DE102012217761A1

DE102012217761A1 - Verfahren zur Vermeidung von Artefakten beim Serial Block Face Imaging

Info

Publication number: DE102012217761A1
Application number: DE201210217761
Authority: DE
Inventors: Dr. Langer Matthias; Rainer Arnold; Esseling Markus; Jaroslaw Paluszynski
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-04-17
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: US20140092230A1; DE102012217761B4; US9536704B2

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erkennen und Kompensieren von Artefakten beim Aufnehmen von Bilderserien der Probe mittels einer teilchenoptischen Vorrichtung. Dabei umfasst die teilchenoptische Vorrichtung mindestens eine Teilchenquelle, die einen Primärteilchenstrahl erzeugt, mindestens einen Detektor zum Detektieren von Wechselwirkungsprodukten, die bei der Wechselwirkung von Primärteilchenstrahl und Probe entstehen, eine Kammer zur Aufnahme der Probe, sowie eine Schneideinrichtung mit Messer. Ein vorteilhaftes erfindungsgemäßes Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte: a) Aufnehmen eines ersten Bildes der Probe mittels des Detektors, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine erste mittlere Energie derart aufweisen, dass die mit dem Detektor detektierten Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus einer unterhalb der Probenoberfläche liegenden Probenschicht enthalten b) Entfernen der äußersten Probenschicht mithilfe der Schneideinrichtung c) Aufnehmen eines zweiten Bildes der Probe mittels des Detektors, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine zweite mittlere Energie derart aufweisen, dass die mit dem Detektor detektierten Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus der Oberflächenschicht der Probe enthalten d) Berechnen der seitlichen Verschiebung/des seitlichen Versatzes der Probe aus einem Vergleich des ersten und des zweiten Bilds e) Kompensieren des seitlichen Versatzes

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erkennung und Kompensation und/oder Vermeidung von Artefakten, die beim Serial Block Face Imaging auftreten können.
Serial Block Face Imaging ist ein bekanntes Verfahren, das es erlaubt, eine dreidimensionale Rekonstruktion (3D-Rekonstruktion) einer Probe herzustellen. Dazu wird das Probenmaterial in die Form eines Blockes gebracht und ein Bild einer Oberfläche des Blocks (block face) erzeugt und gespeichert. Dann wird die äußerste Probenschicht, die abgebildet worden ist, entfernt. Dadurch wird eine nächstfolgende Probenschicht frei gelegt, die nunmehr die äußerste Probenschicht ist. Von dieser neuen Probenoberfläche wird ein Bild erzeugt und gespeichert. Anschließend wird wiederum diese Probenschicht entfernt, ein Bild der neu frei gelegten Probenoberfläche aufgenommen und gespeichert, dann wieder die nächste Probenschicht entfernt und so weiter bis eine Bilderserie erstellt und gespeichert worden ist, anhand der sich rechnerisch eine 3D-Rekonstruktion des Probenblocks erstellen lässt.
Das Serial Block Face Imaging kann mithilfe einer teilchenoptischen Vorrichtung, zum Beispiel eines Rasterelektronenmikroskops (REM) ausgeführt werden, in dessen Probenkammer sich ein Ultramikrotom mit einem Mikrotommesser befindet. Die Probenoberfläche wird mit dem REM abgebildet. Anschließend werden in sich wiederholender Weise die jeweils äußerste Probenschicht mit dem Ultramikrotom abgeschnitten und die dadurch frei gelegte Probenschicht mit dem REM abgebildet. Bei derart hergestellten Bilderserien sind verschiedenartige Artefakte bekannt, die negativen Einfluss auf die erzeugten Abbilder der Probe und die Qualität der 3D-Rekonstruktion haben.
Artefakte sind unerwünschte Veränderungen der Probe, die in unbeabsichtigter Weise entstehen können, wenn die Probe präpariert wird, das heißt für die eigentliche Untersuchung vorbereitet wird, aber auch, wenn die Probe abgebildet wird. Das führt dazu, dass Bilder, die man von einer solchen, Artefakt-behafteten Probe erhält, nicht mehr den nativen Zustand der Probendetails wiedergeben und die Aussagekraft dieser Bilder somit sehr eingeschränkt ist. Daher ist es vorteilhaft, Artefakte zu erkennen und ihre Entstehung zu vermeiden.
Beim Serial Block Face Imaging, das mit einer teilchenoptischen Vorrichtung mit Ultramikrotom ausgeführt wird, können verschiedenartige Artefakte auftreten.
So können Probendetails wie beispielweise Zellstrukturen biologischer Proben, aufgrund der mechanischen Einwirkung beim Schneiden deformiert werden. Durch die laterale Krafteinwirkung des schneidenden Messers kann der Probenblock seitlich verschoben oder deformiert werden, auch wenn der Probenblock auf dem Probenhalter ausreichend befestigt ist. Die aus einer solchen Probe erstellte 3D-Rekonstruktion ist durch horizontale Verzerrungen beeinträchtigt.
Außerdem kann die abzubildende Probenoberfläche (block face) durch den Schnitt des Mikrotommessers deformiert werden, so dass ein rippelartiges Oberflächenprofil des Schnitts parallel zur Messerkante, auch „chatter” genannt, auftreten kann. Es ist auch möglich, dass senkrecht zur Messerkante verlaufende Längsriefen auftreten. Die 3D-Rekonstruktion basierend auf Bildern von solchen Probenoberflächen enthält dann fehlerhafte Bildinformationen aufgrund der starken Oberflächenrauheit der Probe. Im Extremfall kann die Oberfläche des Probenblocks sogar stufenartig abgeschnitten worden sein. Eine solche Oberflächentopographie der Probe kann zu einer Verfälschung der 3D-Rekonstruktion führen, weil Bildinformationen, die aus unterschiedlich tief liegenden Probenschichten stammen, in einer Bildebene des Rekonstrukts vereinigt werden.
Ähnliche Artefakte können auftreten, wenn der Schnitt nicht perfekt geführt wurde, was bedeutet, dass das Probenmaterial nicht mit einem glatten Schnitt abgetrennt wurde, sondern vielmehr nicht abgetrennte Probereste auf der Probenoberfläche verbleiben. Dadurch kann eine Probenstruktur vorgetäuscht werden, die in der ursprünglichen Probe nicht vorhandenen war.
Wenn das Mikrotommesser nicht exakt rechtwinklig zur optischen Achse der teilchenoptischen Vorrichtung ausgerichtet ist, wird die Probe schräg abgeschnitten. Das bedeutet, dass die Probenoberfläche nicht genau im rechten Winkel zu optischen Achse des REM steht und somit der auf die Probe auftreffende Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche einen Winkel zueinander bilden, der von 90° abweicht. Bei einer solchen unbeabsichtigten Probenneigung wird es immer Probenbereiche geben, die nicht im Fokus liegen und daher nur unscharf abgebildet werden können.
Biologische Proben werden in der Regel in harzartige Substanzen eingebettet, um einen festen Probenblock zu bilden. Da natürliche oder künstliche Harze elektrisch nicht oder nur schlecht leitend sind, kommt es zu Aufladungen der Probenoberfläche, wenn der Primärteilchenstrahl auf die Probe trifft und die dabei übertragenen elektrischen Ladungen nicht abfließen können. Dies kann zu einer aufladungsbedingten Signalverstärkung führen, die eine nicht vorhandene Struktur vortäuscht. Außerdem kann es zu unerwünschtem Auswandern des Bildes kommen.
Kurze Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Es ist eine automatisierte Methode des Serial Block Face Imagings bekannt, bei der die Schnittserie mithilfe eines miniaturisierten Ultramikrotoms aufgenommen wird, das sich in der Vakuumkammer eines Rasterelektronenmikroskops befindet. Die Bilderserie wird mit einem BSE-Detektor aufgenommen. Dabei wird das REM unter Niedervakuumbedingungen betrieben, um Aufladungen der Probenoberfläche zu vermeiden.
Außerdem ist ein Verfahren beschrieben worden, bei dem unerwünschte Ladungen auf der Probenfläche durch Einleiten von inertem Gas lokal kompensiert werden.
Ferner ist vorgeschlagen worden, ein oszillierendes Mikrotommesser zu verwenden, was schnittbedingte Probendeformationen verringern soll. Um die Qualität der vorgeschlagenen Methode zu beurteilen, wird das Ausmaß der Probendeformation bestimmt, indem kugelige Objekte mikroskopisch abgebildet werden; in der zweidimensionalen Darstellung erscheinen diese Objekte – je nach Grad der schnittbedingten Verformung – dann kreisförmig oder elliptisch.
Eine andere Möglichkeit ist, auf die Verwendung eines Mikrotoms ganz zu verzichten und die Probenschichten durch Millen, also durch Bearbeiten mit einem Ionenstrahl, zu entfernen. Nachteilig an der letztgenannten Methode ist, dass sie sehr zeitaufwändig ist und Ionen in das Probenmaterial implantiert werden.
Als Stand der Technik sind folgende Dokumente zu betrachten
US 4,377,958
EP 2009 421
DE 10 2008 040 426
Denk, W. & Horstmann, H. (2004), PLoS Biology, Vol. 2 (11), e329, pp 1–10
Al-Amoudi et al. (2003); Journal of Microscopy, Vol. 212, pp 26–33
Überblick über die Erfindung
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen automatisierten Prozess vorzuschlagen, mit dem Artefakte erkannt, verhindert oder kompensiert werden können, die beim Block Face Imaging, das mittels einer teilchenoptischen Vorrichtung mit Ultramikrotom ausgeführt wird, auftreten können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind durch die abhängigen Ansprüche gegeben.
Zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigt man eine blockförmige Probe, die so beschaffen ist, dass sie in einer teilchenoptischen Vorrichtung untersucht werden kann. Zu diesem Zweck wird die Probe in Abhängigkeit vom jeweiligen Probenmaterial vorbereitet, d. h. beispielsweise fixiert und – falls erforderlich – als Ganzes angefärbt, und schließlich in ein geeignetes Einbettungsmittel eingebettet. Das Einbettungsmittel ist üblicherweise ein Harz, beispielsweise ein natürliches oder künstliches Standard-Harz für die Elektronenmikroskopie, das üblicherweise so modifiziert worden ist, dass es opak ist.
Dann wird die eingebettete Probe so getrimmt, d. h. geschnitten, dass eine Blockform, vorzugsweise eine Quader- oder Pyramidenform, bevorzugt mit trapezförmiger Grundfläche entsteht. Der Probenblock wird von einem Probenhalter aufgenommen, so dass der Probenhalter mit dem Probenblock in die Vakuumkammer einer teilchenoptischen Vorrichtung eingebracht werden kann. Üblicherweise werden Probenblöcke verwendet, die eine Seitenlänge von einigen Millimetern aufweisen. Der Probenblock wird in der Vakuumkammer derart gelagert, dass er verfahrbar ist. Zu diesem Zweck umfasst die teilchenoptische Vorrichtung einen beweglichen Probentisch, auf dem der Probenblock gehalten wird. Mittels des Probentischs kann die Probe entlang verschiedener Achsen verfahren werden, vorzugsweise entlang der x-, y-, z-, Rotations- und Kippachse. Vorteilhaft ist es, wenn der Probentisch mittels einer Computersteuerung bewegt werden kann.
Die teilchenoptische Vorrichtung, in die der Probenblock eingebracht wird, kann ein Rasterelektronenmikroskop (REM) oder ein Zweistrahlgerät, d. h. ein Kombinationsgerät aus REM und Ionenmikroskop mit fokussiertem Ionenstrahl (FIB) sein. Die teilchenoptische Vorrichtung umfasst mindestens eine Teilchenquelle, die eine Elektronenquelle oder eine Ionenquelle sein kann. Die Teilchenquelle erzeugt einen Primärteilchenstrahl, der auf die Probe gerichtet ist, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls durch Anlegen einer Beschleunigungsspannung beschleunigt werden. Die Teilchen des Primärteilchenstrahls werden einer definierten Beschleunigungsspannung ausgesetzt, so dass die Teilchen eine definierte mittlere Energie aufweisen. Die Beschleunigungsspannung kann veränderbar sein, so dass auch die mittlere Energie der Teilchen variiert werden kann. Der Primärteilchenstrahl wird innerhalb eines meist als Rechteck ausgebildeten Scanfelds vorzugsweise rasterartig über die Probenoberfläche geführt. Vorteilhaft ist es, wenn der Primärteilchenstrahl so abgelenkt werden kann (beam shift), dass das abgerasterte Scanfeld gezielt seitlich verschoben werden kann. Die Teilchen des Primärteilchenstrahls, die auf der Probe auftreffen, treten in Wechselwirkung mit dem Probenmaterial, so dass aus der Probe Wechselwirkungsprodukte frei gesetzt werden. Die teilchenoptische Vorrichtung umfasst mindestens einen Detektor, der diese Wechselwirkungsprodukte detektieren kann, um daraus ein Abbild der vom Primärteilchenstrahl getroffenen Probenoberfläche (block face) zu erzeugen. Üblicherweise wird zur Detektion dieser Wechselwirkungsprodukte ein BSE-Detektor und/oder ein SE-Detektor verwendet, je nachdem ob Rückstreuelektronen (BSE) und/oder Sekundärelektronen (SE) zur Bilderzeugung genutzt werden sollen. Es ist auch denkbar, Wechselwirkungsprodukte mit anderen geeigneten Detektoren zu detektieren.
Nachdem ein Bild der Oberfläche des Probenblocks aufgenommen und gespeichert worden ist, wird die Oberflächenschicht, die gerade abgebildet worden ist, entfernt. Zu diesem Zweck umfasst die teilchenoptische Vorrichtung ein miniaturisiertes Mikrotom, das sich innerhalb der Probenkammer befindet. Das Mikrotom kann ein Ultramikrotom sein. Das Mikrotom umfasst ein Mikrotommesser, vorzugsweise ein Diamantmesser, mit dem die Oberfläche des Probenblocks abgeschnitten werden kann. Es ist vorteilhaft, wenn das Messer so ausgebildet ist, dass es während des Schneidvorgangs oszillieren kann. Durch die Oszillationsbewegung, deren Frequenz und Amplitude vorzugsweise veränderbar sind, kann die Qualität des Schnitts beeinflusst werden. Die abgeschnittenen Probenschichten werden verworfen. Das Abtragen der Oberflächenschicht legt einen nächstfolgenden Probenbereich frei, der nun die Oberfläche des Probenblocks bildet. Dann wird ein Bild dieser neuen Probenoberfläche aufgenommen und gespeichert. Anschließend wird in der beschriebenen Weise die nächste Probenschicht entfernt, ein Bild der neu entstandenen Probenoberfläche aufgenommen und gespeichert, dann wieder die nächste Probenschicht entfernt und so weiter, bis eine Bilderserie aufgenommen und gespeichert worden ist. Anhand der gespeicherten Bilderserie lässt sich eine 3D-Rekonstruktion des Probenblocks mit Hilfe einer geeigneten Recheneinheit und eines entsprechenden Computerprogramms erstellen.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft das Erkennen und Kompensieren von seitlichen Verschiebungen der Probe, verursacht durch die laterale Krafteinwirkung des schneidenden Mikrotommessers während des Block-Face-Imaging-Prozesses. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren macht man sich zunutze, dass in Abhängigkeit von der gewählten Beschleunigungsspannung des Primarteilchenstrahls Bildinformationen aus unterschiedlich tief liegenden Probenschichten dargestellt werden können; auf diese Weise können zwei Bilder von derselben Probenschicht aufgenommen werden, wobei das erste Bild aufgenommen wird, solange diese Probenschicht noch innerhalb des Probenblocks liegt. Das zweite Bild wird aufgenommen, nachdem eine weiter außen liegende Probenschicht entfernt worden ist und auf diese Weise die im ersten Bild abgebildete Probenschicht als neue Oberflächenschicht frei gelegt wurde. Diese neue Oberflächenschicht wird im zweiten Bild abgebildet. Durch Vergleich des ersten und des zweiten Bildes lässt sich ein seitlicher Versatz erkennen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem ersten Schritt ein Bild des Probenblocks aufgenommen, indem Wechselwirkungsprodukte detektiert werden, die aufgrund der Wechselwirkung von Primärteilchen eines Primärteilchenstrahls mit dem Probenmaterial entstanden sind. Dazu werden die Teilchen des Primärteilchenstrahls durch das Anlegen einer ersten Beschleunigungsspannung (EHT1) beschleunigt. Diese erste Beschleunigungsspannung bewirkt, dass die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine erste mittlere Energie aufweisen. Die erste Beschleunigungsspannung – und damit auch die erste mittlere Energie der Primärteilchen – wird so gewählt, dass die detektierbaren Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus einer unterhalb der Probenoberfläche liegenden Probenschicht liefern. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann beispielsweise eine Beschleunigungsspannung von 2 kV angelegt werden, was zu einer mittleren Energie der Primärteilchen von 2 keV führt und Bildinformationen aus ungefähr 20 nm Tiefe liefert. Die entstandenen Wechselwirkungsprodukte werden mit Hilfe eines geeigneten Detektors, beispielsweise eines BSE-Detektors, detektiert. Aus den detektierten Signalen wird ein erstes Bild der Probe erzeugt.
In einem zweiten Schritt wird die äußerste Probenschicht durch einen Ultramikrotom-Schnitt entfernt. Dabei wird die äußerste Probenschicht genau in der Stärke abgetragen, dass diejenige Probenschicht an die Oberfläche des Probenblocks gelangt, aus der im vorangegangenen Verfahrensschritt die Probeninformation stammte, d. h. die abgebildet worden ist. Üblicherweise hat die entfernte Probenschicht eine Stärke zwischen 10 nm und 50 nm, beispielsweise 20 nm.
Dann wird eine zweite Beschleunigungsspannung (EHT2) – und damit eine zweite mittlere Energie des Primärteilchenstrahls – gewählt, derart, dass die erhaltende Probeninformation von der neu frei gelegten Probenoberfläche stammt. Die frei gesetzten Wechselwirkungsprodukte werden mit Hilfe des Detektors detektiert, und ein zweites Bild wird erzeugt.
Durch Vergleich des ersten und des zweiten Bilds der Probe ist erkennbar, ob die abgebildeten Probendetails während des Schneidvorgangs seitlich verschoben worden sind. Wenn ein solcher seitlicher Versatz erkennbar ist, kann das Ausmaß des seitlichen Versatzes ermittelt werden, so dass während der nachfolgenden 3D-Rekonstruktion der Versatz rechnerisch kompensiert werden kann. Das Ausmaß des Versatzes kann durch rechnerische Methoden, beispielweise durch Anwendung der Kreuzkorrelationsfunktion ermittelt werden. Zusätzlich oder alternativ können während der nachfolgenden Aufnahme weiterer Bilder einer Bilderserie der Probentisch und/oder der Teilchenstrahl vor jedem Schneidvorgang derart verfahren werden, dass der beim Schneidvorgang zu erwartende Versatz ausgeglichen wird.
In einer speziellen Ausführungsform wird beim Aufnehmen einer Bilderserie im Zuge des Serial Block Face Imagings das erfindungsgemäße Verfahren bei jedem Abtrennen einer Probenschicht ausgeführt. In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren nicht nach jedem Abtrennen einer Probenschicht ausgeführt, sondern erst nach einer bestimmten Anzahl von Schneidvorgängen, beispielweise nach jedem 50. oder jedem 100. Schneidvorgang oder – je nach Gegebenheiten – nach einer beliebigen anderen Anzahl von Schneidvorgängen.
Bei einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es darüber hinaus möglich, den Winkel, unter dem der Primärteilchenstrahl auf die Probe auftrifft, zu bestimmen und, falls erforderlich, zu korrigieren. Dazu wird eine Serie von Bildern aufgenommen, wobei die Fokusebenen der einzelnen Bilder der Bilderserie voneinander verschieden sind: Bei jeder Bildaufnahme wird die Fokusebene verändert, so dass die Fokusebene jeweils von allen vorhergehenden Fokusebenen verschieden ist. Alle Bilder werden gespeichert und dazu verwendet, eine 3D-Rekonstruktion des Probenblocks zu errechnen. Anhand der 3D-Rekonstruktion lässt sich der Winkel bestimmen, unter dem der Primärteilchenstrahl auf der Probenoberfläche auftrifft. Näheres zur Methode ist in US 8,227,752 beschrieben.
Bei einer weiteren, alternativen Ausführungsform werden SE-Signale von beispielsweise drei Probenregionen aufgenommen, wobei diese Regionen zusammen eine gedachte Fläche aufspannen, die in der vom Primärteilchenstrahl abgerasterten Probenoberfläche liegt. Die detektierten Signale aus jeder dieser Regionen werden einem frequenz-basierten Rechen-Algorithmus unterworfen. Das Ergebnis der Berechnung erlaubt Rückschlüsse, ob die jeweilige Probenregion im Fokus liegt und – in der Gesamtbetrachtung der analysierten Probenregionen –, ob die Probenoberfläche im Verhältnis zur optischen Achse gekippt ist.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es außerdem möglich ist, einen nicht exakt geführten Schnitt zu erkennen. Bei einem nicht exakt geführten Schnitt hat das Mikrotommesser das Probenmaterial nicht in einem glatten Schnitt vom Probenblock abgetrennt. Vielmehr sind unbeabsichtigter Weise nicht abgetrennte Probenbereiche auf der Probenoberfläche liegen geblieben, so dass eine nicht-natürliche Probentopographie vorgetäuscht wird.
In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich zum BSE-Bild der Probe ein SE-Bild der Probe mithilfe eines In-lens-Detektors aufgenommen. An kantenförmigen Strukturen oder an Stellen, an denen Probenmaterial aus der Probenfläche heraussteht, treten naturgemäß vermehrt Wechselwirkungsprodukte aus dem Probenmaterial aus, die mithilfe des SE-Detektors detektiert werden können. Dieser Effekt ist aus der Literatur als Kanteneffekt bekannt. Im erfindungsgemäßen Verfahren führt der Kanteneffekt dazu, dass an denjenigen Probenstellen, an denen kantenförmige Strukturen oder überstehendes Probenmaterial vorhanden sind, das detektierte SE-Signal übersteuert oder annähernd übersteuert ist und somit von anderen Probenstellen unterschieden werden kann. Wenn auf diese Weise ein nicht exakt geführter Schnitt in der im Zuge des Serial Block Face Imagings aufgenommenen Schnittserie erkannt worden ist, kann für die folgenden Schnitte der Schnittserie der Vorschub des Mikrotommessers, das heißt also Schnittgeschwindigkeit und/oder Oszillationsfrequenz und/oder Oszillationsamplitude des Mikrotommessers, entsprechend angepasst werden. Außerdem ist es möglich, diese Probenstellen mit Hilfe ihrer Ortskoordinaten den korrespondierenden Bilddaten zuzuordnen, so dass Probeninformation von diesen Probenstellen von der 3D-Rekonstruktion des Probenblocks anhand der gleichzeitig aufgenommenen BSE-Bildserie ausgeschlossen werden können.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Oberflächenrauheit der Probenoberfläche ermittelt. Die Oberflächenrauheit ist ein Maß für die Textur einer Probenoberfläche. Zur Quantifizierung der Oberflächenrauheit wird üblicherweise die vertikale Abweichung einer bestimmten Oberfläche von einer idealen Oberfläche herangezogen. Dazu wird die zu untersuchenden Oberfläche mit der idealen Oberfläche verglichen. Dabei ist es üblich, zur Quantifizierung der Oberflächenrauheit lediglich die Profillinie der zu untersuchenden Oberfläche mit der Profillinie der idealen Oberfläche zu vergleichen, um auf dieses Weise die vertikale Abweichung der zu untersuchenden Profillinie von der idealen Profillinie zu bestimmen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die Höheninformation (Topographie) für jeden Punkt der Probenoberfläche detektiert und gespeichert werden. Anhand dieser Daten wird die Oberflächenrauheit berechnet. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse werden die Schneidparameter der nachfolgenden Schneidvorgänge so angepasst, dass die Oberflächenrauheit der beim nachfolgenden Schneiden erzeugten Probenoberflächen verringert wird.
In einer Erweiterung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es außerdem möglich, unerwünschte Aufladungen zu kompensieren, indem die Probenoberfläche durch gezielt herbeigeführte lokale Ionisation von Gasen in der Nähe der Aufladungsstellen neutralisiert wird.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand von Figuren erläutert. Hierbei werden Komponenten, die sich hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion entsprechen, mit Bezugszeichen versehen, die gleiche Ziffern aufweisen, zur Unterscheidung jedoch mit einem zusätzlichen Buchstaben ergänzt sind.
1 zeigt schematisch eine Vorrichtung, die geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen.
2 zeigt ein Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens.
3a bis 3c zeigen beispielhaft eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
4 zeigt beispielhaft eine weitere vorteilhafte Ausführungsform.
5 bis 7 zeigen Flussdiagramme weiterer spezieller Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
8 zeigt eine Erweiterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1 zeigt eine Vorrichtung, die geeignet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen. Die Vorrichtung umfasst eine teilchenoptische Vorrichtung 1, die als Elektronenstrahlgerät, beispielsweise als Rasterelektronenmikroskop, ausgebildet sein kann. Das Elektronenstrahlgerät verfügt über eine Teilchenquelle (nicht dargestellt), die sich in einer elektronenoptischen Säule 3 befindet und Primärteilchenstrahlen 4 erzeugt. Die Primärteilchenstrahlen 4 verlaufen parallel zur optischen Achse 15 der teilchenoptischen Vorrichtung 1. Die Primärteilchenstrahlen 4 sind auf den Probenblock 10 gerichtet und werden rasterförmig über die Probe geführt, wobei das abgerasterte Scanfeld vorzugsweise eine rechteckige Form hat. Vorteilhaft ist es außerdem, wenn der Primärteilchenstrahl 4 seitlich verschoben werden kann (beam shift). Darunter ist zu verstehen, dass der Primärteilchenstrahl 4 in einer besonderen Weise seitlich abgelenkt wird, derart, dass das abzurasternde Scanfeld an eine andere Stelle der Probe verschoben wird. Der Probenblock 10 befindet sich auf einem verfahrbaren Probentisch 9 innerhalb einer Probenkammer 2, die zur Aufnahme einer Probe ausgebildet ist und in der Vakuumbedingungen herrschen. Der Probentisch 9 ist so ausgebildet, dass er in mehrere Richtungen verfahrbar ist, vorzugsweise in x-, y-, z-Richtung. Außerdem ist der Probentisch 9 um mindestens eine Kippachse, vorzugsweise um zwei Kippachsen, die orthogonal zueinander stehen, drehbar, sowie um eine Rotationsachse drehbar. Innerhalb der Probenkammer 2 befindet sich außerdem eine Schneideinrichtung, die als Mikrotom 7 ausgebildet ist, welches ein Mikrotommesser 8 umfasst.
Vorzugsweise ist das Mikrotom 7 bewegbar ausgebildet, beispielsweise dadurch, dass das Mikrotom 7 als verfahrbare Einheit ausgebildet ist oder auf einem schwenkbaren Arm angeordnet ist. Mithilfe des Mikrotommessers 8 kann vom Probenblock 9 schichtweise Material abgetrennt werden. Die Bewegungen sowohl des Probentischs 9 als auch des Mikrotommessers 8 sind über eine Auswerte- und Steuereinheit 13 gesteuert und können aufeinander abgestimmt werden. Das Mikrotommesser 8 kann eine Diamantschneide aufweisen. In einer speziellen Ausführungsform ist das Mikrotommesser 8 so ausgebildet, dass es während des Schneidvorgangs oszilliert. Frequenz und Amplitude der Messerschwingung sind einstellbar. Die Teilchen des Primärteilchenstrahls 4 treffen auf den Probenblock 10, so dass aufgrund der Wechselwirkung zwischen den auftreffenden Teilchen und dem Probenmaterial Wechselwirkungsprodukte 6 frei gesetzt werden, die von mindestens einem ersten Detektor 5 detektiert werden. Aus den mit dem ersten Detektor 5 detektierten Signalen wird über eine Auswerte- und Steuereinheit 13 ein Bild der Probe erzeugt. Dabei ist es möglich, jedem Probenpunkt einen Bildpunkt (Pixel) mit den Koordinaten x und y zuzuweisen und zu speichern.
In einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst die teilchenoptische Vorrichtung 1 außerdem einen zweiten Detektor (nicht abgebildet), der ein SE-Detektor sein kann. Besonders vorteilhaft ist es, wenn dieser Detektor als In-lens-Detektor ausgebildet ist, was bedeutet, dass der Detektor innerhalb der elektronenoptischen Säule 3 angeordnet ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die für das Verfahren geeignete Vorrichtung eine verfahrbare Gaseinleitungsvorrichtung 12, die eine Nadel 14 umfasst, die als Gaskanüle ausgebildet sein kann und mit der gasförmige Stoffe zur Probenoberfläche geleitet werden können.
Anhand von 1 wird die Erfindung für den Fall erläutert, dass die teilchenoptische Vorrichtung, mit der die Erfindung ausgeführt werden kann, ein Elektronenstrahlgerät ist. Die Erfindung kann jedoch auch ausgeführt werden, wenn die teilchenoptische Vorrichtung ein Ionenstrahlgerät oder ein Zweistrahlmikroskop, also ein Kombinationsgerät aus Elektronenstrahlgerät und Ionenstrahlgerät, ist. Ein Zweistrahlmikroskop verfügt über zwei Strahlquellen, die Primärteilchenstrahlen 4 erzeugen, und zwar eine Elektronenquelle, die sich in einer elektronenoptischen Säule befindet und die einen Elektronenstrahl erzeugen kann und eine Ionenquelle, die sich in einer ionenoptischen Säule befindet und die einen Ionenstrahl erzeugen kann. Ionenstrahlgeräte und Elektronenstrahlgeräte sind grundsätzlich ähnlich aufgebaut. Ionenstrahlgeräte weisen jedoch – im Unterschied zu Elektronenstrahlgeräten – anstelle einer Elektronenquelle eine Ionenquelle auf und anstelle von magnetischen Linsen oder kombinierten elektrostatisch-magnetischen Linsen nur elektrostatische Linsen. Außerdem müssen je nach Polarität der Ionen natürlich auch die Polaritäten der an die verschiedenen Bauteile angelegten Potenziale und Potenzialdifferenzen entsprechend angepasst sein.
2 zeigt ein Flussdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Probenblock, von dem eine 3D-Rekonstruktion mittels Serial Block Face Imaging erstellt werden soll, befindet sich in der Probenkammer der teilchenoptischen Vorrichtung. In Schritt 201 wird ein erstes Bild des Probenblocks bei einer bekannten Vergrößerung und bei einer ersten Beschleunigungsspannung aufgenommen. In Abhängigkeit von dieser ersten Beschleunigungsspannung weisen die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine erste mittlere Energie auf, die so gewählt wird, dass eine im Probenblock unterhalb der Probenoberfläche liegende Probenschicht abgebildet wird. Im folgenden Schritt 202 wird die äußerste Schicht des Probenblocks, die bislang die bereits abgebildete Probenschicht bedeckte, vollständig mithilfe der Schneideinrichtung entfernt. Dann wird in Schritt 203 ein zweites Bild des Probenblocks bei einer zweiten Beschleunigungsspannung, d. h. mit einer zweiten mittleren Energie der Teilchen des Primärteilchenstrahls, aufgenommen, wobei die jetzt neu gebildete Probenoberfläche bei unveränderter Vergrößerung abgebildet wird. Das bedeutet also, dass das erste Bild und das zweite Bild dieselbe oder annähernd dieselbe Probenschicht abbilden und somit dieselben oder annähernd dieselben Probendetails enthalten. In Schritt 204 werden das erste Bild und das zweite Bild miteinander verglichen. Wenn während des Schneidvorgangs keinerlei laterale Verschiebung aufgetreten ist, sind beide Bilder identisch. Wenn jedoch ein Versatz beim Vergleich der beiden Bilder erkennbar ist, deutet dies darauf hin, dass die Probe seitlich verschoben worden ist. In Schritt 205 wird dieser seitliche Versatz kompensiert. Dies kann durch rechnerische Methoden geschehen oder durch entsprechendes Verfahren des Probentisches und/oder Verschieben des Primärteilchenstrahls während des Aufnehmens der Bilderserie.
Zur Verdeutlichung des in 2 als Flussdiagramm dargestellten Verfahrens sind in 3 die Schritte 201 bis 203 nochmals anhand eines Beispiels darstellt. In 3a ist im oberen Teil schematisch die Seitenansicht eines quaderförmigen Probenblocks 10 dargestellt, im unteren Teil in der Draufsicht ein Bild 305 des Probenblocks 10, das im Zuge des Block Face Imagings erzeugt worden ist. Im Innern des Probenblocks 10 befinden sich ein erstes Probendetail 301 und ein zweites Probendetail 302, die schematisch dargestellt sind. In der elektronenoptischen Säule 3 der teilchenoptischen Vorrichtung wird ein Primärteilchenstrahl 4 derart erzeugt und einer Beschleunigungsspannung ausgesetzt, dass der Primärteilchenstrahl 4 auf die erste Probenoberfläche 303 (block face) auftrifft. Aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Material des Probenblocks 10 und den beschleunigten Teilchen des Primärteilchenstrahls 4 entstehen Wechselwirkungsprodukte 6, die von einem ersten Detektor 5 detektiert werden können. Der Detektor 5 kann beispielsweise ein BSE-Detektor sein, mit dem zurück gestreute Elektronen (BSE) detektiert werden. Die Beschleunigungsspannung ist so gewählt, dass die vom Detektor 5 detektierten Wechselwirkungsprodukte 6 überwiegend Probeninformation aus einer unterhalb der ersten Probenoberfläche 303 liegenden Probenschicht 304 enthalten. Um Probeninformationen aus Probenschichten zu gewinnen, die tiefer als 20 nm unter der Probenoberfläche liegen, kann die Beschleunigungsspannung erhöht werden. Die erzielbare Eindringtiefe ist stark abhängig von der Natur des Probenmaterials, insbesondere von seiner Dichte und seiner Ordnungszahl (Z). Je höher die Dichte und je höher die Ordnungszahl eines Materials, desto geringer ist in der Regel die Eindringtiefe des Primärteilchenstrahls. Üblicherweise enthält das erste Bild der Probe Informationen aus einer Probenschicht, die 10 nm bis 50 nm unter der Probenoberfläche liegt. Aus den detektierten Signalen wird ein erstes Bild der Probe 305 erzeugt, das also ein Abbild der innerhalb des Probenblocks 10 liegenden Probenschicht 304 darstellt.
3b zeigt wie mittels des Mikrotommessers 8 an der vorher abgebildeten Probenschicht 304 ein Schnitt durch den Probenblock 10 geführt wird, so dass die äußerste Probenschicht 306 entfernt wird. Der Schnitt wird entlang einer gewünschten Schnittlinie des Mikrotomschnitts 307 geführt. Es sei angemerkt, dass aufgrund der zweidimensionalen Darstellung der 3b eine Schnittlinie 307 dargestellt ist, die aber – da es sich um einen dreidimensionalen Probenblock handelt – eine Schnittfläche repräsentiert. Die Schnittlinie des Mikrotomschnitts 307 wird so gewählt, dass die im vorangegangenen Verfahrensschritt abgebildete Probensschicht frei gelegt wird und nun die zweite Probenoberfläche 303a der Probenblocks 10 bildet.
3c zeigt im oberen Teil schematisch die Seitenansicht des quaderförmigen Probenblocks 10, nachdem die äußerste Probenschicht abgeschnitten worden ist. Im unteren Teil von 3c ist in der Draufsicht ein zweites Bild der Probe, aufgenommen nach dem Schneiden, dargestellt.
Der Probenblock und die in seinem Inneren liegenden Probendetails 301a und 302a sind durch die seitliche Krafteinwirkung des Mikrotommessers 8 beim Schneidvorgang lateral verschoben worden. Der in der elektronenoptischen Säule 3 der teilchenoptischen Vorrichtung erzeugte Primärteilchenstrahl 4 wird nun einer zweiten Beschleunigungsspannung ausgesetzt. Die zweite Beschleunigungsspannung wird so gewählt, dass die vom Detektor 5 detektierten Wechselwirkungsprodukte 6 überwiegend Probeninformation enthalten, die von der durch den Schneidvorgang neu gebildeten zweiten Probenoberfläche 303a des Probenblocks 10 stammen.
Als vorteilhaft hat sich erwiesen, wenn die erste mittlere Energie des Primärteilchenstrahls 4 größer ist als die zweite mittlere Energie des Primärteilchenstrahls 4. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Beschleunigungsspannungen so gewählt werden, dass die erste mittlere Energie des Primärteilchenstrahls 4 größer als 2 keV ist und die zweite mittlere Energie des Primärteilchenstrahls 4 kleiner als 2 keV ist.
Aus den detektierten Signalen wird ein zweites Bild der Probe 305a erzeugt, das die neu gebildete zweite Probenoberfläche 303a darstellt. Durch Vergleich der beiden Bilder 305 und 305a wird deutlich, dass die im ersten Bild 305 abgebildeten Probendetails 301 und 302 gegenüber den im dem zweiten Bild 305a abgebildeten Probendetails 301a und 302a verschoben sind. In einer speziellen Ausführungsform wird der Vergleich des ersten Bilds 305 und des zweiten Bilds 305a durch Anwendung einer Kreuzkorrelationsfunktion ausgeführt. Die Anwendung der Kreuzkorrelationsfunktion liefert direkt eine Aussage über das Ausmaß der Verschiebung der in beiden Bildern abgebildeten Probendetails, angegeben in Pixeln. Anhand der Vergrößerung, mit der beide Bilder aufgenommen worden sind, und die bekannt ist, lässt sich die Verschiebung in eine Längenangabe umrechnen.
Beim Aufnehmen von Bildern für die Bilderserie wird die Probe nun mithilfe des verfahrbaren Probentischs derart bewegt, dass seitliche Verschiebungen kompensiert werden. Alternativ kann der Primärteilchenstrahl während des Aufnehmens der Bilderserie derart abgelenkt werden, dass durch Verschiebung des abgerasterten Scanfelds seitliche Verschiebungen der Probe kompensiert werden können. Außerdem können die seitlichen Verschiebungen der Probe durch rechnerische Methoden bei der 3D-Rekonstruktion kompensiert werden, nachdem eine Bilderserie aufgenommen worden ist.
Um optimale Ergebnisse mit dem beschriebenen Verfahren zu erzielen, sollte es bevorzugt mit bestimmten Parametereinstellungen ausgeführt werden. Es besteht ein Zusammenhang zwischen der gewählten Vergrößerung und DOF (depth of field) und FOV (field of view), da DOF und FOV mit steigender Vergrößerung kleiner werden. Unter DOF wird derjenige Streckenabschnitt verstanden, der entlang der optischen Achse der teilchenoptischen Vorrichtung verläuft und in dem sich ein Objekt befinden muss, damit es fokussiert abgebildet werden kann. Unter FOV wird der Bereich der Probe verstanden, der vom Primärteilchenstrahl abgerastert und von einem Detektor detektiert werden kann. Der Zusammenhang zwischen Öffnungswinkel α, DOF und Vergrößerung Mag kann folgendermaßen beschrieben werden: DOF = Zeilenabstand des Displays/(Mag·tanα)
Der Zeilenabstand auf dem zum Darstellung des Bildes verwendeten Display kann beispielsweise 200 μm betragen. Für das erfindungsgemäße Verfahren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, eine geringe Vergrößerung, beispielsweise 1000-fach bis 2000-fach und einen großen Öffnungswinkel α des Primärteilchenstrahls, beispielsweise α = 5·10^–2, zu verwenden, um eine hohe Auflösung in z-Richtung zu erhalten. Vorteilhaft ist es, wenn das Verfahren mit Hilfe von Strukturdetails auf der Probenoberfläche ausgeführt wird, die mindestens 5- bis 10-fach größer sind als der aktuelle DOF-Wert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem geeignet, eine durch Einfluss des Primärteilchenstrahls bedingte Schrumpfung des Probenmaterials zu erkennen. Wenn Schrumpfungsartefakte auftreten, sollte die Dosis der auf die Probe auftreffenden Primärteilchen reduziert werden.
4 zeigt beispielhaft eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung. Schematisch ist dargestellt, wie Bilder eines Probenblocks 402 aufgenommen werden, wobei der Probenblock 402 aufgrund eines nicht genau rechtwinklig zur optischen Achse 403 der teilchenoptischen Vorrichtung ausgerichteten Mikrotommessers 401 schräg abgeschnitten worden ist. Die abgeschnittene Probenschicht 404 ist verworfen worden. Zur Aufnahme der Bilder wird ein geeigneter Detektor, vorzugsweise ein BSE-Detektor, verwendet. Zunächst wird ein erstes Bild der Probe aufgenommen, wobei die Probe vom Primärteilchenstrahl rasterförmig abgetastet wird und die Probe in einer ersten Fokusebene 405 abgetastet wird. Dann wird ein weiteres Bild der Probe aufgenommen, wobei die Probe in einer weiteren Focusebene 406 abgetastet wird, die von der ersten Fokusebene 405 verschieden ist. Das Aufnehmen eines jeweils weiteren Bildes der Probe wird so lange wiederholt, bis ein n-tes Bild mit einer n-ten Fokusebene 407 aufgenommen worden ist, wobei die n-te Fokusebene 407 von allen vorhergehenden Fokusebenen (405, 406) verschieden ist. Üblicherweise werden mindestens 5 bis 10, vorteilhafterweise 5 bis 50 Fokusebenen aufgenommen. Alle aufgenommenen Bilder werden gespeichert. Dann wird anhand der aufgenommenen Bilder eine 3D-Rekonstruktion des Probenblocks berechnet. Anhand der 3D-Rekonstruktion kann der Winkel γ, den der Primärteilchenstrahl, der parallel zur optischen Achse 403 verläuft, und die Normale der Probenoberfläche 408 zueinander bilden, bestimmt werden. Anschließend kann der Winkel zwischen Primärteilchenstrahl und Probenoberfläche korrigiert werden, so dass dieser Winkel annähernd 0° beträgt. Dies kann geschehen, indem die Probe entsprechend bewegt wird und/oder indem beim nachfolgenden Aufnehmen einer Bilderserie die Fokusebene jedes einzelnen Bildes entsprechend verändert wird. Winkel γ sollte dann als zu groß gelten und korrigiert werden, wenn Winkel γ größer ist als Winkel β. Winkel β wird definiert als β = D/L, wobei D die Dicke der abgeschnittenen Probenschicht bezeichnet, während L die Länge der Längsseite des vom Primärteilchenstrahl abgerasterten, rechteckigen Scanfelds bezeichnet. Dabei wird angenommen, dass tanβ = β ist, da β nur kleine Werte annimmt, weil die Strecke L üblicherweise 10-mal größer, vorzugsweise 50-mal größer ist als die Strecke D. Winkel γ wird korrigiert, indem der Probentisch so lange um eine Kippachse des Probentischs rotiert, bis |γ| < |β| ist.
Grundsätzlich ist es beim Arbeiten mit variablem Fokus vorteilhaft, wenn der Primärteilchenstrahl unter einem möglichst großen Öffnungswinkel α austritt, was sich jedoch nachteilig auf die erreichbare Ortsauflösung auswirken kann. Daher sollte ein Kompromiss gefunden werden zwischen möglichst großem Öffnungswinkel α und der gewünschten Ortsauflösung. Mit steigender Vergrößerung verringern sich DOF (depth of field) und FOV (field of view). DOF bezeichnet denjenigen Streckenabschnitt, der entlang der optischen Achse der teilchenoptischen Vorrichtung verläuft und in dem sich ein Objekt befinden muss, damit es fokussiert abgebildet werden kann. Unter FOV wird der Bereich der Probe verstanden, der vom Primärteilchenstrahl abgescannt und von einem Detektor detektiert werden kann. Für den Zusammenhang zwischen Öffnungswinkel α, DOF und Vergrößerung Mag gilt: DOF = Zeilenabstand des Displays/(Mag·tanα), wobei der Zeilenabstand des Display beispielsweise 200 μm betragen kann. Die beschriebene Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist besonders geeignet für geringe Vergrößerungen, das heißt für Vergrößerungen bis ungefähr 2000-fach, vorzugsweise bis 1000-fach.
5 zeigt ein Flussdiagramm einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem der Winkel, den der auf die Probe auftreffende Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden, bestimmt wird und korrigiert werden kann. Dazu werden Bilder der Probenoberfläche aufgenommen, wobei ein definierter Bereich der Probenoberfläche vom Primärteilchenstrahl abgerastert wird. Die als Wechselwirkungsprodukte entstehenden Sekundärelektronen (SE) werden in Schritt 501 für jeden Probenpunkt (x, y) im Scanfeld als SE-Signal aufgenommen, um ein Bild zu erzeugen. Dabei kann das Signal beispielsweise mit einem In-lens-SE-Detektor oder einem AsB-Detektor (angular selective backscattered electron detector) detektiert werden. Der AsB-Detektor ist ein Detektor, mit dem rückgestreute Elektronen (BSE) winkelselektiv detektiert werden können. Üblicherweise befindet sich der Detektor in unmittelbarere Nähe der Objektivlinse der teilchenoptischen Vorrichtung und umfasst vier Dioden, die unabhängig voneinander gesteuert werden können. Im nächsten Schritt 502 des Verfahrens werden mindestens drei Probenregionen ausgewählt, die in den äußeren Bereichen des aufgenommenen Bildes liegen. In einer vorteilhaften Ausführungsform werden genau drei Probenregionen ausgewählt, es können aber auch fünf oder mehr Probenregionen gewählt werden. Allerdings erhöht sich mit der Zahl der ausgewählten Probenregionen auch die Dauer der folgenden Bearbeitung, so dass es wenig sinnvoll ist, deutlich mehr als fünf Probenregionen auszuwählen. Die ausgewählten Probenregionen spannen eine gedachte Ebene auf, die in der Ebene der Probenoberfläche liegt. Die Probenregionen sollten über das gesamte, vom Primärteilchenstrahl abgerasterte Scanfeld verteilt sein und sich nicht überlappen. Vorteilhaft ist es außerdem, wenn die Probe möglichst homogen ist. Die Größe der ausgewählten Probenregionen sollte in Abhängigkeit vom Probenmaterial gewählt werden, beispielsweise 30 nm × 30 nm. Bei anderen Proben kann es vorteilhaft sein, größere Probenregionen zu definieren, wie zum Beispiel 100 nm × 100 nm. Auch bei der Wahl der Größe der Probenregionen sollte berücksichtigt werden, dass mit steigender Größe mehr Zeit für das Abrastern und die nachfolgende Auswertung benötigt wird. Im nächsten Schritt 503 werden die Bilddaten der ausgewählten Probenregionen mithilfe eines frequenz-basierten Rechen-Algorithmus transformiert. Dies kann beispielsweise eine Schnelle Fourier Transformation (FFT) oder eine Diskrete Fourier Transformation (DFT) sein. Dann werden die transformierten Daten ausgewertet (Schritt 504). Die erhaltenen Ergebnisse lassen Rückschlüsse zu, ob die der Transformation zugrunde liegenden Probenregion im Fokus der abbildenden Komponenten der teilchenoptischen Vorrichtung gelegen hat oder nicht: Eine im Vergleich zum Durchschnitt der Raumfrequenzen hohe Raumfrequenz weist daraufhin, dass die Probenregion im Fokus liegt, während eine im Vergleich zum Durchschnitt der Raumfrequenzen niedrige Raumfrequenz bedeutet, dass die Probenregion außerhalb des Fokus liegt. Mit Hilfe der FFT erhält man eine Darstellung der Raumfrequenzen im reziproken Raum, wobei die beobachtete Probenregion mittels konzentrischer Kreisstrukturen dargestellt wird. Bei dieser Darstellungsweise repräsentieren zentrumsnahe Kreise niedrige Raumfrequenzen und somit Probenregionen, die außerhalb des Fokus liegen. Andererseits repräsentieren zentrumsferne Kreise hohe Raumfrequenzen und somit Probenregionen im Fokus. Da die FFT zeitnah erfolgt, können Änderungen der Fokuseinstellung an der teilchenoptischen Säule der teilchenoptischen Vorrichtung vorgenommen werden, deren Auswirkungen sogleich in der FFT-Darstellung sichtbar werden. Auf diese Weise werden die FFT-Darstellungen der mindestens drei Probenregionen beobachtet, während Fokuseinstellungen an der teilchenoptischen Vorrichtung gezielt verändert werden, um daraus Rückschlüsse ziehen zu können, in welcher Weise der Kippwinkel der Probe verändert werden muss, damit der auftreffende einfallende Primärteilchenstrahl annähernd senkrecht auf die Probenoberfläche auftrifft. Diese Prozedur kann auch automatisiert ausgeführt werden. In Schritt 505 wird dann die Probenposition entsprechend verändert, so dass der Winkel zwischen dem auftreffenden Primärteilchenstrahl und der Probenoberfläche annähernd 90° beträgt. Zu diesem Zweck wird üblicherweise der Kippwinkel der Probe verändert. Anschließend werden in Schritt 506 Bilder für eine Bilderserie aufgenommen, mithilfe der die 3D-Rekonstruktion der Probe erstellt werden kann.
6 zeigt ein Flussdiagramm einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. In Schritt 601 wird für jeden Bildpunkt (x, y) der Probe mit einem SE-Detektor ein SE-Bild aufgenommen. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird dazu ein In-lens SE-Detektor verwendet, der sich innerhalb der elektronenoptischen Säule der teilchenoptischen Vorrichtung befindet. Gleichzeitig mit Schritt 601 wird in Schritt 605 ein BSE-Bild der Probe aufgenommen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Bilder verschiedener Detektoren – in diesem Beispiel des SE-Detektors und des BSE-Detektors – mithilfe mehrer Kanäle gleichzeitig aufzuzeichnen. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird das BSE-Bild mittels eines 4QBSE-Detektors (4-Quadranten BSE) aufgenommen. Der 4QBSE-Detektor umfasst eine ringförmige Detektorfläche, die in vier Segmente, die sogenannten Quadranten, unterteilt ist. Die einzelnen Quadranten können unabhängig voneinander angesteuert werden, und die von jedem Quadranten detektierten Signale können unabhängig voneinander ausgewertet, verrechnet und gespeichert werden. In Schritt 602 werden im SE-Bild auftretende übersteuerte oder annähernd übersteuerte Signale identifiziert, das heißt, es werden diejenigen Bildpunkte identifiziert, die ein übersteuertes oder annähernd übersteuertes SE-Signal aufweisen. Dies kann dadurch geschehen, dass starke Signaländerungen während des Abrasterns der Probe mit dem Primärteilchenstrahl erkannt werden. Aufgrund des Kanteneffekts treten an kantenförmigen Strukturen vermehrt Wechselwirkungsprodukte, vor allem SE, aus dem Probenmaterial aus. Es ist auch möglich, die Anzahl der übersteuerten Pixel pro Probenareal zu erfassen. Sobald die Anzahl einen bestimmten Schwellwert übersteigt, wird dies als ein auffälliges Signal identifiziert. Über einen Rückkoppelungsschritt 603 werden die Schneidparameter variiert, was bedeutet, das beispielsweise Schneidgeschwindigkeit und/oder Oszillationsfrequenz und/oder Oszillationsamplitude des Mikrotommessers angepasst werden. Ziel ist es dabei, eine Parameterkombination zu wählen, bei der die Zahl der übersteuerten Pixel möglichst gering ist. Mit diesen angepassten Parametern wird dann in Schritt 604 die Probe geschnitten, d. h. es wird die äußerste Probenschicht abgetragen. Anschließend kann das nächste SE-Bild entsprechend Schritt 601 aufgenommen werden, um die Qualität des Schnitts zu überprüfen. Außerdem können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren alternativ oder zusätzlich in Schritt 606 die in Schritt 602 identifizierten Bilddaten während der Datenverarbeitung derart gekennzeichnet werden, dass diese Daten von der 3D-Rekonstruktion in Schritt 607 ausgeschlossen werden, so dass die 3D-Rekonstruktion also nur mit bereinigten Bilddaten ausgeführt wird.
7 zeigt ein Flussdiagramm einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit dem die Oberflächenrauheit der Probenoberfläche ermittelt werden kann mit dem Ziel, die Oberflächenrauheit der bei den folgenden Schnitten erzeugten Probenoberflächen zu verringern. In einem ersten Schritt 701 werden für jeden Punkt (x, y) der Probenoberfläche BSE-Signale aufgenommen und gespeichert. Dies kann vorzugsweise mit einem 4QBSE-Detektor geschehen, dessen Detektorfläche in vier Quadranten unterteilt ist. Die einzelnen Quadranten können unabhängig voneinander angesteuert werden, so dass die jeweils detektierten Signale unabhängig voneinander ausgewertet, verrechnet und gespeichert werden können. Dadurch ist es möglich, den Detektor sowohl in einem Betriebsmodus zum Darstellen von Materialkontrast zu betreiben, als auch in einem Betriebsmodus zum Darstellen von Topographiekontrast. Das in Schritt 701 aus den Signalen aller vier Quadranten des 4QBSE-Detektors ermittelte Summensignal s_x,y entspricht dem Materialkontrast. In einem späteren Schritt des Verfahrens (Schritt 707) können diese Daten zur Erstellung einer 3D-Rekonstruktion verwendet werden. Außerdem werden in Schritt 701 für jeden Probenpunkt Bilder aufgenommen, die im Betriebsmodus „Topographiekontrast” des Detektors detektiert werden und mit deren Hilfe die Höheninformation für jeden einzelnen Probenpunkt bestimmt werden kann. Dazu werden üblicherweise mindestens vier Bilder miteinander verrechnet, um für jeden Probenpunkt (x, y) ein Höhensignal z_x,y zu erhalten, das die Höheninformation des Probenpunkts beinhaltet. Aus den Höhensignalen der einzelnen Punkte lässt sich die Topographie der gesamten Probenoberfläche ermitteln. Das bedeutet also, dass anhand der aufgenommen BSE-Signale die Höheninformation für jeden Punkt (x, y) berechnet und gespeichert werden kann.
Um die Oberflächenrauheit zu ermitteln, ist es üblich, Oberflächenprofile zu vergleichen, und zwar derart, dass die vertikale Abweichung des zu untersuchenden Profils von einem Vergleichsprofil (d. h. der Profillinie einer idealen Oberfläche) ermittelt wird. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird daher im folgenden Schritt 703 die Oberflächenrauheit ermittelt, indem für die Höhensignale die Kenngrößen R_a (arithmetisches Mittel der absoluten Werte), R_q (rms, root mean square, quadratisches Mittel), R_v (minimale Peakhöhe) und R_p (maximale Peakhöhe) bestimmt werden.
Dabei gilt
wobei y_i den vertikalen Abstand des i-ten Datenpunkts zum korrespondierenden Ort im Vergleichsprofil der idealen Oberfläche darstellt und n die Gesamtzahl der Datenpunkte.
In Abhängigkeit vom Probenmaterial werden Sollwerte der Kenngrößen definiert. Durch Vergleich der ermittelten Kenngrößen mit diesen Sollwerten kann entschieden werden, in welcher Weise die Schneidparameter angepasst werden sollten. So können beispielsweise Schnittdicke und/oder Schnittgeschwindigkeit (d. h. Vorschub des Mikrotommessers) und/oder Oszillationsparameter des Mikrotommessers angepasst werden. Optimale Parametereinstellungen lassen sich vorzugsweise empirisch ermitteln, da das jeweils verwendete Probenmaterial und aktuelle Verfahrensbedingungen berücksichtigt werden müssen. Dann wird in Schritt 705 die Probe geschnitten. Anschließend werden in Schritt 706 die Schritte 701 bis 705 so lange wiederholt, bis eine genügende Anzahl von Schnitten m ausgeführt worden ist und Bilder von m Schnittebenen aufgenommen worden sind. Anhand der Bilder wird in Schritt 707 eine 3D-Struktur der Probe rekonstruiert, wobei auffällige Proberegionen identifiziert werden. In Schritt 708 wird mittels der in Schritt 701 und 702 aufgenommenen und gespeicherten Materialkontrastbilder eine 3D-Rekonstruktion erstellt, wobei die zuvor identifizierten Probenregionen nicht zur Rekonstruktion beitragen. Zu diesem Zweck wird für jeden Probenpunkt (x, y) aus jeder Schnittebene m ein Grenzwert für z_diff zur Beurteilung der Schnittqualität festgelegt. Dabei ist z_diff definiert als: z_diff = z_m – z_m+1, wobei m die Nummer des Schnittes bezeichnet. z_diff kann maximal den Wert der am Mikrotom eingestellte Schnittdicke annehmen. Diejenigen Bilddaten, für die z_diff den Grenzwert überschreitet, werden identifiziert und von der 3D-Rekonstruktion ausgeschlossen. Mit dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich insbesondere periodisch auftretende Artefakte erkennen, beispielsweise periodische Dickevariationen (Variationen in z).
In einer weiteren, speziellen Ausführungsform der Erfindung ist es ermöglich, unerwünschte elektrische Aufladungen des Probenblocks während des Serial Block Face Imagings zu vermindern. Wie in 1 dargestellt, sind sowohl Mikrotom 7 mit Mikrotommesser 8 und die Nadel 14 der Gaseinleitungsvorrichtung 12 innerhalb der Probenkammer 2 verfahrbar angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass trotz der räumlichen Enge innerhalb der Probenkammer 2 beide Komponenten in die unmittelbare Nähe der Probe positioniert werden können ohne sich gegenseitig zu behindern. Sowohl die Schneideinrichtung, die Mikrotom 7 und Mikrotommesser 8 umfasst, als auch die Nadel 14 der Gaseinleitungsvorrichtung 12 können sich in zwei möglichen Positionen befinden, nämlich in einer Arbeitsposition oder in einer Ruheposition; zwischen diesen beiden Positionen können die Schneideinrichtung (7, 8) und die Nadel 14 der Gaseinleitungsvorrichtung 12 verfahren werden. In der Arbeitsposition befindet sich die Nadel 14 in unmittelbarer Nähe der Probe, in der Ruheposition in einiger Entfernung von der Probe. In der Arbeitsposition der Schneideinrichtung befindet sich die Schneideinrichtung (7, 8) so nahe an der Probe, dass mithilfe des Mikrotommessers 8 eine Schicht des Probenblocks 10 abgeschnitten werden kann. In der Ruheposition befindet sich die Schneideinrichtung (7, 8) so weit vom Probenblock 10 entfernt, dass eine Kollision mit anderen Bauteilen der teilchenoptischen Vorrichtung 1 ausgeschlossen ist. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist das Mikrotommesser (8) der Schneideinrichtung (7, 8) ein Diamantmesser.
In 8 ist ein Flussdiagramm einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. In einem ersten Schritt 801 dieser Ausführungsform wird ein erster Betriebszustand vorbereitet, derart, dass die Nadel der Gaseinleitungsvorrichtung in die Arbeitsposition der Nadel bewegt wird und die Schneideinrichtung in die Ruheposition der Schneideinrichtung bewegt wird. Im nächsten Schritt 802 wird Gas an der Probenoberfläche lokal eingeleitet, so dass das Gas ionisiert wird und die Ladungen auf der Probenoberfläche kompensiert werden. Das eingeleitete Gas kann ein inertes Gas, beispielsweise Stickstoff sein. Durch Zuführung des inerten Gases bildet sich am Ort der Zuführung, vorzugsweise in unmittelbarer Nähe der Probenoberfläche, eine örtlich begrenzte Gaswolke. Wechselwirkungsprodukte, wie beispielsweise SE oder BSE, die durch die Wechselwirkung von Probenmaterial und einfallendem Primärteilchenstrahl entstehen, ionisieren die Gasmoleküle dieser Gaswolke. Die dabei entstehenden Ionen, zum Beispiel positive Ionen, und Elektronen, werden von den aufgeladenen Stellen der Probenoberfläche angezogen. Die Ionen und/oder Elektronen fallen auf die Probe und neutralisieren die Oberfläche der Probe. In Schritt 803 werden ein oder mehrere Bilder der Probe mittels eines Detektors aufgenommen. Im folgenden Schritt 804 wird ein zweiter Betriebszustand vorbereitet, indem die Schneideinrichtung in die Arbeitsposition der Schneideinrichtung bewegt wird und die Nadel in die Ruheposition der Nadel bewegt wird. Dann wird in Schritt 805 eine Probenschicht durch Schneiden mit der Scheideinrichtung entfernt. Schließlich werden in Schritt 806 die Schritte 801 bis 805 so lange wiederholt, bis eine Bilderserie entstanden ist. Aus der Bilderserie kann eine 3D-Rekonstruktion erstellt werden.
Neben den bisher beschriebenen Ausführungsformen beinhaltet die Erfindung noch weitergehende Aspekte, die insbesondere nicht alle Merkmale der oben beschriebenen Ausführungsformen aufweisen müssen. Die Erfindung kann beispielsweise auch als ein Verfahren ausgebildet sein, mit dem der Winkel, den der auf die Probe auftreffende Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden, bestimmt und korrigiert werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Aufnahme eines Bilds der Probe, wobei die Probe vom Primärteilchenstrahl rasterförmig abgetastet wird und die Probe in einer ersten Fokusebene abgetastet wird
b) Aufnahme eines weiteren Bilds der Probe, wobei die Probe in einer weiteren Fokusebene, die von der ersten Fokusebene verschieden ist, abgetastet wird
c) Wiederholen von Schritt b)
d) Berechnen einer 3D-Konstruktion anhand der in a) bis c) aufgenommenen Bilder
e) Bestimmen des Winkels, den der Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden und
f) Korrigieren des Winkels zwischen Primärteilchenstrahl und Probenoberfläche, so dass dieser Winkel annähernd 90° beträgt, und zwar indem die Probe entsprechend bewegt wird und/oder indem beim nachfolgenden Aufnehmen einer Bilderserie die Fokusebene jedes einzelnen Bildes entsprechend verändert wird.

Weiterhin kann die Erfindung als ein Verfahren ausgebildet sein, mit dem der Winkel, den der auf die Probe auftreffende Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden, bestimmt wird und korrigiert werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Aufnehmen von Bildern der Probenoberfläche, wobei ein definierter Bereich der Probenoberfläche vom Primärstrahl abgerastert wird
b) Auswählen von mindestens drei Probenregionen, die in den äußeren Bereichen des aufgenommenen Bildes liegen
c) Transformieren der Bilddaten der ausgewählten Probenregionen mithilfe eines frequenz-basierten Rechen-Algorithmus
d) Auswerten der transformierten Daten und Bestimmung der Fokusebene der Probenregionen
e) Verändern der Probenposition derart, dass sich der Winkel zwischen dem auftreffenden Primärteilchenstrahl und der Probenoberfläche annähernd 90°-Winkel beträgt

Weiterhin kann die Erfindung als ein Verfahren ausgebildet sein, mit dem nicht exakt geführte Schnitte erkannt werden können, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Aufnahme des SE-Signals für jeden Bildpunkt (x, y) mit einem SE-Detektor
b) Identifizieren von Bildpunkten, die ein übersteuertes oder annähernd übersteuertes SE-Signale aufweisen
c) Anpassen von Schneidgeschwindigkeit und/oder Anpassen von Oszillationsfrequenz und/oder Oszillationsamplitude des Mikrotommessers und Schneiden der Probe mit angepassten Parametern, und/oder Ausschließen der in Schritt b) identifizierten Bilddaten von der 3D-Rekonstruktion

Weiterhin kann die Erfindung als ein Verfahren ausgeprägt sein, mit dem die Oberflächenrauheit der Probenoberfläche ermittelt werden kann und das die folgenden Schritte umfasst:

a) Aufnehmen von BSE-Signalen für jeden Punkt (x, y) der Probenoberfläche mit einem Quadrantendetektor mit mindestens vier unabhängig voneinander detektierenden Quadranten
c) Anhand der aufgenommenen BSE-Signale Berechnen und Speichern der Höheninformation für jeden Punkt (x, y)
d) Ermitteln der Oberflächenrauheit
e) Anpassen der Schneidparameter und Schneiden der Probe
f) Wiederholen der Schritte a) bis e)
g) Festlegen eines Grenzwerts zur Beurteilung der Schnittqualität und Ausschließen derjenigen Bilddaten von der 3D-Rekonstruktion, die den Grenzwert überschreiten

Schließlich kann die Erfindung als ein Verfahren ausgebildet sein, mit dem die elektrische Aufladung der Probenoberfläche vermindert oder kompensiert werden kann, wobei die teilchenoptische Vorrichtung weiterhin eine Vorrichtung mit einer bewegbaren Nadel zum Einleiten von Gas umfasst und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Vorbereiten eines ersten Betriebszustand, derart, dass die Nadel in die Arbeitsposition der Nadel bewegt wird und die Schneideinrichtung in die Ruheposition der Schneideinrichtung bewegt wird
b) Lokales Einleiten von Gas an der Probenoberfläche, derart, dass das Gas ionisiert wird und die Ladungen auf der Probenoberfläche kompensiert werden.
c) Aufnehmen eines oder mehrerer Bilder der Probe mittels eines Detektors
d) Vorbereiten eines zweiten Betriebszustands, indem die Schneideinrichtung in die Arbeitsposition der Schneideinrichtung bewegt wird und die Nadel in die Ruheposition der Nadel bewegt wird
e) Entfernen einer Probenschicht mithilfe der Scheideinrichtung
f) Wiederholen der Schritte a) bis e).

Dabei kann das eingeleitete Gas Stickstoff sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zum Kompensieren von Artefakten in einer Probe beim Aufnehmen von Bilderserien der Probe mittels einer teilchenoptischen Vorrichtung. Die teilchenoptische Vorrichtung weist dabei mindestens eine Teilchenquelle, die einen Primärteilchenstrahl erzeugt, mindestens einen Detektor zum Detektieren von Wechselwirkungsprodukten, die bei der Wechselwirkung von Primärteilchenstrahl und Probe entstehen, eine Kammer zur Aufnahme der Probe sowie eine Schneideinrichtung zum Entfernen einer Oberflächenschicht der Probe auf. Das Verfahren umfasst dabei die folgenden Verfahrensschritte:

a) Aufnehmen eines ersten Bildes der Probe mittels des Detektors, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine erste mittlere Energie derart aufweisen, dass die mit dem Detektor detektierten Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus einer unterhalb der Oberflächenschicht liegenden Probenschicht enthalten,
b) Entfernen der Oberflächenschicht der Probe mithilfe der Schneideinrichtung, so dass eine neue Oberflächenschicht entsteht,
c) Aufnehmen eines zweiten Bildes der Probe mittels des Detektors, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine zweite mittlere Energie derart aufweisen, dass die mit dem Detektor detektierten Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus der neuen Oberflächenschicht der Probe enthalten,
d) Bestimmen von beim Entfernen der Oberflächenschicht erzeugten Artefakten in der Probe durch einen Vergleich des ersten und des zweiten Bilds, und
e) Eliminieren oder Kompensieren von im Schritt d) bestimmten Artefakten.

Die Schneideinrichtung kann dabei ein Mikrotom oder ein Ultramikrotom mit einem mechanischen Messer, ein fokussierter Ionenstrahl, ein fokussierter Elektronenstrahl oder ein fokussierter Photonenstrahl sein. In den Fällen eines fokussierten Ionenstrahls, eines fokussierter Elektronenstrahls oder eines fokussierter Photonenstrahls kann zusätzlich eine Gaszuführeinrichtung vorhanden sein, um ein durch den fokussierten Strahl oder Wechselwirkungsprodukte des fokussierten Strahls mit der Probe aktivierbares Prozessgas der Probe zuzuführen. Die beim Entfernen der Oberflächenschicht der Probe erzeugten Artefakte können dabei in die Probe eingebrachte (implantierte) Ionen des Ionenstrahls, Atome des Prozessgases oder durch die Energieeinwirkung des fokussierten Strahls in der Probe erzeugte Veränderungen der Probe sein. Das Kompensieren der Artefakte kann dadurch geschehen, dass Probenstellen, an denen das Probenmaterial nicht hinreichend abgetragen worden ist, nachbearbeitet werden, um zusätzlich Probenmaterial abzutragen. Andererseits können Probenstellen identifiziert werden, an denen zuviel Material abgetragen worden ist. Solche Probenstellen können bei der 3D-Rekonstruktion einer anderen Probenschicht zugeordnet werden oder ganz von der 3D-Rekonstruktion ausgeschlossen werden.
Bezugszeichenliste

1: Teilchenoptische Vorrichtung
2: Probenkammer
3: Elektronenoptische Säule
4: Primärteilchenstrahl
5: Erster Detektor
6: Wechselwirkungsprodukte
7: Mikrotom
8: Mikrotommesser
9: Probentisch
10: Probenblock
12: Gaseinleitungsvorrichtung
13: Auswerte- und Steuereinheit
14: Nadel
15: Optische Achse
201: Schritt: Aufnehmen eines ersten Bildes bei einer ersten Beschleunigungsspannung
202: Schritt: Entfernen der äußersten Probenschicht
203: Schritt: Aufnehmen eines zweiten Bildes bei einer zweiten Beschleunigungsspannung
204: Schritt: Vergleich des ersten und des zweiten Bildes
205: Schritt: Kompensieren des seitlichen Versatzes
301: Erstes Probendetail
301a: Erstes Probendetail nach dem Schneiden
302: Zweites Probendetails
302a: Zweites Probendetails nach dem Schneiden
303: Erste Probenoberfläche
303a: Zweite Probenoberfläche
304: Abgebildete Probenschicht
305: Erstes Bild der Probe
305a: Zweites Bild der Probe
306: Äußerste Probenschicht
307: Schnittlinie des Mikrotomschnitts
401: Mikrotommesser
402: Probenblock
403: Optische Achse
404: Abgeschnittene Probenschicht
405: Erste Fokusebene
406: Zweite Fokusebene
407: n-te Fokusebene
408: Probenoberfläche
501: Schritt: Detektor-Signal für jeden Probenpunkt aufnehmen
502: Schritt: Probenregionen auswählen
503: Schritt: Transformation für ausgewählte Probenpunkte ausführen
504: Schritt: Ergebnisse auswerten
505: Schritt: Tischkippung ändern
506: Schritt: Bilderserie aufnehmen
601: Schritt: SE-Bild aufnehmen
602: Schritt: Übersteuerte Signale im SE-Bild identifizieren
603: Schritt: Schneidparameter anpassen
604: Schritt: Schnitt ausführen
605: Schritt: BSE-Bild aufnehmen
606: Schritt: Identifizierte Probenstellen kennzeichnen
607: Schritt: 3D-Rekonstruktion aus bereinigten Bilddaten erstellen
701: Schritt: BSE-Signale aufnehmen
702: Schritt: z und s separat speichern
703: Schritt: Kenngrößen für s berechnen
704: Schritt: Schneidparameter anpassen
705: Schritt: Schnitt ausführen
706:: Schritt: Schritte 701 bis 705 wiederholen
707: Schritt: 3D-Struktur rekonstruieren und auffällige Probenbereiche identifizieren
708: Schritt: Identifizierte Probenbereiche aus der Rekonstruktion eliminieren
801: Schritt: Ersten Betriebszustand vorbereiten
802: Schritt: Gas lokal einleiten
803: Schritt: Bild der Probe aufnehmen
804: Schritt: Zweiten Betriebszustand vorbereiten
805: Schritt: Probenschicht schneiden
806:: Schritt: Schritte 801 bis 805 wiederholen

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 4377958 [0015]
EP 2009421 [0015]
DE 102008040426 [0015]
US 8227752 [0028]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Denk, W. & Horstmann, H. (2004), PLoS Biology, Vol. 2 (11), e329, pp 1–10 [0015]
Al-Amoudi et al. (2003); Journal of Microscopy, Vol. 212, pp 26–33 [0015]

Claims

Verfahren zum Erkennen und Kompensieren von seitlichen Verschiebungen einer Probe beim Aufnehmen von Bilderserien der Probe mittels einer teilchenoptischen Vorrichtung, wobei die teilchenoptische Vorrichtung – mindestens eine Teilchenquelle, die einen Primärteilchenstrahl erzeugt, – mindestens einen Detektor zum Detektieren von Wechselwirkungsprodukten, die bei der Wechselwirkung von Primärteilchenstrahl und Probe entstehen, – eine Kammer zur Aufnahme der Probe sowie – eine Schneideinrichtung mit Messer umfasst und das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst: f) Aufnehmen eines ersten Bildes der Probe mittels des Detektors, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine erste mittlere Energie derart aufweisen, dass die mit dem Detektor detektierten Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus einer unterhalb der Oberflächenschicht liegenden Probenschicht enthalten, g) Entfernen der Oberflächenschicht mithilfe der Schneideinrichtung, so dass eine neue Oberflächenschicht entsteht, h) Aufnehmen eines zweiten Bildes der Probe mittels des Detektors, wobei die Teilchen des Primärteilchenstrahls eine zweite mittlere Energie derart aufweisen, dass die mit dem Detektor detektierten Wechselwirkungsprodukte überwiegend Probeninformation aus der neuen Oberflächenschicht der Probe enthalten i) Berechnen der seitlichen Verschiebung der Probe aus einem Vergleich des ersten und des zweiten Bilds j) Kompensieren der seitlichen Verschiebung
Verfahren nach Anspruch 1, wobei für die Erzeugung des ersten und des zweiten Bildes an der Probe gestreute Primärteilchen mittels eines BSE-Detektors aufgenommen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die erste mittlere Energie des Teilchenstrahls größer ist als die zweite mittlere Energie des Teilchenstrahls.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste mittlere Energie des Teilchenstrahls größer als 2 keV und zweite mittlere Energie des Teilchenstrahls kleiner als 2 keV ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das erste Bild der Probe Informationen aus einer Probenschicht enthält, die 10 nm bis 50 nm unter der Probenoberfläche liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe während des Aufnehmens der Bilderserie derart bewegt wird, dass seitliche Verschiebungen kompensiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Primärteilchenstrahl während des Aufnehmens der Bilderserie derart abgelenkt wird, dass durch Verschiebung des abgerasterten Scanfelds seitliche Verschiebungen der Probe kompensiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei seitlichen Verschiebung durch rechnerische Methoden bei der 3D-Rekonstruktion kompensiert wird, nachdem eine Bilderserie aufgenommen worden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zum Vergleich des ersten und des zweiten Bildes die Kreuzkorrelation beider Bilder gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das weiterhin ein Verfahren umfasst, mit dem der Winkel, den der auf die Probe auftreffende Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden, bestimmt und korrigiert werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Aufnahme eines Bilds der Probe, wobei die Probe vom Primärteilchenstrahl rasterförmig abgetastet wird und die Probe in einer ersten Fokusebene abgetastet wird, b) Aufnahme eines weiteren Bilds der Probe, wobei die Probe in einer weiteren Fokusebene, die von der ersten Fokusebene verschieden ist, abgetastet wird, c) Wiederholen von Schritt b), d) Berechnen einer 3D-Konstruktion anhand der in a) bis c) aufgenommenen Bilder, e) Bestimmen des Winkels, den der Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden und f) Korrigieren des Winkels zwischen Primärteilchenstrahl und Probenoberfläche, so dass dieser Winkel annähernd 90° beträgt, und zwar indem die Probe entsprechend bewegt wird und/oder indem beim nachfolgenden Aufnehmen einer Bilderserie die Fokusebene jedes einzelnen Bildes entsprechend verändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das weiterhin ein Verfahren umfasst, mit dem der Winkel, den der auf die Probe auftreffende Primärteilchenstrahl und die Probenoberfläche zueinander bilden, bestimmt und korrigiert werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Aufnehmen von Bildern der Probenoberfläche, wobei ein definierter Bereich der Probenoberfläche vom Primärstrahl abgerastert wird, b) Auswählen von mindestens drei Probenregionen, die in den äußeren Bereichen des aufgenommenen Bildes liegen, c) Transformieren der Bilddaten der ausgewählten Probenregionen mithilfe eines frequenz-basierten Rechen-Algorithmus, d) Auswerten der transformierten Daten und Bestimmung der Fokusebene der Probenregionen e) Verändern der Probenposition derart, dass sich der Winkel zwischen dem auftreffenden Primärteilchenstrahl und der Probenoberfläche annähernd 90°-Winkel beträgt
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das weiterhin ein Verfahren umfasst, mit dem nicht exakt geführte Schnitte erkannt werden können, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) für jeden Punkt (x, y) der Probenoberfläche Aufnahme des Signals von durch den Primärteilchenstrahl aus der Probe ausgelösten Sekundärelektronen mittels eines SE-Detektors, b) Identifizieren von Bildpunkten, die ein übersteuertes oder annähernd übersteuertes Ausgangssignal des SE-Detektors aufweisen, c) Anpassen von Schneidgeschwindigkeit und/oder Anpassen von Oszillationsfrequenz und/oder Oszillationsamplitude des Mikrotommessers und Schneiden der Probe mit angepassten Parametern, und/oder Ausschließen der in Schritt b) identifizierten Bilddaten von der 3D-Rekonstruktion.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das weiterhin ein Verfahren umfasst, mit dem die Oberflächenrauheit der Probenoberfläche ermittelt werden kann und das die folgenden Schritte umfasst: a) für jeden Punkt (x, y) der Probenoberfläche Aufnahme des Signals von an der Probenoberfläche gestreuten Primärteilchen mittels eines Quadrantendetektors mit mindestens vier unabhängig voneinander detektierenden Quadranten, c) Anhand der aufgenommenen Signale Berechnen und Speichern der Höheninformation für jeden Punkt (x, y), d) Ermitteln der Oberflächenrauheit, e) Anpassen der Schneidparameter und Schneiden der Probe, f) Wiederholen der Schritte a) bis e), g) Festlegen eines Grenzwerts zur Beurteilung der Schnittqualität und Ausschließen derjenigen Bilddaten von der 3D-Rekonstruktion, die den Grenzwert überschreiten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, mit dem die elektrische Aufladung der Probenoberfläche vermindert oder kompensiert werden kann, wobei die teilchenoptische Vorrichtung weiterhin eine Vorrichtung mit einer bewegbaren Nadel zum Einleiten von Gas umfasst und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Vorbereiten eines ersten Betriebszustand, derart, dass die Nadel in die Arbeitsposition der Nadel bewegt wird und die Schneideinrichtung in die Ruheposition der Schneideinrichtung bewegt wird, b) Lokales Einleiten von Gas an der Probenoberfläche, derart, dass das Gas ionisiert wird und die Ladungen auf der Probenoberfläche kompensiert werden, c) Aufnehmen eines oder mehrerer Bilder der Probe mittels eines Detektors, d) Vorbereiten eines zweiten Betriebszustands, indem die Schneideinrichtung in die Arbeitsposition der Schneideinrichtung bewegt wird und die Nadel in die Ruheposition der Nadel bewegt wird, e) Entfernen einer Probenschicht mithilfe der Scheideinrichtung f) Wiederholen der Schritte a) bis e)
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das eingeleitete Gas Stickstoff ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Messer der Schneideinrichtung ein Diamantmesser ist.