DE102013002981A1

DE102013002981A1 - Optical arrangement of e.g. three-dimensional electron microscopy used for tumor diagnostics, has transparent thin light sheet whose sides are illuminated by light exactly or nearly perpendicular to direction of observation

Info

Publication number: DE102013002981A1
Application number: DE201310002981
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2014-08-21
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: DE102013002981B4

Abstract

The optical arrangement has transparent thin light sheet whose sides are illuminated simultaneously by the light exactly or nearly perpendicular to the direction of observation. An effect of shadowing in the light sheet is reduced while the light sheet is illuminated exactly on orthogonal sides. An object directed towards center of circular motion is illuminated by circular beam to thin sample.

Description

Es wird ein Verfahren beschrieben, mit dem störende Abschattungen in der Lichtblattmikroskopie verringert werden können, sowie die Kombination dieser Technik mit mehreren anderen mikroskopischen Techniken.A method is described which can reduce spurious shadowing in light sheet microscopy and the combination of this technique with several other microscopic techniques.

Stand der Technik:State of the art:

Bei der Lichtblattmikroskopie werden durchsichtige Präparate von der Seite mit einem dünnen Lichtblatt durchleuchtet und die so entstehenden optischen Schnitte von oben mit einer Kamera aufgenommen. Wenn das Objektsukzessive senkrecht durch das Lichtblatt geschoben wird und die vielen optischen Schnitte aufgenommen werden, kann aus den aufgenommenen Einzelbildern schließlich eine 3 dimensionale Rekonstruktion des Objektes berechnet werden.In light-sheet microscopy, transparent specimens are transilluminated from the side with a thin sheet of light and the resulting optical sections are taken from above with a camera. When the object successive is pushed vertically through the light sheet and the many optical sections are taken, a 3-dimensional reconstruction of the object can finally be calculated from the recorded individual images.

Ein Problem bei der Lichtblattbeleuchtung ist, daß absorbierende Strukturen im Objekt zu dunklen Streifen in den Einzelbildern führen.A problem with the light sheet illumination is that absorbing structures in the object lead to dark stripes in the frames.

Dem soll dadurch Abhilfe geschaffen werden, daß nicht nur mit einem Lichtblatt von der Seite sondern mit mehr als 2 Lichtblättern, z. B. 4 Lichblättern im 90 Grad Winkel beleuchtet wird (1). Wie 2 zeigt, werden bei Beleuchtung im 90 Grad Winkel die Streifen noch besser durch die anderen Lichtblätter ausgeleuchtet. So erhält man weitgehend schattenfreie Bilder und bessere Rekonstruktionen.This is to be remedied by the fact that not only with a light sheet from the side but with more than 2 sheets of light, z. B. 4 light leaves is illuminated at 90 degrees angle ( 1 ). As 2 shows, when illuminated at 90 degrees angle, the strips are better illuminated by the other sheets of light. This gives you largely shadow-free images and better reconstructions.

Eine weitere Lösungsmöglichkeit ist, die flächenhafte Beleuchtung des Objekts durch einen um das Objekt kreisenden, dünnen, auf die Objektmitte fokussierten Laserstrahl herzustellen. Damit werden keine ganzen dunklen Streifen, sondern nur noch spitz zulaufende Abschattungszonen erzeugt, ebenfalls ein Vorteil gegenüber den langgezogenen dunklen Streifen in den herkömmlichen Lichtblättern.Another possible solution is to produce the planar illumination of the object by a thin, focused on the object center around the object laser beam. Thus, no entire dark stripes, but only tapered shading zones are generated, also an advantage over the elongated dark stripes in the conventional light sheets.

Bei der oben beschriebenen Anordnung ohne Filter kann Streulicht detektiert werden. Wird ein Fluoreszensfilter vor die Kamera gesetzt, so kann bei Beleuchtung mit Licht kürzerer Wellenlänge als der Detektionswellenlänge des Fluoreszensfilters, Fluoreszens detektiert werden.In the arrangement without filter described above, stray light can be detected. If a fluorescence filter is placed in front of the camera, fluorescence can be detected when illuminated with light of shorter wavelength than the detection wavelength of the fluorescence filter.

Zur Beleuchtung kommt auch ein Weißlichtlaser in Frage, falls Streulicht oder Fluoreszenslicht verschiedener Wellenlänge detektiert werden sollen. Der Vorteil des Weißlichtlasers ist, daß für die Beleuchtung interessante Wellenlängen durch Filter oder AOTFs je nach Bedarf des Präparats herausgefiltert werden können, da man nicht auf eine fixe Laserwellenlänge festgelegt ist.A white-light laser is also suitable for illumination if scattered light or fluorescent light of different wavelengths is to be detected. The advantage of the white light laser is that interesting wavelengths for the illumination can be filtered out by filters or AOTFs as required by the specimen, since one is not fixed to a fixed laser wavelength.

Zur Auflösungserhöhung können die Lichtblätter über das STED Verfahren wesentlich dünner gemacht werden, wie in beschrieben. Je dünner die Lichtblätter, desto größer die Neigung zur Streifenbildung und desto wichtiger das obige Verfahren zu ihrer Vermeidung.To increase the resolution, the light sheets can be made substantially thinner using the STED method, as described in US Pat. The thinner the light sheets, the greater the tendency to streak and the more important the above method to avoid them.

Ein Problem beim Aufnehmen geklärter Präparate sind optische Aberrationen, die die Auflösung deutlich verschlechtern. Diese können durch Verwendung sogenannter adaptiver Optik verbessert werden. Dabei wird ein deformierbarer Spiegel in den Abbildungsstrahlengang eingebracht und die optischen Aberrationen werden durch Verformung des Spiegels kompensiert. Hierbei wird der Spiegel zunächst zufällig verformt und dann durch Ausprobieren und einen geeigneten Algorithmus die optimale Spiegelform gefunden. Maß ist hierbei der Kontrast im Bild.One problem with taking in clarified preparations is optical aberrations, which significantly worsen the resolution. These can be improved by using so-called adaptive optics. In this case, a deformable mirror is introduced into the imaging beam path and the optical aberrations are compensated by deformation of the mirror. Here, the mirror is first deformed randomly and then found by trial and error and a suitable algorithm, the optimal mirror shape. The measure here is the contrast in the picture.

In letzter Zeit wird die korrelative Mikroskopie, also die Darstellung von Präparaten in der Lichtmikroskopie für die Übersicht und in der Elektronenmikroskopie für die Detailaufnahmen immer interessanter. Hierfür eignet sich insbesondere die Lichtblattmikroskopie, wenn das Klärmedium anschließende Elektronenmikroskopie erlaubt. So müssen insbesondere die Zellmembranen beim Klärvorgang zumindest zum Teil erhalten bleiben. Dann kann z. B. zunächst ein Hirnareal zur Übersicht der Faserverläufe mit dem Lichtblattmikroskop aufgenommen werden und dann die synaptischen Verbindungen mit dem Elektronenmikroskop dargestellt werden.Recently, correlative microscopy, ie the presentation of specimens in light microscopy for the overview and in electron microscopy for the detail images is becoming increasingly interesting. Light sheet microscopy is particularly suitable for this purpose if the clarification medium permits subsequent electron microscopy. In particular, the cell membranes must be at least partially preserved during the clarification process. Then z. B. first recorded a brain area to overview the fiber profiles with the light sheet microscope and then the synaptic connections are shown with the electron microscope.

Die oben beschriebenen Verfahren können insbesondere in der Pathologie verwendet werden. So können cm große Tumorpräparate untersucht werden um festzustellen, ob bei der Operation der Tumor vollständig entfernt wurde. Insbesondere dabei sind streifenarme Bilder mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren entscheidend.The methods described above can be used in particular in pathology. For example, cm-sized tumor specimens can be examined to determine if the tumor was completely removed during surgery. In particular, streak-poor images are crucial with the aid of the methods described above.

Sowohl in der Pathologie als auch in der Hirnforschung und Embryologie sind Immunfärbung der Präparate von großer Bedeutung. Hierbei können geeignete Klärverfahren wie Clarity nach Deisseroth mit der Lichtblattmikroskopie kombiniert werden. Damit können große, immungefärbte Präparate in 3D aufgenommen werden.Both in pathology and in brain research and embryology immunostaining of the preparations are of great importance. Suitable clarification methods such as Clarity according to Deisseroth can be combined with light-sheet microscopy. This allows large, immunostained slides to be recorded in 3D.

Claims

Optical arrangement for the light-sheet microscopy in which the preferably transparent object is transilluminated by a thin light sheet, wherein the observation direction is exactly or approximately perpendicular to the light sheet, characterized in that 1. the object is illuminated by at least 2, better 4 sides simultaneously. At 2 light leaves is illuminated from opposite, 4 sides of exactly or approximately mutually perpendicular sides. This leads to a reduction of shadowing in the light sheet. 2. The object is illuminated by a thin laser beam circulating around the sample, which is directed towards the center of the circular motion. 3. Arrangement according to claim 1 or 2 is detected in the fluorescence or scattered light. 4. Arrangement according to claim 1, 2 and / or 3 in which a white light laser is used for illumination. 5. Arrangement according to claim 1, 2 and / or 3 in which a 2 photon laser is used for illumination. 6. Arrangement according to claim 1, 2 and / or 3 in which a STED illumination is used to increase the resolution. 7. Arrangement according to claim 1 and / or to 6 and in the adaptive optics on the observation side to improve the resolution in inhomogeneous preparations or preparations whose refractive index is not adapted to the lenses. 8. Arrangement according to claim 1 and / or to 7 in which a clarification medium is used for the transparency of preparations that subsequent electronmoscopy is also permitted 9. Arrangement according to claim 1 and / or to 8 in the subsequent correlative electron microscopy is possible, especially correlative 3D Electron Microscopy 10. Arrangement according to claim 1 and / or up to 9 s of the pathology to be examined 11. Arrangement according to claim 1 and / or to 10 are carried out at the examination for antibody staining.