+免疫细胞，CD8+LAG3-PD1+TIM3-免疫细胞的“互作百分比（EP）”的胃癌患者免疫相关无疾病进展期（irPFS）较长。在免疫相关的总生存分析中，我们发现：患者较高的CD8+LAG3+TIM3+免疫细胞，CD68+免疫细胞“互作百分比（EP）”与胃癌患者接受免疫治疗后的总生存较短相关。
最后，在整体80例胃癌患者中，我们对胃癌患者总生存，进行了分析。“互作评分（ES）”验证发现：患者具有较高的CD4+CTLA-4+PD-L1+免疫细胞、CD8+PD1+TIM3+免疫细胞、CD68+巨噬细胞、CD68+CD163+巨噬细胞的“互作评分（ES）”与胃癌患者较短的总生存（Overall survival, OS）相关（图6）。
在整体80例胃癌患者中，我们对胃癌患者总生存，进行了“互作百分比（EP）”验证发现：患者具有较高的CD4+CTLA-4+PD-L1+免疫细胞、CD8+PD1+TIM3+免疫细胞、CD68+巨噬细胞、CD68+CD163+巨噬细胞的互作百分比（EP）”与胃癌患者较短的总生存相关（图7）。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种可通过细胞微环境空间分析来预测患者免疫治疗疗效的产品，其特征在于，所述产品包含对肿瘤细胞与特定免疫细胞亚型的“互作评分”和“互作百分比”进行检测的试剂和/或设备；
其中，
Figure 608681DEST_PATH_IMAGE001
；
在上述公式中，
“互作评分”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，中心细胞与周边细胞的配对数与中心细胞总细胞数的比值，其中，中心细胞是指肿瘤细胞，周边细胞是指特定免疫细胞亚型；
“互作百分比”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，计算在以肿瘤细胞为中心，半径20um内，是否有相应免疫细胞亚型细胞存在，如果有记为1，如果没有记为0，然后比上所有中心细胞数量。
2.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述治疗疗效是指免疫治疗是否有效。
3.一种细胞微环境空间分析方法在制备用于预测患者免疫治疗的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含对肿瘤细胞与特定免疫细胞亚型的“互作评分”和“互作百分比”进行检测的试剂和/或设备；
其中，
Figure 894169DEST_PATH_IMAGE002
；
在上述公式中，
“互作评分”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，中心细胞与周边细胞的配对数与中心细胞总细胞数的比值，其中，中心细胞是指肿瘤细胞，周边细胞是指特定免疫细胞亚型；
“互作百分比”是指，在肿瘤中心视野内，引入的定义距离20um范围内，计算在以肿瘤细胞为中心，半径20um内，是否有相应免疫细胞亚型细胞存在，如果有记为1，如果没有记为0，然后比上所有中心细胞数量。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗疗效是指免疫治疗是否有效。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒或电子设备。
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