DE102012019471B4

DE102012019471B4 - Device and method for determining material properties

Info

Publication number: DE102012019471B4
Application number: DE102012019471.4A
Authority: DE
Inventors: Nico Correns; Daniel Thomae; Ralf Peter Günther; Mario Krause
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2023-12-21
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: DE102012019471A1

Abstract

Verfahren zum Ermitteln einer Stoffeigenschaft, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, einer Probe (2), wobei folgende Schritte durchgeführt werden:a) Beleuchten der Probe (2) mit Lichtpulsen (L) einer ersten Pulsfrequenz,b) Aufnehmen von ersten Phasendifferenzwerten von an einem dispersiven Element (9) spektral aufgespaltetem Probenlicht (P) mittels einer mit den Lichtpulsen (L) synchronisierten Laufzeitkamera (4) mit einem ortsauflösenden Detektor (4.1),c) Beleuchten der Probe (2) mit Lichtpulsen (L) einer zweiten, von der ersten verschiedenen Pulsfrequenz,d) Aufnehmen von zweiten Phasendifferenzwerten von an dem dispersiven Element (9) spektral aufgespaltetem Probenlicht (P) mittels der mit den Lichtpulsen (L) synchronisierten Laufzeitkamera (4) unde) Ermitteln mindestens einer Stoffeigenschaft anhand erster und zweiter Phasendifferenzwerte.Method for determining a substance property, in particular a fluorescence lifespan, of a sample (2), the following steps being carried out: a) illuminating the sample (2) with light pulses (L) of a first pulse frequency, b) recording first phase difference values on a dispersive element (9) spectrally split sample light (P) by means of a time-of-flight camera (4) synchronized with the light pulses (L) with a spatially resolving detector (4.1), c) illuminating the sample (2) with light pulses (L) of a second, different from the first Pulse frequency, d) recording second phase difference values of sample light (P) spectrally split on the dispersive element (9) by means of the time-of-flight camera (4) synchronized with the light pulses (L), ande) determining at least one material property based on first and second phase difference values.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln einer (oder mehrerer) Stoffeigenschaft(en), insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, einer Probe durch Beleuchten einer Probe mit Lichtpulsen und damit synchronisiertem Aufnehmen von spektral aufgespaltetem Probenlicht mittels einer Laufzeitkamera sowie eine Vorrichtung zum Ermitteln einer (oder mehrerer) Stoffeigenschaft(en), insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, einer Probe, umfassend eine modulierbare Lichtquelle zur Emission von Lichtpulsen, eine ortsauflösende Laufzeitkamera, einen Pulsgeber mit einstellbarer Pulsfrequenz und eine Steuereinheit, wobei die Lichtquelle und die Laufzeitkamera mit dem Pulsgeber verbunden sind und im Strahlengang der Laufzeitkamera zur spektral aufgelösten Aufnahme von Probenlicht ein dispersives Element angeordnet ist. Die Ortsauflösung der Kamera verläuft dabei vorzugsweise längs der Dispersionsrichtung des dispersiven Elements. Sie dient vorzugsweise zur simultanen Aufnahme von Licht von verschiedenen Orten auf der Probe in unterschiedliche Detektorelemente, so dass ein eindimensionales oder zweidimensionales Bild ermittelbar ist.The invention relates to a method for determining one (or more) material property(s), in particular a fluorescence lifespan, of a sample by illuminating a sample with light pulses and synchronized recording of spectrally split sample light using a time-of-flight camera, as well as a device for determining one (or more) Material property(s), in particular a fluorescence lifespan, of a sample, comprising a modulatable light source for emitting light pulses, a spatially-resolving time-of-flight camera, a pulse generator with an adjustable pulse frequency and a control unit, the light source and the time-of-flight camera being connected to the pulse generator and in the beam path of the time-of-flight camera A dispersive element is arranged for the spectrally resolved recording of sample light. The spatial resolution of the camera preferably runs along the dispersion direction of the dispersive element. It is preferably used to simultaneously record light from different locations on the sample in different detector elements, so that a one-dimensional or two-dimensional image can be determined.

Im Sinne der Erfindung umfasst der Begriff Licht jede mit optischen Mitteln manipulierbare elektromagnetische Strahlung, also insbesondere ultraviolette, sichtbare und infrarote Strahlung. Probenlicht ist im Sinne der Erfindung Licht, das durch Fluoreszenz von der Probe emittiert wird, angeregt durch die beleuchtenden Lichtpulse. Es kann auch Anteile enthalten, die durch Reflexion und/oder Streuung der beleuchtenden Lichtpulse an der Probe entstehen. Die zu ermittelnde Stoffeigenschaft kann durch jede messbare Größe dargestellt werden, insbesondere kann es sich um eine physikalische, biologische oder chemische Eigenschaft eines einzelnen Inhaltsstoffs der Probe oder, beispielsweise im Falle einer Stoffmischung, der Probe insgesamt handeln.For the purposes of the invention, the term light includes any electromagnetic radiation that can be manipulated using optical means, in particular ultraviolet, visible and infrared radiation. For the purposes of the invention, sample light is light that is emitted by the sample through fluorescence, excited by the illuminating light pulses. It can also contain components that arise from reflection and/or scattering of the illuminating light pulses on the sample. The material property to be determined can be represented by any measurable quantity, in particular it can be a physical, biological or chemical property of an individual ingredient of the sample or, for example in the case of a mixture of substances, of the sample as a whole.

Eine Laufzeitkamera ist im Sinne der Erfindung jeder optoelektronische Detektor, der eine Zeitdifferenz zwischen einem Referenzsignal, das die Emission eines beleuchtenden Lichtpulses anzeigt, und der Detektion von (zeitlich versetzt mit dem Lichtpuls korrelierendem) Licht, insbesondere der Fluoreszenzantwort der Probe auf den beleuchtenden Lichtpuls, in Form einer Phasenverschiebung, einer Zeitdauer, einer Weglänge oder einer anderen äquivalenten Größe (analog oder digital) auszugeben vermag (nachfolgend als Phasendifferenzwert bezeichnet). Die Laufzeitkamera wird dazu mittels des Referenzsignals mit der Lichtquelle synchronisiert. Die Laufzeitkamera kann dabei zur Lichtquelle entweder so angeordnet sein, dass sie rückgestreutes/reflektiertes Probenlicht (Remission) empfängt, oder so, dass sie vorwärtsgestreutes/transmittiertes Probenlicht (Transmission) empfängt.For the purposes of the invention, a time-of-flight camera is any optoelectronic detector that detects a time difference between a reference signal that indicates the emission of an illuminating light pulse and the detection of light (which correlates with a time offset with the light pulse), in particular the fluorescence response of the sample to the illuminating light pulse, in the form of a phase shift, a time duration, a path length or another equivalent quantity (analog or digital) (hereinafter referred to as a phase difference value). For this purpose, the time-of-flight camera is synchronized with the light source using the reference signal. The time-of-flight camera can be arranged relative to the light source either in such a way that it receives backscattered/reflected sample light (remission) or in such a way that it receives forward-scattered/transmitted sample light (transmission).

Im Stand der Technik sind derartige Verfahren und Vorrichtungen aus DE 199 51 154 A1 und aus US 2011/007311 A1 bekannt. Damit ist es möglich, Materialien mit sehr ähnlichen optischen Eigenschaften, insbesondere spektral ähnlich fluoreszierende Stoffe, durch die zusätzliche Auswertung der Laufzeit des von der Probe emittierten Lichts voneinander zu unterscheiden. Zu diesem Zweck können anhand der Laufzeit insbesondere Fluoreszenzlebensdauern gemessen werden. In DE 199 51 154 A1 sind als Verfahren zur Messung unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauern in derselben Probe die Phasenfluorometrie, die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl. „fluorescence correlation spectroscopy“; FCS) und die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (engl. „time-correlated single photon counting“; TCSPC) beschrieben. Als Laufzeitkamera wird dabei ein Photomischdetektor (engl. „photonic mixing device“; PMD) verwendet, der Teil eines optischen Spektrometers sein kann. Die Genauigkeit der Messung ist mit den beschriebenen Verfahren jedoch begrenzt, insbesondere bei Vorliegen verschiedener Fluorophorsorten mit deutlich voneinander verschiedenen Fluoreszenzlebensdauern in der Probe, beispielsweise bei Stoffgemischen.Such methods and devices are known in the prior art DE 199 51 154 A1 and from US 2011/007311 A1 known. This makes it possible to distinguish materials with very similar optical properties, in particular spectrally similar fluorescent substances, from one another by additionally evaluating the transit time of the light emitted by the sample. For this purpose, fluorescence lifetimes in particular can be measured based on the transit time. In DE 199 51 154 A1 Phase fluorometry, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and time-correlated single photon counting (TCSPC) are described as methods for measuring different fluorescence lifetimes in the same sample. A photonic mixing device (PMD), which can be part of an optical spectrometer, is used as the time-of-flight camera. However, the accuracy of the measurement is limited with the methods described, especially when there are different types of fluorophore with significantly different fluorescence lifetimes in the sample, for example in mixtures of substances.

Aus der US 5 485 530 A und aus Lakowicz, J. R. & Berndt, K. W. 1991: Lifetimeselective fluorescence imaging using an rf phase-sensitive camera; In: Rev. Sci. Instrum. 62: 1727 - 1734 sind bildgebende Verfahren unter Verwendung von Fluorophoren unterschiedlicher Lebensdauer bekannt. Die US 7 328 059 B2 offenbart eine Möglichkeit, Bilder unter Verwendung eines fluoreszierenden Kontrastmittels zu erstellen.From the US 5,485,530 A and from Lakowicz, JR & Berndt, KW 1991: Lifetime selective fluorescence imaging using an rf phase-sensitive camera; In: Rev. Sci. Instrument. 62: 1727 - 1734, imaging methods using fluorophores with different lifetimes are known. The US 7,328,059 B2 discloses a way to create images using a fluorescent contrast agent.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren der jeweils eingangs genannten Art zu verbessern, so dass eine größere Messgenauigkeit möglich wird.The invention is based on the object of improving a device and a method of the type mentioned at the beginning, so that greater measurement accuracy is possible.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, und durch eine Vorrichtung, welche die in Anspruch 7 angegebenen Merkmale aufweist.The object is achieved by a method which has the features specified in claim 1, and by a device which has the features specified in claim 7.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.Advantageous embodiments of the invention are specified in the subclaims.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass zum zeit-, orts- und spektral aufgelösten Messen einer Stoffeigenschaft einer Probe folgende Schritte durchgeführt werden:

a) Beleuchten der Probe mit Lichtpulsen einer ersten Pulsfrequenz (mittels einer Lichtquelle),
b) Aufnehmen von ersten Phasendifferenzwerten von an einem dispersiven Element spektral aufgespaltetem Probenlicht mittels einer mit den Lichtpulsen synchronisierten Laufzeitkamera mit einem (längs der Dispersionsrichtung) ortsauflösenden Detektor,
c) Beleuchten der Probe mit Lichtpulsen einer zweiten, von der ersten verschiedenen Pulsfrequenz,
d) Aufnehmen von zweiten Phasendifferenzwerten von an dem dispersiven Element spektral aufgespaltetem Probenlicht mittels der mit den Lichtpulsen synchronisierten Laufzeitkamera und
e) Ermitteln mindestens einer Stoffeigenschaft anhand (aufgenommener) erster und zweiter Phasendifferenzwerte.

According to the invention, the following steps are carried out to measure a material property of a sample in a time-, space- and spectrally-resolved manner:

a) illuminating the sample with light pulses of a first pulse frequency (using a light source),
b) recording first phase difference values of sample light spectrally split at a dispersive element using a time-of-flight camera synchronized with the light pulses and having a spatially resolving detector (along the dispersion direction),
c) illuminating the sample with light pulses of a second pulse frequency different from the first,
d) recording second phase difference values of sample light spectrally split at the dispersive element using the time-of-flight camera synchronized with the light pulses and
e) Determining at least one material property based on (recorded) first and second phase difference values.

Vor dem Ermitteln der Stoffeigenschaft in Schritt e) wird vorzugsweise in einem Zwischenschritt identifiziert, dass die aufgenommenen Phasendifferenzwerte signifikant sind. Nichtsignifikante Phasendifferenzwerte werden bei dem Ermitteln der Stoffeigenschaft in Schritt e) vorzugsweise nicht berücksichtigt (in dem Zwischenschritt werden dann nichtsignifikante Phasendifferenzwerte verworfen). Die Identifikation der Signifikanz erfolgt vorzugsweise anhand mindestens eines vorgegebenen (oberen und/oder unteren) Grenzwerts für die Phasendifferenzwerte, insbesondere durch einen Vergleich der aufgenommenen Phasendifferenzwerte mit dem/den vorgegebenen Grenzwerten. Diese können beispielsweise vom Benutzer durch eine visuelle Bewertung des Amplitudenspektrums (oder Intensitätsspektrums) festgelegt werden. Alternativ können sie anhand von vorgegebenen Grenzen für Energiewerte und einen Mindestabstand zwischen Anregungswellenlängen und Fluoreszenzwellenlängen innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens automatisch ermittelt werden, beispielsweise von einer Steuereinheit.Before determining the material property in step e), it is preferably identified in an intermediate step that the recorded phase difference values are significant. Non-significant phase difference values are preferably not taken into account when determining the material property in step e) (non-significant phase difference values are then discarded in the intermediate step). The significance is preferably identified using at least one predetermined (upper and/or lower) limit value for the phase difference values, in particular by comparing the recorded phase difference values with the predetermined limit value(s). These can be set by the user, for example, through a visual assessment of the amplitude spectrum (or intensity spectrum). Alternatively, they can be determined automatically within the method according to the invention, for example by a control unit, based on predetermined limits for energy values and a minimum distance between excitation wavelengths and fluorescence wavelengths.

Entsprechend ist für eine erfindungsgemäße Vorrichtung vorgesehen, dass die Steuereinheit zum Durchführen folgender Schritte eingerichtet ist:

a) Einstellen des Pulsgebers zur Abgabe von Pulsen einer ersten Pulsfrequenz,
b) Ermitteln von ersten Phasendifferenzwerten von (an dem dispersiven Element spektral aufgespaltetem) Probenlicht mittels der Laufzeitkamera,
c) Einstellen des Pulsgebers zur Abgabe von Pulsen einer zweiten, von der ersten verschiedenen Pulsfrequenz,
d) Ermitteln von zweiten Phasendifferenzwerten von (spektral aufgespaltetem) Probenlicht mittels der Laufzeitkamera,
e) Ermitteln mindestens einer Stoffeigenschaft anhand (aufgenommener) erster und zweiter Phasendifferenzwerte.

Accordingly, it is provided for a device according to the invention that the control unit is set up to carry out the following steps:

a) setting the pulse generator to emit pulses of a first pulse frequency,
b) determining first phase difference values of sample light (spectrally split at the dispersive element) using the time-of-flight camera,
c) setting the pulse generator to emit pulses of a second pulse frequency that is different from the first,
d) determining second phase difference values of (spectrally split) sample light using the time-of-flight camera,
e) Determining at least one material property based on (recorded) first and second phase difference values.

Anschließend können kann die ermittelte Stoffeigenschafft von der Steuereinheit über eine Schnittstelle ausgegeben werden. Vor dem Ermitteln der Fluoreszenzlebensdauer in Schritt e) wird vorzugsweise in einem Zwischenschritt identifiziert, dass die aufgenommenen Phasendifferenzwerte signifikant sind. Nichtsignifikante Phasendifferenzwerte werden bei dem Ermitteln der Fluoreszenzlebensdauer in Schritt e) vorzugsweise nicht berücksichtigt.The determined material properties can then be output by the control unit via an interface. Before determining the fluorescence lifetime in step e), it is preferably identified in an intermediate step that the recorded phase difference values are significant. Non-significant phase difference values are preferably not taken into account when determining the fluorescence lifetime in step e).

Jeder Phasendifferenzwert gibt die Zeitdifferenz zwischen der Emission eines jeweiligen beleuchtenden Lichtpulses und dem Eintreffen der zugehörigen Fluoreszenzantwort in der Laufzeitkamera an. Alternativ kann als Phasendifferenzwert jede zur Zeitdifferenz äquivalente Größe verwendet werden, beispielsweise die entsprechende Winkeldifferenz bezüglich der Pulsfrequenz oder die entsprechende zurückgelegte Weglänge. Neben den Phasendifferenzwerten können auch spektrale Intensitätswerte des Probenlichts ermittelt werden. In vorteilhaften Ausführungsformen kann die Ermittlung der Stoffeigenschaft zusätzlich anhand der spektralen Intensitätswerte erfolgen.Each phase difference value indicates the time difference between the emission of a respective illuminating light pulse and the arrival of the associated fluorescence response in the time-of-flight camera. Alternatively, any quantity equivalent to the time difference can be used as the phase difference value, for example the corresponding angular difference with respect to the pulse frequency or the corresponding path length traveled. In addition to the phase difference values, spectral intensity values of the sample light can also be determined. In advantageous embodiments, the material property can also be determined using the spectral intensity values.

Zweckmäßigerweise werden für jeden Phasendifferenzwert für mehrere unterschiedliche (disjunkte) Wellenlängenbereiche separate Subphasendifferenzwerte ermittelt. Jeder Phasendifferenzwert kann dann ein Skalar sein, der aus einem (beispielsweise anhand der Fehler der Subwerte gewichteten) Mittelwert seiner (wellenlängenabhängigen) Subwerte gebildet wird. Alternativ kann der Phasendifferenzwert ein Vektor sein, dessen Komponenten die Subwerte sind.Separate subphase difference values are expediently determined for each phase difference value for several different (disjoint) wavelength ranges. Each phase difference value can then be a scalar, which is formed from an average of its (wavelength-dependent) subvalues (weighted, for example, based on the errors of the subvalues). Alternatively, the phase difference value can be a vector whose components are the subvalues.

Durch die sequentielle Modulation mit mindestens zwei (vorzugsweise drei oder mehr) unterschiedlichen Pulsfrequenzen und dadurch separate Ermittlung der Phasendifferenzwerte bei unterschiedlichen Pulsfrequenzen können eine oder mehrere voneinander verschiedene Stoffeigenschaften mit signifikant höherer Genauigkeit ermittelt werden als bisher. Das gilt insbesondere für stark unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern und auch dann, wenn die betreffenden Fluorophoren ein spektral überlappendes oder gar ähnliches Emissionsspektrum aufweisen. Das Ermitteln der Stoffeigenschaft gelingt insbesondere anhand einer Matrix der ermittelten Phasendifferenzwerte, die in einer ersten Dimension durch die betreffende Wellenlänge (genauer gesagt: durch den betreffenden Wellenlängenbereich) des Probenlichts (oder ein Äquivalent derselben) und in einer zweiten Dimension durch die Pulsfrequenz (oder ein Äquivalent derselben) parametrisiert ist. Zweckmäßigerweise wird eine solche Matrix daher vor dem Ermitteln der Stoffeigenschaft anhand der ermittelten Phasendifferenzwerte erstellt. Je mehr Stützstellen diese Matrix aufweist, also durch Messung bei mehr Pulsfrequenzen oder bei mehr Wellenlängenbereichen, desto höher ist die Genauigkeit bei der Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer.Through the sequential modulation with at least two (preferably three or more) different pulse frequencies and thereby separate determination of the phase difference values at different pulse frequencies, one or more different material properties can be determined with significantly higher accuracy than before. This applies in particular to very different fluorescence lifetimes and even when the fluorophores in question have a spectrally overlapping or even similar emission spectrum. The material property can be determined in particular using a matrix of the determined phase difference values, which are determined in a first dimension by the relevant wavelength (more precisely: by the relevant wavelength range) of the sample light (or an equivalent thereof) and in a second dimension by the pulse frequency (or a Equivalent of the same) is parameterized. It is expedient to use a sol The matrix is therefore created before determining the material properties based on the determined phase difference values. The more support points this matrix has, i.e. by measuring at more pulse frequencies or at more wavelength ranges, the higher the accuracy in determining the fluorescence lifetime.

Da die Ermittlung der Stoffeigenschaft und damit die Bewertung einer einzelnen Probe in kurzer Zeit möglich ist, können anstelle von (womöglich zunächst ausgesonderten) Stichproben vorzugsweise alle Produkte eines Herstellungsprozesses auf diese Weise untersucht werden.Since the determination of the material properties and thus the evaluation of an individual sample is possible in a short time, all products of a manufacturing process can preferably be examined in this way instead of (possibly initially separated) samples.

Es kann vorteilhaft sein, Phasendifferenzwerte, die Lichtlaufzeiten unterhalb einer vorgegebenen Mindestlaufzeit und oberhalb einer vorgegebenen Maximallaufzeit entsprechen, zu verwerfen (nicht bei der Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer zu berücksichtigen). Dadurch kann vermieden werden, dass Licht von außerhalb der Probe oder aus einer Verpackung stammendes Probenlicht die Genauigkeit der Ermittlung der Stoffeigenschaft beeinträchtigt. Eine noch höhere Genauigkeit kann erreicht werden, indem eine Probe mit fluoreszenzfreier Verpackung verwendet wird.It may be advantageous to discard phase difference values that correspond to light transit times below a predetermined minimum transit time and above a predetermined maximum transit time (not to be taken into account when determining the fluorescence lifetime). This can prevent light from outside the sample or sample light from packaging from affecting the accuracy of determining the material property. Even higher accuracy can be achieved by using a sample with fluorescence-free packaging.

In besonderen Ausführungsformen des Verfahrens kann vor dem Beleuchten und Aufnehmen von Probenlicht vorteilhafterweise ein Fluoreszenz-Löscher (engl. „quencher“) in die Probe eingebracht werden. Dadurch können eine oder mehrere Fluoreszenzlebensdauern verändert und so die Messgenauigkeit erhöht werden. Das gelingt insbesondere, indem ein erster Messdurchgang (mit mindestens zwei verschiedenen Pulsfrequenzen) ohne Fluoreszenzlöscher und nach dem Hinzufügen des Fluoreszenzlöschers ein zweiter Messdurchgang (mit mindestens zwei verschiedenen Pulsfrequenzen, vorzugsweise denselben wie im ersten Durchgang) durchgeführt werden. Anhand der Fluoreszenzlebensdauer unter Anwesenheit des Löschers kann beispielsweise ein chemometrisches Modell erstellt und bei einer späteren Ermittlung der Stoffeigenschaft einer regulären (löscherfreien) Probe verwendet werden. Neben der Fluoreszenzlebensdauer kann dann beispielsweise auch die Konzentration eines beteiligten fluoreszierenden Stoffes ermittelt werden.In special embodiments of the method, a fluorescence quencher can advantageously be introduced into the sample before illuminating and recording sample light. This allows one or more fluorescence lifetimes to be changed and thus the measurement accuracy can be increased. This is achieved in particular by carrying out a first measurement pass (with at least two different pulse frequencies) without a fluorescence quencher and, after adding the fluorescence quencher, a second measurement pass (with at least two different pulse frequencies, preferably the same as in the first pass). For example, based on the fluorescence lifetime in the presence of the quencher, a chemometric model can be created and used in a later determination of the material properties of a regular (quencher-free) sample. In addition to the fluorescence lifetime, the concentration of a fluorescent substance involved can also be determined.

Vorteilhaft sind Verfahrensformen, in denen eine Probe verwendet wird, die von einer geschlossenen Hülle umgeben ist, insbesondere eine flüssige Probe. Im Sinne der Erfindung ist die Hülle ein Teil der Probe, so dass auch von ihr eine Stoffeigenschaft ermittelt werden kann. So kann beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauer nichtinvasiv durch die Hülle ermittelt werden. Die Hülle kann insbesondere eine Verpackung sein. Dadurch können bereits verpackte Produkte bewertet werden. Vorzugsweise kann dabei eine Fluoreszenzlebensdauer einer leeren oder einer mit einem nichtfluoreszierenden Stoff gefüllten Hülle, die beispielsweise in einer Kalibriermessung ermittelt werden kann, zur Ermittlung der Stoffeigenschaft der Probe verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist eine solche Verfahrensform zur Untersuchung eines in eine Flasche abgefüllten Getränks.Methods in which a sample is used which is surrounded by a closed shell, in particular a liquid sample, are advantageous. In the sense of the invention, the shell is part of the sample, so that a material property can also be determined from it. For example, the fluorescence lifetime can be determined non-invasively through the shell. The cover can in particular be packaging. This means that products that have already been packaged can be evaluated. Preferably, a fluorescence lifetime of an empty shell or one filled with a non-fluorescent substance, which can be determined, for example, in a calibration measurement, can be used to determine the material properties of the sample. Such a method is particularly advantageous for examining a beverage filled into a bottle.

Beispielsweise kann für die ermittelte Stoffeigenschaft ein oberer oder unterer Grenzwert oder ein Intervall zulässiger Werte vorgegeben sein. Wird ein Überschreiten eines oberen Grenzwerts, ein Unterschreiten eines unteren Grenzwerts oder ein Verlassen eines Intervalls identifiziert, kann die untersuchte Probe abweichend von anderen Proben behandelt werden. Beispielsweise kann sie ausgesondert werden. Eine andere Möglichkeit der Behandlung ist die Einordnung untersuchter Proben in unterschiedliche Qualitätsstufen, insbesondere mit Kennzeichnung der Proben mit der betreffenden Qualitätsstufe.For example, an upper or lower limit value or an interval of permissible values can be specified for the material property determined. If an upper limit value is exceeded, a lower limit value is not exceeded, or an interval is exceeded, the examined sample can be treated differently from other samples. For example, it can be separated out. Another possible treatment is to classify examined samples into different quality levels, in particular by labeling the samples with the relevant quality level.

In einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann anhand der ermittelten Stoffeigenschaft ein Herstellungsprozess für die Probe gesteuert werden. Dadurch können die Auswirkungen von Fehlern im Herstellungsprozess deutlich vermindert werden.In a special embodiment of the method according to the invention, a manufacturing process for the sample can be controlled based on the material property determined. This can significantly reduce the impact of errors in the manufacturing process.

Ein Problem bei einer spektroskopischen Transreflexionsmessung, bei der das Beleuchtungslicht insbesondere eine spektroskopisches Antwortsignal aus dem oberen Bereich der Probe liefert, ist die unerwünschte Messung von Glanz, also einer gerichteten Reflexion von Anregungslicht an der Probenoberfläche. Vorteilhaft sind daher Ausführungsformen, in denen Phasendifferenzwerte, die kleiner als ein vorgegebener Phasendifferenzgrenzwert sind, beim Ermitteln der Stoffeigenschaft nicht verwendet werden. Auf diese Weise kann beispielsweise eine höhere Genauigkeit der ermittelten Stoffeigenschaft erreicht werden, indem gestreutes oder reflektiertes Beleuchtungslicht (das ausschließlich während des beleuchtenden Lichtpulses auftritt) nicht berücksichtigt wird, denn die Glanzinformation erreicht den Sensor vor der eigentliche Messinformation im Probenlicht, die aus dem inneren der Probe stammt. Mittels zeitaufgelöster Spektroskopie läßt sich der Glanz aus der Messung herausrechnen oder durch Verwerfen einer individuellen Messantwort, also des gemessenen Phasendifferenzwertes, vor einer bestimmten Zeit - vorzugsweise der Pulsdauer der beleuchtenden Lichtpulse - herausfiltern. Auf diese Weise kann der im Stand der Technik nötige Aufwand im optischen Aufbau zur Vermeidung von Glanzeinflüssen auf die ermittelte(n) Stoffeigenschaft(en) reduziert oder gar vollständig vermieden werden.A problem with a spectroscopic transreflection measurement, in which the illuminating light provides in particular a spectroscopic response signal from the upper region of the sample, is the undesirable measurement of gloss, i.e. a directed reflection of excitation light on the sample surface. Embodiments in which phase difference values that are smaller than a predetermined phase difference limit value are not used when determining the material property are therefore advantageous. In this way, for example, a higher accuracy of the determined material property can be achieved by not taking into account scattered or reflected illumination light (which only occurs during the illuminating light pulse), because the gloss information reaches the sensor before the actual measurement information in the sample light, which comes from inside the Sample comes from. Using time-resolved spectroscopy, the gloss can be calculated out of the measurement or filtered out by rejecting an individual measurement response, i.e. the measured phase difference value, before a certain time - preferably the pulse duration of the illuminating light pulses. In this way, the effort required in the prior art in the optical structure to avoid gloss influences on the determined material property(s) can be reduced or even completely avoided.

Vorteilhaft kann es auch sein, mittels der Laufzeitkamera (wiederholt, insbesondere quasi-permanent) einen räumlichen Abstand der Probe von der Laufzeitkamera zu ermitteln. Dadurch kann auf einen zusätzlichen Abstandssensor verzichtet werden. Mit der Zusatzinformation, aus welchem Abstand die spektroskopisch zerlegte Messantwort kommt, können Korrekturverfahren genutzt werden, um die Messgenauigkeit zu erhöhen und die Plausibilität der Messung einzuschätzen. Ein solches Verfahren mit Abstandsmessung kann beispielsweise in der Prozessmesstechnik eingesetzt werden, wenn Proben in unterschiedlichem Abstand von der Messvorrichtung (beispielsweise auf einem Transportband mit unterschiedlich hohem Befüllungsprofil) spektroskopisch vermessen werden sollen. Der Abstand zur Probe und damit der optische Weg, der zweimal durchlaufen wird, variieren. Damit variiert der Einfluß der Atmosphäre im optischen Weg, beispielsweise aufgrund von Feuchtigkeit. Durch Messung des genauen Probenabstandes lassen sich Korrekturen der Absorption vorgegebener Wellenlängen, beispielsweise verursacht durch Luftfeuchtigkeit, in die spektroskopische Messung einbeziehen, um einen aus der Absorption resultierenden Messfehler zu kompensieren. Es kann daher zweckmäßig sein, den ermittelten Abstand bei der Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer oder zur Ermittlung einer (anderen) Stoffeigenschaft der Probe zu verwenden, beispielsweise als Korrekturfaktor in einer Rechenvorschrift. Alternativ oder zusätzlich kann der ermittelte Abstand in einer zeitlich parallel ablaufenden Messung und in der Auswertung einer solchen Messung verwendet werden.It can also be advantageous to use the time-of-flight camera to determine (repeatedly, in particular quasi-permanently) a spatial distance of the sample from the time-of-flight camera. This means that there is no need for an additional distance sensor. With the additional information about the distance from which the spectroscopically decomposed measurement response comes, correction methods can be used to increase the measurement accuracy and assess the plausibility of the measurement. Such a method with distance measurement can be used, for example, in process measurement technology if samples are to be measured spectroscopically at different distances from the measuring device (for example on a conveyor belt with a different filling profile). The distance to the sample and thus the optical path that is passed through twice vary. This means that the influence of the atmosphere in the optical path varies, for example due to moisture. By measuring the exact sample distance, corrections to the absorption of specified wavelengths, for example caused by humidity, can be included in the spectroscopic measurement in order to compensate for a measurement error resulting from the absorption. It can therefore be useful to use the determined distance when determining the fluorescence lifetime or to determine a (different) material property of the sample, for example as a correction factor in a calculation rule. Alternatively or additionally, the determined distance can be used in a measurement that runs parallel in time and in the evaluation of such a measurement.

Vorzugsweise weist die Laufzeitkamera ein eindimensionales oder zweidimensionales Feld (engl. „array“) von Photomischdetektoren auf. Dadurch kann spektral aufgelöstes Probenlicht mit geringem Aufwand aufgenommen werden. Bei einem zweidimensionalen Feld kann zudem nicht nur ein näherungsweise punktförmiger Probenfleck, sondern eine linienförmige Probenregion ortsaufgelöst vermessen werden. Auf diese Weise kann entweder (beispielsweise durch Zusammenfassen der Messorte durch gewichtete Mittelung der betreffenden Phasendifferenzwerte) die Messgenauigkeit verbessert oder (beispielsweise durch separate Behandlung der Messorte) die Messung beschleunigt werden.The time-of-flight camera preferably has a one-dimensional or two-dimensional array of photomixing detectors. This means that spectrally resolved sample light can be recorded with little effort. In a two-dimensional field, not only an approximately point-shaped sample spot, but also a line-shaped sample region can be measured with spatial resolution. In this way, the measurement accuracy can either be improved (for example by combining the measurement locations by weighted averaging of the relevant phase difference values) or the measurement can be accelerated (for example by treating the measurement locations separately).

Vorteilhaft sind solche Ausgestaltungen, in denen der Strahlengang der Laufzeitkamera mindestens einen Lichtwellenleiter umfasst, wobei das dispersive Element zwischen dem Lichtwellenleiter und der Laufzeitkamera angeordnet ist. Dadurch kann die Vorrichtung kompakt aufgebaut sein.Embodiments in which the beam path of the time-of-flight camera comprises at least one optical waveguide are advantageous, with the dispersive element being arranged between the optical waveguide and the time-of-flight camera. This allows the device to have a compact design.

Zweckmäßigerweise ist das dispersive Element ein Plangitter oder ein abbildendes Gitter oder ein Prisma.The dispersive element is expediently a flat grid or an imaging grid or a prism.

Die Lichtquelle umfasst vorzugsweise eine oder mehrere Halbleiterlichtquellen, beispielsweise LED, OLED oder Laser. Alternativ können Gasentladungsblitzlampen eingesetzt werden. Wenn die Lichtquelle selbst kontinuierlich emittiert, können die beleuchtenden Lichtpulse aus dem kontinuierlichen Lichtstrom mittels eines Modulators erzeugt werden, der im Sinne der Erfindung Teil der Lichtquelle ist. Verwendbar sind beispielsweise akustooptische oder elektrooptische Modulatoren (AOM, EOM) oder polarisationsoptische Modulatoren wie Pockelszellen oder Flüssigkristallschalter. Zweckmäßigerweise kann die Lichtquelle gekühlt werden, um eine reproduzierbare Anregungswellenlänge und Intensität zu erreichen. Das ist besonders wegen der unterschiedlichen Verlustleistungen bei verschiedenen Pulsfrequenzen vorteilhaft.The light source preferably comprises one or more semiconductor light sources, for example LED, OLED or laser. Alternatively, gas discharge flash lamps can be used. If the light source itself emits continuously, the illuminating light pulses can be generated from the continuous luminous flux by means of a modulator, which is part of the light source in the sense of the invention. For example, acousto-optical or electro-optical modulators (AOM, EOM) or polarization-optical modulators such as Pockels cells or liquid crystal switches can be used. The light source can expediently be cooled in order to achieve a reproducible excitation wavelength and intensity. This is particularly advantageous because of the different power losses at different pulse frequencies.

Die Nutzung mehrerer (spektral nicht zusammenhängender) Anregungswellenlängen (Anregungswellenlängenbereiche) erlaubt die genauere Bestimmung von zeitaufgelösten Fluoreszenzvorgängen und Phasenlagen, insbesondere bei Existenz unterschiedliche Fluorophore in der Probe. Verschiedene Anregungswellenlängen können mittels unterschiedlicher Lichtquellen oder mittels eines variablen spektralen Filters vor einer in mehreren spektralen Bändern emittierenden Lichtquelle erzeugt werden. Vorteilhaft ist es, wenn die Lichtquelle(n) zu jedem (erwarteten) Spektralbereich der Fluoreszenzantwort eine spektral beabstandete Anregungswellenlänge emittieren.The use of several (spectrally unrelated) excitation wavelengths (excitation wavelength ranges) allows the more precise determination of time-resolved fluorescence processes and phase positions, especially if different fluorophores exist in the sample. Different excitation wavelengths can be generated using different light sources or using a variable spectral filter in front of a light source emitting in several spectral bands. It is advantageous if the light source(s) emit a spectrally spaced excitation wavelength for each (expected) spectral range of the fluorescence response.

Vorteilhaft sind Ausgestaltungen, in denen im Strahlengang der Laufzeitkamera ein zweites dispersives Element angeordnet ist, dessen Dispersionsrichtung unter einem von Null verschiedenen Winkel zur Dispersionsrichtung des ersten dispersiven Elements angeordnet ist. Dadurch kann die spektrale Auflösung verbessert werden.Embodiments are advantageous in which a second dispersive element is arranged in the beam path of the time-of-flight camera, the dispersion direction of which is arranged at an angle other than zero to the dispersion direction of the first dispersive element. This can improve the spectral resolution.

Durch Ausgestaltung der Vorrichtung derart, dass ein Teil jedes beleuchtenden Lichtpulses der Lichtquelle als Referenzlicht (ohne Wechselwirkung mit der Probe) zu der Laufzeitkamera gelangt (Zweistrahlaufbau) kann die Messgenauigkeit deutlich verbessert werden. Alternativ kann die Vorrichtung einen zusätzlichen optoelektronischen Detektor aufweisen, wobei ein Teil jedes beleuchtenden Lichtpulses der Lichtquelle als Referenzlicht zu dem Detektor gelangt. So steht für jede Messung ein genauer Referenzzeitstempel der optischen Anregung zur Verfügung. Die Laufzeitkamera kann zu diesem Zweck beispielsweise zwei optische Eingänge oder einen kombinierten optischen Eingang für das Probenlicht und das Referenzlicht aufweisen. Der kombinierte optische Eingang kann beispielsweise ein segmentierter Querschnittswandler sein. Bei zwei Eingängen kann das Referenzlicht in einen Bereich des Sensors der Laufzeitkamera abgebildet werden, der nicht für die spektroskopische Auswertung genutzt wird. Alternativ können die beiden Eingänge (auch die separaten Eingänge eines kombinierten Eingangs) mit optischen Verschlüssen (engl. „shutter“) versehen sein, um entweder Probenlicht oder Referenzlicht zum Sensor gelangen zu lassen.By designing the device in such a way that a portion of each illuminating light pulse from the light source reaches the time-of-flight camera as a reference light (without interaction with the sample) (two-beam structure), the measurement accuracy can be significantly improved. Alternatively, the device can have an additional optoelectronic detector, with a portion of each illuminating light pulse from the light source reaching the detector as reference light. This means that an exact reference time stamp of the optical excitation is available for each measurement. For this purpose, the time-of-flight camera can have, for example, two optical inputs or a combined optical input for the sample light and the reference light. The com bined optical input can be, for example, a segmented cross-sectional converter. With two inputs, the reference light can be imaged in an area of the time-of-flight camera sensor that is not used for spectroscopic evaluation. Alternatively, the two inputs (also the separate inputs of a combined input) can be provided with optical shutters to allow either sample light or reference light to reach the sensor.

In allen Ausgestaltungsvarianten kann das Referenzlicht als Zeitreferenz, beispielsweise für eine Abstandsmessung, und/oder als spektrale Intensitätsreferenz genutzt werden. Das Abtrennen des Referenzlichts gelingt in allen Ausgestaltungsvarianten beispielsweise mittels eines Strahlteilers und/oder eines Lichtwellenleiters. Alternativ ist eine Freistrahloptik denkbar, so dass das Spektrometer direkt oder über Spiegel Licht von der Lichtquelle aufnimmt.In all design variants, the reference light can be used as a time reference, for example for a distance measurement, and/or as a spectral intensity reference. The reference light can be separated in all design variants, for example by means of a beam splitter and/or an optical waveguide. Alternatively, free-beam optics are conceivable, so that the spectrometer records light from the light source directly or via mirrors.

Vorzugsweise erfolgt das Ermitteln der Stoffeigenschaft(en) mittels einer Ausgleichsrechnung, insbesondere unter Minimierung einer Abweichungsfunktion, insbesondere von Abweichungsquadraten. Das ermöglicht eine hohe Messgenauigkeit mit geringem Kostenaufwand.Preferably, the material property(s) is determined by means of a compensation calculation, in particular while minimizing a deviation function, in particular deviation squares. This enables high measurement accuracy with low costs.

Vorteilhaft sind Ausführungsformen, bei denen in der Ausgleichsrechnung eine Anpassung eines vorgegebenen oder vorgebbaren (zwei- oder mehrdimensionalen) mathematischen Modells, das von Beleuchtungs-Pulsfrequenzen und Fluoreszenz-Wellenlängen abhängt, an die ermittelten Phasendifferenzwerte erfolgt. Das ermöglicht eine hohe Messgenauigkeit trotz geringem Rechenaufwand, welche optional durch das Hinzuziehen der Intensitäts- und/oder Amplitudenwerte weiter gesteigert werden kann.Embodiments are advantageous in which, in the compensation calculation, a predetermined or predeterminable (two- or multi-dimensional) mathematical model, which depends on illumination pulse frequencies and fluorescence wavelengths, is adapted to the determined phase difference values. This enables high measurement accuracy despite low computational effort, which can optionally be further increased by including the intensity and/or amplitude values.

Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen das Ermitteln der Stoffeigenschaft(en) nicht anhand von Intensitätswerten und/oder Amplitudenwerten der Laufzeitkamera erfolgt. Dadurch kann/können die Stoffeigenschaft(en) anhand der Phasendifferenzwerte trotz geringem Rechenaufwand hochgenau gemessen werden.Particularly preferred are embodiments in which the material property(s) are not determined based on intensity values and/or amplitude values of the time-of-flight camera. This means that the material property(s) can be measured with high precision using the phase difference values despite little computational effort.

Besonders schnell und genau gelingt das Ermitteln der Stoffeigenschaft(en) anhand eines vorgegebenen oder vorgebbaren Emissionsverhältnisses mindestens zweier verschiedener Fluorophorsorten, da durch das Emissionsverhältnis der Lösungsraum des mathematischen Modells eingeschränkt werden kann. Das Emissionsverhältnis wird vorzugsweise als bekannte Information über die Probe vorausgesetzt und vorgegeben.The material property(s) can be determined particularly quickly and accurately based on a predetermined or predeterminable emission ratio of at least two different types of fluorophore, since the solution space of the mathematical model can be restricted by the emission ratio. The emission ratio is preferably assumed and specified as known information about the sample.

Vorzugsweise kann vor der Ausgleichsrechnung die Fluoreszenzlebensdauer der dominierenden Fluorophorsorte zunächst anhand der ermittelten Phasendifferenzwerte oder anhand von aus einer Leermessung einer Verpackung stammenden Phasendifferenzwerten ermittelt werden. Das erlaubt eine besonders hohe Genauigkeit der Messung.Preferably, before the compensation calculation, the fluorescence lifetime of the dominant fluorophore type can first be determined on the basis of the determined phase difference values or on the basis of phase difference values originating from an empty measurement of a packaging. This allows for particularly high measurement accuracy.

Besonders genau gelingt das Ermitteln einer oder mehrerer Stoffeigenschaft in der Ausgleichsrechnung, indem eine vorgebbare oder vorgegebene oder ermittelte Fluoreszenzlebensdauer einer dominierenden Fluorophorsorte konstant belassen wird.One or more material properties can be determined particularly precisely in the balancing calculation by leaving a predeterminable or predetermined or determined fluorescence lifespan of a dominant fluorophore type constant.

Insbesondere kann in der Ausgleichsrechnung vorteilhafterweise eine erste Fluoreszenzlebensdauer von Null (für eine fiktive Fluorophorsorte, die das Anregungslicht darstellt) verwendet und als Stoffeigenschaft eine zweite Fluoreszenzlebensdauer ermittelt werden. Dadurch kann insbesondere in Fällen, in denen die Lichtquelle sowohl in einem Wellenlängenbereich zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe als auch in einem Wellenlängenbereich der Fluoreszenz emittiert, die Fluoreszenz von reflektiertem/gestreutem Anregungslicht im Probenlicht getrennt werden. Vorzugsweise wird dies genutzt, um anschließen anhand der zweiten Fluoreszenzlebensdauer einen Reflexionsgrad der Probe unter Kompensation der störenden Fluoreszenz zu ermitteln. Vorteilhafterweise können in der Ausgleichsrechnung weitere Fluoreszenzlebensdauern ermittelt werden, insbesondere anhand eines Modells mit einer entsprechenden Anzahl von Fluorophorsorten (zuzüglich der fiktiven Fluorophorsorte mit der ersten Fluoreszenzlebensdauer von Null).In particular, in the compensation calculation, a first fluorescence lifetime of zero (for a fictitious fluorophore type that represents the excitation light) can advantageously be used and a second fluorescence lifetime can be determined as a material property. This makes it possible to separate the fluorescence from reflected/scattered excitation light in the sample light, particularly in cases in which the light source emits both in a wavelength range for exciting fluorescence in the sample and in a wavelength range for fluorescence. This is preferably used to then use the second fluorescence lifetime to determine a reflectance of the sample while compensating for the disturbing fluorescence. Advantageously, additional fluorescence lifetimes can be determined in the compensation calculation, in particular using a model with a corresponding number of fluorophore types (plus the fictitious fluorophore type with the first fluorescence lifetime of zero).

Vorzugsweise liegen die erste und zweite Pulsfrequenz zwischen 1 MHz und 1000 MHz. Dasselbe gilt für eine eventuelle dritte und weitere Pulsfrequenzen in weiteren (ebenfalls miteinander synchronisierten) Beleuchtungs- und Aufnahmeschritten. Diese Frequenzen sind vorteilhaft, weil bei der Mehrzahl der bekannten fluoreszierenden Stoffen die Fluoreszenzlebensdauern im Bereich von 0,01 ns bis 100 ns liegen.Preferably the first and second pulse frequencies are between 1 MHz and 1000 MHz. The same applies to any third and further pulse frequencies in further (also synchronized with each other) lighting and recording steps. These frequencies are advantageous because the fluorescence lifetimes of the majority of known fluorescent substances are in the range from 0.01 ns to 100 ns.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung weisen die beleuchtenden Lichtpulse einen sinus- oder cosinusförmigen Intensitätsverlauf auf. Dadurch kann die Messgenauigkeit deutlich verbessert werden. Die Vorrichtung umfasst dazu zweckmäßigerweise Mittel zum Erzeugen von Lichtpulsen mit sinus- oder cosinusförmigen Intensitätsverlauf. Es kann sich dabei beispielsweise um einen digitalen Signalprozessor (DSP) handeln. Eine andere Möglichkeit besteht darin, hinter den Ausgang des (Rechteck-)Pulsgebers eine Signalverzögerungseinheit zu schalten, die im zeitlichen Mittel sinus-halbwellenförmige Verzögerung der elektrischen Pulse bewirkt, wobei die verzögerten Pulse an die Lichtquelle und/oder auch an die Laufzeitkamera ausgegeben werden. Alternativ zu einer Signalverzögerung kann auch die Methode harmonischen Fehlerzurückweisung verwendet werden. Vorzugsweise erfolgt die Erzeugung der beleuchtenden Lichtpulse derart, dass dabei Oberwellen (Harmonische) der Grundanregung (weitgehend) vermieden werden.In an advantageous embodiment, the illuminating light pulses have a sinusoidal or cosine-shaped intensity curve. This can significantly improve the measurement accuracy. For this purpose, the device expediently comprises means for generating light pulses with a sinusoidal or cosine-shaped intensity curve. This can be, for example, a digital signal processor (DSP). Another possibility is to connect a signal delay unit behind the output of the (rectangular) pulse generator, which causes a sinusoidal half-wave delay of the electrical pulses on average over time, with the delayed pulses being sent to the light source and/or also be output to the time-of-flight camera. As an alternative to a signal delay, the harmonic error rejection method can also be used. The illuminating light pulses are preferably generated in such a way that harmonics of the basic excitation are (largely) avoided.

Es kann vorteilhaft sein, eine breitbandig emittierende Lichtquelle einzusetzen und mehrschichtige Proben unter Nutzung der Kenntnis über Absorptionsvorgänge des Schichtaufbaus eine zeitaufgelöste spektrale Antwort der Rückseite der Probe und/oder des jeweils durchdrungenen Schichtaufbaus auszuwerten. Dabei durchläuft das Anregungslicht jede Schicht der Probe als optischen Pfad zweimal (Transflexion). In jeder Schicht wird ein Teil des Anregungslichtes durch Fluorophore absorbiert und das Anregungslicht für die nächste Schicht spektral in der Amplitude verändert. Die Steuereinheit simuliert dieses Verhalten zweckmäßigerweise in einem entsprechenden Mehrschichtenmodell. Eine breitbandig emittierende Lichtquelle ist im Sinne der Erfindung eine Lichtquelle, die in einem signifikanten spektralen Anteil (über eine Breite von mindestens 400 nm) des Bereichs von 300 nm bis 3000 nm emittiert. Es kann sich beispielsweise um einen thermischen Strahler, eine Halogenlampe, oder auch - mit eingeschränktem Wellenlängenbereich - eine Xenon- oder Deuteriumlampe sein. Halbleiterlichtquellen wie weiße LED können ebenfalls im VIS-Bereich breitbandig emittierten , beispielsweise von 350 nm bis 780 nm. Wichtig ist, dass der Anregungswellenlängenbereich der in der Probe erwarteten Fluorophore umfasst ist.It can be advantageous to use a broadband emitting light source and to evaluate a time-resolved spectral response of the back of the sample and/or the layer structure penetrated through multilayer samples using knowledge of the absorption processes of the layer structure. The excitation light passes through each layer of the sample twice as an optical path (transflection). In each layer, part of the excitation light is absorbed by fluorophores and the amplitude of the excitation light for the next layer is spectrally changed. The control unit expediently simulates this behavior in a corresponding multi-layer model. For the purposes of the invention, a broadband emitting light source is a light source that emits in a significant spectral portion (over a width of at least 400 nm) of the range from 300 nm to 3000 nm. It can be, for example, a thermal radiator, a halogen lamp, or - with a limited wavelength range - a xenon or deuterium lamp. Semiconductor light sources such as white LEDs can also emit broadband in the VIS range, for example from 350 nm to 780 nm. It is important that the excitation wavelength range of the fluorophores expected in the sample is included.

Die Erfindung umfasst auch eine Steuereinheit und ein Computerprogramm, eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Steuereinheit beziehungsweise das Computerprogramm kann zu diesem Zweck folgende Komponenten umfassen:

- ein Softwaremodul zum Einstellen des Pulsgebers zur Abgabe von Pulsen einer ersten Pulsfrequenz,
- ein Softwaremodul zum Ermitteln von ersten Phasendifferenzwerten von Probenlicht mittels der Laufzeitkamera,
- ein Softwaremodul zum Einstellen des Pulsgebers zur Abgabe von Pulsen einer zweiten, von der ersten verschiedenen Pulsfrequenz,
- ein Softwaremodul zum Ermitteln von zweiten Phasendifferenzwerten von Probenlicht mittels der Laufzeitkamera,
- ein Softwaremodul zum Ermitteln mindestens einer Stoffeigenschaft anhand (aufgenommener) erster und zweiter Phasendifferenzwerte.

The invention also includes a control unit and a computer program set up to carry out the method according to the invention. For this purpose, the control unit or the computer program can include the following components:

- a software module for setting the pulse generator to emit pulses of a first pulse frequency,
- a software module for determining first phase difference values of sample light using the time-of-flight camera,
- a software module for setting the pulse generator to emit pulses of a second pulse frequency that is different from the first,
- a software module for determining second phase difference values of sample light using the time-of-flight camera,
- a software module for determining at least one material property based on (recorded) first and second phase difference values.

Es kann sich dabei um unterschiedliche Softwaremodule handeln, es kann sich aber auch bei mehreren oder gar allen der genannten Softwaremodule um dasselbe Softwaremodul handeln.These can be different software modules, but several or even all of the software modules mentioned can also be the same software module.

Besonders vorteilhaft ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Identifikation eines Objekts, insbesondere einer Banknote, insbesondere mit Identifikation eines fluoreszierenden Bestandteils des Objekts anhand einer Fluoreszenzwellenlänge und/oder einer Fluoreszenzlebensdauer. Diese Verwendung erlaubt damit eine neue Sicherheitsbewertung von Banknoten, bei der nicht nur anhand der Fluoreszenz eines oder mehrerer Inhaltsstoffe in den Banknoten die Existenz dieses/dieser Inhaltsstoffe(s) nachgewiesen, sondern auch deren Fluoreszenzlebensdauer mit einem vorgegebenen Wert verglichen werden kann. Zweckmäßigerweise werden dabei die Fehlerintervalle des vorgegebenen Werts einerseits und der ermittelten Fluoreszenzlebensdauer andererseits miteinander verglichen und ausschließlich bei einer Überlappung der Fehlerintervalle die betreffende Banknote als echt identifiziert. Die Fluoreszenzlebensdauer(n) des/der Inhaltsstoffe(s) können so als zusätzliches Sicherheitsmerkmal verwendet werden. It is particularly advantageous to use a device according to the invention for identifying an object, in particular a banknote, in particular with identification of a fluorescent component of the object based on a fluorescence wavelength and/or a fluorescence lifetime. This use thus allows a new security assessment of banknotes, in which the existence of this ingredient(s) can not only be proven based on the fluorescence of one or more ingredients in the banknotes, but their fluorescence lifespan can also be compared with a predetermined value. The error intervals of the specified value on the one hand and the determined fluorescence lifespan on the other hand are expediently compared with one another and the banknote in question is identified as genuine only if the error intervals overlap. The fluorescence lifespan(s) of the ingredient(s) can thus be used as an additional safety feature.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Aufgabe, die Genauigkeit der Messung einer Stoffeigenschaft einer fluoreszierenden Probe mittels optischer Spektroskopie zu verbessern. Zu diesem Zweck ist eine Vorrichtung zum Ermitteln einer Stoffeigenschaft, insbesondere einer eines Reflexionsgrades, einer Probe, insbesondere von Papier, umfassend eine modulierbare Lichtquelle zur Emission von Lichtpulsen, eine ortsauflösende Laufzeitkamera, einen Pulsgeber und eine Steuereinheit, wobei die Lichtquelle und die Laufzeitkamera mit dem Pulsgeber verbunden sind und im Strahlengang der Laufzeitkamera zur spektral aufgelösten Aufnahme von Probenlicht ein dispersives Element angeordnet ist, vorgesehen, deren Steuereinheit zum Durchführen folgender Schritte eingerichtet ist:

a) Einstellen des Pulsgebers zur Abgabe von Pulsen,
b) Aufnehmen von Intensitätswerten und zugehörigen Phasendifferenzwerten von an einem dispersiven Element spektral aufgespaltetem Probenlicht mittels der Laufzeitkamera,
c) Identifizieren einer Teilmenge der Intensitätswerte, deren zugehörige Phasendifferenzwerte kleiner als ein vorgegebener Schwellwert sind,
e) Ermitteln mindestens einer Stoffeigenschaft anhand der Teilmenge der Intensitätswerte.

A further aspect of the invention relates to the task of improving the accuracy of the measurement of a material property of a fluorescent sample using optical spectroscopy. For this purpose, a device for determining a material property, in particular a reflectance, of a sample, in particular of paper, comprising a modulatable light source for emitting light pulses, a spatially-resolving time-of-flight camera, a pulse generator and a control unit, the light source and the time-of-flight camera being connected to the Pulse generators are connected and a dispersive element is arranged in the beam path of the time-of-flight camera for spectrally resolved recording of sample light, the control unit of which is set up to carry out the following steps:

a) Setting the pulse generator to deliver pulses,
b) recording intensity values and associated phase difference values of sample light spectrally split on a dispersive element using the time-of-flight camera,
c) identifying a subset of the intensity values whose associated phase difference values are smaller than a predetermined threshold value,
e) Determine at least one material property based on the subset of the intensity values.

Die Steuereinheit führt dabei vorzugsweise das folgende erfindungsgemäße Verfahren zum Ermitteln einer Stoffeigenschaft, insbesondere eines Reflexionsgrades, einer Probe, insbesondere von Papier, durch, wobei folgende Schritte durchgeführt werden:

a) Beleuchten der Probe mit Lichtpulsen mittels einer Lichtquelle,
b) Aufnehmen von Intensitätswerten und zugehörigen Phasendifferenzwerten von an einem dispersiven Element spektral aufgespaltetem Probenlicht mittels einer mit den Lichtpulsen synchronisierten Laufzeitkamera mit einem ortsauflösenden Detektor,
c) Identifizieren einer Teilmenge der Intensitätswerte, deren zugehörige Phasendifferenzwerte kleiner als ein vorgegebener Schwellwert sind,
e) Ermitteln der Stoffeigenschaft anhand der Teilmenge der Intensitätswerte.

The control unit preferably carries out the following method according to the invention for determining a material property, in particular a reflectance, a sample, in particular of paper, whereby the following steps are carried out:

a) illuminating the sample with light pulses using a light source,
b) recording intensity values and associated phase difference values of sample light spectrally split on a dispersive element using a time-of-flight camera synchronized with the light pulses and having a spatially resolving detector,
c) identifying a subset of the intensity values whose associated phase difference values are smaller than a predetermined threshold value,
e) Determining the material property based on the subset of the intensity values.

Dieser weitere Aspekt der Erfindung ermöglicht die Ermittlung des Reflexionsvermögens (Reflexionsgrads) sowohl in einer wellenlängenabhängigen Form als auch integriert über alle gemessenen Wellenlängen ohne den Fehler, der durch die Fluoreszenzemission der Probe entsteht. Diese Form der Ermittlung ist besonders dann vorteilhaft, wenn die Lichtquelle sowohl in einem Wellenlängenbereich zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe als auch in einem Wellenlängenbereich der Fluoreszenz emittiert.This further aspect of the invention enables the determination of reflectivity (reflectance) both in a wavelength-dependent form and integrated over all measured wavelengths without the error arising from the fluorescence emission of the sample. This form of determination is particularly advantageous if the light source emits both in a wavelength range for stimulating fluorescence in the sample and in a wavelength range for fluorescence.

Dieser zweite Aspekt der Erfindung umfasst auch eine Steuereinheit und ein Computerprogramm, eingerichtet zur Durchführung des Verfahrens. Die Steuereinheit beziehungsweise das Computerprogramm kann zu diesem Zweck folgende Komponenten umfassen:

a) Softwaremodul zum Einstellen des Pulsgebers zur Abgabe von Pulsen,
b) Softwaremodul zum Aufnehmen von Intensitätswerten und zugehörigen Phasendifferenzwerten von an einem dispersiven Element spektral aufgespaltetem Probenlicht mittels der Laufzeitkamera,
c) Softwaremodul zum Identifizieren einer Teilmenge der Intensitätswerte, deren zugehörige Phasendifferenzwerte kleiner als ein vorgegebener Schwellwert sind,
e) Softwaremodul zum Ermitteln mindestens einer Stoffeigenschaft anhand der Teilmenge der Intensitätswerte.

This second aspect of the invention also includes a control unit and a computer program set up to carry out the method. For this purpose, the control unit or the computer program can include the following components:

a) Software module for setting the pulse generator to deliver pulses,
b) software module for recording intensity values and associated phase difference values of sample light spectrally split on a dispersive element using the time-of-flight camera,
c) software module for identifying a subset of the intensity values whose associated phase difference values are smaller than a predetermined threshold value,
e) Software module for determining at least one material property based on the subset of the intensity values.

Die Erfindung ermöglicht die Nutzung von Fluoreszenz-, Phosphoreszenz- und Lumineszenzvorgängen in Stoffen auf nichtinvasive, technisch einfache, kostengünstige und schnelle Weise zur Bestimmung von Probeneigenschaften und/oder zur Unterscheidung von Proben und/oder zur Quantifizierung/Konzentrationsbestimmung von Probenbestandteilen von ruhenden oder bewegten Proben. Auch Plausibilitätskontrollen sind möglich. Die beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen können aufgrund der hohen Messgeschwindigkeit und Messgenauigkeit zur Bestimmung der an der Probe beteiligten Inhaltstoffe und/oder deren Verpackung in der Prozessmesstechnik, Bioanalytik, Lebensmittelüberwachung und Werkstofftechnik eingesetzt werden. Die Vorrichtung kann zu diesem Zweck auf einer Traverse über einer Transportvorrichtung, auf welcher Proben vorbeibewegbar sind, montiert sein. Dabei ist es möglich, Mehrfach- und Multifluoreszenzvorgänge zu analysieren und - sofern notwendig - die ermittelten Daten so aufzubereiten, dass sie zur unmittelbaren Verwendung in der Prozesstechnik genutzt werden können, insbesondere in laufenden Herstellungsprozessen („in-line“, „on-line“ oder „at-line“). Auch die optische Qualitätskontrolle der Abwesenheit bestimmter nicht erwünschter Anteile an der Probe, beispielsweise Verunreinigungen, ist auf diesem Wege möglich (Indirektes Messverfahren).The invention enables the use of fluorescence, phosphorescence and luminescence processes in substances in a non-invasive, technically simple, cost-effective and rapid manner to determine sample properties and/or to differentiate samples and/or to quantify/determine the concentration of sample components of stationary or moving samples . Plausibility checks are also possible. Due to the high measurement speed and measurement accuracy, the methods and devices described can be used to determine the ingredients involved in the sample and/or their packaging in process measurement technology, bioanalytics, food monitoring and materials technology. For this purpose, the device can be mounted on a traverse above a transport device on which samples can be moved past. It is possible to analyze multiple and multi-fluorescence processes and - if necessary - to prepare the data obtained in such a way that they can be used for immediate use in process technology, especially in ongoing manufacturing processes (“in-line”, “on-line”) or “at-line”). Visual quality control of the absence of certain undesirable components in the sample, such as impurities, is also possible in this way (indirect measurement method).

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below using exemplary embodiments.

In den Zeichnungen zeigen:

1 eine Messvorrichtung in schematischer Darstellung,
2 einen detaillierten Ausschnitt aus einer Messvorrichtung,
3 ein gemessenes Amplituden- und Phasenspektrum,
4 eine gemessene Phasendifferenzmatrix,
5 eine daraus ermittelte Fluoreszenzlebensdauer in Abhängigkeit der Wellenlänge und
6 eine Erläuterung der Unterscheidung von reflektiertem Licht und Fluoreszenzemission bei der Messung des Reflexionsvermögens.

In the drawings show:

1 a measuring device in a schematic representation,
2 a detailed section of a measuring device,
3 a measured amplitude and phase spectrum,
4 a measured phase difference matrix,
5 a fluorescence lifetime determined from this depending on the wavelength and
6 an explanation of the distinction between reflected light and fluorescence emission when measuring reflectivity.

In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.In all drawings, corresponding parts have the same reference numerals.

1 zeigt eine Vorrichtung 1 zur zeitaufgelösten Spektroskopie, insbesondere zur Messung einer oder mehrerer Fluoreszenzlebensdauern von in einer Probe 2 enthaltenen Fluorophorsorten, in schematischer Darstellung. Die Probe 2 kann homogen oder ein Stoffgemisch und jeweils verpackt oder unverpackt sein. Die Vorrichtung 1 umfasst eine modulierbare, vorzugsweise spektral breitbandige Lichtquelle 3 zur Emission von Lichtpulsen L mit einstellbarer Pulsfrequenz und einstellbarer Pulsform, beispielsweise eine Leuchtdiode 3.1 (LED) mit einer Treiberschaltung 3.2. Eine höhere Intensität des Beleuchtungslichts L erlaubt geringere Integrationszeiten beziehungsweise höhere Messfrequenzen, somit eine schnellere Analyse der zeitaufgelösten Fluoreszenz und dadurch eine höhere Messgenauigkeit. 1 shows a device 1 for time-resolved spectroscopy, in particular for measuring one or more fluorescence lifetimes of fluorophore types contained in a sample 2, in a schematic representation. Sample 2 can be homogeneous or a mixture of substances and can be packaged or unpackaged. The device 1 comprises a modulable, preferably spectrally broadband Light source 3 for emitting light pulses L with an adjustable pulse frequency and adjustable pulse shape, for example a light-emitting diode 3.1 (LED) with a driver circuit 3.2. A higher intensity of the illuminating light L allows shorter integration times or higher measurement frequencies, thus faster analysis of the time-resolved fluorescence and thus higher measurement accuracy.

Die Vorrichtung 1 umfasst weiterhin eine ortsauflösende Laufzeitkamera 4, die beispielsweise einen PMD-Sensor 4.1, insbesondere in Matrixform wie der Typ „PMD[vision] 3k-S“ mit einer Auflösung von 64x48 Pixeln, sowie einen Pulsgeber 5 mit einstellbarer Pulsfrequenz und eine Steuereinheit 6, enthält. Der Pulsgeber 5 ist hier Teil der Laufzeitkamera 4, wobei er über einen Eingang für die Vorgabe der zu erzeugenden Pulsfrequenz verfügt. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann der Pulsgeber 5 Teil der Lichtquelle 3 oder Teil der Steuereinheit 6 sein. Der Eingang für die Pulsfrequenz ist beispielsweise mit der Steuereinheit 6 verbunden, so dass diese die Pulsfrequenz vorgeben kann. Die Lichtquelle 3 und der Sensor 4.1 der Laufzeitkamera 4 sind mit dem Pulsgeber 5 verbunden und dadurch miteinander synchronisiert.The device 1 further comprises a spatially-resolving time-of-flight camera 4, which, for example, has a PMD sensor 4.1, in particular in matrix form such as the “PMD[vision] 3k-S” type with a resolution of 64x48 pixels, as well as a pulse generator 5 with an adjustable pulse frequency and a control unit 6, contains. The pulse generator 5 is here part of the time-of-flight camera 4, and has an input for specifying the pulse frequency to be generated. In alternative embodiments (not shown), the pulse generator 5 can be part of the light source 3 or part of the control unit 6. The input for the pulse frequency is connected, for example, to the control unit 6 so that it can specify the pulse frequency. The light source 3 and the sensor 4.1 of the time-of-flight camera 4 are connected to the pulse generator 5 and are thereby synchronized with one another.

Die sogenannte SBI-Korrektur („Suppression of Background Illumination“) des Sensors 4.1 zur Unterdrückung des Umgebungslichts/Fremdlichts durch Skalierung wird vorzugsweise ausgeschaltet, um die Messergebnisse nicht zu verfälschen. Der Intensitätsverlauf des auf die Probe 2 treffenden Beleuchtungslichts ist vorzugsweise sinus- oder cosinusförmig. Das kann beispielsweise durch eine entsprechende Form der von dem Pulsgeber 5 ausgegebenen elektrischen Pulse erreicht werden.The so-called SBI correction (“Suppression of Background Illumination”) of the sensor 4.1 to suppress the ambient light/external light through scaling is preferably switched off in order not to falsify the measurement results. The intensity curve of the illumination light striking the sample 2 is preferably sinusoidal or cosine-shaped. This can be achieved, for example, by a corresponding form of the electrical pulses emitted by the pulse generator 5.

Von der Probe 2 in Transmission und/oder Reflexion abgegebenes Probenlicht P wird über optische Elemente, hier beispielsweise einen Lichtwellenleiter 7 und einen Eintrittsspalt 8, auf den in der Bildebene angeordneten Sensor der Laufzeitkamera 4 abgebildet. In diesem Detektionsstrahlengang ist ein dispersives Element 9, beispielsweise ein holographisches Gitter, angeordnet, das eine räumlich-spektrale Aufspaltung des einfallenden Probenlichts P bewirkt. Die Laufzeitkamera 4 bildet mit den optischen Elementen 7, 8 und 9 ein Spektrometer 10, mit dem die das Probenlicht P spektral und zeitlich aufgelöst detektiert werden kann. In 2 ist das Spektrometer 10 in detailliertere Form im Querschnitt dargestellt. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann das Spektrometer ausschließlich in Freistrahloptik an die Probe gekoppelt sein.Sample light P emitted by the sample 2 in transmission and/or reflection is imaged via optical elements, here for example an optical waveguide 7 and an entrance slit 8, onto the sensor of the time-of-flight camera 4 arranged in the image plane. A dispersive element 9, for example a holographic grating, is arranged in this detection beam path, which causes a spatial-spectral splitting of the incident sample light P. The time-of-flight camera 4 forms a spectrometer 10 with the optical elements 7, 8 and 9, with which the sample light P can be detected with spectral and temporal resolution. In 2 the spectrometer 10 is shown in a more detailed cross-section. In alternative embodiments (not shown), the spectrometer can be coupled to the sample exclusively in free-beam optics.

Die Intensitäts- und Lichtlaufzeitantwort der Probe 2 wird über die Anregungsphasenlage der beleuchtenden Lichtpulse L erfasst, wobei die Pulsfrequenz variiert werden kann. Das erfolgt vorzugsweise selbständig durch die Laufzeitkamera 4, beispielsweise mittels eines internen Algorithmus in deren Sensor 4.1 oder in einer speziellen (kamerainternen oder kameraexternen) Steuer- und Auswerteeinheit (nicht abgebildet). Dabei wird aus den gruppierten Intensitäts- und Lichtlaufzeitantworten des Probenlichts P und optional unter Nutzung von Messergebnissen aus separaten Dunkel- und /oder Referenzmessungen die zeitaufgelöste Fluoreszenzantwort der Probe 2, in Amplitude und Phasenlage, ermittelt. Die im Sensor 4.1 erfassten Matrixbilder enthalten dann gleichzeitig die spektrale Intensitätsinformation des Probenlichts P und deren Zeitauflösung relativ zu den Pulsen des Pulsgebers 5 in Form von Phasendifferenzwerten (oder anderen physikalischen Äquivalenten der Lichtlaufzeit).The intensity and light transit time response of sample 2 is recorded via the excitation phase position of the illuminating light pulses L, whereby the pulse frequency can be varied. This is preferably done independently by the time-of-flight camera 4, for example by means of an internal algorithm in its sensor 4.1 or in a special (camera-internal or camera-external) control and evaluation unit (not shown). The time-resolved fluorescence response of sample 2, in amplitude and phase position, is determined from the grouped intensity and light transit time responses of the sample light P and optionally using measurement results from separate dark and/or reference measurements. The matrix images recorded in the sensor 4.1 then simultaneously contain the spectral intensity information of the sample light P and its time resolution relative to the pulses of the pulse generator 5 in the form of phase difference values (or other physical equivalents of the light transit time).

Mit einer eindimensional ortsauflösenden Laufzeitkamera 4 kann zu einem Probenlichtpuls genau ein zeitaufgelöstes Spektrum von genau einem Probenbereich aufgenommen werden, wenn die Dispersionsrichtung des dispersiven Elements parallel zur Richtung der Ortsauflösung (Pixelzeile) ist. Die Messung ergibt dann eine der Pixelanzahl entsprechende Zahl von Stützstellen für die Phasendifferenz und die Intensität des jeweils detektierten Probenlichts, wobei die Anzahl der spektralen Stützstellen geringer sein kann. In 3 ist sind die Phasendifferenz Δφ und die Intensität I als Detektorzählrate aus einer solchen Messung emissionswellenlängenabhängig aufgetragen. Wiederholt man die Messung bei anderen Pulsfrequenzen, kann man die Phasenverschiebung sowohl über der Emissionswellenlänge sowie der Pulsfrequenz darstellen (siehe 4). Mit einer zweidimensional ortsauflösenden Laufzeitkamera 4 kann beispielsweise von unterschiedlichen Probenbereichen simultan ein jeweiliges Spektrum in je eine Pixelzeile der Laufzeitkamera 4 aufgenommen werden, wenn die Dispersionsrichtung des dispersiven Elements 9 parallel zu den Zeilen ist. Jede Zeile stellt dann einen separaten Detektionskanal dar, der jeweils über dieselbe Anzahl von Stützstellen verfügt. Eine solche mehrkanalige Anordnung können simultan die spektral aufgelösten Phasendifferenzwerte und Intensitäten des Probenlichts von verschiedenen Orten der Probe vermessen werden.With a one-dimensional spatially resolving time-of-flight camera 4, a time-resolved spectrum of exactly one sample area can be recorded for a sample light pulse if the dispersion direction of the dispersive element is parallel to the direction of the spatial resolution (pixel line). The measurement then results in a number of support points corresponding to the number of pixels for the phase difference and the intensity of the sample light detected in each case, whereby the number of spectral support points can be smaller. In 3 The phase difference Δφ and the intensity I are plotted as a detector count rate from such a measurement depending on the emission wavelength. If the measurement is repeated at other pulse frequencies, the phase shift can be represented both over the emission wavelength and the pulse frequency (see 4 ). With a two-dimensional spatially-resolving time-of-flight camera 4, for example, a respective spectrum from different sample areas can be recorded simultaneously in each pixel line of the time-of-time camera 4 if the dispersion direction of the dispersive element 9 is parallel to the lines. Each line then represents a separate detection channel, each of which has the same number of support points. With such a multi-channel arrangement, the spectrally resolved phase difference values and intensities of the sample light from different locations on the sample can be measured simultaneously.

Die Steuereinheit 6 stellt zu diesem Zweck in einem ersten Schritt den Pulsgeber 5 auf eine erste Pulsfrequenz f_Puls,1 ein und schaltet die Lichtquelle 3 ein, so dass die Probe 2 mit Lichtpulsen beleuchtet und enthaltene Fluorophore zur Fluoreszenz angeregt werden. Durch die gesteuerte Aufnahme von Matrixbildgruppen mit gezieltem Phasenversatz der Ladungsträgerschaukel jedes Pixels des PMD-Sensors 4.1 des Laufzeitkamera 4 bei mindestens zwei verschiedenen Pulsfrequenzen des Beleuchtungslichts L entstehen Rohdaten von spektralen Intensitäten I und der zugehörigen Phaseninformation, aus der die Phasendifferenzwerte Δφ ermittelt und an die Steuereinheit 6 ausgegeben werden.For this purpose, in a first step, the control unit 6 sets the pulse generator 5 to a first pulse frequency f _pulse,1 and switches on the light source 3 so that the sample 2 is illuminated with light pulses and the fluorophores contained therein are excited to fluoresce. The controlled recording of matrix image groups with a targeted phase offset of the charge carrier swing of each pixel of the PMD sensor 4.1 of the time-of-flight camera 4 at at least two different pulse frequencies of the illumination light L creates raw data of spectral intensity acts I and the associated phase information, from which the phase difference values Δφ are determined and output to the control unit 6.

Während die Lichtquelle 3 die Probe 2 mit fluoreszenzanregenden Lichtpulsen L beleuchtet, nimmt die Steuereinheit 6 über eine vorgegebene Integrationszeit hinweg mittels der Laufzeitkamera 4 eine Matrix von Intensitätswerten und ersten Phasendifferenzwerten des spektral aufgespalteten Probenlichts P auf. Eine Koordinate der Matrix gibt beispielsweise den Detektionskanal an, zu dem die betreffende Spalte der Matrix gehört. Sie beschreibt damit den Ort der Probe 2, von dem das in einem Matrixelement integrierte Probenlicht P stammt. Eine zweite Koordinate der Matrix gibt beispielsweise die spektrale Stützstelle an, zu der eine Zeile der Matrix gehört. Sie beschreibt also das spektrale Intervall, aus dem das in einem Matrixelement integrierte Probenlicht P stammt. Jedes Matrixelement enthält einerseits einen Intensitätswert und andererseits einen Phasendifferenzwert.While the light source 3 illuminates the sample 2 with fluorescence-stimulating light pulses L, the control unit 6 records a matrix of intensity values and first phase difference values of the spectrally split sample light P over a predetermined integration time using the time-of-flight camera 4. A coordinate of the matrix indicates, for example, the detection channel to which the relevant column of the matrix belongs. It thus describes the location of the sample 2, from which the sample light P integrated in a matrix element comes. A second coordinate of the matrix indicates, for example, the spectral support point to which a row of the matrix belongs. It therefore describes the spectral interval from which the sample light P integrated in a matrix element comes. Each matrix element contains, on the one hand, an intensity value and, on the other hand, a phase difference value.

Die Steuereinheit 6 stellt dann in einem zweiten Schritt den Pulsgeber 5 auf eine zweite Pulsfrequenz f_Puls,2, die von der ersten Pulsfrequenz verschieden ist, und nimmt während der Beleuchtung der Probe 2 mittels der Laufzeitkamera 4 eine weitere Matrix von Intensitätswerten und zweiten Phasendifferenzwerten auf. Entsprechend wird in einem dritten Schritt bei einer dritten (von der ersten und der zweiten verschiedenen) Pulsfrequenz eine dritte Matrix von Intensitätswerten und dritten Phasendifferenzwerten und allgemein im n-ten Schritt bei einer n-ten Pulsfrequenz f_Puls,n eine n-te Matrix von Intensitätswerten und n-ten Phasendifferenzwerten aufgenommen.In a second step, the control unit 6 then sets the pulse generator 5 to a second pulse frequency f _pulse,2 , which is different from the first pulse frequency, and records a further matrix of intensity values and second phase difference values while illuminating the sample 2 using the time-of-flight camera 4 . Accordingly, in a third step at a third pulse frequency (different from the first and second) a third matrix of intensity values and third phase difference values and generally in the nth step at an nth pulse frequency f _pulse,n an nth matrix of Intensity values and nth phase difference values were recorded.

Die Steuereinheit 6 wertet die Phasendifferenzwerte aus, um eine oder mehrere Fluoreszenzlebensdauern von einem oder mehreren Inhaltsstoffen der Probe 2 zu ermitteln. Dabei gibt es keinen analytischen Weg zur Ermittlung der Lösung, sondern es kommen mathematische Algorithmen und Regressionen zum Einsatz, die die Lösungsmöglichkeiten der Multifluoreszenzantwort des Fluorophorgemisches über die Berechnung einer Ausgleichsrechnung (engl. „best-fit calculation“) bewerten und von mehreren möglichen Lösungsansätzen den/die plausible(n) bestimmen.The control unit 6 evaluates the phase difference values in order to determine one or more fluorescence lifetimes of one or more ingredients of the sample 2. There is no analytical way to determine the solution, but rather mathematical algorithms and regressions are used, which evaluate the possible solutions to the multifluorescence response of the fluorophore mixture by calculating a best-fit calculation and from several possible solution approaches /determine the plausible(s).

Vorzugsweise bildet die Steuereinheit 6 für die Ausgleichsrechnung aus den zuvor aufgenommenen n Matrizen eine Matrix Δφ(f_Puls,λ) von Phasendifferenzwerten, deren eine Koordinate die Pulsfrequenz angibt, bei der die betreffende Matrixspalte aufgenommen wurde, und deren zweite Koordinate die spektrale Stützstelle angibt, aus der die betreffende Matrixzeile stammt. Es kann also für jeden Detektionskanal eine separate Phasendifferenzmatrix oder eine aus mehreren (oder allen) Detektionskanälen gemittelte Phasendifferenzmatrix gebildet werden. 4 zeigt eine solche Phasendifferenzmatrix. Es wurden beispielsweise 24 Pulsfrequenzen gemessen.For the compensation calculation, the control unit 6 preferably forms a matrix Δφ(f _pulse , λ) of phase difference values from the previously recorded n matrices, one coordinate of which indicates the pulse frequency at which the matrix column in question was recorded, and the second coordinate of which indicates the spectral support point, from which the matrix row in question comes. A separate phase difference matrix or a phase difference matrix averaged from several (or all) detection channels can therefore be formed for each detection channel. 4 shows such a phase difference matrix. For example, 24 pulse frequencies were measured.

Zur weiteren Auswertung wird der Steuereinheit 6 beispielsweise ein mathematisches Modell der zu ermittelnden Fluoreszenzlebensdauer(n) τ(_i) vorgegeben. Die Steuereinheit 6 optimiert das Modell dann gegenüber der gemessenen Phasenlagendifferenzmatrix über eine Ausgleichsrechnung durch Minimierung einer Fehlerfunktion zu einem (globalen) Minimum hin. Dabei können Fehlereinflüsse wie Aliasing einbezogen werden. Ein zu optimierender Startwert kann dabei vorgegeben werden. 5 zeigt ein (wellenlängenabhängiges) Ergebnis eines Auswertemodells einer Ausgleichsrechnung samt minimierter Abweichung χ_φ. Bei Mehrfach- und Multifluoreszenzvorgängen wird zusätzlich das vorgegebene optische Emissionsverhältnis, also eine dem Konzentrationsverhältnis der betreffenden Fluorophorsorten äquivalente Größe, in der Auswertung berücksichtigt und in die Optimierung des Modells der Fluoreszenzlebensdauer τ einbezogen. Als Lösungen ergeben sich eine oder mehrere Fluoreszenzlebensdauer(n) τ_(i) und deren Emissionsspektren, welche den Eigenschaften der Probe 2, also gegebenenfalls von Verpackung und Inhalt, entsprechen. Beispielsweise wird zur Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer bei der betreffende Emissionswellenlänge ein quasistabiler Zustand der Optimierung, in dem die Fehlerfunktion minimal ist, identifiziert und aus diesem Bereich die Fluoreszenzlebensdauer ermittelt. Der weitere Verlauf der Kurven kann zur Plausibilitätsbewertung des verwendeten Modells dienen, vorzugsweise bei der Kalibrierung der Steuereinheit 6.For further evaluation, the control unit 6 is given, for example, a mathematical model of the fluorescence lifetime(s) τ( _i ) to be determined. The control unit 6 then optimizes the model compared to the measured phase position difference matrix via a compensation calculation by minimizing an error function to a (global) minimum. Error influences such as aliasing can be taken into account. A starting value to be optimized can be specified. 5 shows a (wavelength-dependent) result of an evaluation model of a compensation calculation including minimized deviation χ _φ . In the case of multiple and multifluorescence processes, the specified optical emission ratio, i.e. a quantity equivalent to the concentration ratio of the relevant fluorophore types, is also taken into account in the evaluation and included in the optimization of the model of the fluorescence lifetime τ. The solutions are one or more fluorescence lifetime(s) τ _(i) and their emission spectra, which correspond to the properties of sample 2, i.e. possibly of the packaging and contents. For example, to determine the fluorescence lifetime at the emission wavelength in question, a quasi-stable state of the optimization in which the error function is minimal is identified and the fluorescence lifetime is determined from this range. The further course of the curves can serve to assess the plausibility of the model used, preferably when calibrating the control unit 6.

Die Ausgleichsrechnung wird genauer, wenn durch Kenntnisse von einzelnen Fluoreszenzvorgängen in der Probe, beispielsweise aus der Werkstofftechnik oder durch gezielte Leermessungen von Verpackungen, der (plausible) potentielle Lösungsraum eingeschränkt wird. Zur Minimierung von Messfehlern können zudem Messwerte aus Referenzmessungen, beispielsweise Hell- und Dunkelmessungen, zur Korrektur verwendet werden. Beispielsweise können eine oder mehrere Fluoreszenzlebensdauer(n) und/oder Phasendifferenzwert(e) aus einer oder mehreren Dunkelmessungen und/oder aus einer oder mehreren Messungen bekannter Stoffanteile der Probe 2, beispielsweise einer Fluoreszenzantwort der Leerverpackung, vorgegeben werden. Besonders vorteilhaft ist das bei Mehrfachbeziehungsweise Multifluoreszenzvorgängen in der Probe 2. Hierbei wird vorzugsweise die ermittelte Fluoreszenzlebensdauer der Leerverpackung und/oder des dominierenden Fluorophors fest vorgegeben und (eine) weitere Fluoreszenzlebensdauer(n) als Variable(n) im Auswertealgorithmus freigegeben. Bei der Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer(n) erfolgt eine Plausibilitätsprüfung über die Fehlerabweichungsfunktion.The compensation calculation becomes more precise if the (plausible) potential solution space is limited through knowledge of individual fluorescence processes in the sample, for example from materials technology or through targeted empty measurements of packaging. To minimize measurement errors, measured values from reference measurements, such as light and dark measurements, can also be used for correction. For example, one or more fluorescence lifetime(s) and/or phase difference value(s) can be specified from one or more dark measurements and/or from one or more measurements of known substance components of the sample 2, for example a fluorescence response of the empty packaging. This is particularly advantageous in the case of multiple or multifluorescence processes in the sample 2. Here, the determined fluorescence lifetime of the empty packaging and/or the dominant fluorophore is preferably predetermined and (an) additional fluorescence lifetime(s) as Variable(s) released in the evaluation algorithm. When determining the fluorescence lifetime(s), a plausibility check is carried out using the error deviation function.

Zusätzlich kann das Amplitudenspektrum (spektrale Intensität) des Probenlichts P von der Steuereinheit 6 ausgewertet werden. Zweckmäßigerweise wird zunächst die Emissionswellenlänge des dominierenden Fluorophors ermittelt. Anhand der Welligkeit des Amplitudenspektrums kann beispielsweise eine Anzahl von (möglichen) enthaltenen Fluoreszenzübergängen ermittelt werden. Für jeden Übergang wird dann durch das oben beschriebene Verfahren die Emissionswellenlänge und die zugehörige Fluoreszenzlebensdauer ermittelt. Aus diesen Werten kann ein chemometrisches Modell erstellt werden, dass in der Prozessmesstechnik angewendet werden kann, beispielsweise zu Prozesssteuerung oder -regelung.In addition, the amplitude spectrum (spectral intensity) of the sample light P can be evaluated by the control unit 6. It is expedient to first determine the emission wavelength of the dominant fluorophore. Based on the ripple of the amplitude spectrum, for example, a number of (possible) fluorescence transitions contained can be determined. The emission wavelength and the associated fluorescence lifetime are then determined for each transition using the method described above. From these values, a chemometric model can be created that can be used in process measurement technology, for example for process control or regulation.

Vorzugsweise erfolgt die Aufnahme des Probenlichts P von regulären Proben 2 mit identischer Integrationszeit und identischen Pulsfrequenzen wie bei einer Dunkelmessung und/oder einer Verpackungsleermessung. Wird zyklisch gemessen, beispielsweise zur Verringerung von Messfehlern, so erfolgt vorzugsweise die Mittelung der Messwerte des Probenlichts P von regulären Proben 2, beispielsweise der Phasendifferenzwerte, identisch wie bei einer Dunkelmessung und/oder einer Verpackungsleermessung.The sample light P is preferably recorded from regular samples 2 with identical integration times and identical pulse frequencies as in a dark measurement and/or an empty packaging measurement. If measurements are taken cyclically, for example to reduce measurement errors, the measured values of the sample light P from regular samples 2, for example the phase difference values, are preferably averaged in the same way as in a dark measurement and/or an empty packaging measurement.

Mit den beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen ist es möglich, Fluoreszenzvorgänge spektral aufzulösen und gleichzeitig über die Zeitauflösung Stoffe zu unterscheiden und Lösungsansätze bei unbekannten Fluorophorgemischen über eine Auswertung des Phasenganges zu ermitteln. Durch Erstellung eines chemometrischen Modells und (empirische) Kalibrierung des Modells für eine betreffende Applikation ist es möglich, die Konzentration eines oder mehrerer fluoreszierender Stoffe in Stoffgemischen zu bestimmen. Dabei wird mit dem gezeigten Referenzaufbau eine absolute Messgenauigkeit für Fluoreszenzlebensdauern im ns-Bereich von 0,1 ns und eine Standardabweichung kleiner 50 ps erreicht, die noch deutlich gesteigert werden kann. Die chemometrischen Modelle können durch zusätzliche Kalibrierungen nach Zugabe von „Quenchern“ zu den fluoreszierenden Stoffen mit noch höherer Genauigkeit erstellt werden. Mit den einmal erstellten chemometrischen Modellen ist der Einsatz in der Prozessmesstechnik zur Quantifizierung/Konzentrationsüberwachung und stofflichen Plausibilitätskontrolle, auch von verpackten Proben, kostengünstig und schnell möglich.With the methods and devices described, it is possible to resolve fluorescence processes spectrally and at the same time to differentiate between substances using the time resolution and to determine possible solutions for unknown fluorophore mixtures by evaluating the phase response. By creating a chemometric model and (empirically) calibrating the model for a relevant application, it is possible to determine the concentration of one or more fluorescent substances in mixtures of substances. The reference setup shown achieves an absolute measurement accuracy for fluorescence lifetimes in the ns range of 0.1 ns and a standard deviation of less than 50 ps, which can be significantly increased. The chemometric models can be created with even higher accuracy through additional calibrations after adding “quenchers” to the fluorescent substances. Once the chemometric models have been created, they can be used in process measurement technology for quantification/concentration monitoring and material plausibility control, even of packaged samples, quickly and cost-effectively.

Ein erster Nachweis der Messgenauigkeit des beschrieben Verfahrens und der beschriebenen Vorrichtungen erfolgte durch Analyse von fluoreszierenden Sicherheitsmerkmalen in Banknoten am Beispiel von 20€- und 50€-Noten. Dabei konnten die einzelnen Fluoreszenzlebensdauern von flächigen grünen und faserigen blauen Sicherheitsmerkmalen in räumlich eng beieinanderliegenden Bereichen nachgewiesen werden.A first proof of the measurement accuracy of the described method and the devices described was carried out by analyzing fluorescent security features in banknotes using the example of €20 and €50 notes. The individual fluorescence lifetimes of flat green and fibrous blue security features could be detected in areas that are spatially close to one another.

Ein zweiter Nachweis der Messgenauigkeit des beschrieben Verfahrens und der beschriebenen Vorrichtungen erfolgte durch den Nachweis der Fluoreszenzeigenschaften in mit Tonic-Getränk gefüllten Flaschen. Es wurde der Chinin-Anteil im Tonic-Getränk durch die ebenfalls fluoreszierende Verpackung (Polyethylen mit unbekannten Beimischungen) hindurch analysiert. Die Flaschen stellen dabei eine geschlossene Hülle um die gemessene Probe dar und sind Teil der Probe. Die (relevanten) Fluoreszenzlebensdauern und Emissionsspektren einerseits des Inhaltsstoffs Chinin und andererseits der Verpackung (Multifluoreszenzantwort) konnten aus dem überlagerten Emissionsspektrum bestimmt werden. Durch eine Messung der Leerverpackung als Referenzmessung konnte nachgewiesen werden, dass die Analyse der Multifluoreszenzvorgänge in der Probe zur richtigen Lösung für die Fluoreszenzlebensdauer des Chinins führt, wobei im allgemeinen Fall Vorkenntnissen aus den Materialeigenschaften die Plausibilität der gefundenen Lösung unterstützen können.A second proof of the measurement accuracy of the method and devices described was provided by detecting the fluorescence properties in bottles filled with tonic drinks. The quinine content in the tonic drink was analyzed through the fluorescent packaging (polyethylene with unknown admixtures). The bottles represent a closed shell around the measured sample and are part of the sample. The (relevant) fluorescence lifetimes and emission spectra of the ingredient quinine on the one hand and the packaging (multifluorescence response) on the other hand could be determined from the superimposed emission spectrum. By measuring the empty packaging as a reference measurement, it was possible to prove that the analysis of the multifluorescence processes in the sample leads to the correct solution for the fluorescence lifetime of the quinine, although in general, previous knowledge of the material properties can support the plausibility of the solution found.

Durch Zugabe von Quenchern, insbesondere Chloriden, beispielsweise NaCl - in dieser Applikation beispielsweise als Quencher für chemisch funktionelle Gruppen des Chinin -, konnte eine Veränderung der Fluoreszenzlebensdauer bewirkt und nachgewiesen werden. Die Erfindung erlaubt es, für eine konkrete Applikation ein jeweiliges Chemometriemodell zu erstellen, mit dem die Konzentration von Quencherstoffen in Proben durch zeitaufgelöste Spektroskopie ermittelt werden kann, und ermöglicht somit ein indirektes Messverfahren, beispielsweise für Qualitätsmerkmale einer Probe.By adding quenchers, especially chlorides, for example NaCl - in this application, for example, as a quencher for chemically functional groups of quinine - a change in the fluorescence lifetime could be brought about and detected. The invention allows a specific chemometric model to be created for a specific application, with which the concentration of quenching substances in samples can be determined by time-resolved spectroscopy, and thus enables an indirect measurement method, for example for quality characteristics of a sample.

Das beschriebene Verfahren und die die beschriebene Vorrichtung 1 stellen eine neue, kostengünstige und schnelle Form der optischen Qualitätskontrolle dar, die für direkte und indirekte Messungen geeignet ist.The method described and the device 1 described represent a new, cost-effective and rapid form of optical quality control that is suitable for direct and indirect measurements.

Ein besonders vorteilhafter Aspekt der Erfindung betrifft die Bestimmung des Reflexionsvermögens fluoreszierender Proben als Stoffeigenschaft, beispielsweise in Form eines Reflexionsgrads. Bekannt sind beispielsweise Grundlagen zur Bestimmung des (wellenlängenabhängigen) Reflexionsvermögens fluoreszierenden Proben bei der Prüfung von Papier und Pappe gemäß DIN 53145-2 :März 2000. In der Norm wird eine Messung mit hohem gerätetechnischen Aufwand beschrieben, der eine Vergleichsmessung erfordert und auch besondere Anforderungen an die Beleuchtung stellt. So ist zum Beispiel Anregungslicht unterhalb 400 nm durch Filter auszuschließen. Problematisch ist, dass das bei der Messung aufgenommene Spektrum auch zeitverzögert remittiertes Fluoreszenzlicht einschließt und so den resultierenden Reflexionsgrad verfälscht. 6 illustriert das Problem, das besonders bei spektral breitbandiger Beleuchtung, beispielsweise zwischen 350 nm und 800 nm, auftritt, was insbesondere bei weißen Proben wie Papier notwendig ist. Während der Emission des Beleuchtungslichts L antwortet die Probe mit Probenlicht P, das durch Fluoreszenzremission E stärker ist als das (hypothetische) ausschließlich auf Reflexion und Streuung beruhende Probenlicht T.A particularly advantageous aspect of the invention relates to the determination of the reflectivity of fluorescent samples as a material property, for example in the form of a reflectance. For example, the principles for determining the (wavelength-dependent) reflectivity of fluorescent samples when testing paper and cardboard are known DIN 53145-2 :March 2000. The standard describes a measurement that requires a lot of technical equipment requires comparative measurements and also places special demands on the lighting. For example, excitation light below 400 nm must be excluded using filters. The problem is that the spectrum recorded during the measurement also includes fluorescent light that is remitted with a time delay and thus distorts the resulting reflectance. 6 illustrates the problem that occurs particularly with spectrally broadband illumination, for example between 350 nm and 800 nm, which is particularly necessary for white samples such as paper. During the emission of the illuminating light L, the sample responds with sample light P, which, due to fluorescence reflectance E, is stronger than the (hypothetical) sample light T, which is based solely on reflection and scattering.

Durch die erfindungsgemäße Nutzung der zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung können die Nachteile der Messung nach DIN 53145-2 überwunden und eine schnelle, kostengünstige Messung ermöglicht werden: Bei der Ermittlung eines Reflexionsgrades einer Probe 2, insbesondere Papier, aus mittels einer Laufzeitkamera 4 gemessenen Intensitäts- und Phasendifferenzwerten kann es vorteilhaft sein, Intensitätswerte, deren zugehörige Phasendifferenzwerte einer reinen Reflexion in der Probe 2 entsprechen, zu verwerfen (nicht bei der Ermittlung des Reflexionsgrades zu verwenden). Die störende Fluoreszenzemission E kann auf diese Weise kompensiert werden. Phasendifferenzwerte, die einer reinen Reflexion/Streuung in der Probe entsprechen, können beispielsweise in einer Kalibriermessung an einem (vorzugsweise nahezu idealen) Reflektor (nicht abgebildet) als Kalibrierprobe ermittelt werden. Der dabei ermittelte maximale Phasendifferenzwert für das Verwerfen des betreffenden Intensitätswerts kann in einer regulären Messung als Vergleichsbedingung vorgegeben werden: Ist der zu einem Intensitätswert gehörende Phasendifferenzwert größer als der vorgegebene maximale Phasendifferenzwert, so wird der betreffende Intensitätswert (und der zugehörige Phasendifferenzwert) verworfen (nicht bei der Ermittlung der Stoffeigenschaft verwendet). Eine derartige Messung der Reflexion mittels zeitaufgelöster Spektroskopie ermöglicht Reflexionsmessungen ohne Fehleranteil durch Fluoreszenzemission E oder zumindest mit genau bekanntem Fehleranteil. Damit steht mit der zeitaufgelösten Spektroskopie ein neues, qualitativ besseres Messverfahren zur Verfügung.By using the time-resolved fluorescence measurement according to the invention, the disadvantages of the measurement according to DIN 53145-2 can be overcome and a quick, cost-effective measurement can be made possible: When determining a degree of reflectance of a sample 2, in particular paper, from intensity and phase difference values measured using a time-of-flight camera 4 can It may be advantageous to discard intensity values whose associated phase difference values correspond to a pure reflection in sample 2 (not to be used when determining the degree of reflectance). The disruptive fluorescence emission E can be compensated for in this way. Phase difference values that correspond to pure reflection/scattering in the sample can be determined, for example, in a calibration measurement on a (preferably almost ideal) reflector (not shown) as a calibration sample. The maximum phase difference value determined for discarding the relevant intensity value can be specified in a regular measurement as a comparison condition: If the phase difference value belonging to an intensity value is greater than the specified maximum phase difference value, the relevant intensity value (and the associated phase difference value) is rejected (not in used to determine the material properties). Such a measurement of reflection using time-resolved spectroscopy enables reflection measurements without an error component due to fluorescence emission E or at least with a precisely known error component. This means that time-resolved spectroscopy is a new, qualitatively better measurement method.

Alternativ zum Verwerfen von Messwerten in Abhängigkeit der Antwortzeit des Probenlichts kann ein gemessenes Reflexionsvermögen (Reflexionsgrad) einer Probe, insbesondere von Papier, durch Anpassen eines Modells einer Probe mit (mindestens) zwei Fluorophorsorten korrigiert werden, wobei für eine Sorte eine erste fiktive Fluoreszenzlebensdauer von Null vorgegeben wird. Sie stellt das von der Probe reflektierte/gestreute Anregungslicht dar. Sind in der Probe mehrere reale Fluorophorsorten enthalten, können diese im Modell näherungsweise als eine einzige (mit einer gemeinsamen zweiten Fluoreszenzlebensdauer) simuliert werden. Die reale/simulierte Fluorophorsorte in der Probe hat beispielsweise eine Lebensdauer von 2 ns, die zur Korrektur des gemessenen Reflexionsgrades zu ermitteln ist. Zu diesem Zweck wird die Probe wie oben beschrieben mit mindestens zwei verschiedenen Pulsfrequenzen beleuchtet und spektral aufgelöste Phasendifferenzwerte aufgenommen. Anhand der Phasendifferenzwerte wird das Modell mit den zwei unterschiedlichen Fluorophorsorten an die gemessenen Phasendifferenzwerte (und optional an die gemessenen Intensitätswerte) angepasst. Durch die Trennung in zwei Fluorophorsorten werden die Reflexion T und die Fluoreszenz E separiert, so dass der Reflexionsgrad korrigiert werden kann. Da sowohl eine breitbandig emittierende Lichtquelle als auch die Fluorophore komplexe Eigenschaften aufweisen und sich durch eine einzelne Fluoreszenzlebensdauer nur ungenau beschreiben lassen, wird die zweite Fluoreszenzlebensdauer vorzugsweise wellenlängenabhängig aus dem Modell ermittelt und das Reflexionsvermögen (Reflexionsgrad) entsprechend vorzugsweise wellenlängenabhängig korrigiert.As an alternative to discarding measured values depending on the response time of the sample light, a measured reflectivity (reflectance) of a sample, in particular of paper, can be corrected by adapting a model of a sample with (at least) two types of fluorophore, with a first fictitious fluorescence lifetime of zero for one type is specified. It represents the excitation light reflected/scattered by the sample. If the sample contains several real fluorophore types, these can be approximately simulated in the model as a single one (with a common second fluorescence lifetime). For example, the real/simulated fluorophore type in the sample has a lifetime of 2 ns, which must be determined to correct the measured reflectance. For this purpose, the sample is illuminated with at least two different pulse frequencies as described above and spectrally resolved phase difference values are recorded. Using the phase difference values, the model with the two different types of fluorophore is adapted to the measured phase difference values (and optionally to the measured intensity values). By separating into two types of fluorophore, the reflection T and the fluorescence E are separated so that the reflectance can be corrected. Since both a broadband emitting light source and the fluorophores have complex properties and can only be described inaccurately by a single fluorescence lifetime, the second fluorescence lifetime is preferably determined from the model in a wavelength-dependent manner and the reflectivity (reflectance) is corrected accordingly, preferably in a wavelength-dependent manner.

BezugszeichenlisteReference symbol list

11: MessvorrichtungMeasuring device
22: Probesample
33: Lichtquellelight source
44: LaufzeitkameraTime-of-flight camera
55: PulsgeberPulse generator
66: SteuereinheitControl unit
77: Lichtwellenleiteroptical fiber
88th: EintrittsspaltEntry gap
99: Dispersives ElementDispersive element
1010: Spektrometerspectrometer
EE: FluoreszenzemissionFluorescence emission
LL: Beleuchtende LichtpulseIlluminating light pulses
PP: ProbenlichtSample light
TT: Probenlicht aus ReflexionSample light from reflection
λλ: Wellenlängewavelength

Claims

Method for determining a material property, in particular a fluorescence lifespan, of a sample (2), the following steps being carried out: a) illuminating the sample (2) with light pulses (L) of a first pulse frequency, b) recording first phase difference values of sample light (P) spectrally split on a dispersive element (9) by means of a time-of-flight camera (4) synchronized with the light pulses (L). with a spatially resolving detector (4.1), c) illuminating the sample (2) with light pulses (L) of a second pulse frequency that is different from the first, d) recording second phase difference values of sample light (P) spectrally split at the dispersive element (9) by means of the time-of-flight camera (4) synchronized with the light pulses (L) and e) determining at least one material property based on first and second phase difference values.

Method according to the preceding claim, wherein a fluorescence quencher is introduced into the sample (2) before illuminating and recording.

Method according to one of the preceding claims, wherein a sample (2) is used which is surrounded by a closed shell, in particular a liquid sample, in particular using a fluorescence lifetime of an empty shell or a shell filled with a non-fluorescent substance to determine the substance property of the sample (2).

Method according to one of the preceding claims, wherein a manufacturing process for the sample (2) is controlled based on the determined material property.

Method according to one of the preceding claims, wherein a spatial distance of the sample (2) from the time-of-flight camera (4) is determined by means of the time-of-flight camera (4), in particular using the determined distance in determining a feature of the sample (2).

Method for determining a material property, in particular a reflectance, of a sample (2), in particular of paper, the following steps being carried out: a) illuminating the sample (2) with light pulses (L) using a light source (3), b) recording intensity values and associated phase difference values of sample light (P) spectrally split on a dispersive element (9) by means of a time-of-flight camera (4) synchronized with the light pulses and having a spatially resolving detector, c) identifying a subset of the intensity values whose associated phase difference values are smaller than a predetermined threshold value, and d) Determining the material property based on the subset of the intensity values.

Method according to one of the preceding claims, wherein the material property is determined by means of a compensation calculation, in particular while minimizing a deviation function, in particular deviation squares.

Method according to the preceding claim, wherein in the compensation calculation an adjustment of a predetermined or predeterminable mathematical model, which depends on illumination pulse frequencies and fluorescence wavelengths, is carried out to the determined phase difference values.

Method according to the preceding claim, wherein before the compensation calculation, the fluorescence lifetime of the dominant fluorophore type is first determined on the basis of the determined phase difference values or on the basis of phase difference values originating from an empty measurement of a packaging.

Procedure according to one of the Claims 7 until 8th , whereby a first fluorescence lifetime of zero is used in the compensation calculation and a second fluorescence lifetime is determined as a material property, in particular with subsequent determination of a reflectance based on the second fluorescence lifetime.

Method according to one of the preceding claims, wherein the illuminating light pulses have a sinusoidal or cosine-shaped intensity curve.

Method according to one of the preceding claims, wherein the light source (3) emits both in a wavelength range for stimulating fluorescence in the sample (2) and in a wavelength range of fluorescence.

Device (1) for determining a material property, in particular a fluorescence lifespan, of a sample (2), comprising a modulatable light source (3) for emitting light pulses (L), a spatially resolving time-of-flight camera (4), a pulse generator (5) with adjustable pulse frequency and a control unit (6), the light source (3) and the time-of-flight camera (4) being connected to the pulse generator (5) and a dispersive element (9) arranged in the beam path of the time-of-flight camera (4) for the spectrally resolved recording of sample light (P). is, characterized in that the control unit (6) is set up to carry out the following steps: a) setting the pulse generator (5) to emit pulses of a first pulse frequency, b) determining first phase difference values of sample light (P) using the time-of-flight camera (4 ), c) Setting the pulse generator (5) to deliver Pulsing a second pulse frequency that is different from the first, d) determining second phase difference values of sample light (P) using the time-of-flight camera (4) and e) determining at least one material property based on first and second phase difference values.

Device (1) for determining a material property, in particular a reflectance, of a sample (2), in particular of paper, comprising a modulatable light source (3) for emitting light pulses (L), a spatially-resolving time-of-flight camera (4), a pulse generator (5 ) and a control unit (6), the light source (3) and the time-of-flight camera (4) being connected to the pulse generator (5) and a dispersive element (9) in the beam path of the time-of-flight camera (4) for the spectrally resolved recording of sample light (P). ) is arranged, characterized in that the control unit (6) is set up to carry out the following steps: a) setting the pulse generator (5) to emit pulses, b) recording intensity values and associated phase difference values from the dispersive element (9) spectrally split sample light (P) using the time-of-flight camera (4), c) identifying a subset of the intensity values whose associated phase difference values are smaller than a predetermined threshold value, and d) determining at least one material property based on the subset of the intensity values.

Device according to one of the preceding device claims, wherein the time-of-flight camera (4) has a one-dimensional or two-dimensional field of photomixing detectors.

Device according to one of the preceding device claims, wherein the beam path of the time-of-flight camera (4) comprises at least one optical waveguide (7), the dispersive element (9) being arranged between the optical waveguide (7) and the time-of-flight camera (4).

Device according to one of the preceding device claims, wherein a second dispersive element (9) is arranged in the beam path of the time-of-flight camera (4), the dispersion direction of which is arranged at an angle other than zero to the dispersion direction of the first dispersive element (9).

Device according to one of the preceding device claims, wherein a part of each illuminating light pulse from the light source (3) reaches the time-of-flight camera (4) as a reference, in particular by means of a beam splitter and/or an optical waveguide (7).

Device according to one of the preceding device claims, comprising an additional, optoelectronic detector, wherein a part of each illuminating light pulse (L) of the light source (3) reaches the additional, optoelectronic detector, in particular by means of a beam splitter and / or an optical waveguide (7).

Control unit or computer program, set up to carry out a method according to one of the method claims.

Use of a device according to one of the device claims for identifying an object, in particular a banknote, in particular with identification of a fluorescent component of the object based on a fluorescence wavelength and/or a fluorescence lifetime.