DE102009012293A1

DE102009012293A1 - Light auto-focusing method for use in microscope, involves arranging detector elements such that profiles of radiation property registered by detector elements are different and focus position is set based on profiles

Info

Publication number: DE102009012293A1
Application number: DE102009012293A
Authority: DE
Inventors: Paul Hing; Sven Dr. Hensler
Original assignee: Sensovation AG
Current assignee: Miltenyi Imaging GmbH
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2010-09-16

Abstract

The method involves focusing light from a light source (12) at a measurement light focus in a sample (6), where the light source has a LED. The light reflected from the sample is guided through an optical system (22) in two light paths onto two detector elements. The measurement light focus is moved into layers of the sample that reflects the light to different extents. The detector elements are arranged such that profiles of a radiation property registered by the detector elements are different and a focus position is set based on the profiles. An independent claim is also included for an auto-focusing device comprising an optical system.

Description

Die Anmeldung betrifft ein Autofokusverfahren, bei dem Licht einer Lichtquelle in einem Messlichtfokus in einer Probe fokussiert und von dort zurückgeworfen wird und das zurückgeworfene Licht durch ein optisches System und zumindest eine Blendenöffnung in zwei Lichtpfaden auf zumindest zwei Detektorelemente geführt wird.The The application relates to an autofocus method in which light from a light source focused in a sample light focus in a sample and thrown back from there is and the reflected light by an optical System and at least one aperture in two light paths is guided on at least two detector elements.

Stand der TechnikState of the art

Zur automatischen Fokussierung von Mikroskopen auf eine Probe sind zwei Methoden bekannt:

– Es wird die Position einer Probe oder die Entfernung der Probe zu einem Bezugspunkt gemessen, indem von der Probe reflektiertes Licht auf Schemen, Intensität oder dergleichen oder interferometrisch untersucht wird.
– Es wird das Bilder der Probe auf Kontrast, Auflösung, Autokorrelation oder Phasenkontrast hin untersucht.

For automatic focusing of microscopes on a sample two methods are known:

The position of a sample or the distance of the sample to a reference point is measured by examining light reflected from the sample for patterns, intensity or the like or interferometrically.
The image of the sample is examined for contrast, resolution, autocorrelation or phase contrast.

In der Mikroskopie besteht eine Probe üblicherweise aus einem zu untersuchenden Probenmaterial, das auf einen lichtdurchlässigen Probenträger aufgebracht und mit einem dünnen lichtdurchlässigen Abdeckglas abgedeckt ist. Eine Positionsmessung des Probenmaterials führt häufig zur Messung der Position einer der Reflexionsebenen an den Schichtgrenzen der Probe. Da ein Reflex an der Luft-Abdeckglas-Grenzschicht weit stärker ist als ein Reflex an einer Grenzschicht am Probenmaterial, überstrahlt der Luft-Abdeckglas-Reflex typischerweise den für einen Autofokus geeigneteren Reflex an einer Grenzschicht am Probenmaterial.In In microscopy, a sample usually consists of one to be examined sample material, which is on a translucent Sample carrier applied and with a thin translucent cover glass is covered. A position measurement Of the sample material often leads to the measurement of Position of one of the reflection planes at the layer boundaries of the sample. Because a reflection at the air-cover glass boundary layer far stronger is over-radiated as a reflection at a boundary layer on the sample material the air cover glass reflex is typically the one for a Autofocus more suitable reflex at a boundary layer on the sample material.

Aus der US 6,130,745 ist es bekannt, die Position einer starken Reflexschicht oberhalb oder unterhalb der Probe zu messen und aus der Dicke der Probe auf die Position des Probenmaterials zu schließen, das in einer bekannten Entfernung von der Reflexschicht angeordnet ist. Typischerweise sind jedoch bei der beschrieben Probe bei Verwendung hochauflösenden Systemen die Toleranzen in den Schichtdicken (z. B. des Deckglases oder des Objektträgers) größer als die Tiefenschärfe des Abbildungssystems und eine Fokussierung kann mit einer solchen Methode nicht immer gewährleistet werden.From the US 6,130,745 It is known to measure the position of a strong reflective layer above or below the sample and to close from the thickness of the sample to the position of the sample material, which is arranged at a known distance from the reflective layer. Typically, however, in the described sample using high resolution systems, the tolerances in the layer thicknesses (eg, of the coverslip or slide) are greater than the depth of field of the imaging system, and focusing can not always be ensured with such a method.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Autofokusverfahren anzugeben, mit dem ein optisches System, z. B. ein Mikroskop, schnell und genau auf eine reflektierende Schicht einer Probe fokussierend eingestellt werden kann.It It is an object of the invention to provide an autofocus method, with an optical system, for. As a microscope, fast and accurate focused on a reflective layer of a sample can be.

Lösung der AufgabeSolution of the task

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren der Eingangs genannten Art gelöst, bei dem der Messlichtfokus erfindungsgemäß in unterschiedlich stark Licht zurückwerfenden Schichten der Probe bewegt wird und die Detektorelemente so angeordnet sind, dass hierbei Verläufe einer von den Detektorelementen registrierten Strahlungseigenschaft unterschiedlich sind und eine Fokusposition in Abhängigkeit von den Verläufen eingestellt wird. Durch die unterschiedlichen Verläufe der registrierten Strahlungsverläufe kann die Position einer besonders ausgezeichneten Schicht in der Probe, z. B. einer reflektierenden Grenzfläche, gefunden und darauf oder auf eine in einem bekannten Abstand dazu angeordnete Fokuszielebene fokussiert werden.These Task is solved by a method of the type mentioned, in which the measurement light focus according to the invention in different strong light-reflecting layers of the Sample is moved and the detector elements are arranged so that in this case, courses of a registered by the detector elements Radiation property are different and a focus position set depending on the progressions becomes. Due to the different courses of the registered Radiation gradients can be the location of a particularly excellent Layer in the sample, z. B. a reflective interface, found and on top or one at a known distance from it focused focus target level are focused.

Auch Flächen, z. B. Grenzflächen, sind im Folgen als Schichten zu verstehen. Eine der Schichten ist vorteilhafterweise eine Grenzfläche. Die Lichtpfade sind zweckmäßigerweise zumindest teilweise voneinander getrennt, insbesondere sind sie im optischen System voneinander getrennt. Der Verlauf kann durch punktuelle Messungen an mehreren Positionen des Messlichtfokus erfasst werden, zweckmäßigerweise nach Lichtpfaden getrennt. Die Strahlungseigenschaft des zurückgeworfenen Lichts kann die Strahlungsintensität sein. Die eingestellte Fokusposition ist eine gewünschte Fokusposition, in der das optische System zweckmäßigerweise so zur Probe angeordnet ist, dass eine Bildaufnahme der Probe zu gewünschten Bildern führt.Also Surfaces, z. As interfaces, are as follows To understand layers. One of the layers is advantageously an interface. The light paths are expediently at least partially separated from each other, in particular they are separated in the optical system. The course can be through spot measurements are taken at several positions of the measuring light focus are suitably separated according to light paths. The radiation property of the reflected light can be the Be radiation intensity. The set focus position is a desired focus position in which the optical System suitably arranged as sample is that an image capture of the sample to desired images leads.

Außerdem kann durch die Erfindung die optische Weglänge der Lichtpfade bestimmt werden. Zweckmäßigerweise werden die optischen Weglängen der Lichtpfade unterschiedlich gewählt. Hierdurch kann durch die getrennte Auswertung der optischen Weglängen der Lichtpfade ein Abweichungssignal zu einer gewählten reflektierenden/streuenden Probenstruktur generiert und darauf oder auf eine in einem bekannten Abstand dazu angeordnete Fokuszielebene fokussiert werden. Eine Licht zurückwerfende Schicht kann eine reflektierende und/oder streuende Probenstruktur sein und kann insbesondere eine Grenzschicht sein, insbesondere eine an das Probenmaterial angrenzende Grenzschicht bzw. Grenzfläche.Furthermore can by the invention, the optical path length of the light paths be determined. Appropriately, the optical path lengths of the light paths chosen differently. This can be achieved by the separate evaluation of the optical path lengths the light paths a deviation signal to a selected generated reflective and scattering sample structure and on it or to a focus target plane located at a known distance therefrom be focused. A light-reflecting layer can may be and may be a reflective and / or scattering sample structure in particular a boundary layer, in particular one to the sample material adjacent boundary layer or interface.

Das Autofokusverfahren ist ein Verfahren zum automatisierten Fokussieren des optischen Systems auf eine gewünschte Fokusposition bzw. Fokuszielebene, z. B. innerhalb der Probe. Ist auf die Fokuszielebene fokussiert, kann das optische System ein dort angeordnetes Objekt in eine Bildebene scharf abbilden, in der zweckmäßigerweise ein Detektor bzw. eine Kamera angeordnet ist. Nach der Autofokussierung kann die Probe mit Hilfe einer Kamera abgebildet werden.The Autofocus method is a method of automated focusing of the optical system to a desired focus position or focus target level, z. Within the sample. Is on the focus target level focused, the optical system can be an object arranged there in an image plane sharply, in the expediently a detector or a camera is arranged. After autofocusing the sample can be imaged using a camera.

Die Probe kann zur Untersuchung vorbereitetes Probenmaterial, einen Träger, auf den es aufgebracht ist, und ein Abdeckglas, das es abdeckt, umfassen. Ebenso eignen sich eine für das Autofokuslicht lichtdurchlässige Schichtstruktur, an deren Schichtgrenzen Reflexion oder Streuung des verwendeten Autofokuslichts auftritt. Die Probe muss keine Lichtdurchlässigkeit für das Autofokuslicht nach der zur Fokussierung bestimmten Schicht aufweisen. Die Reflexion/Streuung an einer Grenzschicht, die hier beschrieben wird, kann auch durch reflektierende/streuende Partikelschicht bzw. Fehlstellenschicht im Material hervorgerufen werden. Die Schichtgrenzen können vorbehandelt (z. B. verspiegelt) werden um die Signale für das Autofokussystem zu erhöhen.The sample may be prepared for assay prepared sample material, a support to which it is applied, and a cover glass covering it believe it. Also suitable for the autofocus light translucent layer structure at the layer boundaries reflection or scattering of the autofocus light used occurs. The sample does not have to have light transmission to the autofocus light after the focusing layer. The reflection / scattering at a boundary layer, which is described here, can also be caused by reflecting / scattering particle layer or defect layer in the material. The layer boundaries can be pretreated (eg mirrored) to increase the signals for the autofocus system.

Die Fokuszielebene ist diejenige Ebene innerhalb der Probe, auf die das optische System fokussiert werden soll oder von der die Position des gewünschten Fokus in einem vorbestimmten Abstand entfernt sein soll. Die Fokuszielebene ist zweckmäßigerweise eine Reflexionsebene, an der einfallendes Licht reflektiert wird. Sie kann eine Grenzschicht innerhalb der Probe sein, z. B. die Ebene einer Glas-Probenmaterial-Grenzfläche. Ebenso könnte die Streuung an der Probe selbst ausgenutzt werden.The Focus target level is the level within the sample to which the optical system should be focused or from the position the desired focus at a predetermined distance away should be. The focus target level is expediently a reflection plane at which incident light is reflected. It may be a boundary layer within the sample, e.g. For example, the plane a glass-sample material interface. Likewise, the Scattering at the sample itself be exploited.

Das auf die Lichtpfade geleitete Licht stammt zweckmäßigerweise aus einer gemeinsamen Lichtquelle, wobei als Lichtquelle nicht nur originär strahlendes Material sondern auch eine reflektierende Schicht, eine Blendenöffnung oder dergleichen bezeichnet wird. Typischerweise wird eine ein- bzw. zweidimensionale Lichtquelle verwendet. Die beiden Lichtpfade sind zweckmäßigerweise symmetrisch zueinander gebildet und insbesondere symmetrisch zur optischen Achse des optischen Systems angeordnet.The Light directed onto the light paths is expediently obtained from a common light source, being used as a light source not only originally radiant material but also a reflective layer, an aperture or the like is called. typically, a one- or two-dimensional light source is used. The Both light paths are expediently symmetrical to each other formed and in particular symmetrical to the optical axis of the optical Systems arranged.

Die Lichtquelle, die insbesondere punktförmig ist oder mehrere Lichtpunkte umfasst, wird im Messlichtfokus in der Probe durch die Optik fokussiert. Der Messlichtfokus ist üblicherweise punktförmig, kann aber je nach Form der Lichtquelle alternativ ein- oder mehrdimensional sein und z. B. mehrere Punkte umfassen. Der Messlichtfokus liegt vorteilhafterweise im Fokus oder nahe des Fokus des zu fokusierenden optischen Systems. Der Fokus des optischen Systems kann eine Fokusebene sein. Ein im Fokus des optischen Systems liegendes Objekt wird vom optischen System in einer Bildebene scharf abgebildet. Es ist auch möglich, dass der Messlichtfokus in einer voreingestellten Entfernung vom Fokus des optischen Systems liegt. Hierdurch kann der Messlichtfokus auf eine Reflexionsebene eingestellt werden, z. B. eine Grenzschicht Deckglas-Probenmaterial, wobei der Fokus des opti schen Systems z. B. 20 μm entfernt von der Grenzschicht im Probenmaterial liegt.The Light source, which is in particular punctiform or more Points of light is in the measuring light focus in the sample through the Optics focused. The measuring light focus is usually punctiform, but may alternatively depending on the shape of the light source be one or more dimensional and z. B. include several points. The measuring light focus is advantageously in the focus or near the Focus of the optical system to be focused. The focus of the optical Systems can be a focal plane. One in focus of the optical system lying object is focused by the optical system in an image plane displayed. It is also possible that the measuring light focus at a preset distance from the focus of the optical system lies. This allows the measuring light focus on a reflection plane be set, for. B. a boundary layer cover glass sample material, wherein the focus of the optical system rule z. B. 20 microns away from the boundary layer in the sample material.

Von dem auf die Probe auftreffenden Licht wird ein Teil zurückgeworfen. Unter Zurückwerfen kann im Folgenden eine Reflexion und/oder eine Streuung verstanden werden. Die das Licht zurückwerfende Schicht kann eine reflektierende und/oder streuende Schicht sein. Wenn im Folgenden von Reflexion gesprochen wird, soll eine Streuung mit umfasst sein können.From a part of the light striking the sample is thrown back. Rejecting may be followed by a reflection and / or a dispersion can be understood. The light throwing back Layer can be a reflective and / or scattering layer. When we speak of reflection in the following, let a scatter can be included.

Die Lichtpfade treffen vorteilhafterweise aus unterschiedlichen Richtungen auf die Probe auf, so dass ihre Reflexe in unterschiedliche Richtungen abgestrahlt und so leicht getrennt voneinander ausgewertet werden können. Es erleichtert die Detektion der einzelnen Schichten in einer Schichtstruktur, wenn der Winkel der auftreffenden Lichtpfade so gewählt wird, dass Reflexe von benachbarten Schichten sich nicht überdecken. Wird eine streuende Schicht zur Bestimmung der Fokusposition verwendet, so sollte die Aufteilung der Lichtpfade erst im Detektionspfad erfolgen.The Light paths advantageously meet from different directions to the test, so that their reflexes in different directions be radiated and evaluated so easily separated from each other can. It facilitates the detection of the individual layers in a layered structure, when the angle of the incident light paths is chosen so that reflections from adjacent layers do not cover up. Is a scattering layer to Determining the focus position used, so should the division the light paths take place only in the detection path.

Vorteilhafterweise hat das Licht des Autofokussystems eine andere Frequenz als Licht, das zur Untersuchung bzw. Abbildung der Probe verwendet werden kann. Die Lichteigenschaft ist zweckmäßigerweise die Lichtintensität.advantageously, the light of the autofocus system has a different frequency than light, which can be used to study or image the sample. The light property is suitably the Light intensity.

Das optische System kann dasjenige eines Mikroskops sein. Es weist eine optische Achse auf, die üblicherweise senkrecht zu einer Probenebene gerichtet ist, in der sich die Probe erstreckt.The optical system may be that of a microscope. It has one optical axis, which is usually perpendicular to a Proscope is directed, in which the sample extends.

Die Lichtpfade zwischen Lichtquelle und Releflexionsschicht bzw. zwischen Reflexionsschicht und Detektor können als Beleuchtungspfade bzw. Detektionspfade bezeichnet werden. Ein Autofokuslichtpfad besteht somit aus einem Beleuchtungspfad und einem Detektionspfad. Der Unterschied in der optischen Weglänge kann nun sowohl im Beleuchtungspfad, im Detekti onspfad sowie in beiden beiden Pfaden erzeugt werden. Im Folgenden wird eine Realisierung im Detektionspfad beschrieben.The Light paths between the light source and releflection layer or between Reflection layer and detector can be used as illumination paths or detection paths are called. An autofocus light path exists thus from a lighting path and a detection path. The difference in the optical path length can now both in the illumination path, be generated in Detekti onspfad and in both paths. An implementation in the detection path will be described below.

Die Messung der optischen Weglänge der Pfade erfolgt durch mindestens eine, insbesondere jeweils eine Blende vor den Detektoren. Durch eine weglängenabhängige Position der Lichtpfade an der Blende, kann somit auf die optische Weglänge des Systems geschlossen werden. Eine mögliche Realisation wird im Folgenden beschrieben:
Die Detektorelemente sind z. B. relativ zu einem Element des optischen Systems so angeordnet, z. B. zu einer Blende, dass Verläufe einer von den Detektorelementen registrierten Strahlungseigenschaft zueinander unterschiedlich sind. Das Element des optischen Systems kann eine Blende, z. B. unmittelbar vor den Detektorelementen, ein Strahlteiler, ein Spiegel oder ein anderes geeignetes Element sein.The measurement of the optical path length of the paths is carried out by at least one, in particular in each case a diaphragm in front of the detectors. By means of a path length-dependent position of the light paths at the diaphragm, it is thus possible to deduce the optical path length of the system. A possible realization is described below:
The detector elements are z. B. relative to an element of the optical system so arranged, for. For example, to a diaphragm that curves of a registered by the detector elements radiation property are different from each other. The element of the optical system may include a shutter, e.g. B. immediately before the detector elements, a beam splitter, a mirror or another suitable element.

Die Blende bzw. deren Blendenöffnung ist vorteilhafterweise in einer Bildebene des optischen Systems angeordnet, also in einer Ebene, in der ein vom optischen System fokussierter Gegenstand abgebildet wird. Die Blendenöffnung kann ein Abbild der Lichtquelle sein.The aperture or its aperture is advantageously in an image plane of the optical Systems arranged, ie in a plane in which an object focused by the optical system is imaged. The aperture can be an image of the light source.

Die Blendenöffnung ist zweckmäßigerweise nicht wie üblich symmetrisch um die optische Achse des optischen Systems angeordnet sondern unsymmetrisch zur optischen Achse, insbesondere unsymmetrisch zur optischen Achse der beiden Lichtpfade am Ort der Blendenöffnung. Insbesondere ist sie vollständig außerhalb der optischen Achse angeordnet. Hierdurch kann auf einfache Weise eine Selektion des einen oder anderen Lichtpfads für eine getrennte Auswertung an verschiedenen Positionen des Messlichtfokus erreicht werden.The Aperture is not expediently as usual, symmetrical about the optical axis of the optical Systems arranged but asymmetrical to the optical axis, in particular unbalanced to the optical axis of the two light paths at the place of Aperture. In particular, it is complete arranged outside the optical axis. This can in a simple way a selection of one or the other light path for a separate evaluation at different positions of the measuring light focus can be achieved.

Eine besonders genaue Fokussierung kann erreicht werden, wenn die Verläufe kontinuierliche erfasst werden.A Precise focusing can be achieved when the gradients be recorded continuously.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird ein Fokus des optischen Systems so eingestellt, dass die Signale der Detektorelemente in einem festen Verhältnis zueinander stehen. Bei einem Lichteinfall auf die Detektorelemente in einem festen Verhältnis kann in einfacher Weise eine Symmetrieposition zwischen den Lichtpfaden und damit die Fokuszielebene erfasst werden. Noch einfacher kann dies geschehen, wenn die Signale gleich stark sind. Der Weglängenunterschied der Pfade wird so gewählt, dass bei Überlagerung der Signale die Signale an einer Flanke überlappen und somit einen Schnittpunkt aufweisen. In diesem Schnittpunkt sind die Signale gleich stark. Mithilfe eines Nulldurchgangs des Differenzsignals kann die gleiche Stärke der Signale einfach erfasst werden.In an advantageous embodiment of the invention will a focus of the optical system adjusted so that the signals the detector elements in a fixed relationship to each other stand. At a light incident on the detector elements in a fixed Ratio can easily be a symmetry position between the light paths and thus the focus target plane are detected. This can be done even easier if the signals are equally strong. The path length difference of the paths is chosen that when superimposed on the signals at a Flank overlap and thus have an intersection. At this intersection, the signals are equally strong. With help of a Zero crossing of the difference signal can be the same strength of the Signals are easily detected.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass eine Zielposition eines Fokus des optischen Systems mit Hilfe der Signale der Detektorelemente erfasst wird und der Fokus mit Hilfe der erfassen Zielposition durch einen Aktuator eingestellt wird. Die Zielposition kann eine vom Aktuator ausgegebene Position sein, z. B. diejenige Position, an der die Signale der Detektorelemente gleich sind. Es ist auch möglich, diese Einstellung nur als Voreinstellung zu verwenden. Alternativ oder z. B. als Feineinstellung zusätzlich ist es denkbar, die Zielposition durch ein Regeln zu erreichen, wobei die Detektorsignale als Regeleingangssignale und ein Signal zum Steuern des Aktuators als Regelausgangssignal verwendet wird.A Another embodiment of the invention provides that a Target position of a focus of the optical system by means of the signals the detector elements is detected and the focus with the help of capture Target position is set by an actuator. The target position may be a position output by the actuator, e.g. B. the one Position at which the signals of the detector elements are the same. It is also possible, this setting only as a default to use. Alternatively or z. B. as a fine adjustment in addition it is conceivable to reach the target position by a rule, wherein the detector signals as control input signals and a signal is used to control the actuator as a control output signal.

Eine einfache und zuverlässige automatische Fokussierung kann erreicht werden, wenn die Detektorelemente so kalibriert sind, dass die Stärke ihres Signals, das von einer Grenzschicht zurückgeworfenem Licht hervorgerufen wird, gleich ist. Hierbei liegt die Fokusposition zweckmäßigerweise in der reflektierenden bzw. das Licht zurückwerfenden Schicht. Alternativ können die Detektorelemente so eingestellt sein, dass ihre Signalstärke gezielt unterschiedlich ist, z. B. um einen gezielten Fokusoffset zu erreichen.A simple and reliable automatic focusing can be achieved when the detector elements are calibrated so that the strength of their signal, thrown back from a boundary layer Light is caused, is the same. This is the focus position expediently in the reflective or the light-reflecting layer. Alternatively you can the detector elements should be adjusted so that their signal strength specifically different, z. B. a targeted focus offset to reach.

Eine gute Orientierung bei der Suche nach der Zielposition des Fokus bzw. der Fokuszielebene kann erreicht werden, wenn der Messlichtfokus durch die Fokuszielebene auf eine Probe-Luft-Grenzfläche zu bewegt wird und der Reflex der Probe-Luft-Grenzfläche zur groben Orientierung verwendet wird.A good orientation in the search for the target position of the focus or the focus target level can be achieved if the measuring light focus through the focus target plane to a sample-air interface is moved and the reflex of the sample-air interface to rough orientation is used.

Zur Untersuchung einer Probe kann es notwendig sein, dass sie an verschiedenen Orten untersucht wird, z. B. wenn sie größer als ein Blickfeld des Mikroskops ist. Hierzu wird sie nach einer ersten Untersuchung senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems bewegt und anschließend erneut untersucht. Eine schnelle automatische Fokussierung nach einer solchen Bewegung kann erreicht werden, die Signale der Detektorelemente nach einer Bewegung der Probe senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems auf Plausibilität hinsichtlich einer nach wie vor vorhandenen Grobeinstellung auf die Fokuszielebene überprüft werden. Liegt Plausibilität vor, kann auf eine zeitaufwendige vollständige neue Fokussierung verzichtet werden. Die Plausibilität kann ein Grenzwert im Unterschied der Signale sein, der nicht überschritten werden darf. Die Plausibilitätsprüfung kann außerdem zur Grobeinstellung verwendet werden, so dass bei vorliegender Plausibilität nur noch eine Feineinstellung vorgenommen wird.to Examination of a sample may require that it be different Places is examined, for. If they are larger than a field of view of the microscope is. For this she will after a first Investigation perpendicular to the optical axis of the optical system moved and then re-examined. A fast automatic focusing after such a movement can be achieved be the signals of the detector elements after a movement of the Sample perpendicular to the optical axis of the optical system for plausibility with regard to a still present coarse adjustment the focus objective level will be reviewed. Is there plausibility May focus on a time consuming full new focus be waived. The plausibility can be a limit be in difference of the signals that did not exceed may be. The plausibility check can also be used for coarse adjustment, so that in the present plausibility only still a fine adjustment is made.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass die Lichtquelle ein Lichtmuster aufweist, das in der Probe abgebildet wird. Das Lichtmuster kann ein-, zwei oder dreidimensional sein und ist zweckmäßigerweise in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems in der Probe abgebildet. Hierbei wird reflektiertes Licht aus mehreren Musterpunkten des Lichtmusters jeweils nach Lichtpfaden getrennt erfasst. Hierdurch kann aus mehreren Zielpositionen zu den mehreren Musterpunkten eine Verkippung der Fokuszielebene, z. B. zur optischen Achse, erkannt werden. Die so erzeugten Signale können zur Regelung der Autofokussierung genutzt werden.A sees further advantageous embodiment of the invention suggest that the light source has a light pattern in the sample is shown. The light pattern can be one, two or three dimensional and is conveniently perpendicular in a plane to the optical axis of the optical system in the sample. Here, reflected light from several pattern points of the Light pattern separately detected according to light paths. hereby can from several target positions to the multiple pattern points one Tilting the focus target level, z. B. to the optical axis recognized become. The signals generated in this way can be used to control autofocusing be used.

Die Erfindung ist außerdem gerichtet auf eine Autofokuseinrichtung mit einem optischen System zum Fokussieren von Licht in einem Messlichtfokus in einer Probe und zum Führen von von dort zurückgeworfenem Licht durch eine Blendenöffnung auf zumindest zwei Detektorelemente.The The invention is also directed to an autofocus device with an optical system for focusing light in a measuring light focus in a sample and to guide it thrown back from there Light through an aperture on at least two detector elements.

Es wird vorgeschlagen, dass die Autofokuseinrichtung einen Aktuator und ein Steuermittel umfasst zum Bewegen eines Elements des optischen Systems oder der Probe durch den Aktuator derart, dass der Messlichtfokus in unterschiedlich stark Licht zurückwerfenden Schichten der Probe bewegt wird, wobei die Detektorelemente so angeordnet sind, dass hierbei Verläufe einer von den Detektorelementen registrierten Strahlungseigenschaft unterschiedlich sind und das Steuermittel zum Auswerten der Verläufe an mehreren Positionen des Messlichtfokus vorgesehen ist.It is proposed that the autofocus device comprises an actuator and a control means for moving an element of the optical system or the specimen through the actuator in such a way, in that the measuring light focus is moved in layers of the sample which reflect light to a different extent, the detector elements being arranged such that courses of a radiation property registered by the detector elements are different and the control means is provided for evaluating the courses at a plurality of positions of the measuring light focus.

Bei der Bewegung des Elements des optischen Systems relativ zur Probe kann der Aktuator das Element oder die Probe relativ zu einem festen Bezugspunkt, z. B. einem Erdboden, bewegen.at the movement of the element of the optical system relative to the sample For example, the actuator may position the element or sample relative to a fixed reference point. z. B. a soil, move.

Vorteilhafterweise ist das Steuermittel dazu ausgebildet, einen, mehrere oder alle der oben angeführten Verfahrensschritte zu steuern.advantageously, the control means is adapted to one, several or all to control the above-mentioned process steps.

Vorteilhafterweise umfasst die Autofokuseinrichtung ein Messsystem, das dazu vorgesehen ist, den Abstand des Elements des optischen Systems zur Probe oder einen davon abhängigen Abstand zu erfassen, insbesondere auf nicht-optischem Wege. Sobald die Fokusposition optische gefunden wurde, kann der Abstand mit dem weiteren Messsystem gemessen und während der Beleuchtung der Probe gehalten werden.advantageously, The autofocus device comprises a measuring system provided for this purpose is the distance of the element of the optical system to the sample or to record a dependent distance, in particular in a non-optical way. Once the focus position optical found was measured, the distance with the other measuring system and be held during the illumination of the sample.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die in den Zeichnungen dargestellt sind.The Invention will become apparent from exemplary embodiments explained, which are illustrated in the drawings.

Es zeigen:It demonstrate:

1 ein Mikroskop mit einer Autofokusvorrichtung in einer schematischen Darstellung, 1 a microscope with an autofocus device in a schematic representation,

2 einen schematisiert dargestellten Strahlengang bzw. Beleuchtungspfade der Autofokuseinrichtung auf eine Probe, 2 a schematically illustrated beam path or illumination paths of the autofocus device on a sample,

3–6 Reflexionsstrahlengänge bzw. Detektionspfade von der Probe auf zwei Detektorelemente, 3 - 6 Reflection beam paths or detection paths from the sample to two detector elements,

7 ein Diagramm von Signalen der Detektorelemente und eines veränderten Arbeitsabstands über die Zeit, 7 a diagram of signals of the detector elements and an altered working distance over time,

8 ein schematisiertes Diagramm der Signale mit einem Differenzsignal, 8th a schematic diagram of the signals with a difference signal,

9 eine Projektion eines Lichtpunkts auf eine bewegte schiefe Probe, 9 a projection of a light spot onto a moving crooked sample,

10 eine Projektion eines Lichtquellenmusters auf eine ruhende schiefe Probe, 10 a projection of a light source pattern onto a stationary crooked sample,

11 eine Auftrennung eines Strahlengangs durch einen halbdurchlässigen Spiegel und 11 a separation of an optical path through a semitransparent mirror and

12 eine Auftrennung eines Strahlengangs durch einen dichroidischen Spiegel. 12 a separation of a beam path by a dichroid mirror.

1 zeigt eine Autofokusvorrichtung 2, die in ein optisches Abbildungssystem 4 integriert ist. Das optische Abbildungssystem ist in dieser speziellen Ausführungsform ein Mikroskop zur Fluoreszenzanalyse von biologischem Material in einer Probe 6. Hierzu umfasst das optische Abbildungssystem 4 einen Bilddetektor 8 bzw. eine Kamera, der mit einem Steuermittel 10 zur Aufnahmesteuerung und Speichern aufgenommener Bilder verbunden ist, oder ein Okular zur direkten Beobachtung der Probe. Das Steuermittel 10 ist Teil sowohl des optischen Abbildungssystems 4 als auch der Autofokusvorrichtung 2 und dient zur Steuerung des im Folgenden beschriebenen Autofokusverfahrens. 1 shows an auto focus device 2 working in an optical imaging system 4 is integrated. The optical imaging system in this particular embodiment is a microscope for fluorescence analysis of biological material in a sample 6 , This includes the optical imaging system 4 an image detector 8th or a camera, with a control means 10 for recording control and storing recorded images, or an eyepiece for direct observation of the sample. The control means 10 is part of both the optical imaging system 4 as well as the autofocus device 2 and serves to control the autofocus method described below.

Die Autofokusvorrichtung 2 umfasst eine Lichtquelle 12, die Licht für das Autofokusverfahren zur Verfügung stellt. Sie kann auch das Licht für die Fluoreszenzanalyse zur Verfügung stellen, wobei es in der Regel zweckmäßiger sein wird, dass das optische Abbildungssystem 4 hierfür eine andere, nicht dargestellte Lichtquelle umfasst. Die Lichtquelle 12 weist einen Lichterzeuger 14 auf, z. B. eine LED (Light Emitting Diode), und eine Optik 16 zum Formen des abgestrahlten Lichts, die einen Lichtdiffusor umfassen kann. Eine Blende 18 mit einem Öffnungsmuster erzeugt ein ein- oder zweidimensionales Lichtquellenmuster, das zweckmäßigerweise symmetrisch zu einer optischen Achse 20 eines optischen Systems 22 ist, das neben der Optik 16 weitere optische Elemente 24 und ein Objektiv 26 des optischen Abbildungssystems 4 umfassen kann. Eine räumlich definierte Lichtquelle kann auch die Elemente 16 und 18 ersetzen. Ein Mittel 28, das einer Apertur gleichkommt, trennt die Beleuchtung der Probe 6 aus der Lichtquelle 12 in mehrere Lichtpfade auf, die getrennt voneinander vom Mittel 28 zur Probe 6 verlaufen und in der Probe 6 in einen gemeinsamen Messlichtfokus gebracht werden (Beleuchtungspfade). Das Mittel 28 kann alternativ im Detektionspfad (s. unten) zwischen Elementen 30 und 46 angebracht sein, insbesondere bei Fokussierung auf streuende Objekte.The auto focus device 2 includes a light source 12 that provides light for the autofocus procedure. It may also provide the light for fluorescence analysis, it being generally more convenient that the optical imaging system 4 this includes another, not shown, light source. The light source 12 has a light generator 14 on, z. As an LED (Light Emitting Diode), and optics 16 for shaping the radiated light, which may include a light diffuser. A panel 18 with an aperture pattern produces a one- or two-dimensional light source pattern, which is suitably symmetrical to an optical axis 20 an optical system 22 is that next to the optics 16 other optical elements 24 and a lens 26 of the optical imaging system 4 may include. A spatially defined light source can also be the elements 16 and 18 replace. A means 28 , which equals an aperture, separates the illumination of the sample 6 from the light source 12 in several light paths, separated from each other by the means 28 for trial 6 run and in the sample 6 be brought into a common measuring light focus (illumination paths). The middle 28 alternatively, in the detection path (see below) between elements 30 and 46 be appropriate, especially when focusing on scattering objects.

Über zwei Strahlteiler 30, 32 in Form von dichroidischen oder halbdurchlässigen Spiegeln wird Licht aus der Lichtquelle 12 in das Objektiv 26 des optischen Abbildungssystems 4 gelenkt, das in einem Mikroskopgehäuse 34 gelagert ist und das Licht auf die Probe 6 fokussiert. Hierzu umfasst das Objektiv 26 ein optisches Element 36, z. B. eine Linse, die mittels eines Aktuators 38 entlang der optischen Achse 20 des Objektivs 26 steuerbar beweglich ist. Die Steuerung der Position des optischen Elements 36 und damit des Fokus in der Probe 6 wird durch das Steuermittel 10 vorgenommen. Der Aktuator selbst kann einen unabhängigen Abstandsmesser umfassen.Over two beam splitters 30 . 32 in the form of dichroic or semitransparent mirrors, light is emitted from the light source 12 in the lens 26 of the optical imaging system 4 steered in a microscope housing 34 is stored and the light on the sample 6 focused. This includes the lens 26 an optical element 36 , z. B. a lens by means of an actuator 38 along the optical axis 20 of the lens 26 is controllably movable. The control of the position of the optical element 36 and thus the focus in the sample 6 is by the control means 10 performed. The actuator itself may comprise an independent distance meter sen.

Von der Probe 6 reflektiertes Licht durchtritt das Objektiv 26 in entgegengesetzter Richtung, wie durch einen gestrichelten Pfeil angedeutet ist, und wird über den Strahlteiler 32 einerseits in eine Optik 40 und in den Bilddetektor 8 und andererseits über den Strahlteiler 30 und eine weitere Optik 42 zu einem Detektor 44 geleitet, der mehrere Detektorelemente umfasst (Detektionspfad). Die Detektorelemente können einzelne Sensoren, z. B. Fotodioden, sein oder ein Gitter von Sensoren. Vor dem Detektor 44 ist eine Blende des optischen Systems 22 mit einer Blendenöffnung 46 angeordnet, die entsprechend der Blendenöffnung der Blende 18 geformt ist und in der Bildebene des optischen Systems 22 angeordnet ist, in der ein Bild der Probe 6 und damit des in der Probe 6 abgebildeten des Lichtquellenmusters erzeugt ist. Die Blendenöffnung 46 kann eine oder mehrere Öffnungen umfassen und wird im Folgenden nur als Blendenöffnung 46 bezeichnet. Der Detektor 44 liefert seine Signale an das Steuermittel 10, das diese auswertet und als Steuer- oder Regeleingang für eine Steuerung des Aktuators 38 verwendet. Das Steuermittel kann außerdem das unabhängige Abstandssignal des Aktuators 38 verarbeiten und wahlweise zur Regelung nutzen.From the sample 6 reflected light passes through the lens 26 in the opposite direction, as indicated by a dashed arrow, and is transmitted through the beam splitter 32 on the one hand in an optic 40 and in the image detector 8th and on the other hand via the beam splitter 30 and another look 42 to a detector 44 passed, which includes a plurality of detector elements (detection path). The detector elements can individual sensors, z. As photodiodes, his or a grid of sensors. In front of the detector 44 is a diaphragm of the optical system 22 with a shutter 46 arranged according to the aperture of the aperture 18 is shaped and in the image plane of the optical system 22 is arranged, in which a picture of the sample 6 and with it in the sample 6 imaged of the light source pattern is generated. The aperture 46 may include one or more openings and is hereinafter referred to as aperture only 46 designated. The detector 44 delivers its signals to the control means 10 which evaluates them and as a control or control input for a control of the actuator 38 used. The control means may also control the independent distance signal of the actuator 38 process and optionally use for regulation.

2 zeigt einen schematisiert dargestellten Strahlengang (Beleuchtungspfad) der Autofokuseinrichtung 2 in zwei Lichtpfaden 48, 50 auf die Probe 6. Zur Vereinfachung der Darstellung ist das Lichtmuster der Lichtquelle 12 auf einen Lichtpunkt reduziert, der durch zwei Öffnungen des Mittels 28 zum Auftrennen in die Lichtpfade 48, 50 hindurchstrahlt. Licht aus beiden Lichtpfaden 48, 50 wird in einem punktförmigen Messlichtfokus 52 in der Probe 6 fokussiert. Da sowohl für das Messlicht aus der Lichtquelle 12 als auch das Licht für die Probenuntersuchung durch das Objektiv 26 geführt wird, kann der Messlichtfokus 52 im Fokus der Kamera bzw. des optischen Abbildungssystems 4 liegen, der eine Fokusebene sein kann. Es ist jedoch auch möglich, dass der Messlichtfokus 52 um eine vorbekannte Abstand 54 von einem Fokus 56 der Kamera entfernt ist. 2 shows a schematically illustrated beam path (illumination path) of the autofocus device 2 in two light paths 48 . 50 to the test 6 , For ease of illustration, the light pattern is the light source 12 reduced to a point of light passing through two openings of the agent 28 to split into the light paths 48 . 50 shines through. Light from both light paths 48 . 50 becomes in a punctiform measuring light focus 52 in the sample 6 focused. Because both for the measuring light from the light source 12 as well as the light for the sample examination through the lens 26 can be guided, the measuring light focus 52 in the focus of the camera or the optical imaging system 4 lie, which can be a focal plane. However, it is also possible that the measuring light focus 52 by a known distance 54 from a focus 56 the camera is removed.

Die typische Probe 6 umfasst einen Probenträger 58, auf den biologisches Probenmaterial 60 aufgebracht ist, das mit einem dünnen transparenten Deckglas 62 abgedeckt ist. Diese Probe 6 reflektiert einfallendes Licht an drei Grenzflächen 64, 66, 68, nämlich der stark reflektierenden Luft-Glas-Grenzfläche 64, an der deutlich weniger stark reflektierenden Glas-Probenmaterial-Grenzfläche 66 und an der im Folgenden nicht weiter betrachteten Probenmaterial-Glas-Grenzfläche 68, wobei bei sehr dünnen Probenmaterialien die Signale eine Kombination aus den Grenzflächen 66 und 68 entsteht. Die Glas-Probenmaterial-Grenzfläche 66 bildet hierbei eine in diesem ersten Ausführungsbeispiel beschriebene Fokuszielebene 70, in die der Messlichtfokus 52 durch das Autofokusverfahren geführt werden soll.The typical sample 6 includes a sample carrier 58 on the biological specimen 60 Applied with a thin transparent coverslip 62 is covered. This sample 6 reflects incident light at three interfaces 64 . 66 . 68 namely, the highly reflective air-glass interface 64 , at the much less reflective glass-sample material interface 66 and at the sample material-glass interface which will not be considered further below 68 In the case of very thin sample materials, the signals are a combination of the interfaces 66 and 68 arises. The glass-sample material interface 66 in this case forms a focus target level described in this first embodiment 70 into which the measuring light focus 52 to be guided by the autofocus method.

Das hierzu durchgeführte Autofokusverfahren wird anhand der 3–8 beschrieben. Die 3–6 zeigen das optische System 22 und das Objektiv 26 stark vereinfacht über der Probe 6, die nur anhand der Grenzflächen 64, 66 angedeutet ist. Der Detektor 44 ist anhand zweier Detektorelemente 72, 74 dargestellt, die beidseitig der optischen Achse 20 angeordnet sind. Die Blendenöffnung 46 vor dem Detektor 44 ist so angeordnet, dass sie unsymmetrisch versetzt zur optischen Achse 20 zu liegen kommt, wobei die Achse 20 außerhalb der Blendenöffnung 46 liegt, sie also nicht durchtritt.The autofocus method performed for this purpose is based on the 3 - 8th described. The 3 - 6 show the optical system 22 and the lens 26 greatly simplified over the sample 6 that only based on the interfaces 64 . 66 is indicated. The detector 44 is based on two detector elements 72 . 74 shown on both sides of the optical axis 20 are arranged. The aperture 46 in front of the detector 44 is arranged so that it is asymmetrically offset from the optical axis 20 to lie down, being the axis 20 outside the aperture 46 lies, so it does not pass.

Die beiden Lichtpfade 48, 50 sind in ihrem auf die Probe 6 einfallenden Teil dünn punktiert dargestellt und auf den Messlichtfokus 52 gerichtet, der im Probenträger 58 liegt, also unterhalb der Fokuszielebene 70, die identisch mit der Grenzfläche 66 ist. Von der stark reflektierenden Grenzfläche 64 reflektiertes Licht ist in durchgezogenen Linien dargestellt und von der weniger stark reflektierenden Grenzfläche 66 reflektiertes Licht in gestrichelten Linien. Es ist ersichtlich, dass zum einen im Messlichtfokus 52 kein oder vernachlässigbar wenig Licht reflektiert wird und zum anderen das von den Grenzflächen 64, 66 reflektierte Licht die Blendenöffnung 46 verfehlt, so dass kein Licht zu den Detektorelementen 72, 74 gelangt.The two light paths 48 . 50 are in their to the test 6 incident part shown dotted thin and on the measuring light focus 52 directed, in the sample carrier 58 is below the focus target level 70 that are identical to the interface 66 is. From the highly reflective interface 64 reflected light is shown in solid lines and the less reflective interface 66 reflected light in dashed lines. It can be seen that on the one hand in the measuring light focus 52 no or negligible little light is reflected, and secondly that of the interfaces 64 . 66 reflected light the aperture 46 missed, so no light to the detector elements 72 . 74 arrives.

In 4 ist die Probe 6 im Vergleich zur Abbildung in 3 nach unten bewegt, wie durch Pfeile angedeutet ist, so dass der Messlichtfokus 52 relativ zur Probe 6 nach oben be wegt wurde. Die Bewegung der Probe 6 ist äquivalent zur Bewegung des Objektivs 26 anhand des Aktuators 38. Bei der in 4 dargestellten Stellung der Probe 6 zum Objektiv 26 liegt der Messlichtfokus 52 knapp unterhalb der Grenzfläche 66. Durch die Asymmetrie der Blendenöffnung 46 zur optischen Achse 20 tritt bei dieser Position reflektiertes Licht aus dem Lichtpfad 48 durch die Blendenöffnung 46 und fällt auf das Detektorelement 72, wohingegen Licht vom Lichtpfad 50 die Blendenöffnung 46 verfehlt, so dass das Detektorelement 74 abgeschattet bleibt.In 4 is the sample 6 in comparison to the picture in 3 moved down, as indicated by arrows, so that the measuring light focus 52 relative to the sample 6 moved upward. The movement of the sample 6 is equivalent to the movement of the lens 26 based on the actuator 38 , At the in 4 illustrated position of the sample 6 to the lens 26 lies the measuring light focus 52 just below the interface 66 , Due to the asymmetry of the aperture 46 to the optical axis 20 At this position, reflected light emerges from the light path 48 through the aperture 46 and falls on the detector element 72 while light from the light path 50 the aperture 46 missed, so that the detector element 74 shadowed remains.

Bei einer weiteren Bewegung der Probe 6 nach unten oder des Messlichtfokus 52 in der Probe 6 nach oben erreicht der Messlichtfokus 52 die Grenzschicht 66 und Fokuszielebene 70, wie in 5 dargestellt ist. Die Reflexionen beider Lichtpfade 48, 50 kreuzen sich in der Bildebene, in der die Blende und die Blendenöffnung 46 angeordnet sind. Durch die asymmetrische Blendenöffnung 46 außerhalb der optischen Achse 20 werden beide Lichtpfade 48, 50 weitgehend abgeschattet, jedoch nicht vollständig wegen der flächigen Apertur der Lichtpfade 48, 50. Beide Detektorelemente 72, 74 empfangen jeweils etwas und gleich viel Licht und senden ein gleiches Signal an das Steuermittel 10.In a further movement of the sample 6 down or the measuring light focus 52 in the sample 6 the measuring light focus reaches the top 52 the boundary layer 66 and focus objective level 70 , as in 5 is shown. The reflections of both light paths 48 . 50 intersect in the image plane, in which the aperture and the aperture 46 are arranged. Due to the asymmetrical aperture 46 outside the optical axis 20 Both are light paths 48 . 50 largely shadowed, but not completely because of the areal aperture of the light paths 48 . 50 , Both detector elements 72 . 74 receive each something and the same amount of light and send an equal signal to the control means 10 ,

6 zeigt die Lichtpfade 48, 50 bei einer noch weiteren Bewegung der Probe 6 nach unten oder des Messlichtfokus 52 in der Probe 6 nach oben. Der Messlichtfokus 52 verlässt die Grenzschicht 66 und nähert sich der Grenzschicht 64, so dass die Reflexion der Grenzschicht 66, die nur noch das Detektorelement 74 erreicht, immer weiter abgeschattet wird und die Reflexion der Grenzschicht 64 immer stärker durch die Blendenöffnung 46 auf das Detektorelement 72 fällt. 6 shows the light paths 48 . 50 with a further movement of the sample 6 down or the measuring light focus 52 in the sample 6 up. The measuring light focus 52 leaves the boundary layer 66 and approaches the boundary layer 64 , so that the reflection of the boundary layer 66 that only has the detector element 74 is reached, it is becoming increasingly shadowed and the reflection of the boundary layer 64 getting stronger through the aperture 46 on the detector element 72 falls.

In 7 sind die Amplituden A des Signals 76 des Detektorelements 72 und des Signals 78 des Detektorelements 74 bei einer Bewegung des Messlichtfokus 52 in der Probe 6 wie zu den 3–6 beschrieben über die Zeit t dargestellt. Außerdem ist die Bewegung der Position 80 des Messlichtfokus 52 in z-Richtung, die parallel zur optischen Achse 20 des Objektivs 26 ist, über die Zeit t korrelierend zu den Signalen 76, 78 dargestellt. Vier Zeitpunkte III, IV, V, VI sind markiert, die den Positionen 80 des Messlichtfokus 52 in den 3, 4, 5, 6 entsprechen.In 7 are the amplitudes A of the signal 76 of the detector element 72 and the signal 78 of the detector element 74 during a movement of the measurement light focus 52 in the sample 6 how to the 3 - 6 described over time t. In addition, the movement of the position 80 the measuring light focus 52 in z-direction, parallel to the optical axis 20 of the lens 26 is, over time t correlated to the signals 76 . 78 shown. Four time points III, IV, V, VI are marked, which correspond to the positions 80 the measuring light focus 52 in the 3 . 4 . 5 . 6 correspond.

Zum automatischen Fokussieren der Probe 6 wird zunächst der Lichterzeuger 14 der Autofokus-Lichtquelle 12 eingeschaltet und das Objektiv 26 bzw. deren durch den Aktuator 38 bewegliches optisches Element 36 in ihre Ausgangsstellung – in den Figuren in Richtung der Probe 6 ganz nach unten – bewegt, damit der Messlichtfokus 52 innerhalb der Probe 6 liegt und dort zweckmäßigerweise innerhalb des Probenträgers 58.For automatically focusing the sample 6 first becomes the light generator 14 the auto focus light source 12 turned on and the lens 26 or by the actuator 38 movable optical element 36 in their initial position - in the figures in the direction of the sample 6 all the way down - moves, so that the measuring light focus 52 within the sample 6 lies and expediently within the sample carrier 58 ,

Nun wird der Aktuator 38 so bewegt, dass der Messlichtfokus 52 ganz durch das Probenmaterial 60 und durch die Fokuszielebene 70 hindurchbewegt wird. Gleichzeitig werden kontinuierlich die Signale 76, 78 der Detektorelemente 72, 74 und zweckmäßigerweise auch ein Positionssignal des Aktuators 38 aufgenommen. Zunächst steigt das Signal 76 des Detektorelements 72 an, um schnell wieder abzufallen. Dann steigt das Signal 78 des Detektorelements 74 an und fällt ebenfalls wieder ab, beide entsprechend des Lichteinfalls durch die Blendenöffnung 46 wie zu den 4–6 beschrieben.Now the actuator 38 moved so that the measuring light focus 52 entirely through the sample material 60 and through the focus objective level 70 is moved through. At the same time, the signals become continuous 76 . 78 the detector elements 72 . 74 and expediently also a position signal of the actuator 38 added. First, the signal rises 76 of the detector element 72 to drop off quickly. Then the signal rises 78 of the detector element 74 on and off again, both according to the light through the aperture 46 how to the 4 - 6 described.

Insbesondere wird die Position des Schnittpunkts der Flanken der Signale 76, 78 – im Folgenden Zielposition – aufgenommen, in der der Messlichtfokus 52 in der Fokuszielebene 70 liegt. Diese Zielposition wird durch das Steuermittel 10 erfasst, das mit dem Aktuator 38 verbunden ist, der seine Position bzw. die des optischen Elements 36 ständig oder auf Anfrage des Steuermittels 10 an das Steuermittel 10 gibt.In particular, the position of the intersection of the edges of the signals 76 . 78 - in the following target position - recorded, in which the measuring light focus 52 in the focus objective level 70 lies. This target position is determined by the control means 10 recorded with the actuator 38 connected, its position or that of the optical element 36 constantly or on request of the tax money 10 to the control means 10 gives.

Das erneute starke Ansteigen erst des Signals 76 und dann des Signals 78 über einen Grenzwert g wird als Zeichen und Orientierung dafür genommen, dass sich der Messlichtfokus 52 der stark reflektierenden Grenzfläche 64 nähert und somit oberhalb der Fokuszielebene 70 liegt. Das Bewegen des Messlichtfokus 52 nach oben wird gestoppt.The renewed strong increase of the signal 76 and then the signal 78 over a limit g is taken as a sign and orientation for the fact that the measuring light focus 52 the highly reflective interface 64 approaches and thus above the focus target level 70 lies. Moving the measuring light focus 52 up is stopped.

Nun kann in einem einfachen Verfahrensschritt der Aktuator 38 entsprechend der erfassten Zielposition eingestellt werden und die Probe 6 ist sehr zügig fokussiert. Der Messlichtfokus 52 ist auf die Fokuszielebene 70 eingestellt und damit auch der Fokus des Mikroskops 4, wenn der Messlichtfokus 52 in diesem Fokus liegt. Ansonsten ist der Fokus auf eine gewünscht Ebene eingestellt, die um eine bekannte Strecke von der Fokuszielebene 70 entfernt ist.Now, in a simple process step, the actuator 38 be set according to the detected target position and the sample 6 is focused very quickly. The measuring light focus 52 is at the focus target level 70 adjusted and thus the focus of the microscope 4 when the measuring light focus 52 lies in this focus. Otherwise, the focus is set to a desired level that is around a known distance from the focus target plane 70 is removed.

Eine genauere Fokussierung wird erreicht, wenn die Bewegung des Messlichtfokus 52 umgekehrt wird und der Messlichtfokus 52 diesmal langsamer in das Probenmaterial 60 hineingeführt wird, wie in 7 dargestellt ist. Es bildet sich wieder das Maximum des Signals 76, und ein Einstellen der Signale 76, 78 auf Signalgleichheit führt den Messlichtfokus 52 in die Fokuszielebene 70.A closer focus is achieved when the movement of the measuring light focus 52 is reversed and the measuring light focus 52 slower this time into the sample material 60 is brought in, as in 7 is shown. It again forms the maximum of the signal 76 , and adjusting the signals 76 . 78 on signal equality leads the measuring light focus 52 into the focus target level 70 ,

Eine Regelung auf die Zielposition anhand der Signale 76, 78 ist im Folgenden anhand 8 erläutert. Es wird ein Differenzsignal 82 aus der Differenz zwischen den Signalen 76, 78 gebildet, z. B. durch Subtraktion der Signale 76, 78, und als Regelgröße verwendet mit dem Nulldurchgang 84 als Regelzielwert. Im Nulldurchgang 84 liegt der Messlichtfokus 52 in der Zielposition 86. Vorteilhafterweise ist der Detektor 44 hierzu so kalibriert, dass die Signale 75, 78 gleich sind, wenn der Messlichtfokus 52 in der Fokuszielebene 70 liegt. Soll der Messlichtfokus 52 etwas außerhalb der reflektierenden Grenzschicht 66 liegen, so kann ein Offset auf ein Signal 76, 78 gegeben oder ein Signal 76, 78 mehr oder weniger verstärkt werden. Hierdurch verschiebt sich der Nulldurchgang 84 entsprechend in z-Richtung. Ist die Relation von Offset oder Verstärkung zur Verschiebung bekannt, so kann die Fokuszielebene 70 entsprechend um die Grenzfläche 66 herum eingestellt werden, ohne dass das zu den 7 und 8 geschilderte Autofokusverfahren geändert werden muss. Die entsprechende Einstellung des Detektors 44 kann als Kalibrierung vor einem Autofokusverfahren durchgeführt werden oder während des Autofokusverfahrens auf entsprechende Anweisung des Steuermittels 10.A regulation to the target position based on the signals 76 . 78 is explained below 8th explained. It becomes a difference signal 82 from the difference between the signals 76 . 78 formed, z. B. by subtraction of the signals 76 . 78 , and used as a controlled variable with the zero crossing 84 as a rule target value. In the zero crossing 84 lies the measuring light focus 52 in the target position 86 , Advantageously, the detector is 44 calibrated so that the signals 75 . 78 are the same when the measuring light focus 52 in the focus objective level 70 lies. Should the measuring light focus 52 just outside the reflective boundary layer 66 lie, so may be an offset to a signal 76 . 78 given or a signal 76 . 78 more or less reinforced. This shifts the zero crossing 84 accordingly in the z direction. If the relation of offset or gain to displacement is known, the focus target plane can be 70 corresponding to the interface 66 be set around without that being to the 7 and 8th described autofocus method must be changed. The corresponding setting of the detector 44 may be performed as a calibration prior to an autofocus method or during the autofocus method upon appropriate instruction of the control means 10 ,

Nach dem Einstellen oder Einregeln der Fokusposition kann der Lichterzeuger 14 ausgeschaltet und die Fokusposition mittels des Positionssignals des Aktuators 38 geregelt oder gehalten werden. Dies hat den Vorteil, dass das Autofokus-Lichtmuster während der Belichtung nicht mit der Kamera abgebildet wird. Optional kann der Lichterzeuger 14 kontinuierlich eingeschaltet bleiben und die Regelung nach dem Differenzsignal 82 durchgeführt werden.After adjusting or adjusting the focus position, the light generator can 14 turned off and the focus position by means of the position signal of the actuator 38 be regulated or held. This has the advantage of having the autofocus light pattern during the exposure is not displayed with the camera. Optionally, the light generator 14 remain switched on continuously and the control after the difference signal 82 be performed.

Nun können Bilder der Probe 6 bzw. des Probenmaterials 60 aufgenommen werden, ggf. an mehreren z-Positionen. Diese können durch eine entsprechende Steuerung des Aktuators 38 angefahren werden. Es ist auch möglich, diese durch eine Signalverschiebung eines oder beider Signale 76, 78 zu erreichen.Now you can see pictures of the sample 6 or the sample material 60 be recorded, possibly at several z-positions. These can be controlled by an appropriate control of the actuator 38 be approached. It is also possible this by a signal shift of one or both signals 76 . 78 to reach.

Zur Aufnahme mehrerer Bilder einer großen Probe 6 wird diese in x-y-Richtung 88, also senkrecht zur s-Achse bzw. optischen Achse 20 bewegt, wie in 9 angedeutet ist. Die Fokussierung kann hierbei erhalten bleiben. Ist die Probe 6 jedoch schief, verrutscht der Messlichtfokus 52 um eine Strecke 90 in z-Richtung innerhalb der Probe 6. Um dies zu erkennen, werden die Signale 76, 78 an der neuen x-y-Position auf Plausibilität überprüft. Falls die Signale 76, 78 nicht der Erwartung entsprechen, also außerhalb von Grenzwerten liegen, wird das grobe Finden der Fokuszielebene 70 eingeleitet, wie zu 7 beschrieben ist. Sind die Signale 76, 78 akzeptabel kann direkt mit der Regelung begonnen werden, z. B. auf den Nulldurchgang 84.To take multiple pictures of a large sample 6 this will be in xy direction 88 , ie perpendicular to the s-axis or optical axis 20 moves, as in 9 is indicated. The focus can be maintained here. Is the sample 6 but wrong, the measuring light focus slips 52 by a distance 90 in z-direction within the sample 6 , To detect this, the signals become 76 . 78 checked for plausibility at the new xy position. If the signals 76 . 78 do not meet the expectation, ie lie outside limits, the coarse finding of the focus target level 70 initiated, how to 7 is described. Are the signals 76 . 78 acceptable can be started directly with the scheme, for. B. to the zero crossing 84 ,

10 zeigt eine Projektion eines Lichtquellenmusters auf eine ruhende, schiefe Probe 6. Anhand eines einzigen Autofokus-Lichtpunkts kann nicht erkannt werden, ob die Probe 6 re lativ zur optischen Achse 20 schief ist. Umfasst jedoch der Messlichtfokus 52 mehrere Fokuspunkte 92, z. B. indem ein Lichtmuster an mehreren Fokuspunkten 92 in der Probe abgebildet wird, können Reflexionen aus jedem Fokuspunkt 92 über jeweils zumindest zwei Lichtpfade getrennt ausgewertet werden, wie oben beschrieben wurde. Auf diese Weise kann erkannt werden, dass die jeweils gefundenen Fokuszielebenen zu den einzelnen Fokuspunkten 92 nicht identisch sind. Es kann ein Fehlersignal ausgegeben werden, so dass die Probe 6 erneut und gerade in ihre Halterung eingesetzt wird. 10 shows a projection of a light source pattern on a stationary, crooked sample 6 , A single focus point can not detect the sample 6 relative to the optical axis 20 is awry. However, includes the measuring light focus 52 several focus points 92 , z. B. by a light pattern at multiple focus points 92 Imaged in the sample, reflections can be from any focal point 92 be evaluated separately in each case at least two light paths, as described above. In this way, it can be seen that the respectively found focus target levels to the individual focus points 92 are not identical. An error signal can be output so that the sample 6 is inserted again and straight into its holder.

11 und 12 zeigen alternative Detektionsschemen, die zwei im optischen System 22 räumlich nicht getrennte optische Pfade nutzen. In 11 wird ein Strahl im Detektionspfad erst nach dem optischen System 22 und vor den Detektoren 72, 74 mittels eines halbdurchlässigen Spiegels 94 getrennt. Mittels zweier Blendenöffnungen 46, die asymmetrisch zum Spiegel 94 vor den Detektoren 72, 74 angeordnet sind, wird das Abstandssignal der gering unterschiedlichen Wege detektiert. Die Asymmetrie ist durch die unterschiedlichen Abstände 96, 98 der Blendenöffnungen 46 senkrecht zum Spiegel 94 dargestellt. 11 and 12 show alternative detection schemes, the two in the optical system 22 use spatially non-separated optical paths. In 11 becomes a beam in the detection path only after the optical system 22 and in front of the detectors 72 . 74 by means of a semipermeable mirror 94 separated. By means of two apertures 46 that is asymmetrical to the mirror 94 in front of the detectors 72 . 74 are arranged, the distance signal of the slightly different paths is detected. The asymmetry is due to the different distances 96 . 98 the apertures 46 perpendicular to the mirror 94 shown.

In 12 emittiert der Lichterzeuger 14 Strahlung mit zwei unterschiedlichen Frequenzen (λ₁, λ₂), die vor den Detektoren 72, 74 mittels eines dichroidischen Spiegels 100 getrennt werden. Wiederum wird mit Hilfe der Blendenöffnungen 46 das Abstandsignal erzeugt. In diesem Fall können die Blendenöffnungen 46 symmetrisch zum dichroidischen Spiegel 100 angeordnet sein, wenn der Brechungsindex des optischen Systems 22 die Lichtpfade der unterschiedlichen Frequenzen ausreichend räumlich trennt, wie in 12 durch die Abstände der beiden Lichtpfade vor dem Spiegel 100 dargestellt ist.In 12 the light generator emits 14 Radiation with two different frequencies (λ ₁ , λ ₂ ), in front of the detectors 72 . 74 by means of a dichroidic mirror 100 be separated. Again, with the help of the apertures 46 generates the distance signal. In this case, the apertures can 46 symmetrical to the dichroic mirror 100 be arranged when the refractive index of the optical system 22 the light paths of the different frequencies sufficiently spatially separates, as in 12 by the distances of the two light paths in front of the mirror 100 is shown.

22: AutofokusvorrichtungAutofocus device
44: Mikroskopmicroscope
66: Probesample
88th: Bilddetektorimage detector
1010: Steuermittelcontrol means
1212: Lichtquellelight source
1414: Lichterzeugerlight generator
1616: Optikoptics
1818: Blendecover
2020: optische Achseoptical axis
2222: optisches Systemoptical system
2424: optisches Elementoptical element
2626: Objektivlens
2828: Mittelmedium
3030: Strahlteilerbeamsplitter
3232: Strahlteilerbeamsplitter
3434: Mikroskopgehäusemicroscope housing
3636: optisches Elementoptical element
3838: Aktuatoractuator
4040: Optikoptics
4242: Optikoptics
4444: Detektordetector
4646: Blendenöffnungaperture
4848: Lichtpfadlight path
5050: Lichtpfadlight path
5252: MesslichtfokusMeasuring light focus
5454: Abstanddistance
5656: Fokusfocus
5858: Probenträgersample carrier
6060: Probenmaterialsample material
6262: Deckglascover glass
6464: Grenzflächeinterface
6666: Grenzflächeinterface
6868: Grenzflächeinterface
7070: FokuszielebeneFocus target level
7272: Detektorelementdetector element
7474: Detektorelementdetector element
7676: Signalsignal
7878: Signalsignal
8080: Positionposition
8282: Differenzsignaldifference signal
8484: NulldurchgangZero-crossing
8686: Zielpositiontarget position
8888: Richtungdirection
9090: Streckeroute
9292: Fokuspunktfocus point
9494: Spiegelmirror
9696: Abstanddistance
9898: Abstanddistance
100100: Spiegelmirror
AA: Amplitudeamplitude
gG: Grenzwertlimit
tt: ZeitTime
zz: Richtung der optischen Achsedirection the optical axis

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 6130745 [0004]

Claims

Autofocus method in which light from a light source ( 12 ) in a measuring light focus ( 52 ) in a sample ( 6 ) and thrown back from there, and the light reflected back through an optical system ( 22 ) in two light paths ( 48 . 50 ) on at least two detector elements ( 72 . 74 ), characterized in that the measuring light focus ( 52 ) in layers of the sample which reflect light to different degrees ( 6 ) and the detector elements ( 72 . 74 ) are arranged so that in this case courses one of the detector elements ( 72 . 74 ) registered radiation property are different from each other and a focus position is adjusted depending on the gradients.

A method according to claim 1, characterized in that the reflected light by at least one aperture ( 46 ), which are outside an optical axis ( 20 ) of the optical system ( 22 ) is arranged.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the light in the light paths ( 48 . 50 ) has different spectral properties and the light paths ( 48 . 50 ) in front of the detector elements ( 72 . 74 ) are separated according to the spectral properties.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the gradients continuously be recorded.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a focus of the optical system ( 22 ) is adjusted so that signals ( 76 . 78 ) of the detector elements ( 72 . 74 ) are in a fixed relationship to each other and in particular are equally strong.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a difference of signals ( 76 . 78 ) of the detector elements ( 72 . 74 ) and a focus of the optical system ( 22 ) to the zero crossing of the difference signal ( 82 ) is set.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a target position of a focus of the optical system ( 22 ) with the help of the signals ( 76 . 78 ) of the detector elements ( 72 . 74 ) and the focus is detected by means of an actuator ( 38 ) is set.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the detector elements ( 72 . 74 ) are calibrated so that the strength of their signal ( 76 . 78 ), that of a boundary layer ( 66 ) caused by the reflected light is the same.

Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the detector elements ( 72 . 74 ) are set so that the strength of their signal ( 76 . 78 ), that of a boundary layer ( 66 ) is caused to be reflected light by a predetermined value from each other.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the measuring light focus ( 52 ) to a sample-air interface ( 64 ) and the reflection of the sample-air interface ( 64 ) is used for rough orientation.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the measuring light focus ( 52 ) on a light-reflecting boundary layer ( 66 ) and then the sample ( 6 ) perpendicular to the optical axis ( 20 ) of the optical system ( 22 ) and the signals ( 76 . 78 ) of the detector elements ( 72 . 74 ) then plausibility with respect to a still existing coarse adjustment on the reflective boundary layer ( 66 ).

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the reflected light by at least one aperture ( 46 ), in their shape the shape of the light source ( 12 ) corresponds.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the light source ( 12 ) has a light pattern in the sample ( 6 ) is displayed.

A method according to claim 13, characterized in that reflected light from a plurality of pattern points of the light pattern in each case according to light paths ( 48 . 50 ) is detected separately.

A method according to claim 14, characterized in that from a plurality of target positions to the plurality of pattern points a tilt of a reflective boundary layer ( 66 ) is detected.

Autofocus device ( 2 ) with an optical system ( 22 ) for focusing light in a measuring light focus ( 52 ) in a sample ( 6 ) and for guiding reflected light therefrom onto at least two detector elements ( 72 . 74 ), characterized by an actuator ( 38 ) and a control means ( 10 ) to move an item ( 36 ) of the optical system ( 22 ) relative to the sample ( 6 ) by the actuator ( 38 ) such that the measuring light focus ( 52 ) in layers of the sample which reflect light to different degrees ( 6 ) is moved, the detectors lemente ( 72 . 74 ) are arranged so that in this case courses one of the detector elements ( 72 . 74 ) registered radiation property are different and the control means ( 10 ) for evaluating the courses ( 72 . 74 ) at several positions of the measurement light focus ( 52 ) is provided.