DE10102218A1

DE10102218A1 - Measurement of chemical and/or biological samples, useful for screening interactions between two bio-molecules, comprises excitement of a marker with electromagnetic radiation of one wavelength or polarization from a pulsed transmitter

Info

Publication number: DE10102218A1
Application number: DE2001102218
Authority: DE
Inventors: Rolf Guenther; Leif Brand; Christian Eggeling; Karsten Gall; Claus Seidel
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2002-08-01

Abstract

To measure chemical and/or biological samples, using spectroscopy or microscopy and especially with luminescent spectroscopy, comprises at least one sample with a marker in a measurement volume which is exposed to electromagnetic radiation to excite the marker with at least two different wavelength ranges and/or polarizations. The marker transmits emission wavelength ranges which are detected. An independent claim is included for an apparatus to measure chemical and/or biological samples and especially by luminescent spectroscopy, with a pulsed transmitter (12) to give electromagnetic pulses in at least one wavelength range and/or polarization.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie.The invention relates to a method and an apparatus for Measuring chemical and / or biological samples using the Luminescence spectroscopy.

Als Meßverfahren für derartige Proben ist das Screening der Proben bekannt. Beim Screening wird die Wechselwirkung zwischen zwei Biomolekülen in Gegenwart einer Testsubstanz untersucht. Bei den Biomolekülen kann es sich beispielsweise um die Paare Ligand-Rezeptor, Substrat-Enzym, Protein-Protein oder Protein-DNA handeln. Dabei kann ein meßbares Signal entweder von den Biomolekülen selbst erzeugt werden, oder es müssen, wie in den meisten Fällen, Probenmarker an die Biomoleküle gebunden werden. Als Marker werden Stoffe eingesetzt, die Signale auf der Grundlage von Radioaktivität, Lumineszenz oder Absorption erzeugen. Bei der Verwendung von Farbstoffmarkern, die eine Lumineszenz erzeugen, werden die Farbstoffmarker durch elektromagnetische Strahlung, z. B. geeignetes Laserlicht, angeregt, so dass durch die elektromagnetische Strahlung ein Elektron auf ein höheres Energieniveau gehoben wird und der Farbstoffmarker durch Rückkehr des Elektrons auf das ursprüngliche Energie niveau Licht abgibt, d. h. luminesziert. Die Wahrscheinlichkeit der Rückkehr des Elektrons in das ursprüngliche Energieniveau und damit die Lumineszenzemission ist zeitlich exponentiell verteilt. Die mittlere Lebensdauer des angeregten Zustandes wird daher auch als Lumineszenzlebensdauer bezeichnet. Da lumineszierende Marker in den meisten Fällen nur geringfügigen Einfluß auf die Wechselwirkungen der Biomoleküle haben und im Vergleich zu anderen bekannten Markern äußerst empfindlich sind, ist der Einsatz von lumineszierenden Farbstoffmarkern be sonders vorteilhaft. Die Informationen über eine Reaktion zwischen den beiden Biomolekülen werden dadurch erhalten, dass die Veränderung des von den Farbstoffmarkern emittierten Lichts in Relation mit der Reaktion der Biomoleküle gesetzt wird.The screening method is the measuring method for such samples Samples known. When screening, the interaction between examined two biomolecules in the presence of a test substance. The biomolecules can be, for example, the pairs Ligand receptor, substrate enzyme, protein protein or Trade protein DNA. A measurable signal can either generated by the biomolecules themselves, or it must, like in most cases, sample markers bound to the biomolecules become. Substances are used as markers, the signals on based on radioactivity, luminescence or absorption produce. When using dye markers, the one Generate luminescence, the dye markers are generated by electromagnetic Radiation, e.g. B. suitable laser light, excited, so that an electron is due to the electromagnetic radiation a higher energy level is raised and the dye marker by returning the electron to the original energy emits level light, d. H. luminescent. The probability the return of the electron to the original energy level and thus the luminescence emission is exponential in time distributed. The average lifespan of the excited state is therefore also referred to as the luminescence lifetime. There luminescent markers in most cases only marginal Have an influence on the interactions of the biomolecules and in Extremely sensitive compared to other known markers are, the use of luminescent dye markers be particularly advantageous. The information about a reaction between the two biomolecules are obtained in that the change in the light emitted by the dye markers in relation to the reaction of the biomolecules.

In einem Beispiel eines Meßverfahrens wird ein Targetmolekül zuerst einem fluoreszierenden Reagenz als lumineszierendem Reagenz ausgesetzt, das die Fähigkeit hat, an das Targetmolekül zu binden. Ändert sich bei der Bindung die Fluoreszenzinten sität, so kann sie zur Quantifizierung der Bindung verwendet werden. In einem weiteren Experiment wird das Target sowohl dem fluoreszenzmarkierten Reagenz als auch einer einzelnen Substanz ausgesetzt. Wenn eine Bindung zwischen der Substanz und dem Target entsteht, wird das fluoreszenzmarkierte Reagenz durch die Substanz von dem Target getrennt. Hierdurch ändert sich das Verhältnis von gebundenen zu freien markierten Molekülen. Dies hat wiederum eine Veränderung der Fluoreszenzemission der Probe zur Folge und es kann ermittelt werden, ob und inwieweit sich eine Substanz an ein Target bindet. In one example of a measurement method, a target molecule first a fluorescent reagent as luminescent Exposed to reagent that has the ability to target the molecule to tie. The fluorescence inks change during binding tity, it can be used to quantify the binding become. In another experiment, the target is both the fluorescent labeled reagent as well as a single substance exposed. If there is a bond between the substance and the Target is created, the fluorescence-labeled reagent is through the substance is separated from the target. This changes that Ratio of bound to free labeled molecules. This again has a change in the fluorescence emission of the sample result and it can be determined whether and to what extent binds a substance to a target.

Zur Erhöhung der während einer Messung zu erhaltenden Informa tion können mehrere Marker, insbesondere zwei Farbstoffmarker, verwendet werden. In Abhängigkeit von der Anregungsenergie der zwei Farbstoffmarker werden zum Anregen der Farbstoffmarker zwei elektromagnetische Strahlungsquellen, z. B. Laser, unter schiedlicher Wellenlängen eingesetzt. Beispielsweise wird ein roter und ein grüner Farbstoffmarker in Kombination mit einem roten und einem grünen Laser eingesetzt. Bei der Verwendung von roten und grünen Farbstoffmarkern wurde festgestellt, dass die Intensität des von dem roten Farbstoffmarker abgegebenen Lichts bei Verwendung eines roten zusammen mit einem grünen Laser ge ringer ist als die Intensität des roten Farbstoffmarkers, wenn dieser ausschließlich mit rotem Laserlicht bestrahlt wird. Dieser Intensitätsverlust bringt einen Informationsverlust mit sich und führt zu verfälschten Ergebnissen.To increase the information to be obtained during a measurement tion, several markers, in particular two dye markers, be used. Depending on the excitation energy of the two dye markers are used to excite the dye markers two electromagnetic radiation sources, e.g. B. laser, under different wavelengths used. For example, a red and a green dye marker in combination with one red and a green laser. When using red and green dye markers, it was found that the Intensity of light emitted by the red dye marker when using a red together with a green laser is less than the intensity of the red dye marker, though this is only irradiated with red laser light. This loss of intensity brings with it a loss of information itself and leads to falsified results.

Dieses Phänomen kann auch bei der Verwendung von Farbstoff markern anderer Farben festgestellt werden.This phenomenon can also occur when using dye markers of other colors can be found.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrich tung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie zu schaffen, mit dem ver besserte Meßergebnisse erzielt werden können. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, eine Verbesserung der Meßergebnisse bei gemeinsam verwendeten roten und grünen Farbstoffmarkern zu erreichen.The object of the invention is a method and a Vorrich device for measuring chemical and / or biological samples Using luminescence spectroscopy to create ver better measurement results can be achieved. In particular is it is the object of the invention to improve the measurement results with shared red and green dye markers to reach.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch das Ver fahren gemäß Patentanspruch 1 bzw. durch die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 13. The object is achieved according to the invention by Ver drive according to claim 1 or by the device according to Claim 13.

Erfindungsgemäß kann eine Verbesserung der Meßergebnisse da durch erreicht werden, dass die zur Untersuchung von Proben verwendete elektromagnetische Strahlung zumindest in einem Wel lenlängenbereich und/oder zumindest einer Polarisation gepulst wird. Bei der Verwendung von beispielsweise elektromagnetischer Strahlung mit beispielsweise zwei unterschiedlichen Wellenlän genbereichen, wie beispielsweise rotem und grünem Laserlicht, strahlt das rote oder grüne Laserlicht kontinuierlich auf die Probe ein und das jeweils andere Laserlicht ist gepulst. Bei Verwenden von rotem und grünem Laserlicht ist vorzugsweise das grüne Laserlicht kontinuierlich und das rote Laserlicht ge pulst. Das durch eine gepulste Anregung verursachte Lumines zenzsignal weist einen charakteristischen zeitlichen Verlauf auf, wobei die Intensität nach der Anregung bis zur nächsten Anregung zeitlich abnimmt. Der zeitliche Verlauf einer ge pulsten Anregung ist somit zumindest in ausreichender Genauig keit bekannt. Die durch den anderen Wellenlängenbereich ange regten Farbmarker weisen einen kontinuierlichen Verlauf auf. Die beiden von der Probe abgegebenen Lumineszenzsignale sind somit auf Grund des unterschiedlichen zeitlichen Verlaufs von einander unterscheidbar.According to the invention, the measurement results can be improved be achieved by that for the examination of samples used electromagnetic radiation at least in one world lenlength range and / or at least one polarization pulsed becomes. When using, for example, electromagnetic Radiation with two different wavelengths, for example areas such as red and green laser light, the red or green laser light continuously shines on the Try in and the other laser light is pulsed. at Using red and green laser light is preferably that green laser light continuously and the red laser light ge pulses. The Lumines caused by a pulsed excitation zenzsignal has a characteristic temporal course on, the intensity after the excitation until the next Excitation decreases in time. The time course of a ge pulsed excitation is therefore at least sufficiently accurate known. The indicated by the other wavelength range excited color markers have a continuous course. The two luminescence signals emitted by the sample are thus due to the different time course of distinguishable from each other.

Es ist somit möglich, die Meßergebnisse durch das Pulsen einer Lichtquelle erheblich zu verbessern. Da beispielsweise beim Einsatz von zwei Laserlichtquellen Laserlicht unterschiedlicher Wellenlänge emittiert und nur eine der beiden Laserlichtquellen gepulst werden muss, handelt es sich um eine einfache und kostengünstige Veränderung der zur Durchführung des Verfahrens erforderlichen Vorrichtung. Insbesondere ist es vorteilhaft, bei vorstehendem Beispiel den roten Laser zu pulsen, da grüne gepulste Laser sehr kostenintensiv sind. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass zur Wahrnehmung der beiden von der Probe abgegebenen Lumines zenzsignale nur ein Detektor erforderlich ist.It is thus possible to measure the results by pulsing one Improve light source significantly. For example, when Use of two laser light sources different laser light Wavelength emitted and only one of the two laser light sources must be pulsed, it is a simple and inexpensive change of the procedure required device. In particular, it is advantageous to pulse the red laser in the example above, since the green one pulsed lasers are very expensive. Another advantage of the inventive method is that for Perception of the two lumines emitted by the sample only one detector is required.

Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch bei mehr als zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen einge setzt werden. Ebenso ist es möglich, anstelle unterschiedlicher Wellenlängenbereiche unterschiedliche Polarisationen der die Farbstoffmarker anregenden Strahlung zu verwenden. Ebenso kann eine Verbesserung der Meßergebnisse mit vorstehendem erfin dungsgemäßem Verfahren erreicht werden, wenn nur ein Farbstoff marker eingesetzt wird, da dieser beispielsweise durch Strah lung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder unter schiedlicher Polarisationen unterschiedlich angeregt wird und daher unterschiedliche Informationen erhalten werden können.Of course, the method according to the invention can also be used more than two different wavelength ranges be set. It is also possible to use different ones instead Wavelength ranges different polarizations of the Use dye markers to stimulate radiation. Likewise can an improvement of the measurement results with the above inventions Process according to the invention can be achieved if only one dye marker is used, since this is, for example, by means of strah different wavelength ranges and / or below different polarizations is excited differently and therefore different information can be obtained.

Die Erfindung beruht u. a. auf der Erkenntnis, dass ein roter Farbstoffmarker, der durch rotes Laserlicht angeregt wurde, von dem grünen Laserlicht zerstört werden kann. Die Zerstörung wird dadurch hervorgerufen, dass ein Elektron des roten Farbstoff markers durch das rote Laserlicht auf ein höheres Energieniveau gehoben wird und von dem grünen Laser weiter angeregt wird. Diese Anregung durch den grünen Laser führt zu einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Zerstörung des roten Farbstoffmark ers, z. B. durch Ionisierung. In den meisten Fällen ist diese Zerstörung irreversibel, d. h. der Farbstoffmarker kann nicht mehr zur Lumineszenzemission angeregt werden und ist für die weitere Messung verloren. Somit kommt es zu einer Verschlechte rung des Meßsignals. Dies gilt entsprechend auch für Farbstoff marker anderer Farben. The invention is based u. a. on the realization that a red Dye marker excited by red laser light from the green laser light can be destroyed. The destruction will caused by an electron of the red dye markers through the red laser light to a higher energy level is lifted and is further excited by the green laser. This excitation by the green laser leads to an increase the likelihood of destroying the red dye pulp first, e.g. B. by ionization. In most cases this is Irreversible destruction, d. H. the dye marker cannot are more stimulated to luminescence emission and is for the further measurement lost. This leads to a deterioration tion of the measurement signal. This also applies accordingly to dye markers of other colors.

Eine weitere erfindungsgemäße Verbesserung des Meßsignals kann in besonders bevorzugter Weise dadurch erreicht werden, dass die zur Untersuchung von Proben verwendete elektromagnetische Strahlung, wie beispielsweise das Laserlicht, gepulst wird und die elektromagnetische Strahlung mindestens zwei unterschied liche Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen aufweist, die zueinander zeitlich versetzt abgegeben werden. Das Pulsen erfolgt hierbei in mindestens zwei Wellenlängenbereichen bzw. Polarisationen. Die elektromagnetische Strahlung unterschied licher Wellenlängenbereiche und/oder unterschiedlicher Polari sationen trifft somit nacheinander auf der Probe auf. So ist z. B. die Gefahr der Zerstörung des Farbstoffmarkers dadurch verringert, dass der Strahlungsimpuls, der den Farbstoffmarker zerstören könnte, erst zu einem Zeitpunkt auftrifft, zu dem das angeregte Elektron sich mit hoher Wahrscheinlichkeit bereits wieder in seinem Ausgangszustand befindet.A further improvement of the measurement signal according to the invention can can be achieved in a particularly preferred manner in that the electromagnetic used to examine samples Radiation, such as the laser light, is pulsed and the electromagnetic radiation made at least two differences Liche wavelength ranges and / or polarizations, which are delivered at different times. The pulsing takes place in at least two wavelength ranges or Polarizations. The electromagnetic radiation differed Licher wavelength ranges and / or different polarities sations thus hit the sample one after the other. So is z. B. the risk of destroying the dye marker that reduces the radiation pulse that hits the dye marker could only destroy at a time when that excited electron with high probability already is back in its original state.

Durch das Pulsen der elektromagnetischen Strahlung in allen Wellenlängenbereichen und/oder beiden Polarisationen können weitere Verbesserungen der Meßergebnisse erreicht werden.By pulsing the electromagnetic radiation in all Wavelength ranges and / or both polarizations can further improvements in the measurement results can be achieved.

Eine Verbesserung der Meßergebnisse kann durch vorstehendes er findungsgemäßes Verfahren auch dann erreicht werden, wenn nur ein einzelner Farbstoffmarker in der Probe vorhanden ist. Dieser Farbstoffmarker wird durch die elektromagnetische Strah lung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder unter schiedlicher Polarisationen unterschiedlich angeregt. Bei spielsweise können unterschiedliche Polarisationen bei der emittierten Strahlung detektiert werden und damit Rückschlüsse auf die Rotationseigenschaften der Farbstoffmarker gezogen wer den. The measurement results can be improved by the above inventive method can also be achieved if only there is a single dye marker in the sample. This dye marker is through the electromagnetic beam different wavelength ranges and / or below different polarizations excited differently. at for example, different polarizations in the emitted radiation are detected and thus conclusions to the rotational properties of the dye marker the.

Unter Farbstoffmarker ist im Folgenden sowohl ein der Probe zu geführter Marker als auch ein der Substanz inhärenter Marker zu verstehen, d. h. Substanzen, die lumineszierende Eigenschaften besitzen. Lumineszenz umfaßt insbesondere auch Fluoreszenz und Phosphoreszenz.Below is one of the sample under dye marker fed marker as well as a marker inherent in the substance understand d. H. Substances that have luminescent properties have. Luminescence in particular also includes fluorescence and Phosphorescence.

Im Folgenden wird die Erfindung zunächst anhand der Verwendung elektromagnetischer Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlän genbereichen erläutert. Dies erfolgt zum besseren Verständnis anhand des Beispiels eines roten und eines grünen Farbstoff markers, die jeweils durch rotes bzw. grünes Laserlicht ange regt werden.In the following, the invention is first of all based on its use electromagnetic radiation with different wavelengths areas explained. This is done for better understanding using the example of a red and a green dye markers, each indicated by red or green laser light be stimulated.

Erfindungsgemäß wird das Laserlicht zur Anregung der Farbstoff marker, d. h. im erläuterten Beispiel das rote und das grüne Laserlicht, gepulst. Zusätzlich werden die Laserlichtimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche zueinander zeitlich ver setzt. Aufgrund des zeitlichen synchronisierten Versatzes der Impulse zueinander trifft zu einem Zeitpunkt stets nur entweder ein roter oder ein grüner Laserlichtimpuls auf die Probe auf. Bereits bei einem äußerst geringen zeitlichen Abstand des grünen Laserlichtimpulses von dem roten Laserlichtimpuls werden erheblich weniger rote Farbstoffmarker zerstört. Dies erhöht die Intensität bzw. die Zählrate des von den Farbstoffmarkern abgegebenen Lichts. Hierdurch können die Meßergebnisse deutlich verbessert werden.According to the invention, the laser light is used to excite the dye marker, d. H. in the example explained, the red and the green Laser light, pulsed. In addition, the laser light pulses of the individual wavelength ranges ver puts. Due to the temporally synchronized offset of the Pulses to each other only ever come at a time a red or a green laser light pulse on the sample. Even at an extremely short time interval from the green laser light pulse from the red laser light pulse significantly less red dye markers destroyed. This increases the intensity or the count rate of that of the dye markers emitted light. This allows the measurement results to be clear be improved.

Erfindungsgemäß wird daher bei der Verwendung von roten und grünen Farbstoffmarkern zuerst einer oder mehrere Lichtimpulse des roten Laserlichts und anschließend einer oder mehrere Lichtimpulse des grünen Laserlichts auf die Probe gerichtet. According to the invention, therefore, when using red and green dye markers first one or more light pulses the red laser light and then one or more Light pulses of the green laser light are aimed at the sample.

Zwischen dem letzten roten Lichtimpuls und dem ersten grünen Lichtimpuls besteht ein zeitlicher Abstand. Die Zeitspanne ist so gewählt, dass die Anregung der roten Farbstoffmarker im We sentlichen wieder abgeklungen ist, so dass die Elektronen des roten Farbstoffmarkers durch den grünen Laserlichtimpuls nicht aus einem erhöhten Energieniveau weiter angeregt und die roten Farbstoffmarker dabei zerstört werden können.Between the last red light pulse and the first green There is a time interval between the light pulse. The time span is chosen so that the excitation of the red dye markers in We has decayed considerably, so that the electrons of the red dye marker due to the green laser light pulse stimulated further from an increased energy level and the red ones Dye markers can be destroyed.

Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Laserlichtimpuls erst erzeugt, nachdem die Anregung des durch den vorherigen Laserlichtimpuls eines verschiedenen Wellenlän genbereichs angeregten Farbstoffmarkers im Wesentlichen abge klungen ist. Somit wird beispielsweise der grüne Laserlichtim puls erst auf die Probe geleitet, wenn die Anregung der durch rote Laserlichtimpulse angeregten Farbstoffmarker im Wesent lichen abgeklungen ist. Vorzugsweise wird der nächste Laser lichtimpuls erst dann auf die Probe abgegeben, wenn die Anre gung des zuvor angeregten Farbstoffmarkers um mindestens 90%, vorzugsweise um mindestens 95%, besonders bevorzugt um mindestens 98%, abgeklungen ist. Hierdurch werden die erzielbaren Meßergebnisse erheblich verbessert.A is preferably used in the method according to the invention Laser light pulse is generated only after the excitation of the the previous laser light pulse of a different wavelength gene range excited dye marker essentially abge is cleared. Thus, for example, the green laser light is pulse only passed to the sample when the excitation by red laser light pulses stimulated dye marker essentially lichen has subsided. Preferably the next laser The light pulse is only released onto the sample when the stim reduction of the previously excited dye marker by at least 90%, preferably by at least 95%, particularly preferably by at least 98% has subsided. This will make the achievable measurement results significantly improved.

Der notwendige zeitliche Versatz zweier aufeinanderfolgender Lichtimpulse verschiedener Wellenlängenbereiche ist abhängig von der Lumineszenzlebensdauer des verwendeten Farbstoff markers. Für einen Farbstoffmarker mit der Lebensdauer 3 ns be trägt der notwendige zeitliche Versatz mindestens 2 ns, vor zugsweise mindestens 7 ns. Bei der Lebensdauer 1 ns beträgt er mindestens 0,7 ns, vorzugsweise mindestens 2,3 ns. Dabei können Pulse mit unterschiedlichen Intensitäten eingesetzt werden, dies gilt auch für nicht-lumineszente Anregungen. Bei Verwen dung eines roten und eines grünen Laserlichts ist der Abstand eines auf einen roten Laserlichtimpuls folgenden grünen Laser lichtimpulses maßgebend, da ein zu früh oder gleichzeitig mit dem roten Laserlichtimpuls abgegebener grüner Laserlichtimpuls zur Zerstörung der roten Farbstoffmarker führen kann. Der Ab stand eines auf einen grünen Laserlichtimpuls folgenden roten Laserlichtimpulses ist hingegen unerheblich, da der grüne Farbstoffmarker durch den roten Laserlichtimpuls nicht zerstört wird. Es muß in diesem Fall somit lediglich sichergestellt sein, dass die beiden Impulse nicht gleichzeitig erfolgen.The necessary temporal offset of two successive ones Light pulses of different wavelength ranges are dependent on the luminescence lifetime of the dye used markers. For a dye marker with a lifespan of 3 ns the necessary time offset is carried out at least 2 ns preferably at least 7 ns. With a lifespan of 1 ns at least 0.7 ns, preferably at least 2.3 ns. You can Pulses with different intensities are used, this also applies to non-luminescent suggestions. When used The use of a red and a green laser light is the distance a green laser following a red laser light pulse light pulse is decisive, because one too early or at the same time the red laser light pulse emitted green laser light pulse can destroy the red dye markers. The Ab stood a red one following a green laser light pulse Laser light pulse, however, is irrelevant because the green one Dye markers are not destroyed by the red laser light pulse becomes. In this case, it only has to be ensured be that the two impulses do not occur simultaneously.

Die Impulsfrequenz des Laserlichts beträgt für Fluoreszenzanre gung vorzugsweise 20-100 MHz, insbesondere 60-80 MHz. Die Impulsfrequenzen der einzelnen Laserlichtbereiche sind hierbei vorzugsweise identisch, so dass die Abstände zwischen aufeinan derfolgenden Laserlichtimpulsen verschiedener Wellenlängenbe reiche über die Zeit konstant bleiben.The pulse frequency of the laser light is for fluorescence excitation supply preferably 20-100 MHz, in particular 60-80 MHz. The Pulse frequencies of the individual laser light areas are here preferably identical, so that the distances between each other the following laser light pulses of different wavelengths rich remain constant over time.

Die Reihenfolge der auf die Probe abgegebenen Laserlichtimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche ist vorzugsweise repe tierend. Bei der Verwendung von beispielsweise drei Lasern mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen wird somit zuerst von dem ersten, dann von dem zweiten, anschließend von dem dritten und sodann wieder von dem ersten usw. Laser ein Lichtimpuls auf die Probe abgegeben. Bei der Verwendung von zwei Lasern, bei spielsweise einem roten und einem grünen Laser, werden die Laserlichtimpulse vorzugsweise abwechselnd erzeugt.The order of the laser light pulses emitted on the sample of the individual wavelength ranges is preferably repe tierend. When using, for example, three lasers with different wavelength ranges is therefore the first of the first, then the second, then the third and then again a light pulse from the first etc. laser given the sample. When using two lasers, at for example a red and a green laser, the Laser light pulses are preferably generated alternately.

Entsprechend den vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausfüh rungsformen der Erfindung anhand der Verwendung von Laserlicht und der erfindungsgemäß erzeugten Laserlichtimpulse wird der gleiche erfindungsgemäße Effekt bei Verwendung anderer elektro magnetischer Strahlen, wie beispielsweise Licht im sichtbaren oder nicht sichtbaren Wellenlängenbereich, hervorgerufen. Ent sprechende Strahlungsimpulse rufen denselben erfinderischen Ef fekt wie Laserlichtimpulse hervor. Ebenso ist es bei den vor stehend beschriebenen Ausführungen möglich, eine Probe mit nur einem Farbstoffmarker zu verwenden. Dieser eine Farbstoffmarker wird durch Strahlungsimpulse unterschiedlicher Wellenlängenbe reiche unterschiedlich angeregt, wobei die emittierte Strahlung in Abhängigkeit des Wellenlängenbereichs der anregenden Strah lung unterschiedlich ist oder sein kann.According to the preferred embodiment described above Forms of the invention based on the use of laser light and the laser light pulse generated according to the invention is the same effect according to the invention when using other electro magnetic rays, such as light in the visible or invisible wavelength range. Ent speaking radiation pulses call the same inventive Ef like laser light pulses. It is the same with the previous ones possible versions described above, a sample with only to use a dye marker. This one dye marker is caused by radiation pulses of different wavelengths rich excited differently, the emitted radiation depending on the wavelength range of the exciting beam lung is or can be different.

Es besteht auch die Möglichkeit, verschiedene Impulsfrequenzen gemeinsamer Vielfacher zu verwenden (z. B. 40 MHz und 80 MHz). Es ist dann immer noch ein konstanter zeitlicher Versatz zwischen den beiden Laserlichtimpulsen gewährleistet. Von Vorteil ist dies, wenn einer der beiden Laser, z. B. der rote Laser, leistungsschwächer ist. Da die Intensität der Lumineszenzemission proportional zu der Anregungsleistung ist, kann dann durch eine z. B. um die Hälfte reduzierte Impulsfrequenz des grünen Lasers (z. B. 40 MHz) gegenüber dem roten Laser (z. B. 80 MHz) eine vergleichbare Intensität der Lumineszenzemission des roten und des grünen Farbmarkers erreicht werden. Denn trotz der geringeren Anregungsleistung wird der rote Farbmarker doppelt so oft angeregt.There is also the possibility of different pulse frequencies to use common multiples (e.g. 40 MHz and 80 MHz). Then it is still a constant time offset guaranteed between the two laser light pulses. Of This is an advantage if one of the two lasers, e.g. B. the red Laser that is less powerful. Because the intensity of the Luminescence emission is proportional to the excitation power, can then by a z. B. reduced by half Pulse frequency of the green laser (e.g. 40 MHz) compared to the red laser (e.g. 80 MHz) a comparable intensity of Luminescence emission of the red and green color markers can be achieved. Because despite the lower excitation power the red color marker is excited twice as often.

Das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz von zwei oder mehr gepulsten elektromagnetischen Strahlen unterschiedlicher Wel lenlängenbereiche bietet eine Vielzahl von Anwendungsmöglich keiten im Bereich der Transienten-Spektroskopie, wie beispiels weise der Transienten-Absorptions-Spektroskopie (TRABS). Bei spielsweise ist eine spezielle Anwendung zum Multiplexen über verschiedene Farbmarker mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich. Beispielsweise werden beim Verwenden von zwei gepulsten Laserlichtquellen sämtliche Farbmarker durch den ersten Laserlichtimpuls angeregt. Der zweite, zeitlich versetzte Laserlichtimpuls sättigt oder photozerstört selektiv bestimmte Farbmarker oder fluoreszente Verunreinigungen. Hierdurch kann eine kontrollierte Erniedrigung von Fluoreszenzsignalen er reicht werden und es können bestimmte Farbmarker bevorzugt oder unterscheidbar gemacht werden. Es ist möglich, anstelle von Zeitimpulsen mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen auch mehrere zeitlich zueinander versetzte Impulse in unter schiedlichen Wellenlängenbereichen einzusetzen, wobei die ein zelnen Wellenlängenbereiche derart gewählt sind, dass bestimmte Farbmarker gesättigt oder photozerstört werden.The method according to the invention using two or more pulsed electromagnetic rays from different worlds length ranges offers a multitude of possible applications in the field of transient spectroscopy, such as way of transient absorption spectroscopy (TRABS). at for example, is a special application for multiplexing over different color markers with the inventive method possible. For example, if two are used, they are pulsed Laser light sources all color markers through the first Laser light pulse stimulated. The second, staggered Laser light pulse saturates or selectively destroys certain photos Color markers or fluorescent contaminants. This can a controlled reduction in fluorescence signals be enough and certain color markers can be preferred or be made distinguishable. It is possible instead of Time pulses with different wavelength ranges too several impulses staggered in time in below use different wavelength ranges, the one individual wavelength ranges are selected such that certain Color markers become saturated or photo destroyed.

Entsprechende Ergebnisse wie bei der Verwendung von unter schiedlichen Wellenlängenbereichen können auch durch unter schiedliche Polarisationen der elektromagnetischen Strahlen er reicht werden. So können beispielsweise anstelle eines roten und grünen Lasers entsprechende Meßergebnisse mit senkrecht und parallel polarisiertem Licht erreicht werden, mit denen eben falls Aussagen über den untersuchten Stoff getroffen werden können.Similar results as when using below Different wavelength ranges can also be found under different polarizations of the electromagnetic rays be enough. For example, instead of a red and green laser corresponding measurement results with vertical and parallel polarized light can be achieved with just if statements are made about the investigated substance can.

Der Wellenlängenbereich eines verwendeten grünen Laserlichts beträgt vorzugsweise 480-550 nm, besonders bevorzugt 485- 535 nm. Der Wellenlängenbereich eines roten Lasers beträgt vor zugsweise 630-690 nm, besonders bevorzugt 635-655 nm. Als mögliche grüne Laserlichtquellen kommen bevorzugt hochwertige Argonionenlaser mit monochromatischer Anregung bei 488 nm, 496 nm, 502 nm, 515 nm, 528 nm oder Nd:YAG-Laser mit monochroma tischer Anregung bei 492 nm oder 532 nm in Frage. Rote Laser lichtquellen sind bevorzugt Kryptonlaser mit monochromotnatischer Anregung bei 647 nm, sowie rote Laserdioden, die für ver schiedene Anregungswellenlängen erhältlich sind.The wavelength range of a green laser light used is preferably 480-550 nm, particularly preferably 485- 535 nm. The wavelength range of a red laser is before preferably 630-690 nm, particularly preferably 635-655 nm. As possible green laser light sources are preferred high quality ones Argon ion laser with monochromatic excitation at 488 nm, 496 nm, 502 nm, 515 nm, 528 nm or Nd: YAG laser with monochrome table excitation at 492 nm or 532 nm in question. Red lasers Light sources are preferably krypton lasers with monochromatic ones Excitation at 647 nm, as well as red laser diodes, which are used for ver different excitation wavelengths are available.

Häufig angewendete Methoden unter Benutzung von zwei Farbstoff markern mit zwei Lasern unterschiedlicher Farbe sind Koinzidenzanalysen, die hier anhand der Fluoreszenz vorgestellt werden. Dabei kann festgestellt werden, inwieweit die Farb stoffmarker gleichzeitig oder getrennt vorkommen, d. h. inwie weit sie an einem gemeinsamen Reagenz oder an zwei getrennten Reagenzien gebunden sind. Dabei wird ausgenutzt, dass im Fall des gleichzeitigen Vorkommens das Fluoreszenzlicht beider Far ben immer zur gleichen Zeit detektiert wird, während im Fall des getrennten Vorkommens die Detektion des Fluoreszenzlichts von beiden Farben zeitlich willkürlich verteilt ist. Dies sei wiederum am Beispiel von rot und grün erläutert. Ein speziel ler Fall der Koinzidenzanalyse ist die Kreuzkorrelationsana lyse. Hierbei werden die zeitlichen Fluktuationen des Fluoreszenzlichts des einen Farbstoffmarkers, F_grün(t), auf einem, die des anderen Farbstoffmarkers, F_rot(t), auf einem zweiten Detektor registriert. Die Kreuzkorrelationsfunktion, G(t_c), wird über diese Fluktuationsspuren berechnet.
Commonly used methods using two dye markers with two lasers of different colors are coincidence analyzes, which are presented here on the basis of fluorescence. It can be determined to what extent the dye markers occur simultaneously or separately, ie to what extent they are bound to a common reagent or to two separate reagents. This takes advantage of the fact that in the event of simultaneous occurrence, the fluorescent light of both colors is always detected at the same time, while in the case of separate occurrence, the detection of the fluorescent light from both colors is randomly distributed over time. This is again explained using the example of red and green. Cross correlation analysis is a special case of coincidence analysis. Here, the temporal fluctuations of the fluorescent light of one dye marker, F _green (t), on one, that of the other dye marker, F _red (t), are registered on a second detector. The cross correlation function, G (t _c ), is calculated using these fluctuation traces.

Zu einer Kreuzkorrelationsfunktion ungleich Null kommt es nur, wenn die Fluoreszenzlichter der beiden Farbstoffmarker zeitlich verknüpft ("korreliert") sind. Dies ist nur der Fall, wenn sie an einem gemeinsamen Reagenz gebunden sind. Die Amplitude der Kreuzkorrelationsfunktion, G(t_c = 0), läßt eine direkte Aussage über die Konzentration, c_grün+rot, dieses zweifach farbmarkierten Reagenzes im Vergleich zu den Konzentrationen, c_grün und c_rot, der einfach markierten Reagenzien zu (c_grün und c_rot können dabei durch andere Analyseverfahren bestimmt werden).
A non-zero cross-correlation function only occurs if the fluorescent lights of the two dye markers are temporally linked ("correlated"). This is only the case if they are bound to a common reagent. The amplitude of the cross-correlation function, G (t _c = 0), allows a direct statement about the concentration, c _{green + red} , of this double-color-labeled reagent compared to the concentrations, c _green and c _red , of the single-labeled reagents (c _green and c _red can be determined by other analysis methods).

Durch die bereits erwähnte Zerstörung des roten Farbstoff markers kommt es zu einer ungewollten Verringerung der Konzen trationen, c_grün+rot, des zweifach farbmarkierten Reagenzes (und crot, des rot markierten Reagenzes) und damit zu einer Abnahme der Kreuzkorrelationsamplitude, G(t_c = 0). Eine Analyse dieser Art eines biologischen Systems durch die Kreuzkorrelation würde in diesem Fall zu verfälschten Ergebnissen führen und die tatsächliche biologische Konzentration des zweifach farbmarkierten Reagenzes, C_grün+rot, unterschätzen. Daher werden erfindungsgemäß der rote und grüne Laserlichtimpuls zueinander zeitlich verschoben. Durch das Verhindern der Zerstörung des roten Farbstoffmarkers wird dieser nachteilige Einfluß auf die Korrelationsamplitude unterbunden und eine unverfälschte Kreuzkorrelations- oder Koinzidenzanalyse erzielt.The destruction of the red dye marker already mentioned leads to an unwanted reduction in the concentrations, c _{green + red} , of the double-colored reagent (and crot, of the red reagent) and thus a decrease in the cross-correlation amplitude, G (t _c = 0). In this case, an analysis of this type of biological system by cross-correlation would lead to falsified results and underestimate the actual biological concentration of the double-color-labeled reagent, C _{green + red} . Therefore, according to the invention, the red and green laser light pulses are shifted in time from one another. By preventing the red dye marker from being destroyed, this disadvantageous influence on the correlation amplitude is prevented and an unadulterated cross-correlation or coincidence analysis is achieved.

Ein weiteres Problem bei Meßmethoden unter Verwendung von zwei Farbstoffmarkern mit zwei Lasern unterschiedlicher Farbe ist das Übersprechen der Lumineszenzsignale der beiden Farbstoff marker. Dies soll am Beispiel der Fluoreszenz erläutert werden. Die Absorptions- und Emissionsspektren von Fluoreszenzfarb stoffen sind relativ breit, d. h. sie erstrecken sich über einen relativ großen Wellenlängenbereich, und können sich überlappen. Dadurch kann es zu folgenden Problemen kommen, die keine ein deutige Zuordnung des Fluoreszenzlichts zu einem bestimmten Farbstoffmarker oder Anregungslaser zulassen - z. B. können sie zu Verfälschungen in der Kreuzkorrelationsfunktion führen. Sie seien wiederum an dem Beispiel von rot und grün erläutert:
Another problem with measurement methods using two dye markers with two lasers of different color is the crosstalk of the luminescence signals of the two dye markers. This will be explained using the example of fluorescence. The absorption and emission spectra of fluorescent dyes are relatively wide, ie they extend over a relatively large wavelength range, and can overlap. This can lead to the following problems, which do not allow a clear assignment of the fluorescent light to a specific dye marker or excitation laser - e.g. B. they can lead to falsifications in the cross-correlation function. They are again explained using the example of red and green:

a) the fluorescent light of the red dye marker can be also stimulate (diminished) by the green laser - it there is an overlap between the green and the red Laser excited red fluorescent light;
b) a (small) part of the fluorescent light of the green Dye markers overlap with the red fluorescent light ("crosstalk") - there is an overlay between emitted by the green and red dye marker Fluorescent light on the red radiation detector;
c) the fluorescent light of the red dye marker can not only from the red laser, but also over (Resonance energy transfer) from that of the green laser excited green dye markers are generated - similar Lich as in case i) there is an overlay between from red and indirectly via energy transfer from green laser excited red fluorescent light.

Es ist Sinn dieser Erfindung, durch die zeitliche Verschiebung der roten und grünen Laserlichtimpulse zueinander dieses Über sprechen der Fluoreszenzsignale zu unterbinden. Das vom grünen und roten Laser angeregte Fluoreszenzlicht läßt sich dann zeit lich trennen und erlaubt eine eindeutige Zuordnung, wie an den drei. Problemfällen erläutert werden kann: Nach dem grünen Laserlichtimpuls erfolgt nur die Detektion des Anteils vom grünen Farbstoffmarker ("crosstalk") oder vom direkt oder indi rekt über Energietransfer angeregten roten Farbstoffmarker im roten Fluoreszenzlicht. Folgt nach dem Abklingen dieser Fluoreszenz der rote Laserlichtimpuls, so enthält das rote Fluoreszenzlicht nur Anteile von dem direkt durch den roten Laser angeregten roten Farbstoffmarker. Ist wiederum der grüne Laser auf das Abklingen dieser Fluoreszenz zeitlich abgestimmt, so kann das Fluoreszenzlicht eindeutig den Farbstoffmarkern bzw. anregenden Lasern zugeordnet werden. Hierdurch ist z. B. eine unbeeinflußte Kreuzkorrelationsanalyse möglich.It is the point of this invention, due to the time shift the red and green laser light pulses to each other this over speak to prevent the fluorescence signals. The green one and red laser-excited fluorescent light can then be taken separate and allows a clear assignment, as on the three. Problem cases can be explained: After the green Laser light pulse only detects the portion of the green dye marker ("crosstalk") or direct or indi red dye marker stimulated by energy transfer in the red fluorescent light. After this subsides, this will follow The red laser light pulse contains fluorescence, so the red one Fluorescent light only shares from that directly through the red one Laser excited red dye marker. It's the green one again Laser timed for the decay of this fluorescence, so the fluorescent light can clearly mark the dye or stimulating lasers. This makes z. B. an unaffected cross-correlation analysis possible.

Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung der zeitlichen Ver schiebung von zwei Laserlichtimpulsen ist die Detektion unter schiedlicher Polarisationen des Lumineszenzlichts - im Folgen den nur auf Fluoreszenzlicht bezogen - eines Farbstoffmarkers, mit nur einem Detektor. In üblichen Meßmethoden zur Aufnahme verschiedener Polarisationen des Fluoreszenzlichts wird der Farbstoffmarker mit einem in einer bestimmten Ebene X polari sierten Laser angeregt und der zu X parallele und senkrechte Polarisationsanteil des Fluoreszenzlichts entweder durch den Einsatz eines Polarisations-Strahlteilers gleichzeitig auf zwei verschiedenen Detektoren oder durch den zeitlichen Wechsel der. Transmissionsrichtung eines Polarisationsfilters zeitlich ge trennt (mehrere Sekunden) auf einem Detektor registriert. Da durch können Rückschlüsse auf die Rotationseigenschaften der untersuchten Farbstoffmarker gezogen werden. Sinn dieser Erfin dung ist es nun, zeitlich getrennte Fluoreszenzsignalpulse (- abklingpulse) unterschiedlicher Polarisation durch zwei zeit lich getrennte, in der Ebene X und in der dazu senkrechten Ebene Y polarisierte Laserpulse, zu erzeugen (dies ist sogar mit nur einem Laser unter Aufspaltung erreichbar). Erfolgt die Detektion auf einem einzigen Detektor mit einem Polarisations filter mit konstanter Transmissionsrichtung, so kann eine ver gleichbare Detektion der zu der Polarisationsebene des Lasers parallelen und senkrechten Komponente des Fluoreszenzlichts erfolgen: die Transmissionsrichtung des Polarisationsfilters sei dabei die Ebene X; erfolgt der erste Laserlichtimpuls mit einer Polarisation ebenfalls in der Ebene X, so wird darauffolgend der zu der Polarisationsebene des Lasers parallel polarisierte Anteil des Fluoreszenzlichts detektiert; nach Abklingen dieser Fluoreszenz erfolgt der zweite Laserlichtimpuls mit einer Pola risation in der zur Ebene X senkrechten Ebene Y; darauffolgend wird nur der zu der Polarisationsebene des Lasers senkrecht po larisierte Anteil des Fluoreszenzlichtes detektiert; nach des sen Abklingen wird wieder ein Laserlichtimpuls mit Polarisation in der Ebene X eingestrahlt; usw. Diese Detektion der beiden Polarisationsanteile erfolgt dabei nahezu zeitgleich, da die zeitliche Verzögerung der beiden Laserlichtpulse nur auf das Abklingen des Fluoreszenzlichts, welche im Bereich der Fluores zenzlebensdauer der Farbstoffmarker, üblicherweise zwischen 1- 4 ns liegt, begrenzt ist. Diese "zeitgleiche" Detektion der beiden Polarisationen ist damit unter geringem Materialaufwand mit nur einem Detektor und einem Laser erreichbar und so in jeglichen Anwendungen für Fluoreszenz-Anisotropie und -Polarisationsmessungen von großem Interesse.Another application of the temporal ver shift of two laser light pulses is the detection under different polarizations of the luminescent light - in the following related only to fluorescent light - a dye marker, with only one detector. In usual measurement methods for recording different polarizations of the fluorescent light Dye marker with an X polar in a certain plane laser and the one parallel and perpendicular to X. Polarization component of the fluorescent light either through the Use of a polarization beam splitter on two at the same time different detectors or by changing the time. Direction of transmission of a polarization filter in time separates (several seconds) registered on a detector. because can draw conclusions on the rotational properties of the examined dye markers are drawn. Sense of this inven it is now time to separate fluorescence signal pulses (- decay pulses) of different polarization through two times Lich separated, in the plane X and in the perpendicular to it Plane Y to generate polarized laser pulses (this is even accessible with only one laser with splitting). Does that happen Detection on a single detector with one polarization filter with constant transmission direction, so a ver comparable detection of the to the polarization plane of the laser parallel and vertical components of the fluorescent light take place: is the transmission direction of the polarization filter the plane X; the first laser light pulse takes place with a Polarization also in the X plane, so it follows which polarized parallel to the plane of polarization of the laser Portion of the fluorescent light detected; after this subsides The second laser light pulse with a pola occurs under fluorescence rization in the plane Y perpendicular to the plane X; subsequently only the po perpendicular to the polarization plane of the laser larized portion of the fluorescent light detected; after the The decay will again be a laser light pulse with polarization radiated in the plane X; etc. This detection of the two Polarization components take place almost simultaneously, since the time delay of the two laser light pulses only on that Decay of the fluorescent light in the area of the fluorescence the lifetime of the dye marker, usually between 1- 4 ns is limited. This "simultaneous" detection of the both polarizations is thus with little material accessible with only one detector and one laser and so in any applications for fluorescence anisotropy and -Polarization measurements of great interest.

In ähnlicher Art und Weise kann durch den zeitlichen Versatz von rotem und grünem Laser eine nur um ns zeitversetzte, "zeitgleiche" Detektion von rotem und grünem Lumineszenzsignal auf nur einem Detektor ermöglicht werden.In a similar way, due to the time offset of red and green lasers is only shifted by ns, "Simultaneous" detection of red and green luminescence signals be made possible on only one detector.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es somit möglich, eine Zwei-Farben-Kreuzkorrelationsanalyse mit nur einem Detektor durchzuführen.The method according to the invention thus makes it possible to obtain a Two-color cross-correlation analysis with only one detector perform.

Zur Erzielung besonders guter Meßergebnisse bei der Verwendung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen wird vorzugsweise ein hochempfindliches konfokales Mikroskop eingesetzt.To achieve particularly good measurement results when used different wavelength ranges and / or polarizations is preferably a highly sensitive confocal microscope used.

Eine weitere vorteilhafte Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in Analysen unter Verwendung des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET). Bei FRET-Analysen von, chemischen und/oder biologischen Proben wird der Effekt ausgenutzt, dass die Anregungsenergie eines zuvor mit einer bestimmten Wellenlänge angeregten Stoffs (Donor) die Lumineszenz eines anderen Stoffs (Akzeptor) hervorrufen kann. Der Akzeptor wird somit zusätzlich oder ausschließlich durch von dem Donor abgegebene Energie angeregt (Energietransfer). Die Effektivität dieses Energietransfers ist extrem abhängig von dem räumlichen Abstand und der räumlichen Orientierung zwischen Donor und Akzeptor, so dass z. B. Abstandsveränderungen zwischen diesen beiden Stoffen sehr effektiv mit FRET untersucht werden können.Another advantageous application of the The method according to the invention consists in analyzes under Using fluorescence resonance energy transfer (FRET). For FRET analysis of chemical and / or biological samples the effect is exploited that the excitation energy of a previously excited with a certain wavelength (Donor) the luminescence of another substance (acceptor) can cause. The acceptor becomes additional or excited only by energy given off by the donor (Energy transfer). The effectiveness of this energy transfer is extremely dependent on the spatial distance and the spatial Orientation between donor and acceptor, so that e.g. B. Distance changes between these two substances very much can be effectively examined with FRET.

Aufgrund der primären Anregung des Donors wäre es diesem prinzipiell möglich, Lumineszenzlicht abzugeben. Durch den Energietransfer ist dieses jedoch abgeschwächt bzw. nicht mehr vorhanden (gelöscht) und somit nicht detektierbar. Direkte Veränderungen des Donor-Stoffs, die normalerweise direkt durch dessen Lumineszenzlicht aufgedeckt werden können, sind nun nur noch indirekt über Veränderungen in der FRET-Effektivität beobachtbar. Wie bereits angedeutet, hängt diese jedoch noch von anderen Faktoren (wie z. B. Donor-Akzeptor-Abstand) ab. Die Möglichkeit, das Lumineszenzlicht des Donors zusätzlich beobachten zu könne, würde eine. Unterscheidung der verschiedenen Effekte ermöglichen. Wird bei dem Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielsweise zunächst eine Probe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge gepulst oder kontinuierlich bestrahlt, so kommt es zu einer Sättigung der entsprechenden Farbmarker, d. h. zur Anregung von den meisten dieser Farbmarker. Ein Lichtimpuls einer zweiten Wellenlänge (im Fall der Pulsung des Lichts der ersten Wellenlänge zu diesem zeitlich versetzt) führt zur Anregung eines zweiten Farbmarkers, der als Donor wiederum über FRET indirekt den ersten Farbmarker (Akzeptor) anregt. Da bereits viele der ersten Farbmarker durch das Licht der ersten Wellenlänge angeregt (gesättigt) wurden, ist die FRET-Anregung durch den zweiten Farbmarker geringer. Der erfindungsgemäße Einsatz der Pulsung eines der beiden bzw. des zeitlichen Versatzes der Pulse beider Wellenlängenbereiche hat somit den Vorteil, dass eine geringere Löschung der Lumineszenz des zweiten Farbmarkers (Donors) erfolgt. Denn es ist vermieden, dass ein großer Teil des Lumineszenzlichts des zweiten Farbmarkers nicht sichtbar ist, weil dessen Anregungsenergie durch die FRET-Anregung des ersten Farbmarkers (Akzeptors) aufgebraucht wird. Durch eine geeignete Wahl des Zeitversatzes bzw. der Leistung des Lichts der ersten Wellenlänge wird ein unterschiedliches Ausmaß an Sättigung des ersten Farbmarkers (Akzeptors) erreicht und somit eine optimale Unterdrückung der FRET-Löschung bzw. des FRET- Signals eingestellt.Because of the donor's primary stimulus, it would be this in principle possible to emit luminescent light. By the However, energy transfer is weakened or no longer available (deleted) and therefore not detectable. direct Changes in the donor substance that are normally directly through whose luminescent light can be uncovered are now only still indirectly through changes in FRET effectiveness observable. As already indicated, this still depends on other factors (such as donor-acceptor distance). The Possibility to add the luminescent light of the donor to be able to observe would. Distinguishing the enable different effects. When using the inventive method, for example, first a sample pulsed with light of a certain wavelength or irradiated continuously, so there is a saturation of the corresponding color markers, d. H. to stimulate most this color marker. A light pulse of a second wavelength (in the case of the pulsation of light to the first wavelength staggered) leads to the suggestion of a second Color marker, which as a donor in turn indirectly via FRET first color marker (acceptor). Since many of the first color marker through the light of the first wavelength have been excited (saturated), the FRET second color marker less. The use of the invention Pulsation of one of the two or the temporal offset of the Pulse of both wavelength ranges thus has the advantage that less quenching of the luminescence of the second color marker (Donors). Because it is avoided that much the luminescent light of the second color marker is not visible is because its excitation energy through the FRET excitation of the first color marker (acceptors) is used up. By a suitable choice of time offset or light output The first wavelength has a different degree Saturation of the first color marker (acceptor) reached and thus optimal suppression of the FRET deletion or the FRET Signal set.

Eine weitere Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in einem verbesserten Einsatz einer FRET- Analyse mittels FRET-Kaskaden. Wie bereits angedeutet, nimmt die Effektivität und damit die Beobachtbarkeit von FRET stark mit der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor ab und ist ab einer maximalen Entfernung (üblicherweise ca. 100 nm) verschwunden. Bei FRET-Kaskaden sind mehrere Farbmarker in einer Probe vorgesehen, so dass diese maximal mögliche Entfernung vergrößert werden kann. Beispielsweise wird ein grüner Farbmarker von einem grünen Laser als erster Donor (Donor 1) angeregt. Dieser regt über FRET einen gelben Farbmarker als zweiten Donor (Donor 2) an, der wiederum über eine weitere FRET-Anregung einen dritten, roten Farbmarker als Akzeptor zur Emission von Lumineszenzsignalen anregt. Dadurch können Abstandsveränderungen zwischen Donor 1 und Akzeptor sogar über einen größeren Bereich detektiert werden, da der Energietransfer von Donor 1 zu Akzeptor über den Donor 2 abläuft (FRET-Kaskade) und z. B. zwei Mal der maximale Abstand ausgenutzt werden kann. Ein Nachteil dieser so durchgeführten Methode ist jedoch die Ungewissheit, ob eine Veränderung des Akzeptor-Lumineszenzsignals durch eine Abstands- und somit FRET-Veränderung zwischen Donor 1 und Donor 2 oder eine Abstands- und somit FRET-Veränderung zwischen Donor 2 und Akzeptor hervorgeruden wurde. Durch die Verwendung zweier zeitlich versetzter grüner und gelber gepulster Lichtquellen, die jeweils nur den Donor 1 oder nur den Donor 2 anregen, sind die FRET-Effektivitäten und damit die Abstände zwischen dem Donor 1 und Donor 2 selektiv durch den grünen und zwischen Donor 2 und Akzeptor selektiv durch den gelben Laser analysierbar. Derartige ggf. auch längere FRET-Kaskaden sind somit durch den Einsatz von elektromagnetischer Strahlung, die zumindest in einem Wellenlängenbereich gepulst ist, erheblich verbessert.Another possible application of the invention Method consists in an improved use of a FRET Analysis using FRET cascades. As already indicated, takes the effectiveness and thus the observability of FRET strong with the distance between donor and acceptor and is off a maximum distance (usually approx. 100 nm) disappeared. There are several color markers in FRET cascades a sample is provided so that this is the maximum possible Distance can be enlarged. For example, a green color marker from a green laser as the first donor (Donor 1) excited. This stimulates a yellow one over FRET Color marker as a second donor (Donor 2), which in turn via Another FRET suggestion as a third, red color marker Stimulates acceptor to emit luminescence signals. Thereby can change the distance between donor 1 and acceptor can be detected even over a larger area since the Energy transfer from donor 1 to acceptor via donor 2 expires (FRET cascade) and z. B. twice the maximum distance can be exploited. A disadvantage of this However, the method is uncertainty as to whether a change in the Acceptor luminescence signal by a distance and thus FRET change between donor 1 and donor 2 or one Distance and thus FRET change between donor 2 and Was accepted. By using two staggered green and yellow pulsed light sources, which each excite only donor 1 or only donor 2 the FRET effectiveness and thus the distances between the Donor 1 and Donor 2 selectively by the green and between Donor 2 and acceptor selectively by the yellow laser analyzed. Such long FRET cascades are also possible thus through the use of electromagnetic radiation which is pulsed at least in one wavelength range, considerably improved.

In allen genannten Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung ist die Möglichkeit zur Variation des zeitlichen Versatzes beider Laserpulse von Vorteil. Auf diese Art und Weise kann ein für die Verbesserung der Messergebnisse (z. B. geringere Photozerstörung, optimalere Kreuzkorrelation, höheres Signal- zu-Hintergrund-Verhältnis) optimaler zeitlicher Versatz gefunden werden. Zudem eröffnet es die Möglichkeit, durch systematische Untersuchung, d. h. systematische Veränderung des zeitlichen Versatzees in verschiedenen Messungen, die Wechselwirkungen von Prozessen und/oder Zuständen (z. B. Photozerstörung, transiente Absorption, angeregter Zustand des Farbmarkers) zu charakterisieren.In all the possible applications of the invention the possibility of varying the temporal offset of both Laser pulses are an advantage. In this way, one for the improvement of the measurement results (e.g. lower Photo destruction, more optimal cross correlation, higher signal to background ratio) optimal time offset being found. It also opens up the possibility of systematic investigation, d. H. systematic change of temporal offsets in various measurements that Interactions of processes and / or states (e.g. Photo destruction, transient absorption, excited state of the Color markers).

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird in zumindest einem Wellenlängenbereich und/oder einer Polarisation gepulste elek tromagnetische Strahlung erzeugt. Vorzugsweise erfolgt eine pulsende. Strahlung in mindestens zwei Wellenlängenbereichen und/oder Polarisationen. Insbesondere ist die Vorrichtung er findungsgemäß so aufgebaut, dass die Strahlungsimpulse der ein zelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen zueinander zeitlich versetzt sind. Eine derartige Vorrichtung weist eine Strahlungseinheit, eine Probenaufnahme, eine Detektoreinheit und mindestens eine Optikeinheit auf.With the device according to the invention, at least one Wavelength range and / or a polarization pulsed elec generates tromagnetic radiation. Preferably one takes place pulsing. Radiation in at least two wavelength ranges and / or polarizations. In particular, the device is he According to the invention constructed so that the radiation pulses of a individual wavelength ranges and / or polarizations to each other are staggered in time. Such a device has one Radiation unit, a sample holder, a detector unit and at least one optical unit.

Die Probenaufnahme dient zur Aufnahme einer chemischen und/oder biologischen Probe, die zur Durchführung von Lumineszenz-Spek troskopie mindestens einen Farbstoffmarker aufweist.The sample holder is used to hold a chemical and / or biological sample used to carry out luminescence spec has at least one dye marker.

Die Detektoreinheit dient zum Detektieren der von der Probe ab gegebenen Strahlung. Mit Hilfe der Optikeinheiten wird die Strahlung von der Strahlungseinheit zur Probenaufnahme und/oder die von der Probe abgegebene Strahlung zur Detektoreinheit ge leitet.The detector unit is used to detect the sample given radiation. With the help of the optical units Radiation from the radiation unit for sample collection and / or the radiation emitted by the sample to the detector unit passes.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ausgestaltet sein, dass das Licht von der Strahlungseinheit zur Probenaufnahme und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung dersel ben Optikeinheit zur Detektoreinheit geleitet wird, wobei sich diese ober- oder unterhalb der Probenaufnahme befinden kann. Es ist ferner möglich, dass die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass das Licht von der Strahlungseinheit durch eine Optikein heit zur Probenaufnahme geleitet wird, die sich oberhalb der Probenaufnahme befindet und die von der Probe abgegebene Strah lung unter Verwendung einer weiteren Optikeinheit zur Detek toreinheit geleitet wird, die sich unterhalb der Probenaufnahme befindet.The device according to the invention can be designed such that the light from the radiation unit for sample collection and the radiation emitted by the sample using the same ben optical unit is directed to the detector unit, whereby this can be located above or below the sample holder. It it is also possible that the device is designed such that the light from the radiation unit is through optics unit is passed to the sample holder, which is above the There is a sample holder and the beam emitted by the sample tion using another optical unit for detection Gate unit is routed, which is below the sample holder located.

Die erfindungsgemäß ausgestaltete Strahlungseinheit erzeugt Strahlung in mindestens zwei verschiedenen Wellenlängenbe reichen und/oder zwei verschiedenen Polarisationen. Vorzugs weise wird eine Lasereinheit als Strahlungseinheit verwendet. Dabei werden zwei oder mehr Laser eingesetzt, die jeweils Laserlicht eines anderen Wellenlängenbereichs und/oder einer anderen Polarisation erzeugen und gepulst sind. Die Laser lichtimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Pola risationen sind zueinander zeitlich versetzt. Hierdurch wird, wie vorstehend anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens be schrieben, ein erheblich besseres Meßergebnis erzielt.The radiation unit designed according to the invention generates Radiation in at least two different wavelengths range and / or two different polarizations. virtue a laser unit is used as the radiation unit. Two or more lasers are used, each Laser light of a different wavelength range and / or one generate other polarization and are pulsed. The lasers light pulses of the individual wavelength ranges and / or pola Risks are staggered in time. This will as above using the method according to the invention wrote, achieved a significantly better measurement result.

Vorzugsweise weist die Lasereinheit eine Steuereinheit auf, die mit dem einen bzw. mit sämtlichen Lasern verbunden ist. Hierbei kann für jeden einzelnen Laser eine separate Steuereinheit vor gesehen sein, wobei die einzelnen Steuereinheiten über eine ge meinsame Steuerung miteinander verknüpft werden müssen. Vor zugsweise ist eine einzige Steuereinheit wie ein erster Moden koppler für sämtliche in der Lasereinheit angeordneten Laser vorgesehen. Mit Hilfe dieser einen Steuereinheit wird ein erster Laser gesteuert. Der zweite und jeder weitere Laser ist vorzugsweise mit der einzigen Steuereinheit über ein Trigger kabel verbunden. Aufgrund der Signallaufzeiten, die von der Länge des Triggerkabels abhängig sind, können die Laserlichtimpulse des zweiten und jedes weiteren Lasers automatisch zu den jenigen des ersten Lasers zeitlich versetzt werden. Andere praktische Möglichkeiten, um den zeitlichen Versatz der Laser zu erreichen, sind Weglängenunterschiede der verschiedenen Strahlengänge oder andere elektrische Bauteile zur Veränderung der Signallaufzeiten.The laser unit preferably has a control unit which is connected to one or all of the lasers. in this connection can provide a separate control unit for each individual laser be seen, the individual control units via a ge common control must be linked together. before preferably a single control unit is like a first mode Coupler for all lasers arranged in the laser unit intended. With the help of this one control unit first laser controlled. The second and every other laser is preferably with the only control unit via a trigger cable connected. Due to the signal propagation times by the Depending on the length of the trigger cable, the laser light pulses of the second and each further laser to the those of the first laser are shifted in time. Other practical ways to offset the timing of the laser distance differences between the different Beam paths or other electrical components for modification the signal transit times.

Die Steuereinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vor zugsweise wie vorstehend anhand des erfindungsgemäßen Verfah rens beschrieben ausgebildet sein, so dass beispielsweise ein Laserlichtimpuls erst dann die Probe erreicht, wenn die Anre gung des durch den vorherigen Laserlichtimpuls eines verschie denen Wellenlängenbereichs und/oder einer anderen Polarisation angeregten Farbstoffmarkers im Wesentlichen abgeklungen ist. Ferner können durch die Steuereinheit die Reihenfolge der ein zelnen Laser sowie die zeitlichen Abstände zwischen den Laser lichtimpulsen gesteuert werden.The control unit of the device according to the invention can preferably as above using the method according to the invention be described so that, for example, a Laser light pulse only reaches the sample when the stim of the shift caused by the previous laser light pulse which wavelength range and / or another polarization excited dye marker has essentially subsided. Furthermore, the order of the can by the control unit individual lasers as well as the time intervals between the lasers light pulses can be controlled.

Bei einer bevorzugten Weiterbildung der Detektoreinheit weist die Detektoreinheit nur einen mit einer Auswerteeinheit verbun denen Kombinationsdetektor auf. Dieser einzelne Detektor nimmt sämtliche von den einzelnen in der Probe enthaltenen Farbstoff markern abgegebenen Lumineszenz-Lichtimpulse auf. Da die Lumineszenz-Lichtimpulse aufgrund des zeitlichen Versatzes der die Farbstoffmarker anregenden Strahlungsimpulse auch zeitlich versetzt am Detektor ankommen, können die einzelnen detek tierten Werte mittels der Auswerteeinheit den entsprechenden Farbstoffmarkern und/oder Polarisationen, von denen sie stam men, zugeordnet werden. Durch die Kombination der Informationen über die Abfolge der Strahlungsimpulse und die Abfolge der De tektorsignale in der Auswerteeinheit ist eine Sortierung in rote und grüne Signale bzw. in parallel und senkrecht polari sierte Signale möglich.In a preferred development of the detector unit the detector unit is only connected to an evaluation unit which combination detector. This single detector takes all of each dye contained in the sample emitted luminescence light pulses. Since the Luminescence light pulses due to the time offset of the the radiation impulses stimulating the dye marker also in time arriving at the detector offset, the individual detec the corresponding values using the evaluation unit Dye markers and / or polarizations from which they originate men. By combining the information about the sequence of the radiation pulses and the sequence of the De tector signals in the evaluation unit is a sorting in red and green signals or in parallel and perpendicular polar signals possible.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Detek toreinheit zwei Detektoren auf, wobei ein Detektor zum Detek tieren des von den roten Farbstoffmarkern abgegebenen Lichts und der andere zum Detektieren des von den grünen Farbstoff markern abgegebenen Lichts vorgesehen ist. Hierdurch ist sichergestellt, dass keine Verfälschung der Ergebnisse aufgrund von Fehlern der Auswerteeinheit stattfindet. Ferner kann die Auswerteeinheit einfacher aufgebaut sein. Bei Vorsehen von drei oder mehr Farbstoffmarkern kann dementsprechend die ent sprechende Anzahl von Detektoren vorgesehen werden.In another preferred embodiment, the detector gate unit on two detectors, one detector for detec animals of the light emitted by the red dye markers and the other for detecting that of the green dye markers emitted light is provided. This is ensures that there is no falsification of results errors of the evaluation unit takes place. Furthermore, the Evaluation unit can be constructed more simply. If three are provided or more dye markers can accordingly the ent speaking number of detectors can be provided.

Um zusätzliche Informationen zu erhalten, kann den Detektoren ein polarisierender Strahlteiler vorgeschaltet sein. Ein von einem bestimmten Farbstoffmarker kommender Lichtstrahl wird so mit in zwei Strahlen unterschiedlicher Polarisation aufgeteilt. Diesen beiden Strahlen können zusätzliche Informationen, z. B. Rotationseigenschaften, über die Probe entnommen werden. Insbe sondere kann jeder dieser Detektoren nach dem o. g. Verfahren verschiedene Farben nacheinander messen. So ist es möglich, mit zwei Detektoren mehr als eine Farbe in beiden Polarisationen zu messen.To get additional information, use the detectors be a polarizing beam splitter upstream. One of A beam of light coming from a certain dye marker becomes like this with divided into two beams of different polarization. Additional information, e.g. B. Rotational properties are taken over the sample. in particular in particular, each of these detectors according to the above. method measure different colors one after the other. So it is possible with two detectors more than one color in both polarizations measure up.

Durch das Gating, d. h. das synchrone Ausschalten des Detektors während eines Laserpulses, kann es zu einer weiteren Verbesserung der Messmethode kommen. Neben der bereits bekannten Unterdrückung von promptem Streulicht und damit einer Erhöhung des Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses, kann so die Detektion der Lumineszenzemission, die durch einen Laserpuls erzeugt wurde, spezifisch unterdrückt werden. Bei dem Einsatz von mehreren gepulsten Lasern unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder Polarisation eröffnet dies die spezifische Untersuchung von transienten Zuständen und Prozessen.By gating, i.e. H. the synchronous switching off of the detector during one laser pulse, it can lead to another Improvement of the measurement method. In addition to the already known suppression of prompt stray light and thus one Increasing the signal-to-background ratio can thus Detection of luminescence emission by a laser pulse was specifically suppressed. When using of several pulsed lasers different This opens up the wavelength ranges and / or polarization specific investigation of transient states and Processes.

Die Vorrichtung ist vorzugsweise als hochgenaues konfokales Mikroskop ausgestaltet. Die Detektionseinheit weist vorzugs weise eine Elektronik auf, mit der z. B. eine Kreuzkorrelations messung durchgeführt werden kann.The device is preferably a highly accurate confocal Designed microscope. The detection unit is preferred have electronics with which, for. B. a cross correlation measurement can be carried out.

Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit unterschied lich polarisierter Strahlung und nur einem Detektor wird die Strahlungseinheit vorzugsweise wie folgt modifiziert:
When using the device according to the invention with differently polarized radiation and only one detector, the radiation unit is preferably modified as follows:

1. The radiation from a single unpolarized beam source, such as an unpolarized laser, is through a beam splitter divided into two beams, each polarized differently by a polarization filter and be reunited later. The time offset of the two differently polarized beams due to path length differences in the two beam paths realized.
2. The radiation from a single unpolarized radiation source, like an unpolarized laser, is replaced by a Polarization beam splitter divided into two beams polarization separated and later reunited. The temporal offset of the two differently polar based rays is due to path length differences in the realized in both beam paths.
3. The generation of two radiation pulses different Polarization using a single unpolari The radiation source is also fast rotating polarization filter in an undivided beam lengang reachable. Here, the rotational speed the polarization filter to the pulse frequency of the Radiation source must be matched so that the individual Radiation pulses alternately a different polar have direction of station.
4. Two polarized pulsed radiation sources of the same world length ranges but opposite polarization who as in the two-color approach before other tuned or triggered that their pulses delayed continues to reach the sample.

Während alle Ausführungsformen der Vorrichtung den Vorteil haben, dass nur ein einzelner Detektor erforderlich ist, um die unterschiedlich polarisierten Lumineszenzlichtanteile zu registrieren, ist in den Ausführungsformen (1)-(3) sogar eine einzige gepulste Strahlungsquelle ausreichend.While all embodiments of the device take advantage have that only a single detector is required to detect the differently polarized luminescent light components register is even one in the embodiments (1) - (3) only pulsed radiation source sufficient.

Durch das Einkoppeln zweier zeitlich versetzter Strahlungsim pulse unterschiedlicher Wellenlängenbereiche, z. B. rot und grün, und der Verwendung geeigneter optischer Filter kann Lumineszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche, z. B. rot und grün, mit nur einem Detektor, wie vorher ausgeführt, nahezu "zeitgleich" separat detektiert werden. Es können somit Verfahren, wie die Koinzidenzanalyse oder die Zwei-Farben- Kreuzkorrelationsmessung, mit einem einzigen Detektor durchge führt werden. Dies ist nach dem Stand der Technik nicht mög lich. By coupling two temporally offset radiation im pulse of different wavelength ranges, e.g. B. red and green, and the use of suitable optical filters can Luminescent light of different wavelength ranges, e.g. B. red and green, with only one detector, as stated before, almost "simultaneously" can be detected separately. So it can Procedures such as coincidence analysis or two-color Cross correlation measurement, with a single detector leads. According to the state of the art, this is not possible Lich.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung können insbesondere folgende Meßverfahren durchge führt werden: Spektrometrie, Mehrphotonenanregung (z. B. im Zwei-Photonen-Betrieb), Laser-Scanning-Anregung, Nahfeldspek troskopie, Raman- und Rayleigh-Streulicht-Anwendungen, FIDA- (fluorescence intensity distribution analysis) Anwendungen, zweidimensionale FIDA-Anwendungen, Koinzidenzanalyse und Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen. Es können auch parallele konfokale Systeme, wie Nipkow-Disks, Line-Scanner oder PMA-An ordnungen verwendet werden. Dabei werden vorzugsweise gated CCDs, CIDs, CMOSs oder mehrere CCDs, CIDs oder CMOSs verwendet, die über Farbteiler oder Polarisatoren unterschiedliche Signalanteile messen.With the inventive method and the inventive The device can perform the following measurement procedures in particular are carried out: spectrometry, multi-photon excitation (e.g. in Two-photon operation), laser scanning excitation, near-field spec topology, Raman and Rayleigh scattered light applications, FIDA (fluorescence intensity distribution analysis) applications, two-dimensional FIDA applications, coincidence analysis and Fluorescence lifetime measurements. It can also be parallel confocal systems such as Nipkow disks, line scanners or PMA-An regulations are used. Gates are preferred CCDs, CIDs, CMOSs or several CCDs, CIDs or CMOSs used the different via color dividers or polarizers Measure signal components.

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die erfindungsgemäße Vor richtung sind insbesondere zur pharmazeutischen Wirkstoffsuche (Screening), zur Identifizierung und Charakterisierung von pharmazeutisch relevanten Stoffen und Molekülen, zur Identifi zierung von Analyten in diagnostischen Anwendungen, zur Genom- Analyse oder zur Reinigung und Konzentrierung von Substraten geeignet.The method according to the invention and the pre-invention direction are in particular for pharmaceutical active ingredient search (Screening), for the identification and characterization of pharmaceutically relevant substances and molecules, for identification of analytes in diagnostic applications, for genome Analysis or for cleaning and concentrating substrates suitable.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Versuchsergebnissen sowie anhand einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung näher erläutert. Es zeigen:The invention is based on test results and based on a preferred embodiment of the device explained in more detail. Show it:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausfüh rungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, Fig. 1 is a schematic representation of a preferred exporting approximate shape of the device according to the invention,

Fig. 2-4 Diagramme der Fluoreszenzintensitäten einer reinen roten Farbstofflösung, die mit unterschiedlichem Lichtimpulsversatz eines roten und eines grünen Lasers bestrahlt wurde, Fig. 2-4 graphs of the fluorescence intensities of a pure red dye solution which was irradiated with different light pulse offset of a red and a green laser,

Fig. 5-7 Diagramme des Fluoreszenzabfalles in einem roten und einem grünen Detektionskanal bei den anhand der Fig. 2-4 beschriebenen Versuchen und Fig. 5-7 diagrams of the fluorescence drop in a red and a green detection channel in the experiments described with reference to Figs. 2-4 and

Fig. 8 ein Diagramm, in dem der Kurvenverlauf bei Kreuzkorre lationsmessungen dargestellt ist. Fig. 8 is a diagram in which the course of the curve with cross-correction measurements is shown.

Die in Fig. 1 dargestellte bevorzugte Ausführungsform der er findungsgemäßen Vorrichtung weist eine Probenaufnahme 10 auf. Als Probenaufnahme 10 ist schematisch ein einziger Behälter dargestellt, in dem sich die zu untersuchende Probe befindet. Bei der Probenaufnahme handelt es sich beispielsweise um Mikro- oder Nanotiterplatten. Eine als Strahlungseinheit dienende Lasereinheit 12 weist im dargestellten Beispiel einen Argon- Laser 14 auf, der grünes Laserlicht mit einer Wellenlänge von 496 nm erzeugt. Bei einem zweiten Laser. 16 handelt es sich um eine rote Laserdiode, die Laserlicht mit einer Wellenlänge von 635 nm erzeugt. Beide Laser 14, 16 werden in einem schnellen ge pulsten Modus betrieben. Bei Einsatz der in Fig. 1 darge stellten Vorrichtung zur Durchführung der anhand der Fig. 2-8 beschriebenen Experimente betrug die Impulsfrequenz 73 MHz.The preferred embodiment of the device according to the invention shown in FIG. 1 has a sample holder 10 . A single container, in which the sample to be examined is located, is shown schematically as the sample holder 10 . The sample acquisition is, for example, micro or nanotiter plates. In the example shown, a laser unit 12 serving as a radiation unit has an argon laser 14 which generates green laser light with a wavelength of 496 nm. With a second laser. 16 is a red laser diode that generates laser light with a wavelength of 635 nm. Both lasers 14 , 16 are operated in a fast pulsed mode. When using the device shown in FIG. 1 for performing the experiments described with reference to FIGS . 2-8, the pulse frequency was 73 MHz.

Der Argon-Laser 14 ist über einen Modenkoppler 18 gesteuert, der über ein Kabel 20 mit dem Argon-Laser 14 verbunden ist. Durch den Modenkoppler wird eine exakte Impulsfrequenz erzeugt. Der Modenkoppler 18 ist ferner über ein Triggerkabel 22 mit der roten Laserdiode 16 verbunden. Durch das Vorsehen des Moden kopplers als gemeinsame Triggereinheit ist die Impulsfrequenz der beiden Laser 14, 16 identisch. Aufgrund der Länge des Trig gerkabels 22 sind die von den beiden Lasern 14, 16 erzeugten Im pulse zueinander zeitlich versetzt. Der zeitliche Versatz tritt aufgrund der Signallaufzeit der Steuersignale von dem Moden koppler 18 zu dem Laser 16 auf.The argon laser 14 is controlled via a mode coupler 18 which is connected to the argon laser 14 via a cable 20 . An exact pulse frequency is generated by the mode coupler. The mode coupler 18 is also connected to the red laser diode 16 via a trigger cable 22 . By providing the mode coupler as a common trigger unit, the pulse frequency of the two lasers 14 , 16 is identical. Due to the length of the trigger cable 22 , the pulses generated by the two lasers 14 , 16 are mutually offset in time. The time offset occurs due to the signal delay of the control signals from the mode coupler 18 to the laser 16 .

Die von den beiden Lasern 14, 16 abgegebenen Lichtstrahlen wer den über einen dichroitischen Strahlteiler 24 zusammengeführt, so dass sie einen identischen Strahlengang durchlaufen. Da die Impulse der Laser jedoch zueinander zeitlich versetzt sind, tritt keine Überschneidung der einzelnen Impulse auf. Das von dem dichroitischen Strahlteiler 24 zusammengefaßte Laserlicht wird von einem dichroitischen Spiegel 26 in Richtung der Probenaufnahme 10 gelenkt und durch ein Objektiv 28 in die in der Probenaufnahme 10 befindliche Probe fokussiert.The light beams emitted by the two lasers 14 , 16 are brought together via a dichroic beam splitter 24 , so that they pass through an identical beam path. However, since the pulses of the lasers are staggered in time, there is no overlap between the individual pulses. The laser light combined by the dichroic beam splitter 24 is directed in the direction of the sample holder 10 by a dichroic mirror 26 and focused by an objective 28 into the sample in the sample holder 10 .

Das Objektiv 28 sowie der dichroitische Spiegel 26 sind bereits Bestandteile einer Optikeinheit 30. Die Optikeinheit 30 umfaßt ferner eine Tubuslinse 34 sowie eine. Lochblende 36. Das von den in der Probe enthaltenen Farbstoffmarkern abgegebene Licht ge langt durch das Objektiv 28, den dichroitischen Spiegel 26 und anschließend durch die Tubuslinse 34, durch die es auf die Lochblende 36 fokussiert wird. Hierbei handelt es sich um einen typischen Aufbau eines konfokalen Mikroskops, bei dem durch die Lochblende 36 Anteile des Lichts ausgeblendet werden.The objective 28 and the dichroic mirror 26 are already components of an optical unit 30 . The optical unit 30 further comprises a tube lens 34 and a. Pinhole 36 . The light emitted by the dye markers contained in the sample reaches ge through the lens 28 , the dichroic mirror 26 and then through the tube lens 34 , through which it is focused on the pinhole 36 . This is a typical design of a confocal microscope, in which 36 parts of the light are masked out by the pinhole.

In dem dargestellten Ausführungsbeispiel der Vorrichtung umfaßt eine Detektoreinheit 40 vier optische Filter 32, vier Detek toren 42, 44, 46, 48 sowie einen polarisierenden Strahlteiler 50 und eine Auswerteeinheit 52. Die durch die Lochblende 36 gelangenden Strahlen werden von dem polarisierenden Strahlteiler 50 in einen Strahl 54 mit parallel polarisiertem Licht und einen Strahl 56 mit senkrecht polarisiertem Licht unterteilt. Der Strahl 54 wird von einem dichroitischen Strahlteiler 58 in zwei Strahlen 60, 62 geteilt, wobei einer der Strahlen das von dem roten Farbstoffmarker abgegebene Licht und der andere Strahl das von dem grünen Farbstoffmarker abgegebene Licht enthält.In the illustrated embodiment of the device, a detector unit 40 comprises four optical filters 32 , four detectors 42 , 44 , 46 , 48 as well as a polarizing beam splitter 50 and an evaluation unit 52 . The beams passing through the pinhole 36 are divided by the polarizing beam splitter 50 into a beam 54 with parallel polarized light and a beam 56 with perpendicularly polarized light. Beam 54 is split into two beams 60 , 62 by dichroic beam splitter 58 , one of which contains the light emitted by the red dye marker and the other beam contains the light emitted by the green dye marker.

Entsprechend wird der anders polarisierte Strahl 56 von einem zweiten dichroitischen Strahlteiler 64 in einen roten und einen grünen Strahl 66, 68 geteilt, die von dem Detektoren 46 bzw. 48 detektiert werden. Durch die optischen Filter 32 werden bei spielsweise Randbereiche des abgegebenen Lichts ausgefiltert, die nicht von den Farbstoffmarkern selbst, sondern beispiels weise vom Material der Probenaufnahme 10 herrühren. Die von den Detektoren 42, 44, 46, 48 registrierten Strahlen 60, 62, 66, 68 wer den in elektrische Signale umgewandelt und über Leitungen 70, 72, 74, 76 zu der Auswerteeinheit 52, bei der es sich üb licherweise um einen entsprechend an die Vorrichtung angepaßten PC handelt, geleitet. Mittels der Auswerteeinheit erfolgt eine Bestimmung der Art der Reaktion, die in der Probe stattgefunden hat.Correspondingly, the differently polarized beam 56 is split by a second dichroic beam splitter 64 into a red and a green beam 66 , 68 , which are detected by the detectors 46 and 48, respectively. The optical filters 32 are used, for example, to filter out marginal areas of the emitted light which do not originate from the dye markers themselves but, for example, from the material of the sample holder 10 . The beams 60 , 62 , 66 , 68 registered by the detectors 42 , 44 , 46 , 48 are converted into electrical signals and via lines 70 , 72 , 74 , 76 to the evaluation unit 52 , which is usually a corresponding one PC adapted to the device. The evaluation unit is used to determine the type of reaction that has taken place in the sample.

Anstatt mit einer Optikeinheit sowohl das Laserlicht auf die Probe zu lenken und das von der Probe abgegebene Licht zur De tektoreinheit zu lenken, können auch zwei Optikeinheiten ver wendet werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ausge staltet sein, dass das Licht von der Strahlungseinheit zur Probenaufnahme und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung derselben Optikeinheit zur Detektoreinheit geleitet wird, wobei sich diese ober- oder unterhalb der Probenaufnahme befinden kann. Es ist ferner möglich, dass die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass das Licht von der Strahlungseinheit durch eine Optikeinheit zur Probenaufnahme geleitet wird, die sich oberhalb der Probenaufnahme befindet und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung einer weiteren Optikein heit zur Detektoreinheit geleitet wird, die sich unterhalb der Probenaufnahme befindet.Instead of using an optical unit, both the laser light on the To direct the sample and the light emitted by the sample to the De To steer tector unit, two optics units can also ver be applied. The device according to the invention can be so be designed so that the light from the radiation unit to Sample intake and the radiation emitted by the sample below Using the same optical unit directed to the detector unit is, this is above or below the sample holder can be located. It is also possible that the device is configured that the light from the radiation unit is passed through an optical unit for sample collection, which is above the sample holder and from the sample emitted radiation using another optic unit is passed to the detector unit, which is below the Sample is located.

Anstelle der in Fig. 1 dargestellten Strahlungseinheit mit zwei Lasern 14, 16 kann auch eine Strahlungseinheit mit nur einer Lichtquelle verwendet werden. Um Strahlengänge mit zwei unter schiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen, ist nach der Lichtquelle ein Strahlteiler vorgesehen, der beispielsweise 50% des erzeugten Lichts aus dem Strahlengang, unabhängig von der Frequenz des Lichts, auskoppelt. Es kann sich hierbei bei spielsweise um einen schräggestellten Spiegel handeln, der 50% des Strahlengangs abdeckt. Auf Grund von Weglängenunterschieden kann ein zeitlicher Versatz der beiden erzeugten Strahlengänge hervorgerufen werden. Hierbei ist sodann nur eine einzige ge pulste Lichtquelle erforderlich. Um in den beiden Strahlen gängen unterschiedliche Wellenlängenbereiche hervorzurufen, ist in einem der beiden Strahlengänge eine Einheit zur Wellenlänge nänderung vorgesehen. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen Frequenzverdoppler oder Frequenzvervielfacher handeln. Ferner kann ein OPA vorgesehen sein. Hierbei handelt es sich um einen nicht-linearen Kristall, der eine Frequenzverschiebung zur Folge hat. Ebenso kann ein Raman-Shifter vorgesehen sein, um in einem der beiden Strahlengänge den Wellenlängenbereich zu verschieben.Instead of the radiation unit shown in FIG. 1 with two lasers 14 , 16 , a radiation unit with only one light source can also be used. In order to generate beam paths with two different wavelength ranges, a beam splitter is provided after the light source, which, for example, couples 50% of the light generated out of the beam path, regardless of the frequency of the light. It can be, for example, an inclined mirror that covers 50% of the beam path. Due to path length differences, a temporal offset of the two beam paths generated can be caused. Then only a single pulsed light source is required. In order to produce different wavelength ranges in the two beams, a unit for changing the wavelength is provided in one of the two beam paths. This can be, for example, a frequency doubler or frequency multiplier. An OPA can also be provided. This is a non-linear crystal that results in a frequency shift. A Raman shifter can also be provided in order to shift the wavelength range in one of the two beam paths.

Eine entsprechende Vorrichtung mit nur einer einzigen Licht quelle kann auch verwendet werden, wenn zwei Strahlengänge mit unterschiedlicher Polarisation auf die Probe einwirken sollen. A corresponding device with only a single light source can also be used when using two beam paths different polarization should act on the sample.

Hierbei wird ebenfalls wieder der durch die eine Lichtquelle erzeugte Strahlengang geteilt und durch Weglängenunterschiede ein zeitlicher Versatz der gepulsten einen Lichtquelle hervor gerufen. Um in einem der beiden Strahlengänge eine Polarisa tionsänderung vorzunehmen, ist in dem Strahlengang als Einheit zur Polarisationsänderung beispielsweise ein Polarisations filter vorgesehen.Here, too, the one light source generated beam path divided and by path length differences a temporal offset of the pulsed one light source called. A polarisa in one of the two beam paths change in the beam path is a unit to change the polarization, for example, a polarization filter provided.

Bei den in den Fig. 2-7 dargestellten Messungen wurde stets eine reine rote Farbstofflösung untersucht. Es handelt sich hierbei um den Farbstoff Cyanin 5 (Cy5), der in Wasser mit einer Konzentration von 5 nM gelöst wurde. Die Fluoreszenz lebensdauer von Cy5 in Wasser beträgt 0,7 ns.A pure red dye solution was always examined in the measurements shown in FIGS. 2-7. This is the dye cyanine 5 (Cy5), which was dissolved in water at a concentration of 5 nM. The fluorescence lifetime of Cy5 in water is 0.7 ns.

In den Fig. 2-4 ist jeweils die Zählrate des Detektors über die Zeit aufgetragen. In allen drei Versuchen wurde die Probe innerhalb der ersten 5 s ausschließlich mit dem roten Laser, im Zeitabschnitt von 5-15 s mit dem roten und dem grünen Laser und zwischen 15-20 s wiederum ausschließlich nur mit dem roten Laser bestrahlt. Die Frequenz der beiden gepulsten Laser betrug in allen drei Messungen 73 MHz.In FIGS. 2-4, the count rate of the detector is plotted against time, respectively. In all three experiments, the sample was irradiated exclusively with the red laser within the first 5 s, with the red and green lasers in the period of 5-15 s, and again only with the red laser between 15-20 s. The frequency of the two pulsed lasers was 73 MHz in all three measurements.

In der in Fig. 2 dargestellten Messung wurden im Bereich von 5-15 s, in denen sowohl der rote als auch der grüne Laser eingeschaltet waren, kein Impulsversatz der beiden Laservorge nommen. Die roten und grünen Laserlichtimpulse trafen somit gleichzeitig auf die Probe und auf den roten Farbstoffmarker auf. Aus dem Diagramm (Fig. 2) ist deutlich ersichtlich, dass die Zählrate in dem Bereich von 5-15 s stark zurückgeht in den Bereichen, in denen der grüne Laser nicht eingeschaltet ist, d. h. in dem Bereich von 0-5 s sowie in dem Bereich von 15-20 s, ist die Zählrate deutlich höher. Hieraus wird der zerstörerische Einfluß des grünen Lasers auf die roten Farb stoffmarker ersichtlich.In the measurement shown in FIG. 2, in the range of 5-15 s in which both the red and the green lasers were switched on, no pulse offset of the two lasers was taken. The red and green laser light pulses thus hit the sample and the red dye marker simultaneously. From the diagram ( FIG. 2) it is clearly evident that the count rate drops sharply in the range from 5-15 s in the areas in which the green laser is not switched on, ie in the range from 0-5 s and in that Range of 15-20 s, the count rate is significantly higher. This shows the destructive influence of the green laser on the red dye markers.

Bei der Messung, die anhand von Fig. 3 dargestellt ist, wurde in dem Zeitabschnitt von 5-15 s ein Pulsversatz von 2 ns zwischen dem roten und dem grünen Laser eingestellt. Die Im pulse des grünen Lasers erfolgten stets 2 ns nach denen des roten Lasers, wobei die beiden Laserlichtimpulse abwechselnd auf die Probe auftrafen. Wie aus dem Diagramm (Fig. 3) deutlich ersichtlich ist, ist die Zählrate in dem Bereich von 5-15 s deutlich höher als in dem Diagramm der zuerst durchgeführten Messung (Fig. 2). Es hat somit bereits innerhalb eines Zeitver satzes von 2 ns eine gewisse Abklingung der Erregung der roten Farbstoffmarker stattgefunden (bei Cy5 um 94%), so dass eine erheblich geringere Anzahl von roten Farbstoffmarkern durch den grünen Laser zerstört wurde.In the measurement, which is shown with reference to FIG. 3, a pulse offset of 2 ns was set between the red and the green laser in the period of 5-15 s. The pulses of the green laser were always 2 ns after those of the red laser, the two laser light pulses striking the sample alternately. As can be clearly seen from the diagram ( FIG. 3), the counting rate in the range of 5-15 s is significantly higher than in the diagram of the measurement carried out first ( FIG. 2). Thus, the excitation of the red dye markers had already decayed within a time offset of 2 ns (by 94% for Cy5), so that a considerably smaller number of red dye markers were destroyed by the green laser.

Besonders deutlich ist der Effekt des erfindungsgemäßen Ver fahrens anhand von Fig. 4. Bei dieser Messung wurde ein Impuls versatz von 10 ns in dem Bereich von 5-15 s eingestellt. Es ist hierbei aus dem Diagramm keine Abweichung der Zählrate in den einzelnen Bereichen mehr ersichtlich. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass bereits nach 10 ns annähernd sämtliche zuvor angeregten roten Farbstoffmarker wieder in ihren Grundzu stand zurückgefallen sind.The effect of the method according to the invention is particularly clear with reference to FIG. 4. In this measurement a pulse offset of 10 ns was set in the range of 5-15 s. From the diagram, there is no longer any discrepancy in the counting rate in the individual areas. It can therefore be assumed that after 10 ns almost all previously excited red dye markers have returned to their basic state.

In den Fig. 5-7 ist die Zählrate eines roten und eines grünen Detektionskanals über eine Zeit abgebildet. Bei den Detektions kanälen handelt es sich um die entsprechenden Detektoren in Verbindung mit der Auswerteeinheit. Fig. 5 entspricht der in Fig. 2, Fig. 6 der in Fig. 3 und Fig. 7 der in Fig. 4 darge stellten Messung. Die durchgezogene Linie zeigt jeweils die durch den roten Laser hervorgerufene Fluoreszenz und die ge strichelte Linie die durch den grünen Laser hervorgerufene Fluoreszenz. Die in den Fig. 5-7 dargestellten Messungen wur den jeweils in dem Zeitraum von 5-15 s (Fig. 2-4) durchge führt, d. h. in dem Zeitraum, in dem beide Laser angeschaltet waren. Bei Fig. 5 ist zwischen den roten und grünen Laser lichtimpulsen kein Versatz, bei Fig. 6 beträgt der Zeitversatz entsprechend Fig. 3 2 ns und bei Fig. 7 beträgt der Zeitversatz entsprechend Fig. 4 10 ns.In FIGS. 5-7, the counting rate is shown a red and a green detection channel over time. The detection channels are the corresponding detectors in connection with the evaluation unit. Fig. 5 corresponds to that in Fig. 2, Fig. 6 in Fig. 3 and Fig. 7 in Fig. 4 Darge presented measurement. The solid line shows the fluorescence caused by the red laser and the dashed line shows the fluorescence caused by the green laser. The measurements shown in FIGS . 5-7 were each carried out in the period of 5-15 s (FIGS . 2-4), ie in the period in which both lasers were switched on. In FIG. 5 there is no offset between the red and green laser light pulses, in FIG. 6 the time offset corresponding to FIG. 3 is 2 ns and in FIG. 7 the time offset corresponding to FIG. 4 is 10 ns.

Aus den Fig. 5-7 ergibt sich deutlich die Verschiebung der maximalen Fluoreszenzsignale des roten und des grünen Detek tionskanals zueinander aufgrund des Impulsversatzes. Bei einem Impulsversatz von 10 ns können die beiden Detektionskanäle deutlich voneinander getrennt werden. Dies ermöglicht bei spielsweise den Einsatz eines einzigen Detektors für beide Farbstoffmarker, da bekannt ist, zu welchem Zeitpunkt Licht signale von welchem Farbstoffmarker zu dem Detektor gelangen.From FIGS. 5-7, the maximum displacement of the fluorescence signals of the red and green Detek results clearly tion channel to each other due to the pulse offset. With a pulse offset of 10 ns, the two detection channels can be clearly separated from one another. This enables, for example, the use of a single detector for both dye markers, since it is known at which point in time light signals from which dye marker reach the detector.

Bei dem anhand von Fig. 8 dargestellten Versuch handelt es sich um eine Messung eines mit Cy5 und Rhodamin-Green markierten doppelsträngigen Oligonukleotids, das bei einer Konzentration von ca. 1 nM in Wasser gelöst ist. Das Oligonukleotid ist 66 Basenpaare lang und macht aufgrund der Entfernung zwischen bei den Farbstoffmarkern einen Energietransfer unmöglich. Es wurde eine Kreuzkorrelationsmessung des roten und grünen Fluoreszenz lichts durchgeführt. Der rote und grüne Laser waren wiederum gepulst und zeitlich verschiebbar. Bei der unteren Kurve han delt es sich um den Verlauf der Kreuzkorrelation bei über lagerten Laserlichtimpulsen, d. h. bei Laserlichtimpulsen ohne zeitlichen Versatz. Bei der oberen Kurve waren die Laser lichtimpulse zueinander zeitlich versetzt. Nach Gl. 2 ergibt die obere Kurve eine Konzentation, C_grün+rot = 1 nM, an doppelt markierten Oligonukleotiden, während die verringerte Amplitude der unteren Kurve zu einer geringeren Konzentration, c_grün+rot = 0,6 nM, führt. Es tritt somit aufgrund des Impulsversatzes keine Photozerstörung auf und die Kreuzkorrelationsanalyse führt zu unverfälschteren Ergebnissen.The experiment shown in FIG. 8 is a measurement of a double-stranded oligonucleotide labeled with Cy5 and Rhodamine-Green, which is dissolved in water at a concentration of approximately 1 nM. The oligonucleotide is 66 base pairs long and makes energy transfer impossible due to the distance between the dye markers. A cross-correlation measurement of the red and green fluorescent light was carried out. The red and green lasers were pulsed and shifted in time. The lower curve is the course of the cross correlation with superimposed laser light pulses, ie with laser light pulses without a time offset. In the upper curve, the laser light pulses were staggered in time. According to Eq. 2 gives the upper curve a concentration, C _{green + red} = 1 nM, of double-labeled oligonucleotides, while the reduced amplitude of the lower curve leads to a lower concentration, c _{green + red} = 0.6 nM. There is therefore no photo-destruction due to the pulse offset and the cross-correlation analysis leads to more accurate results.

Claims

1. A method for measuring chemical and / or biological samples with the aid of luminescence spectroscopy, in which
the sample having at least one dye marker is irradiated with electromagnetic radiation with at least two different wavelength ranges and / or polarizations,
the excited dye marker emits radiation in a significant wavelength range and
the emitted radiation is detected by at least one detector,
characterized by
that the electromagnetic radiation used to excite the dye marker is pulsed in at least one wavelength range and / or one polarization.

2. The method according to claim 1, characterized in that the electromagnetic radiation in the at least two different wavelengths is pulsed and the beam tion pulses of the individual wavelength ranges and / or Polarizations staggered from one another to the sample to meet.

3. The method according to claim 2, characterized in that a Radiation pulse is generated only after the excitation by the previous radiation pulse of a different one Wavelength range and / or a different which polarization excited dye marker in Has essentially subsided.

4. The method according to claim 3, characterized in that the next radiation pulse is only given when the on stimulation of the previously excited dye marker by at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferred by at least 98%.

5. The method according to any one of claims 1-4, characterized indicates that the radiation of the individual wavelengths rich and / or polarizations in repetitive order is delivered.

6. The method according to any one of claims 1-5, characterized records that the time interval between two following radiation pulses of different wavelengths range at least 2 ns, preferably at least 10 ns and at most 20 ns.

7. The method according to any one of claims 1-6, characterized records that the sample has two dye markers where for each dye marker of one wavelength range and / or a polarization is excited.

8. The method according to any one of claims 1-7, characterized records that as electromagnetic radiation laser light is used.

9. The method according to claim 8, characterized in that a red and / or a green dye marker together with red and / or green laser light is used, the green laser light preferably has a wavelength range of 480 to 550 nm, particularly preferably from 485 to 535 nm, and the red laser light has a wavelength range of preferred as 630 to 690 nm, particularly preferably from 635 to 645 nm, having.

10. The method according to any one of claims 1-9, characterized records that when using different polari the temporal distance between two successive Radiation pulses at most 20 ns, in particular at most 10 ns.

11. The method according to any one of claims 1-10, characterized shows that the measurement by means of cross correlation to be led.

12. The method according to any one of claims 1-11, characterized records that the measurement using a con focal microscope.

13. Device for measuring chemical and / or biological samples with the help of luminescence spectroscopy, with
a radiation unit ( 12 ) for generating electromagnetic radiation in at least two different wavelength ranges and / or polarizations,
a sample holder ( 10 ) for holding the sample having at least one dye marker,
an at least one detector ( 42-48 ) having detector unit ( 40 ) for detecting the radiation emitted by the sample and
at least one optical unit ( 30 ) which directs the radiation from the radiation unit ( 12 ) to the sample holder ( 10 ) and / or the radiation emitted by the sample to the detector unit ( 40 ),
characterized,
that the radiation unit ( 12 ) generates pulsed radiation in at least one wavelength range and / or one polarization.

14. The apparatus according to claim 13, characterized in that the radiation unit ( 12 ) generates pulsed radiation in the at least two different wavelength ranges and / or different polarizations and the radiation pulses of the individual wavelength ranges and / or polarizations are staggered in time.

15. The apparatus according to claim 13, characterized in that the radiation unit for generating the radiation pulses with a control unit ( 18 ), preferably a mode coupler, is connected.

16. The apparatus according to claim 14, characterized in that the control unit ( 18 ) controls the radiation pulses such that a radiation pulse is generated only after the excitation of the dye marker excited by the previous radiation pulse of a different wavelength range and / or a different polarization essentially has subsided.

17. The apparatus according to claim 15, characterized in that the control unit ( 18 ) controls the radiation unit ( 12 ) such that the next radiation pulse is only emitted when the excitation of the previously excited dye marker by at least 90%, preferably by at least 95% , particularly preferably has decayed by at least 98%.

18. Device according to one of claims 15-17, characterized in that the control unit ( 18 ) controls the radiation pulses in such a way that the radiation pulses of the individual wavelength ranges and / or polarizations are emitted in repetitive order.

19. Device according to one of claims 15-18, characterized in that the control unit ( 18 ) controls the radiation pulses in such a way that the time interval between two successive radiation pulses of different wavelengths is at least 2 ns, preferably at least 10 ns and at most 20 ns ,

20. Device according to one of claims 13-19, characterized in that the radiation unit ( 12 ) has at least two lasers ( 14 , 16 ) for generating different wavelength ranges.

21. The apparatus according to claim 20, characterized in that the radiation unit ( 12 ) for all lasers ( 14 , 16 ) has a common control unit ( 18 ).

22. The apparatus according to claim 21, characterized in that the control unit ( 18 ) with the lasers ( 14 , 16 ) is each connected via a trigger cable ( 20 , 22 ), the time offset of the laser light pulses due to the length of the trigger cable ( 20 , 22 ) is determined.

23. Device according to one of claims 20-22, characterized in that the radiation unit ( 12 ) comprises two lasers ( 14 , 16 ), one laser ( 14 ) producing red and the other ( 16 ) green laser light and the green laser light preferably in a wavelength range from 480 to 550 nm, particularly preferably from 485 to 535 nm, and the red laser light is preferably in a wavelength range from 630 to 690 nm, particularly preferably from 635 to 655 nm.

24. Device according to one of claims 13-23, characterized in that the radiation unit ( 12 ) comprises only a single unpolarized pulsed radiation source ( 14 ), the radiation unit ( 12 ) additionally

a) has a beam splitter and in each beam path generated a polarization filter and a component for unifying the beam paths, or
b) has a polarization beam splitter for generating two beam paths of different polarization and a component for combining the beam paths, or
c) has a rapidly rotating polarization filter in an undivided beam path.

25. The device according to any one of claims 13-23, characterized in that the radiation unit ( 12 ) has two polarized pulsed radiation sources ( 14 , 16 ) of the same wavelength range but opposite polarization.

26. Device according to one of claims 13-25, characterized in that the detector unit ( 40 ) only one connected to an evaluation unit ( 52 ). Combination detector, the evaluation unit ( 52 ) evaluating the radiation emitted by the at least one dye marker separately from one another due to the time offset.

27. The device according to any one of claims 13-26, characterized in that the detector unit ( 40 ) has two detectors ( 42 , 44 ), one for detecting the red dye markers and one for detecting the light emitted by green dye markers.

28. The device according to any one of claims 13-27, characterized in that the detector unit ( 40 ) has a polarizing beam splitter ( 50 ) connected upstream of the detectors ( 42-48 ) for generating two beams ( 54 , 56 ) of different polarization and each beam ( 54 , 56 ) is detected by at least one detector ( 42 , 44 ; 46 , 48 ).

29. Device according to one of claims 13-28, characterized records that the device as a confocal microscope is designed.