DE102011018586A1 - New vector system, useful e.g. as a part of a viral or non-viral gene transfer vector to control targeted expression of a therapeutic DNA sequence and as a part of transfer construct or gene construct for modifying embryonic stem cells - Google Patents

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Abstract

Vector system is new, where the vector system is a part of a viral or non-viral gene transfer vector, in which a desired gene, a complementary DNA (cDNA) or a functional DNA segment linked to the regulatory DNA sequence of the human-Troponin-T promoter is cloned. ACTIVITY : None given. MECHANISM OF ACTION : Gene therapy.

Description

Die Erfindung betrifft ein Vektorsystem, welches eine spezifische und effiziente Genexpression im Herzmuskel in vivo ermöglicht sowie seine Verwendung. Die Abkürzungen in der Beschreibung und den Ansprüchen bedeuten folgendes: AAV = Adeno-assoziiertes VirusThe invention relates to a vector system which enables specific and efficient gene expression in the myocardium in vivo and its use. The abbreviations in the specification and the claims mean the following: AAV = adeno-associated virus

Kardiovaskuläre Erkrankungen bleiben die häufigste Todesursache in den technologisch hochentwickelten Gesellschaften und verursachen erhebliches Leid für die betroffenen Patienten. Gentransfer in das erkrankte myokardiale Gewebe mittels Vektoren, die auf Adeno-assoziierten Viren beruhen, ist eine vielversprechender Ansatz für eine Vielzahl an Gentherapievorhaben mit dem Ziel, diese Erkrankungen zu heilen oder wenigstens zu mildern. Um die Expression der therapeutischen Nukleinsäure zu steuern bedarf es einer regulatorischen Sequenz. Für Anwendungen wie den AAV-basierten Gentransfer muss diese Sequenz kompakt sein und eine starke aber gewebespezifische Expression sicherstellen. Die Verwendung einer Sequenz mit solchen Eigenschaften wird als transkriptionelles Targeting bezeichnet. Während auf der Ebene des transduktionellen Targetings AAV-basierter Vektoren für Herzgewebe durch Verwendung bereits zuvor existierender oder rekombinanter Kapside zur Pseudotypisierung in jüngerer Vergangenheit eindrucksvolle Erfolge erzielt und publiziert wurden gibt es noch viel Raum zur Verbesserung des transkriptionellen Targetings.Cardiovascular disease remains the leading cause of death in the most technologically advanced societies and causes significant harm to the affected patients. Gene transfer into the diseased myocardial tissue by means of vectors based on adeno-associated viruses is a promising approach for a variety of gene therapy projects aimed at curing or at least alleviating these diseases. To control the expression of the therapeutic nucleic acid requires a regulatory sequence. For applications such as AAV-based gene transfer, this sequence must be compact and ensure strong but tissue-specific expression. The use of a sequence with such properties is referred to as transcriptional targeting. While impressive successes have been achieved and published on the level of transduction targeting of AAV-based vectors for cardiac tissue by using previously existing or recombinant capsids for pseudotyping in the recent past, there is still much room for improving transcriptional targeting.

Ein geeigneter Promoter für den AAV-basierten myokardialen Gentransfer muss klein sein, da die Verpackungskapazität der AAV Kapside limitiert ist, eine starke Expression im Herzgewebe hervorrufen um mit einer praktikablen Vektordosis therapeutische Expressionslevel zu erreichen und das Transgen in sehr herzspezifischer Weise zur Expression bringen um negative Auswirkungen zu vermeiden, die andernfalls bei Expression des Transgens außerhalb des Zielgewebes verursacht werden könnten. Ein Ansatz, Sequenzen mit diesen Eigenschaften zu entwickeln ist die Klonierung von Fragmenten endogener Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie in gewissem Umfang herzspezifische Expression der von ihnen regulierten Gene verursachen. Im Rahmen eines solchen Vorhabens haben wir unter anderem Fragmente des humanen TroponinT-Promoters kloniert.A suitable promoter for AAV-based myocardial gene transfer must be small, since the packaging capacity of the AAV capsids is limited, elicit strong expression in cardiac tissue to achieve therapeutic expression levels with a practicable vector dose and express the transgene in a very cardiac-specific manner To avoid effects that might otherwise be caused by expression of the transgene outside of the target tissue. One approach to developing sequences with these properties is the cloning of fragments of endogenous promoters known to cause, to some extent, cardiac expression of the genes they regulate. As part of such a project, we have cloned, inter alia, fragments of the human TroponinT promoter.

Während Fragmente der TroponinT-Promotoren andere Spezies schon erfolgreich eingesetzt wurden um Transgenexpression im murinem Myokard hervorzurufen haben wir uns bewusst für die Erprobung von humanen Fragmenten entschieden, da diese Vorgehensweise über den offensichtlichen Vorteil verfügt, dass deren Funktion im Menschen bereits erwiesen ist, das sie endogenen Ursprungs sind. Daher sind die Erfolgsaussichten einer Klinischen Studie bei Verwendung dieser Fragmente besser als bei Verwendung von Fragmenten andere Spezies.While fragments of the troponin T promoters have been successfully used by other species to induce transgene expression in the murine myocardium, we have deliberately chosen to test human fragments, as this approach has the obvious advantage that its function in humans has already been proven of endogenous origin. Therefore, the chances of success of a clinical trial when using these fragments are better than when using fragments other species.

Für viele Anwendungen im Bereich der Gentherapie oder Forschung ist es wünschenswert, die Transkription einer in Zellen eingebrachten DNA-Sequenz auf ein bestimmtes Gewebe oder sogar einen bestimmten Zelltyp zu beschränken. Dazu können unter Anderem regulatorische Sequenzen stromaufwärts der zu regulierenden Sequenz eingesetzt werden um das Ausmaß der Transkription zu steuern. Im Idealfall führt ein regulatorisches Element zu sehr starker Transkription in Zellen oder Gewebe wo diese gewünscht ist und zu keiner Transkription anderswo. Unser Ziel war, eine regulatorische Sequenz zu finden, die zu starker Transkription im Herzen führt und dabei möglichst wenig Transkription in anderen Geweben hervorruft.For many applications in the field of gene therapy or research, it is desirable to limit transcription of a cell-inserted DNA sequence to a particular tissue or even a particular cell type. Among others, regulatory sequences upstream of the sequence to be regulated may be used to control the extent of transcription. Ideally, a regulatory element will lead to very strong transcription in cells or tissues where it is desired and not to transcription elsewhere. Our goal was to find a regulatory sequence that leads to strong transcription in the heart while causing minimal transcription in other tissues.

Die von uns verfolgte Vogehensweise hat grundlegende Vorteile gegenüber anderen Möglichen Ansätzen um diese Ziele zu erreichen. Es gibt unter anderem folgende Wege, die Transkription eingebrachter DNA-Sequenzen auf ein bestimmtes Zielgewebe zu beschränken:

  • 1. DNA wird durch spezielle Applikationstechniken nur in das Zielgewebe eingebracht, andere Gewebe werden nach Möglichkeit von jeglichem DNA-Transfer verschont.
  • 2. Die DNA wird, beispielsweise durch Verpacken in ein virales Kapsid auf einen bestimmten Zelltyp hingelenkt
  • 3. Die Transkription der DNA wird durch eine geeignete upstream gelegene regulatorische Sequenz in ihrer Transkription reguliert.
  • 4. Die DNA enthält stromabwärts eine regulatorische Sequenz, beispielsweise kodierend für eine Mikro RNA-Bindungsstelle, die zum verstärkten Abbau der bei der Transkription gebildeten RNA führt. Diese Lösung setzt erst nach der Transkription ein.
The approach we follow has fundamental advantages over other possible approaches to achieving these goals. There are, inter alia, the following ways of limiting the transcription of introduced DNA sequences to a specific target tissue:
  • 1. DNA is introduced by special application techniques only in the target tissue, other tissues are spared as far as possible from any DNA transfer.
  • 2. The DNA is directed to a specific cell type, for example, by packaging in a viral capsid
  • 3. Transcription of the DNA is regulated by a suitable upstream regulatory sequence in its transcription.
  • 4. The DNA contains downstream a regulatory sequence, for example, coding for a micro RNA binding site, which leads to increased degradation of the RNA formed in the transcription. This solution starts after transcription.

Die bekannten Lösungen besitzen die Nachteile, dass keine für sich genommen absolut effektiv ist. In der Praxis ist es daher oft angeraten, mehrere dieser Lösungsansätze miteinander zu kombinieren. Wie in 3. formuliert existieren bereits Losungen mit stromaufwärts gelegenen regulatorischen Elementen. Diese verwenden jedoch regulatorische Sequenzen die in geringerem Ausmaß die beschriebenen Ziele erfüllen als die hier beschriebene Sequenz.The known solutions have the disadvantages that none are absolutely effective on their own. In practice, it is therefore often advisable to combine several of these approaches together. As stated in 3., solutions with upstream regulatory elements already exist. These however, use regulatory sequences that to a lesser extent meet the described objectives than the sequence described herein.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine regulatorische Sequenz zu finden, möglichst ausschließlich im Herzmuskel in vivo eine starke Transkription einer bestimmten DNA-Sequenz zu ermöglichen und, falls ebenfalls DNA in anderes Gewebe gelangt, dort dazu zu führen, dass möglichst wenig Transkription stattfindet. Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.The invention had the object of finding a regulatory sequence, as possible exclusively in the myocardium in vivo to allow strong transcription of a particular DNA sequence and, if also DNA gets into other tissue, there to cause the least possible transcription takes place. The invention is realized according to the claims. The subclaims are preferred variants.

Wir haben unterschiedliche Sequenzen der Promotorregion des humanen TroponinT-Gens kloniert ( ) und in vitro wie auch in vivo auf Expressionseffizienz und Spezifität untersucht.We have cloned different sequences of the promoter region of the human troponin T gene ( ) and in vitro as well as in vivo for expression efficiency and specificity.

Bei der Untersuchung der Promotorsequenzen nach AAV6-vermitteltem Gentransfer in vitro zeigte sich, dass die Expression eines Reportergens (Luciferase), die durch die klonierten Fragmente nach transduktion neonataler Rattenkardiomyozyten hervorgerufen werden konnte, vergleichbar war mit der Expression, die durch die Kontrollen verursacht wurde. In 293T Zellen lag sie jedoch mehrere Zehnerpotenzen unter der von den Kontrollen mit dem CMV-Promotor verursachten Expression. Ein solches Ergebnis mit nur schwacher Expression durch die Fragmente des TroponinT-Promoters wurde überraschenderweise auch mit adulten Rattenkardiomyozyten erzielt ( – ).Examination of the promoter sequences after AAV6-mediated gene transfer in vitro revealed that the expression of a reporter gene (luciferase), which could be induced by the cloned fragments after transduction of neonatal rat cardiomyocytes, was comparable to the expression caused by the controls. In 293T cells, however, it was several orders of magnitude lower than that caused by controls with the CMV promoter. Such a result with only weak expression by the fragments of the troponin T promoter was surprisingly also achieved with adult rat cardiomyocytes ( - ).

Daher schien eine Untersuchung in vivo unverzichtbar. Überraschenderweise zeigte sich in den Versuchen mit adulten NMRI Mäusen, dass alle Fragmente nach intravenöser Injektion von AAV9-Vektoren eine myokardiale Luciferaseexpression mit unterschiedlicher Stärke und Spezifität hervorrufen. Das längste der Fragmente (–502 bis +43) erzeugte die stärkste und auch spezifischste Expression, wobei die im Herz nachgewiesenen Luciferaseaktivitäten nicht signifikant von den Kontrollen (kürzere TroponinT-Fragmente, CMV-Promotor) abwichen, während die Expression in Nicht-Zielgeweben wie Leber, Skelettmuskel, Niere und Milz mehrere Zehnerpotenzen unter den bei den Kontrollen dort gemessenen Aktivitäten lagen ( ).Therefore, an in vivo study seemed indispensable. Surprisingly, it was found in the experiments with adult NMRI mice that all fragments after intravenous injection of AAV9 vectors cause a myocardial luciferase expression with different strength and specificity. The longest of the fragments (-502 to +43) produced the strongest and most specific expression, with the luciferase activities detected in the heart not deviating significantly from controls (shorter troponin T fragments, CMV promoter), whereas expression in non-target tissues such as Liver, skeletal muscle, kidney and spleen were several orders of magnitude lower than the activities measured in the controls ( ).

Die regulatorische Sequenz des humanen TroponinT-Promotors enthält daher offenbar regulatorische Elemente, die unter den Bedingungen, wie sie in den Zellen myokardialen Gewebes vorliegen zu starker Transkription führen, während sie unter den Bedingungen in einer Vielzahl anderer Zelltypen zu einer geringeren Transkription führt.The regulatory sequence of the human troponin T promoter therefore appears to contain regulatory elements that lead to strong transcription under the conditions found in the cells of myocardial tissue, while resulting in less transcription under conditions in a variety of other cell types.

Das Fragment von –502 to +43 des humanen TroponinT-Promoters ist sehr geeignet, die Transgenexpression in vorklinischen Modellen myokardialer Gentherapie, Zielvalidierung oder konditionalem Knockdown zu regulieren. Wir haben gezeigt, dass es sowohl starke, als auch myokardspezifische Expression verursacht. Es ist daher auch ein aussichtsreicher Kandidat für den Schritt vom Tiermodell in die Klinik, da es aufgrund seines endogenen Ursprungs erwiesenermaßen im Menschen funktionsfähig ist. Im Vergleich zu anderen beschriebenen Konstrukten ist es sehr klein und erlaubt somit größere Transgene. Insbesondere bei Verwendung im AAV-Kontext stellt dies einen erheblichen Vorteil dar, da die Verpackungskapazität der AAV Vektoren sehr begrenzt ist.The fragment of -502 to +43 of the human troponin T promoter is very well suited to regulate transgene expression in preclinical models of myocardial gene therapy, target validation or conditional knockdown. We have shown that it causes both strong and myocardial expression. It is therefore also a promising candidate for the step from the animal model to the clinic, since it has been proven to be functional in humans due to its endogenous origin. Compared to other constructs described it is very small and thus allows larger transgenes. In particular, when used in the AAV context, this represents a significant advantage because the packaging capacity of the AAV vectors is very limited.

Die Neuheit dieser Erfindung besteht in der Identifizierung geeigneter Fragmente des humanen TroponinT Promoters. Bisherige Arbeiten haben sich hingegen mit den Sequenzen anderer Spezies, vor allem des Huhnes und der Ratte, befasst1-6. Diese unterscheiden sich in Art und Anordnung der regulatorischen Elemente7,8.The novelty of this invention is the identification of suitable fragments of the human troponin T promoter. Previous work, however, has dealt with the sequences of other species, especially the chicken and the rat, 1-6 . These differ in the nature and arrangement of the regulatory elements 7,8 .

Wesentliche Vorteile der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik sind:

  • 1. Die regulatorische Sequenz ist klein, was in Gentherapievektoren mit geringer Verpackungskapazität wie Adeno-assoziierten viralen Vektoren ein großer Vorteil ist.
  • 2. Die regulatorische Sequenz führt zu starker Transkription im Herzmuskel.
  • 3. Die regulatorische Sequenz führt nur zur schwachen Expression in allen untersuchten anderen Geweben.
  • 4. Die regulatorische Sequenz ist humanen Ursprungs. Damit ist ihre Funktion auch in menschlichem Herzmuskel anzunehmen.
Significant advantages of the invention over the prior art are:
  • 1. The regulatory sequence is small, which is a great advantage in gene therapy vectors with low packaging capacity such as adeno-associated viral vectors.
  • 2. The regulatory sequence leads to strong transcription in the heart muscle.
  • 3. The regulatory sequence leads only to weak expression in all other tissues examined.
  • 4. The regulatory sequence is of human origin. Thus, their function is to be accepted in human heart muscle.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert worden:The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments:

Beispiel 1: Example 1:

Klonierung verschiedener Fragmente des humanen TroponinT-PromotersCloning of various fragments of the human troponin T promoter

Vier Fragmente des humanen TroponinT-Promoters mit den Längen –502 bis +3, 502 bis + 43, –267 bis +3 und –267 bis +43 wurden kloniert.Four fragments of human troponin T promoter of lengths -502 to +3, 502 to + 43, -267 to +3 and -267 to +43 were cloned.

Verwendet wurden dazu die Folgenden Primer:

Figure 00050001
The following primers were used:
Figure 00050001

Mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) wurde aus einer Blutprobe des Miterfinders Stanislas Werfel, entsprechend Herstelleranleitung, genomische DNA isoliert. Zunächst wurde, im Sinne einer verschachtelten PCR, mit den Primern TnnT2extSP und TnnP2extAP ein 1,2 kb großes Fragment, welches den Troponin T Promoterbereich mit einschließt, in 20 PCR-Zyklen mit der Phusion-Polymerase präamplifiziert. Das Produkt wurde mit dem QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) gereinigt und für weitere PCR Reaktionen verwendet. Für den Entwurf der Primer wurde die GenBank genomische Sequenz NG_007556 und die Software Vector NTI (Invitrogen, Karlsruhe) verwendet.DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) was used to isolate genomic DNA from a blood sample of co-inventor Stanislas Werfel, according to the manufacturer's instructions. First, in the sense of a nested PCR, with the primers TnnT2extSP and TnnP2extAP a 1.2 kb fragment which includes the troponin T promoter region was preamplified in 20 PCR cycles with the phusion polymerase. The product was purified with the QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) and used for further PCR reactions. For the design of the primers, the GenBank genomic sequence NG_007556 and the software Vector NTI (Invitrogen, Karlsruhe) were used.

Die vier untersuchten TnnT2-Promoterregionen (größtes Fragment ) wurden anschließend mit der Phusion-Polymerase durch unterschiedliche Kombination von vier Primern amplifiziert. Die sense Primer trugen dabei Schnittstellen für MluI und die anti-sense für HindIII an den 5' Überhängen. Die PCR Produkte wurden mit MluI und HindIII verdaut um sie dann für die Ligation einzusetzen. Als Backbone wurde der Vektor pdsCMVenh-MLC0.26-hRluc verwendet (ein Derivat von pdsCMVenh-MLC0.26-EGFP9), welcher ebenfalls mit MluI und HindIII verdaut und anschließend mit CIP dephosphoryliert wurde. Das Backbone und die Inserts wurden dann über ein Agarosegel aufgetrennt und entsprechend ligiert.The four investigated TnnT2 promoter regions (largest fragment ) were then amplified with the phage polymerase by different combinations of four primers. The sense primers carried interfaces for MluI and the anti-sense for HindIII at the 5 'overhangs. The PCR products were digested with MluI and HindIII for use in ligation. The backbone used was the vector pdsCMVenh-MLC0.26-hRluc (a derivative of pdsCMVenh-MLC0.26-EGFP 9 ) which was also digested with MluI and HindIII and subsequently dephosphorylated with CIP. The backbone and the inserts were then separated on an agarose gel and ligated accordingly.

Durch Sequenzierung wurden alle vier Klonierungen erfolgreich bestätigt. Es zeigte sich dabei eine 100%-ige Übereinstimmung mit der Sequenz NG_007556 im entsprechenden Bereich.By sequencing, all four clonings were successfully confirmed. It showed a 100% agreement with the sequence NG_007556 in the corresponding area.

Beispiel 2Example 2

Erzeugung der VektorenGeneration of the vectors

Die zuvor beschriebenen Promoterfragmente wurden in ein Expressionsplasmid kloniert, welches als Reportergen Renilla-Luciferase enthält. Konstrukte mit CMV Promoter und einem Hybridpromoter bestehend aus dem CMV Enhancer und einem 260 Basen Segment des MLC Promoters wurden als Kontrollen ebenfalls erzeugt. Die so erhaltenen Plasmide, in denen die Expressionskassete außerdem von AAV2 inverted terminal repeats (ITR) flankiert ist, wurden in 293T Zellen transfiziert um unter Zuhilfenahme der zusätzlich notwendigen Helferplasmide AAV6 basierte Vektoren zu erzeugen. Für die in vivo Versuche wurden alle Vektoren auch mit AAV9 Kapsiden hergestellt10.The above-described promoter fragments were cloned into an expression plasmid containing Renilla luciferase as the reporter gene. Constructs with CMV promoter and a hybrid promoter consisting of the CMV enhancer and a 260 base segment of the MLC promoter were also generated as controls. The plasmids thus obtained, in which the expression cassette is also flanked by AAV2 inverted terminal repeats (ITR), were transfected into 293T cells in order to generate AAV6-based vectors with the aid of the additionally necessary helper plasmids. For the in vivo experiments, all vectors were also produced with AAV9 capsids 10 .

Beispiel 3:Example 3:

In vitro TestsIn vitro tests

AAV6 Vektoren wurden eingesetzt, um verschiedene Zelltypen zu tranduzieren und festzustellen, welches Ausmaß an Expression die verschiedenen Promoterfragmente in diesen hervorrufen, wobei die in den Proben gemessene Luciferaseaktivität als Maß für die Expressionsstärke herangezogen wurde. Es wurden folgende Zelltypen verwendet: HEK293T-Zellen, neonatale Rattenkardiomyozyten und adulte Rattenkardiomyozyten ( – ). In HEK293T-Zellen und neonatalen Rattenkardiomyozyten wurde pro Zelle 104 Vektoren appliziert, in adulten Rattenkardiomyozyten pro Zelle 105 Vektoren. Nach 48 Stunden wurden die Zellen geerntet und Luciferase-Aktivitäten bestimmt.AAV6 vectors were used to induce different cell types and determine the level of expression of the various promoter fragments in them, using the luciferase activity measured in the samples as a measure of expression strength. The following cell types were used: HEK293T cells, neonatal rat cardiomyocytes and adult rat cardiomyocytes ( - ). In HEK293T cells and neonatal rat cardiomyocytes 10 4 vectors were administered per cell, in adult rat cardiomyocytes per cell 10 5 vectors. After 48 hours cells were harvested and luciferase activities determined.

Beispiel 4:Example 4:

In vivo Tests:In vivo tests:

Da anhand der in vitro Daten offensichtlich ist, dass sich die Fragmente unter diesen Bedingungen sehr anders verhalten als es anhand der Funktion des TroponinT-Promoters im lebenden Menschen anzunehmen gewesen wäre ergab sich die Notwendigkeit weitere Daten im Tierversuch zu erheben. Dazu wurden Gruppen jeweils 5 weiblicher NMRI Mäuse im Alter von 6–8 Wochen mit 1011 DNase-resistenten genomhaltigen Vektorpartikeln pro Tier der jeweiligen AAV9 Vektoren intravenös injiziert. 6 Wochen nach der Injektion wurden die Tiere zur Entnahme von Gewebeproben getötet. Die entnommenen Gewebeproben wurden aufgeschlossen und mittels Luciferase-Assay (Promega) nach Herstellerangaben in einem Luminometer untersucht ( ).Since it is evident from the in vitro data that the fragments behave very differently under these conditions than would have been expected from the function of the troponin T promoter in living humans, there was a need to collect further data in animal experiments. For this purpose, groups of in each case 5 female NMRI mice at the age of 6-8 weeks were intravenously injected with 10 11 DNase-resistant genome-containing vector particles per animal of the respective AAV9 vectors. Six weeks after the injection, the animals were sacrificed for tissue sampling. The removed tissue samples were disrupted and examined by luciferase assay (Promega) according to the manufacturer's instructions in a luminometer ( ).

Literaturverzeichnis:Bibliography:

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  • 10. Goehringer C, Rutschow D, Bauer R, Schinkel S, Weichenhan D, Bekeredjian R, Straub V, Kleinschmidt JA, Katus HA, Müller OJ. Prevention of cardiomyopathy in δ-sarcoglycan knock-out mice after systemic transfer of targeted adeno-associated viral vectors. Cardiovasc Res. 2009: 82(3): 404–10 .10th Goehringer C, Rutschow D, Bauer R, Schinkel S, Weichenhan D, Bekeredjian R, Straub V, Kleinschmidt JA, Katus HA, Müller OJ. Prevention of cardiomyopathy in δ-sarcoglycan knock-out mice after systemic transfer of targeted adeno-associated viral vectors. Cardiovasc Res. 2009: 82 (3): 404-10 ,

Claims (10)

Vektor-System zur spezifischen in vivo Gexexpression in Herzmuskelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass es Bestandteil eines viralen oder nicht-viralen Gentransfervektors ist, in dem ein beliebiges Gen, eine cDNA oder funktioneller DNA-Abschnitt gekoppelt an die regulatorische DNA-Sequenz des humanen TroponinT-Promotors einkloniert ist.Vector system for specific in vivo expression in heart muscle cells, characterized in that it is part of a viral or non-viral gene transfer vector in which any gene, cDNA or functional DNA portion coupled to the human troponin T regulatory DNA sequence Promoter is einkloniert. Vektor-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das beliebige Gen, die cDNA oder der funktionelle DANN-Abschnitt eine Intron, microRNA-Targeting-Sequenz und Poly-A-Sequenz enthält.Vector system according to claim 1, characterized in that the random gene, the cDNA or the functional THEN section contains an intron, microRNA targeting sequence and poly-A sequence. Vektorsystem nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Teile oder Varianten der regulatorischen humanen TroponinT-Sequenz eingesetzt werden.Vector system according to claim 1 and 2, characterized in that parts or variants of the human troponin T regulatory sequence are used. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Bestandteil eines Transferkonstruktes zur Modifikation embryonaler Stammzellen eingesetzt wird.Use of the vector system according to claim 1 to 3, characterized in that it is used as part of a transfer construct for the modification of embryonic stem cells. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Bestandteil eines viralen bzw. nicht-viralen Gentransfervektors gezielte Expression einer therapeutischen DNA-Sequenz steuert, welche bei einer zu behandelnden Krankheit qualitativ oder quantitativ verändert werden soll. Use of the vector system according to claim 1 to 3, characterized in that it controls targeted expression of a therapeutic DNA sequence as part of a viral or non-viral gene transfer vector, which should be qualitatively or quantitatively changed in a disease to be treated. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 1 bis 3 zur Gentherapie, wobei das Vektorsystem konfektioniert und über die Blutbahn, vorzugsweise über ein Katheterverfahren in das arterielle oder venöse Koronarsystem appliziert wird.Use of the vector system according to claim 1 to 3 for gene therapy, wherein the vector system is assembled and applied via the bloodstream, preferably via a catheter method in the arterial or venous coronary system. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Vektorsystem ein Adeno-assoziierter Vektor ist.Use of the vector system according to claims 1 to 3, characterized in that the vector system used is an adeno-associated vector. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierende DNA-Sequenz eine Cre-Rekombinase ist und zur Erzeugung einer konditionalen Geninaktivierung verwendet werden soll.Use of the vector system according to claims 1 to 3, characterized in that the DNA sequence to be expressed is a Cre recombinase and is to be used to produce a conditional gene inactivation. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Bestandteil eines Gentransferkonstruktes zur Modifikation embryonaler Stammzellen eingesetzt wird.Use of the vector system according to claim 1 to 3, characterized in that it is used as part of a gene transfer construct for the modification of embryonic stem cells. Verwendung des Vektor-Systems nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Bestandteil eines Gentransferkonstruktes eingesetzt wird, welches die Expression eines Markergens kontrolliert, zur Selektion und/oder Immortalisierung von Herzmuskelzellen aus embryonalen Stammzellen eingesetzt wird.Use of the vector system according to claim 9, characterized in that it is used as part of a gene transfer construct which controls the expression of a marker gene, is used for the selection and / or immortalization of heart muscle cells from embryonic stem cells.
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