DE102011012060A1 - Mass spectrometric determination of the inhibitory effect of substances on beta-lactamases - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Substanz gegenüber beta-Lactamasen bereit, bei denen die Substanz mit einer beta-Lactamase und einem Substrat, das einen beta-Lactamring aufweist, zusammengeführt wird und danach ein Massenspektrum aufgenommen und dahingehend ausgewertet wird, ob das Substrat durch die beta-Lactamase enzymatisch modifiziert worden ist.The invention provides a method for determining the inhibitory effect of a substance against beta-lactamases, in which the substance is combined with a beta-lactamase and a substrate that has a beta-lactam ring and then a mass spectrum is recorded and evaluated to determine whether the substrate has been enzymatically modified by the beta-lactamase.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung von Substanzen gegenüber beta-Lactamasen und insbesondere der inhibitorischen Wirksamkeit des Inhibitors eines antibiotischen Kombinationspräparates bestehend aus einem beta-Lactam Antibiotikum und dem Inhibitor.The invention relates to a method for determining the inhibitory effect of substances against beta-lactamases and in particular the inhibitory activity of the inhibitor of a combination antibiotic preparation consisting of a beta-lactam antibiotic and the inhibitor.
Stand der TechnikState of the art
Im allgemeinen Sprachgebrauch meint der Begriff Antibiotikum einen pharmakologischen Wirkstoff für die Behandlung bakterieller Infektionskrankheiten. Die Erfolge des Penicillins, aber auch das Auftreten der ersten Resistenzen führten zur Suche und Entdeckung vieler weiterer Antibiotika.In common usage, the term antibiotic means a pharmacological agent for the treatment of bacterial infectious diseases. The success of penicillin, but also the emergence of the first resistances led to the search and discovery of many other antibiotics.
Penicillin ist ein beta-Lactam Antibiotikum. Die beta-Lactam Antibiotika sind eine Gruppe von Antibiotika, die in ihrer Strukturformel einen viergliedrigen beta-Lactamring aufweisen. Sie binden an das Penicillin-Binding-Protein (PBP), eine Peptidoglykan-Transpeptidase, die in Bakterien in verschiedenen Varianten vorliegt. Dieses Enzym ist für die Ausbildung einer neuen und festen Zellwand in der Teilungs- oder Vergrößerungsphase von Bakterien notwendig. Die Bindung eines beta-Lactam Antibiotikums an das PBP machen das PBP unwirksam. Der beta-Lactamring des Antibiotikums stellt das Anlagerungsmotiv dar. Die Anlagerung verhindert die Neusynthese der Zellwand, die Bakterien sind somit teilungsunfähig, leben aber zunächst weiter, bis ihr Wachstum zu genügend vielen Zellwandläsionen fuhrt, die den Zelltod herbeiführen. Teilung und Wachstum menschlicher Zellen werden dagegen nicht behindert, da menschliche Zellen nur eine Zellmembran, aber keine Zellwand aufweisen und daher auch keine entsprechende Transpeptidase besitzen.Penicillin is a beta-lactam antibiotic. The beta-lactam antibiotics are a group of antibiotics that have in their structural formula a four-membered beta-lactam ring. They bind to the penicillin binding protein (PBP), a peptidoglycan transpeptidase, which is present in bacteria in different variants. This enzyme is necessary for the formation of a new and strong cell wall in the division or enlargement phase of bacteria. Binding of a beta-lactam antibiotic to the PBP renders the PBP ineffective. The beta-lactam ring of the antibiotic represents the attachment motif. The attachment prevents the new synthesis of the cell wall, the bacteria are thus unable to divide, but continue to live until their growth leads to enough cell wall lesions that cause cell death. In contrast, division and growth of human cells are not hindered because human cells have only one cell membrane, but no cell wall, and therefore also have no corresponding transpeptidase.
Seitdem Penicillin als pharmakologischer Wirkstoff eingesetzt wird, haben Bakterienstämme in zunehmendem Maße verschiedenartige Resistenzen entwickelt, sich also Eigenschaften angeeignet, die es ihnen ermöglichen, die Wirkung von antibiotisch wirkenden Substanzen abzuschwächen oder ganz zu neutralisieren. Resistenzen sind inzwischen häufig; in den USA sind etwa 70% der in Krankenhäusern erworbenen infektiösen Keime resistent gegen mindestens ein Antibiotikum. Oft sind Patienten mit Bakterienstämmen infiziert, die gegen mehrere Antibiotika resistent sind (Multiresistenz). Sogenannte Problemkeime sind dabei vor allem der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas spec., Escherichia coli mit ESBL-Resistenz und Mycobacterium tuberculosis. Schätzungen des CDC (Center for Disease Control and Prevention) gehen für die USA von zwei Millionen in Krankenhäusern erworbenen Infektionen für das Jahr 2004 aus, mit etwa 90000 Todesfällen. Die Gründe für die Zunahme der Resistenzen sind vielfältig: leichtfertige Verschreibungen von Antibiotika, selbst wenn das nicht nötig wäre; leichtfertig abgebrochene Therapien; leichtfertige, oft rein vorbeugende Anwendungen in der Land- und Viehwirtschaft. Alle diese Verhaltensweisen helfen der Auslese und Verbreitung von resistenten Bakterienstämmen gegenüber nicht resistenten Bakterienstämmen.Since penicillin has been used as a pharmacological agent, bacterial strains have increasingly developed a variety of resistances, thus acquiring properties that enable them to attenuate or completely neutralize the action of antibiotics. Resistance is now common; In the United States, about 70% of hospital-acquired infectious agents are resistant to at least one antibiotic. Often, patients are infected with bacterial strains that are resistant to multiple antibiotics (multi-drug resistance). So-called problematic germs are mainly methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas spec., Escherichia coli with ESBL resistance and Mycobacterium tuberculosis. According to estimates from the Center for Disease Control and Prevention (CDC) for the United States, there are 2 million hospital-acquired infections in 2004, with approximately 90,000 deaths. The reasons for the increase in resistance are many: frivolous prescriptions of antibiotics, even if that were not necessary; recklessly canceled therapies; frivolous, often purely preventive applications in agriculture and livestock. All of these behaviors help to select and spread resistant strains of bacteria to non-resistant strains of bacteria.
Aufgrund der Zunahme von Resistenzen hängt der Erfolg einer Therapie bei bakteriellen Infektionen, die in Akutsituationen, wie einer Sepsis, oder als Sekundärinfektion bei einer schon vorhandenen Primärerkrankung (oder Primärinfektion) lebensbedrohlich sein können, oft davon ab, dass schon die erste Verabreichung eines Antibiotikums wirksam ist. Eine gezielte Verabreichung setzt eine möglichst schnelle und fehlerfreie Identifizierung des oder der Krankheitserreger wie auch die schnelle Bestimmung deren Resistenzen gegen die verschiedenen Antibiotika voraus.Because of the increase in resistance, the success of therapy for bacterial infections, which can be life-threatening in acute situations such as sepsis or secondary to an existing primary disease (or primary infection), often depends on the fact that the first administration of an antibiotic is effective is. Targeted administration presupposes the fastest possible and error-free identification of the pathogen (s) as well as rapid determination of their resistance to the various antibiotics.
In der mikrobiologischen Routine wird heutzutage die Resistenz von Bakterien dadurch bestimmt, dass Bakterien aus einer zu untersuchenden Probe in vitro auf einem Nährmedium (z. B. einer Agarplatte) oder in einem Nährmedium (z. B. einer Bouillonkultur) kultiviert werden, dem ein Antibiotikum zugegeben wird. Ob die Bakterien sich unter dem Einfluss des Antibiotikums vermehren, also resistent gegenüber dem Antibiotikum sind, wird visuell mit dem Auge oder automatisiert mit optischen Mitteln bestimmt. Es werden in der Regel Kultivierungsansätze mit abgestuften Konzentrationen des Antibiotikums getestet, um die minimale Hemm-Konzentration (MHK) zu bestimmen.In the microbiological routine today, the resistance of bacteria is determined by cultivating bacteria from a sample to be examined in vitro on a nutrient medium (eg an agar plate) or in a nutrient medium (eg a broth culture) Antibiotic is added. Whether the bacteria multiply under the influence of the antibiotic, ie are resistant to the antibiotic, is determined visually by eye or automatically by optical means. Cultivation approaches are usually tested with graded concentrations of the antibiotic to determine the minimum inhibitory concentration (MIC).
Die minimale Hemm-Konzentration bezeichnet die niedrigste Konzentration einer Substanz, bei der die Vermehrung eines Mikroorganismus visuell nicht mehr wahrgenommen werden kann. In der Regel wird diejenige Konzentration eines Antibiotikums bestimmt, die das Wachstum eines Bakterienstammes gerade noch hemmt. Antibiotika können auch über die minimale bakterizide Konzentration (MBK) charakterisiert werden, bei der innerhalb eines festen Zeitraums gerade noch 99,9% der Erreger abgetötet werden. Während die MHK prinzipiell bei jedem Antibiotikum ermittelt werden kann, ist die MBK nur bei jenen sinnvoll, die nicht nur eine hemmende, sondern auch eine abtötende (bakterizide) Wirkung entfalten können. Dies sind beispielsweise Aminoglykoside, Gyrasehemmer, Penicilline. Nach der Resistenzbestimmung werden die nachgewiesenen Keime als S – sensibel, I – Intermediär oder R – resistent bezeichnet.The minimum inhibitory concentration denotes the lowest concentration of a substance in which the growth of a microorganism can no longer be perceived visually. In general, that concentration of an antibiotic is determined, which just barely inhibits the growth of a bacterial strain. Antibiotics can also be characterized by the minimum bactericidal concentration (MBC), which kills 99.9% of the pathogens within a fixed period of time. While the MIC can be determined in principle for each antibiotic, the MBC is useful only for those who can develop not only an inhibitory, but also a killing (bactericidal) effect. These are, for example, aminoglycosides, gyrase inhibitors, penicillins. After the determination of the resistance, the detected germs are referred to as S - sensitive, I - intermediate or R - resistant.
Das auf einer Kultivierung beruhende Routineverfahren ermöglicht eine einfache, aber zeitaufwendige Bestimmung der Resistenz, da die Analysedauer durch die Vermehrungsrate der Bakterien vorgegeben wird. Ein Vorteil des Routineverfahrens besteht zudem darin, dass die Wirksamkeit bzw. die Unwirksamkeit eines Antibiotikums gegenüber den Bakterien einer Probe direkt gemessen wird (funktioneller Test).The culture-based routine method allows a simple, but Time-consuming determination of resistance, since the duration of analysis is determined by the multiplication rate of the bacteria. An advantage of the routine method is also that the effectiveness or ineffectiveness of an antibiotic against the bacteria of a sample is measured directly (functional test).
Neben der Kultivierung bei Anwesenheit von Antiobiotika gibt es auch genetische Verfahren zur Bestimmung von Resistenzen. Der Nachweis einer Resistenz erfolgt dabei durch den Nachweis von bekannten Resistenzgenen im Genom des jeweiligen Krankheitserregers. Ein Vorteil der genetischen Verfahren besteht darin, dass die Resistenzgene durch Techniken wie der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden können und damit die Analysedauer nicht mehr durch die Vermehrungsrate der Bakterien bestimmt wird. Die Nachteile bestehen darin, dass sie im Vergleich zum Routineverfahren mit höheren Kosten verbunden sind und keine funktionellen Tests darstellen. So kann zwar ein Resistenzgen vorhanden sein, aber nicht exprimiert werden, wodurch der zu untersuchende Bakterienstamm nicht resistent ist, aber durch das Verfahren als resistent erkannt wird.In addition to the cultivation in the presence of antiobiotics, there are also genetic methods for the determination of resistance. The proof of resistance is provided by the detection of known resistance genes in the genome of the respective pathogen. An advantage of the genetic methods is that the resistance genes can be amplified by techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) and thus the duration of analysis is no longer determined by the multiplication rate of the bacteria. The disadvantages are that they are associated with higher costs compared to the routine method and do not represent functional tests. Thus, although a resistance gene may be present, but not expressed, whereby the bacterial strain to be examined is not resistant, but is recognized by the method as resistant.
Viele Arten von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und einzellige Pilze, lassen sich heutzutage schnell und mit geringen Fehlerraten massenspektrometrisch identifizieren. Unter dem Begriff „Identifizierung” ist dabei die taxonomische Klassifizierung, also die Bestimmung von Familie, Gattung und Art zu verstehen. Die Identifizierung von Bakterien durch massenspektrometrische Nachweisverfahren wird beispielsweise in einem wissenschaftlichen Übersichtsartikel von van Baar ausführlich beschrieben (
Es gibt Ansätze, die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroorganismen auf eine massenspektrometrische Bestimmung ihrer Resistenzen zu erweitern. Allerdings hat sich herausgestellt, dass es bisher nur in Ausnahmefällen möglich ist, die Resistenzen aus einem Massenspektrum direkt zu bestimmen, obwohl sich die Resistenzen auch im Vorhandensein neuer oder veränderter Proteine ausdrücken müssten. Aus der Patentschrift
Eine Art der Resistenz von Bakterien gegenüber beta-Lactam Antibiotika besteht in der Ausbildung von Enzymen (beta-Lactamasen), die die beta-Lactam Antibiotika enzymatisch modifizieren, oft durch eine hydrolytische Spaltung des beta-Lactamringes, und damit unwirksam machen. Durch die katalytische Wirkung genügt eine geringe Menge der beta-Lactamasen, um große Mengen an beta-Lactam Antibiotika unwirksam zu machen. Die genetische Information zur Synthese des Enzyms, die aus entsprechenden Mutationen hervorgegangen ist, wird chromosomal oder plasmidal vererbt. Die plasmidale Information kann durch verschiedene Mechanismen zwischen Bakterien ausgetauscht werden, sogar zwischen Bakterien verschiedener Arten und Gattungen („Horizontalaustausch”). Zur Zeit sind mehr als 340 Varianten von beta-Lactamasen bekannt, die von zahlreichen Bakterienarten gebildet werden. Sie werden nach ihrer molekularen Struktur in vier Klassen (A bis D) sowie nach ihrer Wirkungsart in Gruppen und Untergruppen eingeteilt. Heute gibt es eine Vielzahl von verschiedenen beta-Lactam Antibiotika, darunter mehrere Penicilline (Benzypenicilline, Oralpenicilline, Aminopenicilline, Isoxazylpenicilline, Acylaminopenicilline), Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme. Diese weisen meist größere chemische Gruppen auf, um die beta-Lactamasen sterisch zu behindern.One type of bacterial resistance to beta-lactam antibiotics is the formation of enzymes (beta-lactamases) that enzymatically modify the beta-lactam antibiotics, often by hydrolytic cleavage of the beta-lactam ring, thereby rendering them ineffective. Due to the catalytic effect, a small amount of the beta-lactamases is sufficient to render large amounts of beta-lactam antibiotics ineffective. The genetic information for the synthesis of the enzyme, which has resulted from corresponding mutations, is inherited chromosomally or plasmidically. The plasmid information can be exchanged between bacteria through different mechanisms, even between bacteria of different species and genera ("horizontal exchange"). At present, more than 340 variants of beta-lactamases are known, which are formed by numerous bacterial species. They are classified according to their molecular structure into four classes (A to D) and according to their mode of action in groups and subgroups. Today, there are a variety of different beta-lactam antibiotics, including several penicillins (benzypenicillins, oralpenicillins, aminopenicillins, isoxazylpenicillins, acylaminopenicillins), cephalosporins, monobactams and carbapenems. These usually have larger chemical groups to sterically hinder the beta-lactamases.
Ein Untergruppe der beta-Lactamasen (und der sie produzierenden Bakterien) bilden die sogenannten Extended Spectrum beta-Lactamasen (ESBL bzw. ESBL-Bakterienstämme), die durch Punktmutationen von beta-Lactamasen codierenden Genen in den Plasmiden entstanden sind und ein großes Spektrum an beta-Lactam Antibiotika spalten können. ESBL-Bakterienstämme sind resistent gegen Penicilline, Cephalosporine (Generation 1–4) und gegen Monobactame. Hauptsächlich E. coli und Klebsiellen (Gram-negative Bakterien) tragen ESBL codierende Gene. Die schnelle Ausbreitung dieser ESBL-Resistenz wird von Mikrobiologen mit größter Sorge betrachtet. Sie ist neben der Methicillin-Resistenz des Staphylococcus aureus (MRSA) einer der sorgenreichsten Brennpunkte der Infektionsforschung.A subgroup of the beta-lactamases (and the bacteria producing them) form the so-called Extended Spectrum beta-lactamases (ESBL or ESBL bacterial strains), which were formed by point mutations of beta-lactamase-encoding genes in the plasmids and a large spectrum of beta Lactam antibiotics can cleave. ESBL bacterial strains are resistant against penicillins, cephalosporins (generation 1-4) and against monobactams. Mainly E. coli and Klebsiella (Gram-negative bacteria) carry ESBL-encoding genes. The rapid spread of this ESBL resistance is of great concern to microbiologists. It is in addition to the methicillin resistance of Staphylococcus aureus (MRSA) one of the most worrying focal points of infection research.
Ein Hilfsmittel gegen beta-Lactamasen sind beta-Lactamase Inhibitoren, welche zusammen mit einem beta-Lactam Antibiotikum als Kombinationspräparat verabreicht werden, um die Wirkung der beta-Lactamasen zu hemmen oder zumindest abzuschwächen. Beta-Lactamase Inhibitoren weisen derzeit einen beta-Lactamring auf, haben aber in der Regel keine nennenswerte antibakterielle Wirksamkeit. Es gibt zugelassene Kombinationspräparate mit Clavulansäure (
Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die inhibitorische Wirkung von Substanzen gegenüber beta-Lactamasen schnell und sicher bestimmt wird, insbesondere die inhibitorische Wirkung des Inhibitors eines Kombinationspräparates und damit die auf beta-Lactamasen beruhende Resistenz einer bakteriellen Probe gegenüber einem solchen Kombinationspräparat.It is the object of the invention to provide a method with which the inhibitory effect of substances against beta-lactamases is determined quickly and safely, in particular the inhibitory effect of the inhibitor of a combination preparation and thus based on beta-lactamases resistance of a bacterial sample against a such combination preparation.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden in den Ansprüchen 1, 9 und 19 beschrieben. Bevorzugte Ausführungsbeispiele sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 8 und 10 bis 18 ausgeführt.The processes of the invention are described in
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Substanz gegenüber beta-Lactamasen, bei dem die Substanz mit einer beta-Lactamase und einem Substrat, das einen beta-Lactamring aufweist, zusammengeführt wird und danach ein Massenspektrum aufgenommen und dahingehend ausgewertet wird, ob das Substrat durch die beta-Lactamase enzymatisch modifiziert worden ist.The invention relates to a method for determining the inhibitory effect of a substance against beta-lactamases, in which the substance is combined with a beta-lactamase and a substrate having a beta-lactam ring, and then a mass spectrum is recorded and evaluated to see if the substrate has been enzymatically modified by the beta-lactamase.
Die zu untersuchende Substanz (Testsubstanz) wird mit dem Substrat bevorzugt in einem flüssigen Reaktionsansatz zusammengeführt, wobei nach einer gewissen Reaktionszeit von der Flüssigkeit oder einem Teil davon das Massenspektrum aufgenommen wird. Wird die enzymatische Tätigkeit der beta-Lactamasen durch die Testsubstanz nicht inhibiert, nimmt die Konzentration eines Substrates ab und die von Reaktionsprodukten steigt an, so dass das Massensignal des Substrates in dem Massenspektrum klein ist oder ganz fehlt und ein oder mehrere Massensignale von Reaktionsprodukten des Substrats in dem Massenspektrum vorhanden sind. Die Abnahme des Substrates aufgrund einer enzymatischen Modifikation wird bevorzugt aus dem Intensitätsverhältnis des Massensignals des Substrates zu dem Massensignal eines möglichen Reaktionsproduktes oder zu dem Massensignal einer Referenzsubstanz ermittelt.The substance to be investigated (test substance) is preferably combined with the substrate in a liquid reaction mixture, after which the mass spectrum is absorbed by the liquid or a part thereof after a certain reaction time. If the enzymatic activity of the beta-lactamases is not inhibited by the test substance, the concentration of a substrate decreases and that of reaction products increases, so that the mass signal of the substrate in the mass spectrum is small or absent and one or more mass signals of reaction products of the substrate are present in the mass spectrum. The decrease of the substrate due to an enzymatic modification is preferably determined from the intensity ratio of the mass signal of the substrate to the mass signal of a possible reaction product or to the mass signal of a reference substance.
Zu Beginn kann zudem ein weiteres Massenspektrum aufgenommen werden, um enzymatische Modifikationen aus den veränderten Signalintensitäten der entsprechenden Massensignalen in den beiden Massenspektren ermittelt zu können. Die im Verfahren verwendeten beta-Lactamasen können künstlich synthetisiert werden oder durch Bakterienstämme erzeugt werden, die eine beta-Lactamase Resistenz aufweisen. Beta-Lactamasen bewirken meist eine hydrolytische Spaltung des beta-Lactamringes des Antibiotikums, sodass ein Reaktionsprodukt um 18 atomare Masseneinheiten schwerer als das Antibiotikum ist.At the beginning of a further mass spectrum can be included to determine enzymatic modifications from the altered signal intensities of the corresponding mass signals in the two mass spectra. The beta-lactamases used in the process can be artificially synthesized or produced by bacterial strains that have beta-lactamase resistance. Beta-lactamases usually cause a hydrolytic cleavage of the beta-lactam ring of the antibiotic, so that a reaction product by 18 atomic mass units is heavier than the antibiotic.
Die Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Testsubstanz kann auch eine quantitative Bestimmung der inhibitorischen Wirkung, also die Stärke der inhibitorischen Wirkung, einschließen. Die Reaktionsgeschwindigkeit, mit der eine mehr oder weniger gehemmte beta-Lactamase ein Substrat umsetzt, ist ein Maß für die Stärke der inhibitorischen Wirkung einer Testsubstanz. Sind zu Beginn des Verfahrens die Konzentrationen der beta-Lactamase (bzw. der Menge des biologischen Materials), des Substrates und der Testsubstanz bekannt oder durch standardisierte Arbeitsanweisungen festgelegt, so kann die Reaktionsgeschwindigkeit aus den nach einer bestimmten Zeitdauer gemessenen Konzentrationen des Substrates und/oder dessen Reaktionsprodukten ermittelt werden (Einpunktmessung), wobei die Konzentrationen durch die Signalintensitäten der entsprechenden Massensignale (oder deren Verhältnisse zueinander) wiedergegeben werden. Es kann aber auch zu Beginn des Reaktionsverlaufes ein zusätzliches Massenspektrum (Zweipunktmessung) oder während des Reaktionsverlaufes mehrere zusätzliche Massenspektren (Mehrpunktmessung) aufgenommen werden, um aus den zeitlichen Veränderungen der Massensignale in den Massenspektren die Reaktionsgeschwindigkeit zu ermitteln. Wie in anderen massenspektrometrischen Verfahren üblich, kann am Ende des Reaktionsverlaufes die Konzentration des Substrates bzw. die Konzentrationen von Reaktionsprodukten aus Massensignalen von Kalibrierungssubstanzen abgeleitet werden, die dem Reaktionsansatz (bevorzugt am Ende des Reaktionsverlaufes) zugegeben werden und die nicht enzymatisch modifiziert werden.The determination of the inhibitory effect of a test substance can also include a quantitative determination of the inhibitory effect, ie the strength of the inhibitory effect. The reaction rate at which a more or less inhibited beta-lactamase converts a substrate is a measure of the strength of the inhibitory action of a test substance. If the concentrations of the beta-lactamase (or the amount of biological material), the substrate and the test substance are known at the beginning of the procedure or determined by standardized operating instructions, the reaction rate may be determined from the concentrations of the substrate measured after a certain period of time and / or whose reaction products are determined (one-point measurement), the concentrations being represented by the signal intensities of the corresponding mass signals (or their relationships to one another). However, it is also possible to record an additional mass spectrum (two-point measurement) or several additional mass spectra (multipoint measurement) during the course of the reaction in order to determine the reaction rate from the time changes of the mass signals in the mass spectra. As in common to other mass spectrometric methods, at the end of the course of the reaction, the concentration of the substrate or the concentrations of reaction products can be derived from mass signals from calibration substances which are added to the reaction mixture (preferably at the end of the course of the reaction) and which are not enzymatically modified.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die inhibitorische Wirkung einer Testsubstanz gegenüber mehreren beta-Lactamasen, die zu verschiedenen Klassen von beta-Lactamasen gehören können, gleichzeitig bestimmt werden. Da die Reaktionsprodukte von verschiedenen Substraten in einem Massenspektrum in der Regel gut zu unterscheiden sind, können zudem mehrere Substrate verwendet werden, die jeweils spezifisch für eine bestimmte beta-Lactamase oder für eine bestimmte Klasse von beta-Lactamasen sind, so dass die inhibitorische Wirksamkeit der Testsubstanz gegenüber verschiedenen beta-Lactamasen unterschieden werden kann.With the method according to the invention, the inhibitory effect of a test substance on several beta-lactamases, which may belong to different classes of beta-lactamases, can be determined simultaneously. In addition, since the reaction products of various substrates in a mass spectrum are usually well distinguishable, several substrates can be used, each specific for a particular beta-lactamase or for a particular class of beta-lactamases, so that the inhibitory potency of the Test substance to different beta-lactamases can be distinguished.
Die im Verfahren verwendeten Substrate können wirksame beta-Lactam Antibiotika oder Derivate von beta-Lactam Antibiotika sein. Für eine Erhöhung der Empfindlichkeit des Verfahrens ist es günstig, hohe Konzentrationen der Substrate einzusetzen. Allerdings werden dadurch die Bakterien, die die bevorzugte Quelle der beta-Lactamasen sind, zu schnell abgetötet, und zwar selbst solche mit einer beta-Lactamase Resistenz. Aus diesem Grund können Substrate verwendet werden, die eine geringere antibiotische Wirksamkeit als herkömmliche beta-Lactam Antibiotka aufweisen. Die Substrate bilden dabei in bevorzugter Weise die sterischen Formen von verschiedenen Antibiotika nach.The substrates used in the process may be effective beta-lactam antibiotics or derivatives of beta-lactam antibiotics. To increase the sensitivity of the process, it is advantageous to use high concentrations of the substrates. However, this kills bacteria, which are the preferred source of beta-lactamases, too quickly, even those with beta-lactamase resistance. For this reason, substrates having a lower antibiotic activity than conventional beta-lactam antibiotics can be used. The substrates in this case preferably reproduce the steric forms of various antibiotics.
Die Testsubstanz wird bevorzugt mit mehreren Substraten und resistenten Bakterien in eine Nährlösung gegeben, wobei insbesondere solche Bakterienstämme ausgewählt werden, die eine ausgeprägte beta-Lactamase Resistenz gegenüber bisherigen beta-Lactam Antibiotika und Kombinationspräparaten aufweisen. Nach einer Inkubationszeit wird von dem Überstand der Nährlösung oder einem Teil davon ein Massenspektrum aufgenommen.The test substance is preferably added to a nutrient solution with a plurality of substrates and resistant bacteria, in particular those bacterial strains are selected which have a pronounced beta-lactamase resistance to previous beta-lactam antibiotics and combination preparations. After an incubation period, a mass spectrum is taken up from the supernatant of the nutrient solution or a part thereof.
Das Massenspektrum kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren prinzipiell mit jeder Art von Massenspektrometer aufgenommen werden. Es ist jedoch besonders günstig, ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss zu benutzen, das bereits im Routinebetrieb für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt wird. Da der MALDI-Prozess im unteren Massenbereich von einigen hundert atomaren Masseneinheiten einen starken chemischen Untergrund erzeugt, ist es günstig, Substrate zu verwenden, die in untergrundarmen Massenbereichen liegen. Das gelingt beispielsweise durch den Einsatz von Substraten mit Molekulargewichten größer als 700 atomaren Masseneinheiten, bevorzugt zwischen 700 und 1200 atomaren Masseneinheiten. Außerdem ist es günstig, die Protonenaffinität der Substrate zu erhöhen, um sie besser ionisierbar zu machen. Eine chemische Derivatisierung des Substrates bezüglich des Molekulargewichtes, der Protonenaffinität und/oder eines kovalent gebundenen Ladungstags wird bevorzugt am Ende des Reaktionsverlaufes durchgeführt, um die chemischen Eigenschaften des Substrates während der Reaktion denen eines Antibiotikums möglichst ähnlich zu belassen, und kann auch Reaktionsprodukte des Substrates betreffen. Des Weiteren können die verwendeten Substrate eine Ankergruppe aufweisen, mit dem sie aus dem Medium, in dem die Reaktion angesetzt worden ist, extrahiert und angereichert werden können. Beispiele für Ankergruppen sind Biotin und ein 6-His-Tag aus einer Kette von sechs Histidin-Molekülen, die durch Streptavidin bzw. ein mit Nickelionen beladenes Chelat extrahiert werden, wobei die Bindungen reversibel sind und die extrahierenden Bindungspartner an den Wänden des Reaktionsgefäßes oder an Magnetkügelchen gebunden sein können.The mass spectrum can in principle be recorded in the method according to the invention with any type of mass spectrometer. However, it is particularly advantageous to use an axial ion injection MALDI time-of-flight mass spectrometer already in routine use for the mass spectrometric identification of microorganisms. Since the MALDI process generates a strong chemical background in the lower mass range of a few hundred atomic mass units, it is favorable to use substrates which lie in low-background mass ranges. This is achieved, for example, by the use of substrates having molecular weights greater than 700 atomic mass units, preferably between 700 and 1200 atomic mass units. In addition, it is beneficial to increase the proton affinity of the substrates to make them more ionizable. A chemical derivatization of the substrate in terms of molecular weight, the proton affinity and / or a covalently bonded charge tag is preferably carried out at the end of the reaction to leave the chemical properties of the substrate during the reaction as similar as possible to those of an antibiotic, and may also relate to reaction products of the substrate , Furthermore, the substrates used may have an anchor group with which they can be extracted and enriched from the medium in which the reaction has been started. Examples of anchor groups are biotin and a 6-His tag from a chain of six histidine molecules extracted by streptavidin or a nickel ion-loaded chelate, which bonds are reversible and the extracting binding partners on the walls of the reaction vessel or on Magnetic beads can be bound.
Ein Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, im Rahmen einer pharmakologischen Medikamentenentwicklung eine Substanzbibliothek zu durchmustern, um Leitstrukturen für beta-Lactamase Inhibitoren zu finden, die in Kombinationspräparaten zusammen mit einem Antibiotikum zum Einsatz kommen.One application of the method according to the invention is to screen a substance library as part of a pharmacological drug development in order to find lead structures for beta-lactamase inhibitors which are used in combination preparations together with an antibiotic.
Eine weitere Anwendung besteht darin, dass die inhibitorische Wirksamkeit von mehreren Substanzen, die gegenüber bestimmten Klassen von beta-Lactamasen unterschiedliche inhibitorische Wirkungen aufweisen, gegenüber einem Bakterienstamm mit einer beta-Lactamase Resistenz bestimmt wird und dass die beta-Lactamase des Bakterienstammes durch die inhibitorische Wirksamkeit bzw. Unwirksamkeit der Substanzen charakterisiert wird, und zwar insbesondere hinsichtlich des Kodierungsortes des Resistenzgens. Das Resistenzgen kann bei Bakterien in einem Plasmid oder im Bakterienchromosom kodiert sein. Da ein Resistenzgen auf einem Plasmid im Vergleich zu einem auf dem Bakterienchromosom leicht zwischen Bakterienstämmen verschiedener Arten und sogar Gattungen ausgetauscht werden kann, was die Verbreitungsgeschwindigkeit des Resistenzgenes und damit das Gefahrenpotential durch den Bakterienstamm erhöht, ist die Kenntnis des Kodierungsortes für die epidemiologische Bewertung der bakteriellen Probe von großer Bedeutung. Es ist beispielsweise bekannt, dass beta-Lactamasen der molekularen Gruppe A (Enzyme mit einer Serin-Gruppe) hauptsächlich plasmidal kodiert werden, aber durch Clavulansäure nicht oder nur geringfügig gehemmt werden, während beta-Lactamasen der molekularen Gruppe B (Metalloenzyme) chromosomal kodiert und durch Clavulansäure gehemmt werden.Another application is that the inhibitory potency of several substances which have different inhibitory effects on certain classes of beta-lactamases is determined against a bacterial strain having a beta-lactamase resistance and that the beta-lactamase of the bacterial strain is determined by the inhibitory activity or inefficiency of the substances is characterized, in particular with regard to the coding site of the resistance gene. The resistance gene may be encoded by bacteria in a plasmid or in the bacterial chromosome. Since a resistance gene on a plasmid can be easily exchanged between bacterial strains of various species and even genera on a bacterial chromosome, which increases the rate of spread of the resistance gene and thus the potential danger by the bacterial strain, the knowledge of the coding site for the epidemiological evaluation of the bacterial Sample of great importance. For example, it is known that beta-lactamases of molecular group A (enzymes with a serine group) are mainly plasmid-encoded, but are not or only slightly inhibited by clavulanic acid, while beta-lactamases of molecular group B (metalloenzymes) are chromosomally encoded and inhibited by clavulanic acid.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, mit dem festgestellt wird, ob eine bakterielle Probe gegenüber einem Kombinationspräparat durch die Bildung von beta-Lactamasen resistent ist, wobei insbesondere die inhibitorische Wirksamkeit des Inhibitors eines Kombinationspräparates gegenüber den beta-Lactamasen bestimmt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, dass die bakterielle Probe mit dem Kombinationspräparat zusammengeführt wird und danach ein Massenspektrum aufgenommen und dahingehend ausgewertet wird, ob ein beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates enzymatisch modifiziert worden ist. Ein Kombinationspräparat besteht mindestens aus einem Inhibitor und einem beta-Lactam Antibiotikum. Die Anzahl der Antibiotika und der Inhibitoren in einem Kombinationspräparat kann aber jeweils größer als eins sein.The invention further relates to a method with which it is determined whether a bacterial sample is resistant to a combination preparation by the formation of beta-lactamases, in particular the inhibitory activity of the inhibitor of a combination preparation is determined against the beta-lactamases. The inventive method is that the bacterial sample is combined with the combination preparation and then recorded a mass spectrum and is evaluated to see whether a beta-lactam antibiotic of the combination preparation has been enzymatically modified. A combination preparation consists of at least one inhibitor and one beta-lactam antibiotic. However, the number of antibiotics and the inhibitors in a combination preparation can each be greater than one.
Der Begriff ”bakterielle Probe” ist allgemein zu verstehen. Es kann sich dabei um eine Probe handeln, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie Bakterien enthält, oder die untersucht werden soll, ob sie Bakterien enthält. Eine bakterielle Probe kann beispielsweise eine Teilmenge einer bereits isolierten Bakterienkultur sein, die von einer Agarplatte geerntet wird, aber auch ein Bakterienpellet sein, das direkt aus einer Körperflüssigkeit wie Blut, Urin oder CSF (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) oder aus einer Nährlösung, wie einer Blutkultur oder Bouillonkultur, gewonnen wird. Ebenso gelten Abstriche von Schleimhäuten, insbesondere ein Abstrich der Nasen- oder Rachenschleimhaut, Wundabstriche oder Stuhlproben als bakterielle Proben, wie auch Wischproben in Krankenhäusern oder in Lebensmittel verarbeitenden Betrieben, und Lebensmittelproben selber. Eine bakterielle Probe kann Bakterien eines Stammes oder mehrerer Stämme enthalten.The term "bacterial sample" is to be understood generally. It may be a sample that is known or suspected to contain bacteria, or to be tested for its presence in bacteria. For example, a bacterial sample may be a subset of an already isolated bacterial culture harvested from an agar plate, but may also be a bacterial pellet derived directly from a body fluid such as blood, urine or CSF (cerebrospinal fluid) or from a nutrient solution such as a blood culture or broth culture. Likewise smears of mucous membranes, in particular smear of the nasal or pharyngeal mucosa, wound swabs or stool samples as bacterial samples, as well as wiping samples in hospitals or in food processing plants, and food samples themselves apply. A bacterial sample may contain bacteria of one or more strains.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die bakterielle Probe bevorzugt zusammen mit dem Kombinationspräparat in einer Nährlösung inkubiert und danach der Überstand der Nährlösung oder ein Teil davon einer massenspektrometrischen Messung zugeführt. Es ist allerdings auch möglich, dass die bakterielle Probe auf einem flächigen Nährmedium (z. B. einer Agarplatte) aufgebracht wird, das das Kombinationspräparat enthält. Das Massenspektrum wird dann von dem Nährmedium in der Nähe der bakteriellen Probe aufgenommen.In the method according to the invention, the bacterial sample is preferably incubated together with the combination preparation in a nutrient solution and then the supernatant of the nutrient solution or a part thereof supplied to a mass spectrometric measurement. However, it is also possible for the bacterial sample to be applied to a flat nutrient medium (eg an agar plate) containing the combination preparation. The mass spectrum is then taken up by the nutrient medium in the vicinity of the bacterial sample.
Es ist besonders bevorzugt, dass in einem zusätzlichen Reaktionsansatz die bakterielle Probe nur mit dem beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates zusammengeführt wird. Das zusätzliche Massenspektrum gibt Aufschluss darüber, ob die Bakterien der Probe beta-Lactamasen produzieren, die das beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates enzymatisch modifizieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin so modifiziert werden, dass nicht das Kombinationspräparat mit der bakteriellen Probe zusammengeführt wird, sondern dass der Inhibitor des Kombinationspräparates und ein Substrat, z. B. ein Derivat des beta-Lactam Antibiotikums, mit der bakteriellen Probe zusammengeführt werden.It is particularly preferred that in an additional reaction batch, the bacterial sample is combined only with the beta-lactam antibiotic of the combination preparation. The additional mass spectrum provides information on whether the bacteria of the sample produce beta-lactamases which enzymatically modify the beta-lactam antibiotic of the combination preparation. The inventive method can be further modified so that not the combination preparation is combined with the bacterial sample, but that the inhibitor of the combination preparation and a substrate, for. As a derivative of the beta-lactam antibiotic, are brought together with the bacterial sample.
Wie bereits oben beschrieben, kann aus dem Fehlen des Massensignals des beta-Lactam Antibiotikums oder aus dem Vorhandensein von einem oder mehreren Massensignalen von Reaktionsprodukten oder aus dem Intensitätsverhältnis des Massensignals des beta-Lactam Antibiotikums zu einem Massensignal eines Reaktionsproduktes oder zu dem Massensignal einer Referenzsubstanz auf eine enzymatische Modifikation des beta-Lactam Antibiotikums geschlossen werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit, mit der ein beta-Lactam Antibiotikum eines Kombinationspräparates umgesetzt wird, ist ein quantitatives Maß für die Stärke der beta-Lactamase Resistenz der Bakterien gegenüber dem Kombinationspräparat und kann aus einer Einpunkt-, Zweipunkt oder Mehrpunktmessung bestimmt werden. Die Bestimmung der Resistenz kann, wie in einem funktionellen Test üblich, für verschiedenen Konzentrationen des Kombinationspräparates durchgeführt werden, um die minimale Hemmkonzentration zu bestimmen.As already described above, from the absence of the mass signal of the beta-lactam antibiotic or from the presence of one or more mass signals of reaction products or from the intensity ratio of the mass signal of the beta-lactam antibiotic to a mass signal of a reaction product or to the mass signal of a reference substance an enzymatic modification of the beta-lactam antibiotic can be concluded. The reaction rate at which a beta-lactam antibiotic of a combination preparation is reacted is a quantitative measure of the strength of the beta-lactamase resistance of the bacteria to the combination preparation and can be determined from a single-point, two-point or multi-point measurement. Determination of resistance may be performed for various concentrations of the combination preparation, as is common in a functional assay, to determine the minimum inhibitory concentration.
Insbesondere für den Fall, dass das oder die Massenspektren mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer aufgenommen werden, ist es günstig, dass nach der Reaktion eine zusätzliche chemische Derivatisierung erfolgt, die das beta-Lactam Antibiotikum und/oder die gegebenenfalls vorhandenen Reaktionsprodukte so verändert, dass danach deren Molekulargewicht größer als 700 atomare Masseneinheiten ist, deren Protonenaffinität erhöht ist und/oder sie mindestens eine kovalent gebundene Ladung aufweisen.In particular, in the event that the mass spectra or mass spectra are recorded with a MALDI time-of-flight mass spectrometer, it is favorable that an additional chemical derivatization takes place after the reaction, which changes the beta-lactam antibiotic and / or the optionally present reaction products so that thereafter whose molecular weight is greater than 700 atomic mass units whose proton affinity is increased and / or they have at least one covalently bonded charge.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann schnell und zuverlässig getestet werden, ob eine bakterielle Probe eine beta-Lactamase Resistenz aufweist und ob ein Kombinationspräparat wirksam gegenüber vorhandenen beta-Lactamasen ist. Die Testdauer beträgt weniger als drei Stunden und ist damit sehr viel schneller als das Routineverfahren, in dem das Wachstum der Bakterien bzw. die Hemmung des Wachstums optisch nachgewiesen wird. Im Gegensatz zu genetischen Verfahren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Wirksamkeit von Kombinationspräparate gegenüber einer bakteriellen Probe mit einer beta-Lactamase Resistenz funktionell bestimmt werden.With the method according to the invention can be tested quickly and reliably, whether a bacterial sample has a beta-lactamase resistance and whether a combination preparation is effective against existing beta-lactamases. The test duration is less than three hours and is thus much faster than the routine method in which the growth of bacteria or the inhibition of growth is optically detected. In contrast to genetic methods, the method according to the invention can be used to functionally determine the efficacy of combination preparations in relation to a bacterial sample having a beta-lactamase resistance.
In den erfindungsgemäßen Verfahren kann das Massenspektrum prinzipiell mit jeder Art von Massenspektrometer aufgenommen werden, beispielsweise mit einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), einem Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (ICR-MS), einer elektrostatische Ionenfallen-Massenspektrometer oder einem Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometer. Für eine massenspektrometrische Bestimmung einer enzymatischen Modifikation des Substrats ist ein Triple-Quadrupolfilter-Massenspektrometer besonders geeignet, da sich mit ihm eine sehr hohe Empfindlichkeit erzielen lässt, so dass geringste Ausgangsmengen genügen, um die erfindungsgemäßen Verfahren durchführen zu können. Es ist jedoch erstrebenswert, dasselbe MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss zu verwenden, das bereits im Routinebetrieb für die taxonomische Identifizierung der Bakterien eingesetzt wird. Statt einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) können für die erfindungsgemäßen Verfahren andere Arten der Ionisierung, beispielsweise Elektrosprühen (ESI) oder Ionisierung durch matrixfreie Laserdesorption (nanostructure initiator mass spectrometry (NIMS)), verwendet werden. Dem einschlägigen Fachmann sind diese Massenspektrometer und Ionisierungsverfahren vertraut, so dass hier auf eine detaillierte Schilderung verzichtet wird.In the methods according to the invention, the mass spectrum can in principle be used with any type of Mass spectrometers may be included, for example, with an orthogonal ion impact time-of-flight mass spectrometer (OTOF), an ion cyclotron resonance mass spectrometer (ICR-MS), an electrostatic ion trap mass spectrometer, or a high frequency ion trap mass spectrometer. For a mass spectrometric determination of an enzymatic modification of the substrate, a triple-quadrupole filter mass spectrometer is particularly suitable because it allows a very high sensitivity to be achieved, so that the lowest initial quantities are sufficient to carry out the methods according to the invention. However, it is desirable to use the same axial ion injection MALDI time-of-flight mass spectrometer already in routine use for taxonomic identification of the bacteria. Instead of ionization by matrix-assisted laser desorption (MALDI), other types of ionization, for example electrospray (ESI) or ionization by nanostructure initiator mass spectrometry (NIMS), can be used for the methods according to the invention. Those skilled in the art are familiar with these mass spectrometers and ionization methods, so that a detailed description is omitted here.
Kurze Beschreibung der AbbildungenBrief description of the illustrations
Die
Die
Die
Die
Bevorzugte AusführungsbeispielePreferred embodiments
Die
Die
Im Schritt A werden Testsubstanzen in einer Substanzplatte
Im Schritt B wird mit einem Dispenser
Im Schritt C wird aus jedem Näpfchen der Reaktionsplatte
Im Schritt D wird mit einem Dispenser
Im Schritt E werden aus jedem Näpfchen der Reaktionsplatte
Für die Durchsuchung von großen Substanzbibliotheken kann das Verfahren so durchgeführt werden, dass zunächst die inhibitorische Wirkung in einer Vielzahl von Multiplex-Ansätzen mit jeweils mehreren Testsubstanzen pro Näpfchen bestimmt wird und dass danach diejenigen Testsubstanzen einzeln getestet werden, bei denen sich in einem der Multiplex-Ansätze eine inhibitorische Wirkung gezeigt hat.For the search of large substance libraries, the method can be carried out in such a way that first the inhibitory effect is determined in a multiplicity of multiplex mixtures with in each case several test substances per well and, subsequently, those test substances are individually tested in which one of the multiplex Approaches has shown an inhibitory effect.
Die
Im Schritt A werden von einer isolierten Bakterienkolonie
Im Schritt B wird dem Reaktionsansatz im Eppendorf-Röhrchen
In den Schritten C und D werden die beiden Eppendorf-Röhrchen
Im Schritt E wird etwa ein Mikroliter aus dem Überstand
Das Massenspektrum MS2 weist ein Massensignal des Antibiotikums A und eines Reaktionsproduktes R auf, d. h., dass das Antibiotikum A enzymatisch modifiziert worden ist und die Bakterienkolonie
Die
Das Massenspektrum in der
Das Massenspektrum in der
Die Massenspektren in den
Zur Bestimmung der Resistenz von Kombinationspräparaten können einige oder alle dazu benötigten Verbrauchsmaterialien, wie z. B. MALDI-Probenträger, NIMS-Probenträger, Eppendorf-Röhrchen, eine MALDI-Matrix, Lösungsmittel, Antibiotika, Derivate von Antibiotika, Substrate, Inhibitoren oder Kombinationspräparate, in sterilen Packungen (Kits) bereitgestellt werden.To determine the resistance of combination preparations, some or all of the consumables required for this, such. As MALDI sample carriers, NIMS sample carriers, Eppendorf tubes, a MALDI matrix, solvents, antibiotics, derivatives of antibiotics, substrates, inhibitors or combination preparations, in sterile packs (kits) are provided.
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