DE102011053003A1

DE102011053003A1 - Wide field-microscope device i.e. total internal reflection-microscope device, for fluorescence measurements of flow cell, has mirror directing light beam to adjustable location of prism such that incident angle of beam on sample is changed

Info

Publication number: DE102011053003A1
Application number: DE201110053003
Authority: DE
Inventors: Stefan Diez; Tilman Glaser; Brüne Venus; Rene Schneider; Michael Berndt
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH; Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-02-28

Abstract

The device has a light source (10) i.e. laser light source, for generating light beam (11), a paraboloid prism (17) and a polarizer (12) for polarizing the light beam. A variable mirror (14) is provided for directing the light beam to an adjustable location of the paraboloid prism such that an incident angle of the light beam on a sample i.e. flow cell (20), is changed through changing of the adjustable location. An immersion layer (18) i.e. oil immersion layer, is arranged between the paraboloid prism and the sample, and two transparent plates are provided for enclosing the sample. An independent claim is also included for a microscoping method.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Weitfeld-Mikroskopie. Insbesondere betrifft sie derartige Verfahren und Vorrichtungen, bei welchen eine Probe unter einem Winkel beleuchtet wird, welcher größer ist als ein kritischer Winkel zur Totalreflexion, wobei der Einfallswinkel des Lichtes relativ zur Senkrechten gemessen wird. Eine derartige Mikroskopie wird auch TIR-Mikroskopie (vom Englischen „Total Internal Reflection”) bezeichnet.The present application relates to methods and apparatus for far-field microscopy. More particularly, it relates to such methods and apparatus in which a sample is illuminated at an angle greater than a critical angle to total reflection, wherein the angle of incidence of the light relative to the perpendicular is measured. Such microscopy is also called TIR (Total Internal Reflection) microscopy.

Derartige TIR-Mikroskopie kann beispielsweise für Fluoreszenzmessungen benutzt werden, wobei in einem derartigen Fall der an der Probe totalreflektierte Lichtstrahl die Probe lokal zur Fluoreszenz anregt und das Fluoreszenzlicht dann detektiert wird.Such TIR microscopy can be used, for example, for fluorescence measurements, in which case the light beam totally reflected on the sample locally excites the sample to fluoresce and the fluorescent light is then detected.

Bei einer derartigen Totalreflexion propagiert ein Teil des einfallenden Lichts in der Probe parallel zu der Probenoberfläche in einer Einfallsebene des einfallenden Lichts. Dieses Feld wird auch als evaneszentes Feld bezeichnet und kann z. B. zu einer Anregung von Fluoreszenz führen. Die Intensität eines derartigen evaneszenten Feldes fällt dabei bei Totalreflexion exponentiell von der Oberfläche, d. h. einer Grenzfläche, an welcher die Totalreflexion stattfindet, ab. Der genaue Verlauf dieses exponentiellen Abfalls hängt dabei von dem Einfallswinkel des einfallenden Lichts ab. Details zu derartigen Messungen sind beispielsweise in Daniel Axelrod, „Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology”, Traffic 2001, Vol. 2, Seiten 764–774 beschrieben.In such a total reflection, a part of the incident light propagates in the sample parallel to the sample surface in an incident plane of the incident light. This field is also referred to as evanescent field and z. B. lead to an excitation of fluorescence. The total intensity of such an evanescent field drops exponentially with total reflection from the surface, ie an interface at which the total reflection takes place. The exact course of this exponential decay depends on the angle of incidence of the incident light. Details of such measurements are, for example, in Daniel Axelrod, "Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology", Traffic 2001, Vol. 2, pp. 764-774 described.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen zur Mikroskopie, insbesondere zur Weitfeld-Mikroskopie, bereitzustellen, bei welchen eine Einstellung eines Einfallswinkels von Anregungslicht auf eine Probe einfach und präzise durchgeführt werden kann.It is an object of the invention to provide methods and apparatus for microscopy, in particular for wide-field microscopy, in which an adjustment of an angle of incidence of excitation light on a sample can be performed simply and precisely.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 1 und ein Verfahren nach Anspruch 13. Die Unteransprüche definieren weitere Ausführungsbeispiele.This object is achieved by a microscope device according to claim 1 and a method according to claim 13. The subclaims define further embodiments.

Erfindungsgemäß wird eine Mikroskopanordnung bereitgestellt, umfassend:
eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtstrahls,
zumindest einen Abschnitt eines Paraboloid-Prismas, und
eine variable Optik zum Lenken des Lichtstrahls auf einen einstellbaren Ort des Paraboloid-Prismas derart, dass durch Veränderung des einstellbaren Ortes ein Einfallswinkel des Lichtstrahls auf eine Probe veränderbar ist.According to the invention, a microscope arrangement is provided, comprising:
a light source for generating a light beam,
at least a portion of a paraboloid prism, and
a variable optics for directing the light beam to an adjustable location of the paraboloid prism such that an angle of incidence of the light beam is changed to a sample by changing the adjustable location.

Durch die Benutzung eines Paraboloid-Prismas oder eines Abschnitts hiervon kann somit ein Einfallswinkel auf einfache Weise eingestellt werden, wobei dabei ein Ort, an welchem der Lichtstrahl auf die Probe fällt, bei einer Variation des Einfallswinkels konstant gehalten werden kann.Thus, by using a paraboloid prism or a portion thereof, an angle of incidence can be easily adjusted while keeping a location at which the light beam is incident on the sample constant with a variation in the angle of incidence.

Unter einem Paraboloid-Prisma ist dabei ein Prisma zu verstehen, dessen Form im Wesentlichen einem Rotationsparaboloid entspricht, dessen Spitze abgeschnitten ist. „Im Wesentlichen” bedeutet dabei, dass die Form um nicht mehr als 10% bezogen auf die jeweilige Abmessung, bevorzugt nicht mehr als 1%, noch bevorzugter nicht mehr als 0,1%, von einem derartigen Rotationsparaboloid mit abgeschnittener Spitze aufweist. Falls durch Variation der variablen Optik der Lichtstrahl nur in einem Abschnitt des Paraboloid-Prismas lenkbar ist, ist es dabei ausreichend, nur diesen Abschnitt bereitzustellen.A paraboloid prism is to be understood as meaning a prism whose shape substantially corresponds to a paraboloid of revolution whose tip is cut off. "Substantially" means that the mold does not have more than 10% of the respective dimension, preferably not more than 1%, more preferably not more than 0.1%, of such a truncated tip paraboloid of revolution. If, by varying the variable optics, the light beam can only be steered in a section of the paraboloid prism, then it is sufficient to provide only this section.

Insbesondere kann das Paraboloid-Prisma eine erste Fläche, eine optional zu der ersten Fläche parallele zweite Fläche sowie eine Seitenfläche aufweisen, wobei die Seitenfläche einem Abschnitt einer Fläche eines Rotationsparaboloids entspricht. Die erste Fläche kann dabei größer als die zweite Fläche und der variablen Optik zugewandt sein, während die zweite Fläche bei einem Ausführungsbeispiel der Probe zugewandt ist.In particular, the paraboloid prism may have a first surface, a second surface optionally parallel to the first surface, and a side surface, the side surface corresponding to a portion of a surface of a paraboloid of revolution. The first surface may be larger than the second surface and the variable optics facing, while the second surface faces in one embodiment of the sample.

Die variable Optik kann insbesondere einen verschiebbaren Spiegel umfassen, welcher den Lichtstrahl näherungsweise senkrecht, beispielsweise unter einem Einfallswinkel von 0° ± 10°, bevorzugt 0° ± 5°, noch bevorzugter 0° ± 1°, auf die erste Fläche lenkt, wobei Einfallswinkel wie in der Optik üblich zur Senkrechten gemessen werden, so dass ein Einfallswinkel von 0° einem senkrechten Einfall entspricht.The variable optics may in particular comprise a displaceable mirror which directs the light beam approximately perpendicularly, for example at an angle of incidence of 0 ° ± 10 °, preferably 0 ° ± 5 °, more preferably 0 ° ± 1 °, to the first surface, wherein angles of incidence As usual in optics are measured to the vertical, so that an angle of incidence of 0 ° corresponds to a vertical incidence.

Die Probe kann dabei insbesondere als sogenannte Fließzelle (Flow Cell), d. h. als in einer Flüssigkeit befindliche zu untersuchende Partikel, eingerichtet sein. Zwischen der Fließzelle und dem Paraboloid-Prisma kann eine Schicht mit geeignetem Brechungsindex, insbesondere eine (Öl) Immersionsschicht, und/oder eine transparente Platte, angeordnet sein. Das Paraboloid-Prisma und die transparente Platte können dabei insbesondere aus Quarzglas gefertigt sein.The sample can be used in particular as a so-called flow cell, d. H. be as in a liquid to be examined particles, be furnished. Between the flow cell and the paraboloid prism, a layer with a suitable refractive index, in particular an (oil) immersion layer, and / or a transparent plate can be arranged. The paraboloid prism and the transparent plate can be made of quartz glass in particular.

Die Mikroskopanordnung kann weiterhin ein Objektiv zum Sammeln von von der Probe ausgehendem Licht, insbesondere Streulicht oder Fluoreszenzlicht, aufweisen.The microscope arrangement can furthermore have an objective for collecting light emitted by the sample, in particular scattered light or fluorescent light.

Die Mikroskopvorrichtung kann zudem einen Polarisator zum Polarisieren des Lichtstrahls umfassen.The microscope apparatus may further include a polarizer for polarizing the light beam.

Die Mikroskopvorrichtung kann weiterhin einen Strahlteiler zum Aufspalten des Lichtstrahls in zwei Teilstrahlen umfassen, welche beispielsweise um 90° versetzt an zwei Teilorten des Ortes auf das Paraboloid-Prisma fallen können. Auf diese Weise kann eine Polarisationsabhängigkeit der Beleuchtung der Probe mit dem Lichtstrahl reduziert werden. Auch andere optische Elemente wie z. B. ein Axikon können zum entsprechenden Formen des Lichtstrahls benutzt werden. The microscope device may further comprise a beam splitter for splitting the light beam into two sub-beams, which may, for example, be offset by 90 ° at two partial locations of the location on the paraboloid prism. In this way, a polarization dependence of the illumination of the sample with the light beam can be reduced. Other optical elements such. As an axicon can be used for corresponding shapes of the light beam.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann insbesondere ein Lenken eines Lichtstrahls auf ein Paraboloid-Prisma zur Beleuchtung einer Probe, ein Variieren des Beleuchtungsortes des Paraboloid-Prismas zur Variation eines Einfallswinkels auf der Probe und ein Reflektieren von von der Probe ausgehendem Licht umfassen. Der Einfallswinkel auf der Probe ist dabei bevorzugt größer als ein Winkel der Totalreflexion.In particular, a method of the invention may include directing a beam of light onto a paraboloid prism to illuminate a sample, varying the illumination location of the paraboloid prism to vary an angle of incidence on the sample, and reflecting light emanating from the sample. The angle of incidence on the sample is preferably greater than an angle of total reflection.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. Show it:

1 ein Schemadiagramm eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, und 1 a schematic diagram of an embodiment of a device according to the invention, and

2 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens. 2 a flowchart illustrating an embodiment of a method according to the invention.

Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung detailliert erläutert. Es ist zu bemerken, dass Merkmale verschiedener Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden können, sofern nichts anderes angegeben ist. Auf der anderen Seite ist eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit einer Vielzahl von Merkmalen nicht dahingehend auszulegen, dass alle diese Merkmale zur Ausführung der Erfindung nötig sind. Insbesondere können andere Ausführungsbeispiele weniger Merkmale und/oder alternative Merkmale aufweisen.In the following, embodiments of the invention will be explained in detail. It should be noted that features of various embodiments may be combined with each other unless otherwise specified. On the other hand, a description of an embodiment having a plurality of features is not to be construed as requiring all of these features to practice the invention. In particular, other embodiments may have fewer features and / or alternative features.

Die im Folgenden dargestellten Ausführungsbeispiele beziehen sich insbesondere auf Verfahren und Vorrichtungen zur Weitfeld-Mikroskopie, wobei eine Probe unter einem Einfallswinkel beleuchtet wird, welcher größer ist als der Winkel der Totalreflexion an der entsprechenden Grenzfläche zwischen der Probe und einem die Probe umgebenden Medium ist. Somit kann die Probe wie bereits in der Beschreibungseinleitung beschrieben durch das sogenannte evaneszente Feld angeregt werden.The exemplary embodiments presented below relate in particular to methods and devices for wide-field microscopy, wherein a sample is illuminated at an angle of incidence which is greater than the angle of the total reflection at the corresponding interface between the sample and a medium surrounding the sample. Thus, the sample can be excited by the so-called evanescent field as already described in the introduction to the description.

Bei der Weitfeld-Mikroskopie wird eine Probe allgemein über eine gewisse Fläche beleuchtet und mittels eines Objektivs abgebildet, während im Gegensatz dazu bei konfokaler Mikroskopie Anregungslicht in eine Probe hinein fokussiert wird und Licht aus diesem Fokus im Regelfall durch das gleiche Objektiv auf eine Lochblende abgebildet wird. Anregungs- und Detektionsfokus liegen hier also stets konfokal, während dies bei einer Weitfeld-Mikroskopie nicht der Fall sein muss.In far-field microscopy, a sample is generally illuminated over a certain area and imaged by means of a lens, whereas in confocal microscopy excitation light is focused into a sample and light from that focus is typically imaged through the same objective onto a pinhole , Excitation and detection foci are always confocal, whereas in wide-field microscopy this is not the case.

Einfallswinkel werden im Folgenden generell wie in der Optik üblich relativ zur Senkrechten auf der entsprechenden Fläche angegeben. Ein kritischer Winkel Θ_C berechnet sich dabei nach dem Snelliusschen-Gesetz zu: Θ_C = arcsin(n1/n2), wobei n1 und n2 Brechungsindices an der entsprechenden Grenzfläche sind, insbesondere n1 ein Brechungsindex auf der Seite der Probe und n2 ein Brechungsindex eines an die Probe angrenzenden Mediums auf derjenigen Seite, von welcher das Licht einfällt, ist. Für Einfallswinkel größer als der kritische Winkel Θ_C erfolgt Totalreflexion, wobei dabei das bereits erwähnte evaneszente Feld auftritt.In the following, angles of incidence are generally stated as usual in the optical system relative to the vertical on the corresponding surface. A critical angle Θ _{C is} calculated according to the Snellius law: Θ _C = arcsin (n1 / n2), where n1 and n2 are refractive indices at the respective interface, in particular n1 is a refractive index on the side of the sample and n2 is a refractive index of a medium adjacent to the sample on the side from which the light is incident. For angles of incidence greater than the critical angle Θ _C , total reflection takes place, in which case the already mentioned evanescent field occurs.

Zu bemerken ist, dass, auch wenn im Folgenden Anwendungen beschrieben werden, bei welchen Totalreflexion auftritt, grundsätzlich die im Nachfolgenden beschriebenen Ausführungsbeispiele auch geeignet sind, Lichtstrahlen unter Winkeln auf Proben zu lenken, bei welchen keine Totalreflexion erfolgt.It should be noted that although applications in the following are described in which total reflection occurs, in principle the embodiments described below are also suitable for directing light beams at angles to specimens in which no total reflection takes place.

In 1 ist ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopvorrichtung dargestellt.In 1 an embodiment of a microscope device according to the invention is shown.

Die Mikroskopvorrichtung der 1 umfasst eine Lichtquelle 10, beispielsweise eine Laserlichtquelle, zum Erzeugen eines Lichtstrahls 11, insbesondere eines Laserstrahls. Die Lichtquelle 10 und insbesondere eine Wellenlänge oder ein Wellenlängenbereich des Lichtstrahls 11 kann dabei in Abhängigkeit von einer durchzuführenden Untersuchung gewählt werden. Beispielsweise kann für eine Fluoreszenzmessung der Wellenlängenbereich oder die Wellenlänge des Lichtstrahls 10 entsprechend einer Anregungswellenlänge der nachzuweisenden Fluoreszenz gewählt werden.The microscope device of 1 includes a light source 10 , For example, a laser light source, for generating a light beam 11 , in particular a laser beam. The light source 10 and in particular a wavelength or a wavelength range of the light beam 11 can be chosen depending on the examination to be performed. For example, for a fluorescence measurement, the wavelength range or the wavelength of the light beam 10 be selected according to an excitation wavelength of the fluorescence to be detected.

Optional umfasst die Mikroskopvorrichtung der 1 weiterhin einen Polarisator 12 zum Polarisieren des Lichtstrahls 11, um so polarisationsabhängige Messungen vornehmen zu können.Optionally, the microscope device comprises the 1 continue a polarizer 12 for polarizing the light beam 11 so as to be able to make polarization-dependent measurements.

Zudem durchläuft der Lichtstrahl 11 eine Optik 13, welche im dargestellten Ausführungsbeispiel als eine Linse symbolisiert ist, jedoch mehrer Linsen oder andere optische Elemente umfassen kann, welche auch an anderen Stellen des Strahlengangs des Lichtstrahls 11 angeordnet sein können. Mit der Optik 13 kann der Lichtstrahl 11 geformt werden, beispielsweise auf einen gewünschten Strahldurchmesser zur Einstellung einer gewünschten Beleuchtungsfläche auf einer Probe aufgeweitet oder verengt werden.In addition, the light beam passes through 11 an optic 13 , which is symbolized in the illustrated embodiment as a lens, but may include several lenses or other optical elements, which also at other locations of the beam path of the light beam 11 can be arranged. With the optics 13 can the light beam 11 be shaped, for example, to a desired beam diameter for setting a desired Illuminated area on a sample widened or narrowed.

Der Lichtstrahl 11 wird dann über einen Spiegel 14 zu einem reflektierten Lichtstrahl 16 reflektiert, welcher auf ein Paraboloid-Prisma 17 gelenkt wird. Der Spiegel 14 ist wie durch einen Pfeil 15 angedeutet verschiebbar. Beispielsweise kann der Spiegel 14 in eine gepunktet dargestellte Position 14A verschoben werden, so dass der Lichtstrahl 11 zu einem Lichtstrahl 16A reflektiert wird, welcher statt an einem Ort 210 an einem anderen Ort 210A auf das Paraboloid-Prisma 17 trifft.The light beam 11 is then over a mirror 14 to a reflected light beam 16 which reflects on a paraboloid prism 17 is steered. The mirror 14 is like an arrow 15 indicated displaced. For example, the mirror 14 in a dotted position 14A be moved so that the light beam 11 to a ray of light 16A is reflected, which takes place in one place 210 at an other place 210A on the paraboloid prism 17 meets.

Das Paraboloid-Prisma 17 weist dabei im Wesentlichen die Form eines abgeschnittenen Rotationsparaboloids auf, wobei bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel das Rotationsparaboloid durch zwei parallele ebene Flächen 27 und 28 begrenzt wird, welche durch eine Seitenfläche verbunden sind, welche auf dem entsprechenden Rotationsparaboloid liegt. Wird eine Rotationsachse 29 des Paraboloid-Prismas 17 als z-Achse bezeichnet, und stehen x- und y-Achsen senkrecht hierzu, lässt sich das Rotationsparaboloid gemäß z = a(x² + y²) ausdrücken, wobei a eine Konstante ist und die z-Werte zwischen einem Wert z1 entsprechend der Position der Fläche 28 und einem Wert z2 entsprechend einer Position der Fläche 27 liegen. Es ist zu bemerken, dass aufgrund beispielsweise von Fertigungstoleranzen die Form des Paraboloid-Prismas 17 geringfügig von der obigen mathematischen Formel abweichen kann. Unter einem Paraboloid-Prisma im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein optisches Element zu verstehen, dessen Seitenfläche zwischen einer ersten Fläche, beispielsweise der Fläche 27, und einer zweiten Fläche, beispielsweise der Fläche 28, um nicht mehr als 10%, bevorzugt nicht mehr als 1%, noch bevorzugter nicht mehr als 0,1% von obiger Formel abweicht. Das Paraboloid-Prisma 17 kann insbesondere aus Quarzglas gefertigt sein.The paraboloid prism 17 has substantially the shape of a truncated paraboloid of revolution, wherein in the illustrated embodiment, the paraboloid of revolution by two parallel planar surfaces 27 and 28 is limited, which are connected by a side surface which lies on the corresponding paraboloid of revolution. Becomes an axis of rotation 29 of the paraboloid prism 17 z axis, and x and y axes are perpendicular to it, the paraboloid of revolution can be expressed as z = a (x ² + y ² ) where a is a constant and the z values are between z1 and z1 Position of the surface 28 and a value z2 corresponding to a position of the surface 27 lie. It should be noted that due to, for example, manufacturing tolerances, the shape of the paraboloid prism 17 slightly different from the above mathematical formula. A paraboloid prism in the sense of the present invention is understood to mean an optical element whose side surface is between a first surface, for example the surface 27 , and a second surface, such as the surface 28 does not deviate more than 10%, preferably not more than 1%, more preferably not more than 0.1% from the above formula. The paraboloid prism 17 can be made in particular of quartz glass.

Zu bemerken ist, dass bei manchen Ausführungsbeispielen auch nur ein Abschnitt, d. h. ein Teil, eines derartigen Paraboloid-Prismas bereitgestellt sein kann. Wenn beispielsweise eine Probe 20 wie im Folgenden näher erläutert nur in der dargestellten Zeichenebene beleuchtet wird, können Abschnitte des Paraboloid-Prismas, welche weiter außerhalb dieser Zeichenebene laufen, d. h. Abschnitte, durch welche unabhängig von der Bewegung des Spiegels 14 kein Lichtstrahl läuft, auch weggelassen sein.It should be noted that in some embodiments, only a portion, ie, a portion, of such a paraboloid prism may be provided. For example, if a sample 20 As explained in more detail below is illuminated only in the illustrated plane, sections of the parabolic prism, which continue to run outside this plane, ie sections through which regardless of the movement of the mirror 14 no ray of light is running, even omitted.

Der Spiegel 14 ist dabei bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel insbesondere so positioniert, dass der Lichtstrahl 16 zumindest näherungsweise senkrecht, beispielsweise unter einem Einfallswinkel von 0° ± 10°, bevorzugt 0° ± 5°, noch bevorzugter 0° ± 1°, auf die Fläche 27 fällt. Der Lichtstrahl 16 wird dann in dem Paraboloid-Prisma 17 reflektiert und verlässt das Paraboloid-Prisma durch die zweite Fläche 28. An der zweiten Fläche 28 ist eine Immersionsschicht 18, z. B. eine Ölimmersionsschicht angeordnet. Insbesondere wird durch die Immersionsschicht 18 ein Medium im Wesentlichen konstanter Dicke in der oben beschriebenen z-Richtung bereitgestellt. Der Lichtstrahl 16 trifft dann an einem Ort 22 auf eine als sogenannte Fließzelle vorliegende Probe 20, welche zwischen zwei transparenten Deckplatten 19 und 21, beispielsweise Quarzglasplatten, angeordnet ist. Durch die Immersionsschicht 18 ist es möglich, die Fließzelle 20 mit den Deckplatten 19 und 21 bezüglich des Paraboloid-Prismas 17 zu verschieben, ohne dass sich das optische Verhalten des Systems ändert. Die Fließzelle 20 beinhaltet im Wesentlichen eine Flüssigkeit, in welcher sich z. B. zu untersuchende Partikel befinden. Die Brechungsindices der Ölimmersionslinse 18, der Deckplatte 19 und der Probe 20 sind dabei in dem dargestellten Ausführungsbeispiel derart gewählt, dass der Lichtstrahl 16 an der Grenzfläche zwischen Deckplatte 19 und Probe 20 total reflektiert wird. Der Einfallswinkel kann dabei wie dargestellt durch Bewegung des Spiegels 14 verändert werden, beispielsweise ist der Einfallswinkel für das Beispiel des Lichtstrahls 16A größer als für das Beispiel des Lichtstrahls 16.The mirror 14 is in the illustrated embodiment in particular positioned so that the light beam 16 at least approximately perpendicular, for example at an angle of incidence of 0 ° ± 10 °, preferably 0 ° ± 5 °, more preferably 0 ° ± 1 °, on the surface 27 falls. The light beam 16 is then in the paraboloid prism 17 reflects and leaves the paraboloid prism through the second surface 28 , At the second area 28 is an immersion layer 18 , z. B. arranged an oil immersion layer. In particular, by the immersion layer 18 a medium of substantially constant thickness is provided in the z-direction described above. The light beam 16 then meet in one place 22 to a present as a so-called flow cell sample 20 between two transparent cover plates 19 and 21 , For example, quartz glass plates, is arranged. Through the immersion layer 18 is it possible the flow cell 20 with the cover plates 19 and 21 with respect to the paraboloid prism 17 without changing the optical behavior of the system. The flow cell 20 essentially comprises a liquid in which z. B. are to be examined particles. The refractive indices of the oil immersion lens 18 , the cover plate 19 and the sample 20 are chosen in the illustrated embodiment such that the light beam 16 at the interface between cover plate 19 and sample 20 is totally reflected. The angle of incidence can be as shown by movement of the mirror 14 are changed, for example, the angle of incidence for the example of the light beam 16A larger than for the example of the light beam 16 ,

Zu bemerken ist, dass bei anderen Ausführungsbeispielen die Flächen 27 und 28 nicht parallel sein müssen. Beispielsweise kann die Fläche 27 zur Verringerung von Reflexionen, insbesondere Rückreflexionen, komplett oder teilweise geneigt sein. In einem derartigen Fall kann der Lichtstrahl 16 beispielsweise unter einem anderen Winkel als 90° auf die Fläche 27 treffen, wobei der Winkel unter Berücksichtigung einer Brechung an der Fläche 27 insbesondere derart gewählt sein kann, dass der Lichtstrahl nach dem Eintreten in das Paraboloid-Prisma 17 zunächst (d. h. vor der internen Reflexion) parallel zu der Rotationsachse 29, d. h. in 1 senkrecht, verläuft.It should be noted that in other embodiments, the surfaces 27 and 28 do not have to be parallel. For example, the area 27 to reduce reflections, especially back reflections, completely or partially inclined. In such a case, the light beam 16 For example, at an angle other than 90 ° to the surface 27 meet, taking the angle taking into account a refraction on the surface 27 in particular may be selected such that the light beam after entering the paraboloid prism 17 initially (ie, before the internal reflection) parallel to the axis of rotation 29 ie in 1 vertical, runs.

Bevorzugt ist dabei ein Brennpunkt des dem Paraboloid-Prisma 17 zugrunde liegenden Rotationsparaboloids zumindest näherungsweise an dem Ort 22 angeordnet, so dass sich bei Änderung des Einfallswinkels durch Verschieben des Spiegels 14 in Richtung des Pfeils 15 der Ort 22 nicht verschiebt. Auf diese Weise kann der Einfallswinkel und somit beispielsweise die Intensität des evaneszenten Feldes durch Verschieben des Spiegels 14 eingestellt werden, ohne dass der Ort 22 verändert wird. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Brechungsindizes von Paraboloid-Prisma 17, Immersionsschicht 18 und Deckplatte 19 gleich sind, was beispielsweise durch Wahl des gleichen Materials, beispielsweise Quarz, für das Paraboloid-Prisma 17 und die Deckplatte 19 und durch Wahl eines geeigneten Immersionsmediums, d. h. Öl oder auch Glycerol, für die Immersionsschicht 18 erreicht werden kann. Bei abweichenden Brechungsindizes können sich gegebenenfalls geringfügige Verschiebungen des Orts 22 bei Verschiebung des Spiegels 14 ergeben, was jedoch je nach benötigter Präzision akzeptabel sein kann. Insbesondere kann beispielsweise bei Verwendung eines Paraboloid-Prismas 17 aus Quarz und einer Deckplatte 19 aus herkömmlichem Glas eine geringfügige Verschiebung des Ortes 22 auftreten, welche aber im Regelfall so gering ist, dass ein beleuchtete Fläche ein Gesichtsfeld eines weiter unten beschriebenen Objektivs, welches zur Detektion von von der Probe ausgehendem Licht verwendet wird, nicht verlässt, so dass eine Detektion weiterhin möglich ist bzw. auf einfache Weise ein Nachregeln erfolgen kann.A focal point of the paraboloid prism is preferred 17 underlying paraboloid at least approximately at the location 22 arranged so that when changing the angle of incidence by moving the mirror 14 in the direction of the arrow 15 the place 22 not moving. In this way, the angle of incidence and thus, for example, the intensity of the evanescent field by moving the mirror 14 be set without the place 22 is changed. This is especially the case when the refractive indices of paraboloid prism 17 , Immersion layer 18 and cover plate 19 are the same, for example, by choosing the same material, such as quartz, for the paraboloid prism 17 and the cover plate 19 and by choosing a suitable immersion medium, ie oil or glycerol, for the immersion layer 18 can be achieved. at deviating refractive indices may possibly slight shifts of the location 22 with displacement of the mirror 14 which, however, may be acceptable depending on the required precision. In particular, for example, when using a paraboloid prism 17 made of quartz and a cover plate 19 from conventional glass a slight shift of the place 22 occur, but which is usually so low that an illuminated area does not leave a field of view of an objective described below, which is used for detecting emitted from the sample light, so that a detection is still possible or in a simple manner Readjustment can take place.

Der an der Grenzfläche zwischen Deckplatte 19 und Probe 20 totalreflektierte Lichtstrahl 16 bzw. 16A wird dann wie dargestellt über eine nochmalige Reflexion in dem Paraboloid-Prisma 17 zu einer Strahlfalle 23, beispielsweise einer schwarzen Platte, gelenkt. Anstelle der Lichtfalle 23 kann auch eine Detektionseinrichtung vorgesehen werden, um den reflektierten Lichtstrahl analysieren zu können.The at the interface between cover plate 19 and sample 20 totally reflected light beam 16 respectively. 16A is then as shown via a second reflection in the paraboloid prism 17 to a jet trap 23 , for example a black plate, steered. Instead of the light trap 23 a detection device can also be provided to analyze the reflected light beam.

Von der Probe 20 in Antwort auf eine Anregung mit dem Lichtstrahl 16 bzw. 16A ausgehendes Licht 24, beispielsweise Fluoreszenzlicht oder Streulicht, beispielsweise an Partikeln wie Goldpartikel in der Probe 20 gestreutes Licht, wird über eine Immersionsschicht 25, welche beispielsweise eine Wasserlinse sein kann und eine numerische Apertur von 1 oder größer, beispielsweise 1,2, aufweisen kann, in eine Einrichtung 26 gelenkt, welche weitere optische Elemente, insbesondere ein Objektiv, sowie ein oder mehrere Detektoren zum Detektieren des Lichts 24 umfassen kann, beispielsweise eine Kamera.From the sample 20 in response to an excitation with the light beam 16 respectively. 16A outgoing light 24 , For example, fluorescent light or scattered light, for example on particles such as gold particles in the sample 20 scattered light, is via an immersion layer 25 which may be, for example, a duckweed and may have a numerical aperture of 1 or greater, for example 1.2, in a device 26 directed, which further optical elements, in particular a lens, and one or more detectors for detecting the light 24 may include, for example, a camera.

Zu bemerken ist, dass die in 1 dargestellte Konfiguration einem sogenannten inversen Mikroskop entspricht, bei welcher die Beleuchtung von oben erfolgt und eine Detektion, in diesem Fall über die Immersionsschicht 25 und die Einrichtung 26, unterhalb der Probe angeordnet ist. Es ist jedoch ebenso der umgekehrte Aufbau, d. h. ein Aufbau in Form eines aufrechten Mikroskops, möglich.It should be noted that the in 1 configuration corresponds to a so-called inverted microscope, in which the illumination is from the top and a detection, in this case via the immersion layer 25 and the device 26 , is arranged below the sample. However, it is also the reverse construction, ie a structure in the form of an upright microscope, possible.

Bei manchen Ausführungsbeispielen kann das Paraboloid-Prisma 17 an der Fläche 27 in 1 nach oben hin zylindrisch verlängert sein, beispielsweise um einen Einbau des Paraboloid-Prismas 17 in eine entsprechende Halterung zu erleichtern. Auch andere Proben als die Probe in Form der Fließzelle 20 können verwendet werden, wobei für eine TIR-Mikroskopie an einer entsprechenden Grenzfläche der Probe Totalreflexion auftreten muss, was beispielsweise durch Verwendung eines Deckglases mit einem entsprechenden Brechungsindex erreicht werden kann. Statt der Immersionsschicht 18 und/oder der Immersionsschicht 25 können auch andere optische Elemente verwendet werden, deren Brechungsindex entsprechend gewählt ist, um einen gewünschten Strahlengang zu erreichen. Statt des verschiebbaren Spiegels 14 können auch andere optische Elemente, beispielsweise bewegliche Linsen, benutzt werden, um das Paraboloid-Prisma 17 an einem gewünschten Ort zu beleuchten, um einen gewünschten Einfallswinkel auf der Probe 20 zu erzielen.In some embodiments, the paraboloid prism 17 on the surface 27 in 1 be extended upward cylindrically, for example, an installation of the paraboloid prism 17 to facilitate in a corresponding bracket. Also samples other than the sample in the form of the flow cell 20 can be used, whereby for a TIR microscopy at a corresponding interface of the sample total reflection must occur, which can be achieved for example by using a cover glass with a corresponding refractive index. Instead of the immersion layer 18 and / or the immersion layer 25 It is also possible to use other optical elements whose refractive index is chosen to be such as to achieve a desired beam path. Instead of the sliding mirror 14 For example, other optical elements, such as movable lenses, may be used to form the paraboloid prism 17 to illuminate at a desired location to a desired angle of incidence on the sample 20 to achieve.

Wie bereits erwähnt kann das Paraboloid-Prisma 17 aus Quarz realisiert sein. Bei einer derartigen Realisierung sind insbesondere geringe Oberflächenrauigkeiten zur Minimierung von Oberflächenstreuung sowie eine Minimierung einer Autofluoreszenz und Volumenstreuung möglich, was eine Erzeugung von Falschlicht minimiert und somit ein Signal-Rausch-Verhältnis des detektierten Lichts, im Falle der 1 des Lichtstrahls 24, minimiert. Zusätzlich oder alternativ kann auch ein verwendetes Deckglas wie die Deckplatte 19 aus Quarz gefertigt sein, um Autofluoreszenz- und/oder Streulicht zu minimieren. Die Kombination eines Paraboloid-Prismas aus Quarz mit einem Deckglas aus Quarz kann zu einer Minimierung von Abbildungsfehlern führen, womit ein kleiner Beleuchtungsfleck an dem Ort 22 zur Erreichung höherer Anregungsintensitäten realisiert werden kann, jedoch auch größere Beleuchtungsfleckgrößen, beispielsweise durch entsprechende Wahl einer Dicke der Öllinse 18, erreichbar sind.As already mentioned, the paraboloid prism 17 be made of quartz. In such a realization, in particular small surface roughness to minimize surface scattering and minimizing autofluorescence and volume scattering are possible, which minimizes generation of stray light and thus a signal-to-noise ratio of the detected light, in the case of 1 of the light beam 24 , minimized. Additionally or alternatively, a cover glass used as the cover plate 19 made of quartz to minimize autofluorescence and / or stray light. The combination of a quartz paraboloid prism with a quartz cover glass can minimize aberrations, creating a small spot of illumination in the location 22 to achieve higher excitation intensities can be realized, but also larger illumination spot sizes, for example by appropriate choice of a thickness of the oil lens 18 , are reachable.

Bei manchen Ausführungsbeispielen wird die Größe des Beleuchtungsflecks derart gewählt, dass sie einem Gesichtsfeld (Field of View) der Immersionsschicht 25 und/oder der Einrichtung 26 entspricht. Eine derartige Größe eines Beleuchtungsflecks kann beispielsweise in der Größenordnung von 100 μm·100 μm liegen. Es ist jedoch zu bemerken, dass die Größe des Beleuchtungsfleckes nicht dem Gesichtsfeld der Immersionsschicht 25 und/oder der Einrichtung 26 entsprechen muss. Bei manchen Ausführungsbeispielen können insbesondere das Gesichtsfeld der Immersionsschicht 25 und/oder der Einrichtung 26, beispielsweise durch zusätzliche, nicht dargestellte, Linsen, und die Größe des Beleuchtungsflecks, beispielsweise durch eine entsprechende variable Optik 13, unabhängig voneinander gewählt werden.In some embodiments, the size of the illumination spot is selected to be a field of view of the immersion layer 25 and / or the device 26 equivalent. Such a size of a lighting spot can be, for example, of the order of 100 .mu.m.times.100 .mu.m. It should be noted, however, that the size of the illumination spot is not within the field of view of the immersion layer 25 and / or the device 26 must correspond. In some embodiments, in particular the field of view of the immersion layer 25 and / or the device 26 , For example, by additional, not shown, lenses, and the size of the illumination spot, for example by a corresponding variable optics 13 , to be chosen independently.

Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel erfolgt die Detektion des Lichtes 24 im Dunkelfeld, d. h. durch die Totalreflexion des Lichtstrahls 16 gelangt (abgesehen gegebenenfalls von Streuung) kein Anregungslicht zu der Immersionsschicht 25.In the illustrated embodiment, the detection of the light takes place 24 in the dark field, ie by the total reflection of the light beam 16 (apart from possibly scattering) no excitation light reaches the immersion layer 25 ,

Das Paraboloid-Prisma 17 kann an dem Übergang zwischen der Fläche 28 und/oder der Fläche 27 zu der paraboloidförmigen Seitenfläche eine mechanische Schutzfase aufweisen. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann eine derartige mechanische Schutzfase auch weggelassen sein.The paraboloid prism 17 can be at the transition between the area 28 and / or the area 27 have a mechanical Schutzfase to the paraboloidal side surface. In other embodiments, such a mechanical protective bevel may also be omitted.

Durch die Verwendung des Polarisators 20 können beispielsweise spezielle Verteilungen der eine Streuung oder Fluoreszenz anregenden Leistungsdichte des Lichtstrahls 16 bzw. des durch den Lichtstrahl 16 erzeugten evaneszenten Feldes am Ort 22, d. h. an der Grenzfläche, an welcher die Totalreflexion stattfindet, erzeugt werden. By using the polarizer 20 For example, specific distributions of the scattering or fluorescence exciting power density of the light beam 16 or by the light beam 16 generated evanescent field locally 22 ie, generated at the interface where the total reflection takes place.

Die die Fließzelle 20 begrenzenden Deckplatten 19, 21 können bei manchen Ausführungsbeispielen einen variablen Abstand aufweisen, beispielsweise durch einen Mikromotor verstellbar sein, so dass beispielsweise ihr Abstand auf wenige Mikrometer reduziert werden kann.The the flow cell 20 limiting cover plates 19 . 21 In some embodiments, they may have a variable distance, for example be adjustable by a micromotor, so that, for example, their distance can be reduced to a few micrometers.

Zusätzlich zu den dargestellten optischen Elementen können auch weitere optische Elemente vorhanden sein. Beispielsweise kann das Paraboloid-Prisma 17 mit einem Axikon kombiniert werden, um eine Leistungsdichte am Ort 22 zu erhöhen und/oder Polarisationseffekte zu minimieren. Das Axikon kann z. B. zwischen dem Spiegel 14 und dem Paraboloid-Prisma 17 angeordnet sein. Insbesondere kann dabei zur Minimierung von Polarisationseffekten mittels eines Axikons der Strahl 16 derart geformt werden, dass er in einem Bogenabschnitt eines Kreises, beispielsweise in einem Halbkreis oder einem Teil hiervon, auf die Fläche 27 trifft, wobei ein Mittelpunkt des Kreises, welcher dem Bogenabschnitt zugrunde liegt, ein Schnittpunkt der Rotationsachse 29 mit der Fläche 27 ist. In anderen Worten ist der Ort 210 in diesem Fall bogenförmig und kann aus mehreren bogenförmig angeordneten zusammenhängenden Teilorten bestehend angesehen werden. Hierdurch wird eine Beleuchtung des Ortes 22 simultan von verschiedenen Seiten ermöglicht, was Polarisationseffekte, welche durch den schrägen Einfall auf die Probe 20 an dem Ort 22 bedingt sind, zumindest vermindern kann. Falls die Fläche 27 nicht parallel zu der Fläche 26 ist, sondern ganz oder teilweise schräg verläuft, kann die Form des Ortes 210 entsprechend angepasst werden. Ein derartiges Axikon kann beispielsweise als refraktives Axikon, als diffraktives Axikon oder als achromatisch korrigiertes refraktives mikrooptisches Axikon implementiert sein.In addition to the illustrated optical elements, other optical elements may also be present. For example, the paraboloid prism 17 be combined with an axicon to a local power density 22 increase and / or minimize polarization effects. The axicon can z. B. between the mirror 14 and the paraboloid prism 17 be arranged. In particular, to minimize polarization effects by means of an axicon, the beam 16 be formed so that it in an arc portion of a circle, for example in a semicircle or a part thereof, on the surface 27 applies, wherein a center of the circle, which is the basis of the arc section, an intersection of the axis of rotation 29 with the area 27 is. In other words, the place 210 in this case arcuate and can be considered consisting of several arcuately arranged contiguous parts. This will provide a lighting of the place 22 simultaneously from different sides, allowing for polarization effects caused by the oblique incidence on the sample 20 at the place 22 are conditional, at least can diminish. If the area 27 not parallel to the surface 26 is, but runs completely or partially at an angle, the shape of the place 210 be adjusted accordingly. Such an axicon can be implemented, for example, as a refractive axicon, as a diffractive axicon or as an achromatically corrected refractive micro-optical axicon.

Alternativ kann zur Minimierung von Polarisationseffekten beispielsweise ein Strahlteiler eingesetzt werden, welcher in 1 als Element 211 schematisch dargestellt ist. In dem Beispiel der 1 ist dabei der Strahlteiler 211 zwischen Lichtquelle 10 und Spiegel 14 angeordnet und dient dazu, neben dem dargestellten Lichtstrahl 11, 16 einen weiteren Lichtstrahl mit einem weiteren Strahlengang zu erzeugen, welcher bezüglich der Rotationsachse 29 um 90° versetzt, aber im gleichen Abstand zur Rotationsachse 29, auf das Paraboloid-Prisma trifft. In diesem weiteren Strahlengang kann ein weiterer Spiegel entsprechend dem Spiegel 14 angeordnet sein, welcher insbesondere synchron mit dem Spiegel 14 verschiebbar ist. In diesem Fall umfasst der Ort 210 also zwei unzusammenhängende Teilorte, welche um 90° versetzt zur Rotationsachse 29 sind. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann ein Strahlteiler, gegebenenfalls zusammen mit anderen optischen Elementen, nach dem Spiegel 14 angeordnet sein, so dass durch ein Verschieben des Spiegels 14 zwei unzusammenhängende Teilorte, welche den Ort 210 bilden, an welchem der in zwei Teilstrahlen aufgespaltene Lichtstrahl 16 auf die Fläche 27 trifft, verstellt werden.Alternatively, to minimize polarization effects, for example, a beam splitter can be used, which in 1 as an element 211 is shown schematically. In the example of 1 is the beam splitter 211 between light source 10 and mirrors 14 arranged and serves, in addition to the light beam shown 11 . 16 to generate a further light beam with a further beam path, which with respect to the axis of rotation 29 offset by 90 °, but at the same distance from the axis of rotation 29 , meets the parabolic prism. In this further beam path, another mirror corresponding to the mirror 14 be arranged, which in particular synchronously with the mirror 14 is displaceable. In this case, the place includes 210 So two unconnected parts, which are offset by 90 ° to the axis of rotation 29 are. In other embodiments, a beam splitter, optionally together with other optical elements, may be after the mirror 14 be arranged so that by moving the mirror 14 two disjointed suburbs representing the place 210 form, at which the light beam split into two partial beams 16 on the surface 27 meets, be displaced.

Bei derartigen Möglichkeiten, bei welchen eine Beleuchtung an mehreren zusammenhängenden oder unzusammenhängenden Teilorten erfolgt, weisen die Teilorte insbesondere bei einer Anordnung mit parallelen Flächen 27, 28 wie in 1 gleiche Abstände zu der Rotationsachse 29 auf.In such possibilities, in which a lighting takes place at a plurality of contiguous or discontinuous sub-locations, the sub-locations have, in particular, an arrangement with parallel surfaces 27 . 28 as in 1 equal distances to the axis of rotation 29 on.

Zusätzlich oder alternativ können ein oder mehrere optische Elemente vorhanden sein, welche chromatische Aberrationen zumindest kompensieren, so dass mit Licht mehrerer Wellenlängen, welche beispielsweise durch mehrere separate Lichtquellen 10 erzeugt werden können, aber auch beispielsweise Emissionswellenlängen eines einzigen Lasers sein können, der gleiche Einfallswinkel an der Probe erzeugt werden kann. Derartige optische Elemente können insbesondere optische Elemente sein, welche Aberrationen durch Änderungen des Brechungsindex in Abhängigkeit von der Wellenlänge der dargestellten optischen Elemente, beispielsweise der Immersionsschicht 18, des Paraboloid-Prismas 17 und/oder der Deckplatte 19, kompensieren. Eine derartige Kompensation der chromatischen Aberration kann beispielsweise durch Verwendung von Gläsern verschiedener Dispersion, d. h. verschiedener Abhängigkeiten des Brechungsindex von der Wellenlänge, erreicht werden.Additionally or alternatively, one or more optical elements may be present, which at least compensate for chromatic aberrations, so that with light of several wavelengths, for example, by a plurality of separate light sources 10 can also be, for example, emission wavelengths of a single laser, the same angle of incidence can be generated on the sample. Such optical elements may, in particular, be optical elements which have aberrations due to changes in the refractive index as a function of the wavelength of the illustrated optical elements, for example the immersion layer 18 , the paraboloid prism 17 and / or the cover plate 19 , compensate. Such compensation of the chromatic aberration can be achieved, for example, by using glasses of different dispersion, ie different refractive index dependencies on the wavelength.

Es ist zu bemerken, dass neben einem Paraboloid-Prisma 17 und/oder einem Deckglas 19 aus Quarzglas auch andere Materialien verwendet werden können, beispielsweise Standarddeckgläser, wobei durch eine entsprechende Wahl der Materialkombinationen, beispielsweise des Materials der Immersionsschicht 18, Abbildungsfehler minimiert werden können.It should be noted that in addition to a paraboloid prism 17 and / or a coverslip 19 Other materials can also be used, for example standard cover glasses, whereby by an appropriate choice of the material combinations, for example of the material of the immersion layer 18 , Aberrations can be minimized.

Bei manchen Ausführungsbeispielen kann die Fläche 27 des Paraboloid-Prismas 17 mit einer Anti-Reflexbeschichtung versehen sein, beispielsweise mit einer spektral breitbandig wirkenden Anti-Reflexbeschichtung. Beispielsweise kann eine sogenannte Mottenaugenstruktur zum Einsatz kommen, welche als zusätzliche Schicht auf das Paraboloid-Prisma 17 aufgebracht sein kann oder auch direkt in das Material des Paraboloid-Prismas eingebracht sein kann, letzteres beispielsweise durch ein entsprechendes Ätzverfahren.In some embodiments, the area 27 of the paraboloid prism 17 be provided with an anti-reflective coating, for example, with a spectrally broadband anti-reflective coating. For example, a so-called moth eye structure can be used, which as an additional layer on the paraboloid prism 17 may be applied or may be introduced directly into the material of the paraboloid prism, the latter for example by a corresponding etching process.

Bei manchen Ausführungsbeispielen kann die paraboloidförmige Seitenfläche des Paraboloid-Prismas 17 mit einem Material beschichtet sein, welches einen niedrigeren Brechungsindex aufweist als das Material des Paraboloid-Prismas. Hiermit kann beispielsweise eine korrekte innere Reflexion in dem Paraboloid-Prisma gewährleistet werden, wenn beispielsweise beim Verschieben der Fließzelle das Medium der Immersionsschicht 18, beispielsweise Immersionsöl, an dem Paraboloid-Prisma 17 hochläuft, was ohne eine derartige Beschichtung die Totalreflexion in dem Paraboloid-Prisma 17 negativ beeinträchtigen könnte. In some embodiments, the paraboloidal side surface of the paraboloid prism 17 be coated with a material which has a lower refractive index than the material of the paraboloid prism. Hereby, for example, a correct internal reflection in the paraboloid prism can be ensured if, for example, when moving the flow cell, the medium of the immersion layer 18 For example, immersion oil on the paraboloid prism 17 which, without such a coating, causes total reflection in the paraboloid prism 17 could negatively affect.

In 2 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung dargestellt. Das Verfahren der 2 kann in der Vorrichtung der 1 implementiert sein, kann jedoch auch unabhängig hiervon verwendet werden.In 2 a flow chart illustrating a method according to an embodiment of the invention is shown. The procedure of 2 can in the device of 1 but may be used independently thereof.

In Schritt 30 wird Licht auf ein Paraboloid-Prisma oder einen Abschnitt hiervon zur Beleuchtung einer Probe gelenkt. Dabei kann Licht bevorzugt senkrecht auf eine Fläche, im Beispiel der 1 die Fläche 27 des Paraboloid-Prismas gelenkt werden. Zum Einstellen kann hierbei das Paraboloid-Prisma 17 durch zwei einstellbare Diaphragmen ersetzt werden, und verwendete optische Elemente, beispielsweise der Spiegel 14, können eingestellt werden, so dass der Lichtstrahl, im Beispiel der 1 der Lichtstrahl 16, durch die Diaphragmen in einer geraden Linie hindurchgeht. Zur Einstellung der Orientierung des Paraboloid-Prismas 17, beispielsweise derart, dass der Lichtstrahl 16 parallel zur optischen Achse 29 verläuft, kann beispielsweise die Lichtfalle 23 durch einen Bildschirm oder eine helle Fläche ersetzt werden, und das Reflexionsbild kann beobachtet werden.In step 30 Light is directed to a paraboloid prism or a portion thereof to illuminate a sample. In this case, light can preferably perpendicular to a surface, in the example of 1 the area 27 of the paraboloid prism are directed. To adjust this can be the paraboloid prism 17 be replaced by two adjustable diaphragms, and used optical elements, such as the mirror 14 , can be adjusted so that the light beam, in the example of the 1 the beam of light 16 through which diaphragms passes in a straight line. To adjust the orientation of the paraboloid prism 17 , For example, such that the light beam 16 parallel to the optical axis 29 runs, for example, the light trap 23 be replaced by a screen or a bright surface, and the reflection image can be observed.

In Schritt 31 wird der Beleuchtungsort des Paraboloid-Prismas zur Einstellung eines gewünschten Einfallswinkels auf der Probe variiert.In step 31 the illumination location of the paraboloid prism is varied to set a desired angle of incidence on the sample.

In Schritt 32 wird dann von der Probe in Antwort auf die Beleuchtung mit dem Licht ausgehendes Licht detektiert. Dies kann beispielsweise Fluoreszenzlicht von fluoreszierenden Substanzen, welche sich in der Probe befinden, sein. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann die Probe streuende Partikel, beispielsweise Goldkügelchen, enthalten, und das Streulicht kann reflektiert werden.In step 32 Then, the light emitted by the sample is detected in response to illumination with the light. This may, for example, be fluorescent light from fluorescent substances present in the sample. In other embodiments, the sample may contain scattering particles, such as gold spheres, and the scattered light may be reflected.

Es ist zu bemerken, dass die Schritte 31 und 32 der 2 mehrmals wiederholt werden können, um beispielsweise Messungen bei verschiedenen Einfallswinkeln durchzuführen.It should be noted that the steps 31 and 32 of the 2 can be repeated several times, for example, to perform measurements at different angles of incidence.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Daniel Axelrod, "Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology", Traffic 2001, Vol. 2, pp. 764-774 [0003]

Claims

A microscope device, comprising: a light source ( 10 ) for generating a light beam ( 11 . 16 ), at least a portion of a paraboloid prism ( 17 ), and a variable optics ( 14 ) for directing the light beam ( 11 . 16 ) on the paraboloid prism ( 17 ) at an adjustable location ( 210 ) of the paraboloid prism ( 17 ) such that by changing the settable location ( 210 ) an angle of incidence of the light beam ( 11 . 16 ) to a sample ( 20 ) is changeable.

Microscope device according to claim 1, wherein the variable optics comprise a displaceable mirror ( 14 ).

Microscope device according to claim 1 or 2, further comprising a lens ( 25 . 26 ) for collecting from the sample ( 20 ) outgoing light.

Microscope device according to one of claims 1-3, further comprising an intermediate between the paraboloid prism ( 17 ) and the sample ( 20 ) immersion layer ( 18 ).

Microscope device according to claim 4, wherein the immersion layer ( 18 ) comprises an oil immersion layer.

Microscope device according to one of claims 4 or 5, further comprising an intermediate between the immersion layer ( 18 ) and the sample ( 20 ) arranged transparent plate ( 19 ).

Microscope device according to one of claims 1-6, further comprising a first transparent plate ( 19 ) and a second transparent plate ( 21 ) for enclosing the sample ( 20 ).

Microscope device according to claim 7, further comprising the sample ( 20 ), wherein the sample is designed as a flow cell.

Microscope device according to one of claims 1-8, wherein a focal point of a paraboloid prism ( 17 ) underlying paraboloid of revolution in one place ( 22 ) at which the light beam ( 16 ) to the test ( 20 ) meets.

Microscope device according to one of claims 1-9, wherein the paraboloid prism ( 17 ) a first surface ( 27 ), one to the first surface ( 27 ) parallel second surface ( 28 ), and one the first surface ( 27 ) and the second surface ( 28 ) paraboloid-shaped side surface, wherein the second surface ( 28 ) of the sample ( 20 ) and the variable optics ( 14 ), the light beam ( 16 ) substantially perpendicular to the first surface ( 27 ) to steer.

Microscope device according to one of claims 1-10, further comprising at least one optical element ( 211 ), which is set up, the light beam ( 11 . 16 ) in such a way that the adjustable location ( 210 ) has at least two contiguous or discontinuous parts.

Microscope device according to one of claims 1-11, wherein the angle of incidence of the light beam ( 16 ) to the test ( 20 ) is selected such that the light beam at an interface of the sample ( 20 ) is totally reflected.

A microscopy method, comprising: directing a light beam ( 11 . 16 ) over at least a portion of a paraboloid prism ( 17 ) to a sample ( 20 ), Varying a location at which the light beam ( 16 ) on the paraboloid prism ( 17 ) meets an angle of incidence of the light beam ( 16 ) to the test ( 20 ) and detecting from the sample ( 20 ) in response to the light beam ( 16 ) outgoing light ( 24 ).

The method of claim 13, wherein varying the location for adjusting the angle of incidence comprises adjusting the angle of incidence such that the light beam is at an interface of the sample. 20 ) is totally reflected.

The method of claim 13 or 14, wherein detecting the of the sample ( 20 ) outgoing light ( 24 ) comprises detecting fluorescent light and / or detecting stray light.