DE102011012060A1 - Mass spectrometric determination of the inhibitory effect of substances on beta-lactamases - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Substanz gegenüber beta-Lactamasen bereit, bei denen die Substanz mit einer beta-Lactamase und einem Substrat, das einen beta-Lactamring aufweist, zusammengeführt wird und danach ein Massenspektrum aufgenommen und dahingehend ausgewertet wird, ob das Substrat durch die beta-Lactamase enzymatisch modifiziert worden ist.The invention provides a method for determining the inhibitory effect of a substance against beta-lactamases, in which the substance is combined with a beta-lactamase and a substrate that has a beta-lactam ring and then a mass spectrum is recorded and evaluated to determine whether the substrate has been enzymatically modified by the beta-lactamase.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung von Substanzen gegenüber beta-Lactamasen und insbesondere der inhibitorischen Wirksamkeit des Inhibitors eines antibiotischen Kombinationspräparates bestehend aus einem beta-Lactam Antibiotikum und dem Inhibitor.The invention relates to a method for determining the inhibitory effect of substances against beta-lactamases and in particular the inhibitory activity of the inhibitor of a combination antibiotic preparation consisting of a beta-lactam antibiotic and the inhibitor.

Stand der TechnikState of the art

Im allgemeinen Sprachgebrauch meint der Begriff Antibiotikum einen pharmakologischen Wirkstoff für die Behandlung bakterieller Infektionskrankheiten. Die Erfolge des Penicillins, aber auch das Auftreten der ersten Resistenzen führten zur Suche und Entdeckung vieler weiterer Antibiotika.In common usage, the term antibiotic means a pharmacological agent for the treatment of bacterial infectious diseases. The success of penicillin, but also the emergence of the first resistances led to the search and discovery of many other antibiotics.

Penicillin ist ein beta-Lactam Antibiotikum. Die beta-Lactam Antibiotika sind eine Gruppe von Antibiotika, die in ihrer Strukturformel einen viergliedrigen beta-Lactamring aufweisen. Sie binden an das Penicillin-Binding-Protein (PBP), eine Peptidoglykan-Transpeptidase, die in Bakterien in verschiedenen Varianten vorliegt. Dieses Enzym ist für die Ausbildung einer neuen und festen Zellwand in der Teilungs- oder Vergrößerungsphase von Bakterien notwendig. Die Bindung eines beta-Lactam Antibiotikums an das PBP machen das PBP unwirksam. Der beta-Lactamring des Antibiotikums stellt das Anlagerungsmotiv dar. Die Anlagerung verhindert die Neusynthese der Zellwand, die Bakterien sind somit teilungsunfähig, leben aber zunächst weiter, bis ihr Wachstum zu genügend vielen Zellwandläsionen fuhrt, die den Zelltod herbeiführen. Teilung und Wachstum menschlicher Zellen werden dagegen nicht behindert, da menschliche Zellen nur eine Zellmembran, aber keine Zellwand aufweisen und daher auch keine entsprechende Transpeptidase besitzen.Penicillin is a beta-lactam antibiotic. The beta-lactam antibiotics are a group of antibiotics that have in their structural formula a four-membered beta-lactam ring. They bind to the penicillin binding protein (PBP), a peptidoglycan transpeptidase, which is present in bacteria in different variants. This enzyme is necessary for the formation of a new and strong cell wall in the division or enlargement phase of bacteria. Binding of a beta-lactam antibiotic to the PBP renders the PBP ineffective. The beta-lactam ring of the antibiotic represents the attachment motif. The attachment prevents the new synthesis of the cell wall, the bacteria are thus unable to divide, but continue to live until their growth leads to enough cell wall lesions that cause cell death. In contrast, division and growth of human cells are not hindered because human cells have only one cell membrane, but no cell wall, and therefore also have no corresponding transpeptidase.

Seitdem Penicillin als pharmakologischer Wirkstoff eingesetzt wird, haben Bakterienstämme in zunehmendem Maße verschiedenartige Resistenzen entwickelt, sich also Eigenschaften angeeignet, die es ihnen ermöglichen, die Wirkung von antibiotisch wirkenden Substanzen abzuschwächen oder ganz zu neutralisieren. Resistenzen sind inzwischen häufig; in den USA sind etwa 70% der in Krankenhäusern erworbenen infektiösen Keime resistent gegen mindestens ein Antibiotikum. Oft sind Patienten mit Bakterienstämmen infiziert, die gegen mehrere Antibiotika resistent sind (Multiresistenz). Sogenannte Problemkeime sind dabei vor allem der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas spec., Escherichia coli mit ESBL-Resistenz und Mycobacterium tuberculosis. Schätzungen des CDC (Center for Disease Control and Prevention) gehen für die USA von zwei Millionen in Krankenhäusern erworbenen Infektionen für das Jahr 2004 aus, mit etwa 90000 Todesfällen. Die Gründe für die Zunahme der Resistenzen sind vielfältig: leichtfertige Verschreibungen von Antibiotika, selbst wenn das nicht nötig wäre; leichtfertig abgebrochene Therapien; leichtfertige, oft rein vorbeugende Anwendungen in der Land- und Viehwirtschaft. Alle diese Verhaltensweisen helfen der Auslese und Verbreitung von resistenten Bakterienstämmen gegenüber nicht resistenten Bakterienstämmen.Since penicillin has been used as a pharmacological agent, bacterial strains have increasingly developed a variety of resistances, thus acquiring properties that enable them to attenuate or completely neutralize the action of antibiotics. Resistance is now common; In the United States, about 70% of hospital-acquired infectious agents are resistant to at least one antibiotic. Often, patients are infected with bacterial strains that are resistant to multiple antibiotics (multi-drug resistance). So-called problematic germs are mainly methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas spec., Escherichia coli with ESBL resistance and Mycobacterium tuberculosis. According to estimates from the Center for Disease Control and Prevention (CDC) for the United States, there are 2 million hospital-acquired infections in 2004, with approximately 90,000 deaths. The reasons for the increase in resistance are many: frivolous prescriptions of antibiotics, even if that were not necessary; recklessly canceled therapies; frivolous, often purely preventive applications in agriculture and livestock. All of these behaviors help to select and spread resistant strains of bacteria to non-resistant strains of bacteria.

Aufgrund der Zunahme von Resistenzen hängt der Erfolg einer Therapie bei bakteriellen Infektionen, die in Akutsituationen, wie einer Sepsis, oder als Sekundärinfektion bei einer schon vorhandenen Primärerkrankung (oder Primärinfektion) lebensbedrohlich sein können, oft davon ab, dass schon die erste Verabreichung eines Antibiotikums wirksam ist. Eine gezielte Verabreichung setzt eine möglichst schnelle und fehlerfreie Identifizierung des oder der Krankheitserreger wie auch die schnelle Bestimmung deren Resistenzen gegen die verschiedenen Antibiotika voraus.Because of the increase in resistance, the success of therapy for bacterial infections, which can be life-threatening in acute situations such as sepsis or secondary to an existing primary disease (or primary infection), often depends on the fact that the first administration of an antibiotic is effective is. Targeted administration presupposes the fastest possible and error-free identification of the pathogen (s) as well as rapid determination of their resistance to the various antibiotics.

In der mikrobiologischen Routine wird heutzutage die Resistenz von Bakterien dadurch bestimmt, dass Bakterien aus einer zu untersuchenden Probe in vitro auf einem Nährmedium (z. B. einer Agarplatte) oder in einem Nährmedium (z. B. einer Bouillonkultur) kultiviert werden, dem ein Antibiotikum zugegeben wird. Ob die Bakterien sich unter dem Einfluss des Antibiotikums vermehren, also resistent gegenüber dem Antibiotikum sind, wird visuell mit dem Auge oder automatisiert mit optischen Mitteln bestimmt. Es werden in der Regel Kultivierungsansätze mit abgestuften Konzentrationen des Antibiotikums getestet, um die minimale Hemm-Konzentration (MHK) zu bestimmen.In the microbiological routine today, the resistance of bacteria is determined by cultivating bacteria from a sample to be examined in vitro on a nutrient medium (eg an agar plate) or in a nutrient medium (eg a broth culture) Antibiotic is added. Whether the bacteria multiply under the influence of the antibiotic, ie are resistant to the antibiotic, is determined visually by eye or automatically by optical means. Cultivation approaches are usually tested with graded concentrations of the antibiotic to determine the minimum inhibitory concentration (MIC).

Die minimale Hemm-Konzentration bezeichnet die niedrigste Konzentration einer Substanz, bei der die Vermehrung eines Mikroorganismus visuell nicht mehr wahrgenommen werden kann. In der Regel wird diejenige Konzentration eines Antibiotikums bestimmt, die das Wachstum eines Bakterienstammes gerade noch hemmt. Antibiotika können auch über die minimale bakterizide Konzentration (MBK) charakterisiert werden, bei der innerhalb eines festen Zeitraums gerade noch 99,9% der Erreger abgetötet werden. Während die MHK prinzipiell bei jedem Antibiotikum ermittelt werden kann, ist die MBK nur bei jenen sinnvoll, die nicht nur eine hemmende, sondern auch eine abtötende (bakterizide) Wirkung entfalten können. Dies sind beispielsweise Aminoglykoside, Gyrasehemmer, Penicilline. Nach der Resistenzbestimmung werden die nachgewiesenen Keime als S – sensibel, I – Intermediär oder R – resistent bezeichnet.The minimum inhibitory concentration denotes the lowest concentration of a substance in which the growth of a microorganism can no longer be perceived visually. In general, that concentration of an antibiotic is determined, which just barely inhibits the growth of a bacterial strain. Antibiotics can also be characterized by the minimum bactericidal concentration (MBC), which kills 99.9% of the pathogens within a fixed period of time. While the MIC can be determined in principle for each antibiotic, the MBC is useful only for those who can develop not only an inhibitory, but also a killing (bactericidal) effect. These are, for example, aminoglycosides, gyrase inhibitors, penicillins. After the determination of the resistance, the detected germs are referred to as S - sensitive, I - intermediate or R - resistant.

Das auf einer Kultivierung beruhende Routineverfahren ermöglicht eine einfache, aber zeitaufwendige Bestimmung der Resistenz, da die Analysedauer durch die Vermehrungsrate der Bakterien vorgegeben wird. Ein Vorteil des Routineverfahrens besteht zudem darin, dass die Wirksamkeit bzw. die Unwirksamkeit eines Antibiotikums gegenüber den Bakterien einer Probe direkt gemessen wird (funktioneller Test).The culture-based routine method allows a simple, but Time-consuming determination of resistance, since the duration of analysis is determined by the multiplication rate of the bacteria. An advantage of the routine method is also that the effectiveness or ineffectiveness of an antibiotic against the bacteria of a sample is measured directly (functional test).

Neben der Kultivierung bei Anwesenheit von Antiobiotika gibt es auch genetische Verfahren zur Bestimmung von Resistenzen. Der Nachweis einer Resistenz erfolgt dabei durch den Nachweis von bekannten Resistenzgenen im Genom des jeweiligen Krankheitserregers. Ein Vorteil der genetischen Verfahren besteht darin, dass die Resistenzgene durch Techniken wie der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden können und damit die Analysedauer nicht mehr durch die Vermehrungsrate der Bakterien bestimmt wird. Die Nachteile bestehen darin, dass sie im Vergleich zum Routineverfahren mit höheren Kosten verbunden sind und keine funktionellen Tests darstellen. So kann zwar ein Resistenzgen vorhanden sein, aber nicht exprimiert werden, wodurch der zu untersuchende Bakterienstamm nicht resistent ist, aber durch das Verfahren als resistent erkannt wird.In addition to the cultivation in the presence of antiobiotics, there are also genetic methods for the determination of resistance. The proof of resistance is provided by the detection of known resistance genes in the genome of the respective pathogen. An advantage of the genetic methods is that the resistance genes can be amplified by techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) and thus the duration of analysis is no longer determined by the multiplication rate of the bacteria. The disadvantages are that they are associated with higher costs compared to the routine method and do not represent functional tests. Thus, although a resistance gene may be present, but not expressed, whereby the bacterial strain to be examined is not resistant, but is recognized by the method as resistant.

Viele Arten von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und einzellige Pilze, lassen sich heutzutage schnell und mit geringen Fehlerraten massenspektrometrisch identifizieren. Unter dem Begriff „Identifizierung” ist dabei die taxonomische Klassifizierung, also die Bestimmung von Familie, Gattung und Art zu verstehen. Die Identifizierung von Bakterien durch massenspektrometrische Nachweisverfahren wird beispielsweise in einem wissenschaftlichen Übersichtsartikel von van Baar ausführlich beschrieben ( FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray mass spectrometry” ). Die Identifizierung erfolgt im Routinebetrieb durch eine Ähnlichkeitsanalyse zwischen einem MALDI-Massenspektrum (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) der zu untersuchenden Probe und MALDI-Referenzspektren von bekannten Mikroorganismen. Jedem der Referenzspektren wird in der Ähnlichkeitsanalyse eine Kennzahl zugeordnet, die ein Maß für die Übereinstimmung des entsprechenden Referenzspektrums mit dem Massenspektrum der Probe ist (siehe beispielsweise Jarman et al., Analytical Chemistry, 72[6], 1217–1223, 2000: „An algorithm for automated bacterial identification using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry” ). Dieses Identifizierungsverfahren für Mikroorganismen hat sich sowohl in Studien wie auch im täglichen Einsatz in vielen mikrobiologischen Laboratorien als außerordentlich erfolgreich erwiesen. Es ist schnell, kostengünstig und hat sehr geringe Fehlerraten, weit geringer als die herkömmlicher mikrobiologischer Identifizierungsverfahren.Many types of microorganisms, in particular bacteria and unicellular fungi, can now be identified by mass spectrometry fast and with low error rates. The term "identification" is to be understood as meaning the taxonomic classification, ie the determination of family, genus and species. The identification of bacteria by mass spectrometric detection methods is described in detail, for example, in a scientific review by van Baar ( FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193-219: "Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption / ionization and electrospray mass spectrometry" ). The identification takes place in routine operation by a similarity analysis between a MALDI mass spectrum (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization) of the sample to be examined and MALDI reference spectra of known microorganisms. Each of the reference spectra is assigned in the similarity analysis a measure which is a measure of the correspondence of the corresponding reference spectrum with the mass spectrum of the sample (see, for example, US Pat Jarman et al., Analytical Chemistry, 72 [6], 1217-1223, 2000: "An algorithm for automated bacterial identification using matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry". ). This microorganism identification method has proven to be extremely successful both in studies and in daily use in many microbiological laboratories. It is fast, inexpensive and has very low failure rates, far lower than traditional microbiological identification methods.

Es gibt Ansätze, die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroorganismen auf eine massenspektrometrische Bestimmung ihrer Resistenzen zu erweitern. Allerdings hat sich herausgestellt, dass es bisher nur in Ausnahmefällen möglich ist, die Resistenzen aus einem Massenspektrum direkt zu bestimmen, obwohl sich die Resistenzen auch im Vorhandensein neuer oder veränderter Proteine ausdrücken müssten. Aus der Patentschrift DE 10 2006 021 493 B4 (Govorun et al.) ist ein massenspektrometrisches Verfahren zur Resistenzbestimmung von Bakterien bekannt, in dem Proteinprofile der Bakterien vor und nach einer Kultivierung massenspektrometrisch gemessenen werden, wobei die Kultivierung unter Zugabe eines Antibiotikums erfolgt. Das Verfahren von Govorun et al. ist wie das oben beschriebene Routineverfahren ein funktioneller Test, dessen Analysedauer durch die Vermehrungsrate der Bakterien vorgegeben wird.There are approaches to extend the mass spectrometric identification of microorganisms to a mass spectrometric determination of their resistances. However, it has been found that it is only possible in exceptional cases, to directly determine the resistances from a mass spectrum, although the resistances would also have to express themselves in the presence of new or altered proteins. From the patent DE 10 2006 021 493 B4 (Govorun et al.) A mass spectrometric method for determining the resistance of bacteria is known in which protein profiles of the bacteria are measured by mass spectrometry before and after culturing, wherein the cultivation is carried out with the addition of an antibiotic. The method of Govorun et al. Like the routine method described above, it is a functional test whose analysis time is dictated by the rate of propagation of the bacteria.

Eine Art der Resistenz von Bakterien gegenüber beta-Lactam Antibiotika besteht in der Ausbildung von Enzymen (beta-Lactamasen), die die beta-Lactam Antibiotika enzymatisch modifizieren, oft durch eine hydrolytische Spaltung des beta-Lactamringes, und damit unwirksam machen. Durch die katalytische Wirkung genügt eine geringe Menge der beta-Lactamasen, um große Mengen an beta-Lactam Antibiotika unwirksam zu machen. Die genetische Information zur Synthese des Enzyms, die aus entsprechenden Mutationen hervorgegangen ist, wird chromosomal oder plasmidal vererbt. Die plasmidale Information kann durch verschiedene Mechanismen zwischen Bakterien ausgetauscht werden, sogar zwischen Bakterien verschiedener Arten und Gattungen („Horizontalaustausch”). Zur Zeit sind mehr als 340 Varianten von beta-Lactamasen bekannt, die von zahlreichen Bakterienarten gebildet werden. Sie werden nach ihrer molekularen Struktur in vier Klassen (A bis D) sowie nach ihrer Wirkungsart in Gruppen und Untergruppen eingeteilt. Heute gibt es eine Vielzahl von verschiedenen beta-Lactam Antibiotika, darunter mehrere Penicilline (Benzypenicilline, Oralpenicilline, Aminopenicilline, Isoxazylpenicilline, Acylaminopenicilline), Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme. Diese weisen meist größere chemische Gruppen auf, um die beta-Lactamasen sterisch zu behindern.One type of bacterial resistance to beta-lactam antibiotics is the formation of enzymes (beta-lactamases) that enzymatically modify the beta-lactam antibiotics, often by hydrolytic cleavage of the beta-lactam ring, thereby rendering them ineffective. Due to the catalytic effect, a small amount of the beta-lactamases is sufficient to render large amounts of beta-lactam antibiotics ineffective. The genetic information for the synthesis of the enzyme, which has resulted from corresponding mutations, is inherited chromosomally or plasmidically. The plasmid information can be exchanged between bacteria through different mechanisms, even between bacteria of different species and genera ("horizontal exchange"). At present, more than 340 variants of beta-lactamases are known, which are formed by numerous bacterial species. They are classified according to their molecular structure into four classes (A to D) and according to their mode of action in groups and subgroups. Today, there are a variety of different beta-lactam antibiotics, including several penicillins (benzypenicillins, oralpenicillins, aminopenicillins, isoxazylpenicillins, acylaminopenicillins), cephalosporins, monobactams and carbapenems. These usually have larger chemical groups to sterically hinder the beta-lactamases.

Ein Untergruppe der beta-Lactamasen (und der sie produzierenden Bakterien) bilden die sogenannten Extended Spectrum beta-Lactamasen (ESBL bzw. ESBL-Bakterienstämme), die durch Punktmutationen von beta-Lactamasen codierenden Genen in den Plasmiden entstanden sind und ein großes Spektrum an beta-Lactam Antibiotika spalten können. ESBL-Bakterienstämme sind resistent gegen Penicilline, Cephalosporine (Generation 1–4) und gegen Monobactame. Hauptsächlich E. coli und Klebsiellen (Gram-negative Bakterien) tragen ESBL codierende Gene. Die schnelle Ausbreitung dieser ESBL-Resistenz wird von Mikrobiologen mit größter Sorge betrachtet. Sie ist neben der Methicillin-Resistenz des Staphylococcus aureus (MRSA) einer der sorgenreichsten Brennpunkte der Infektionsforschung.A subgroup of the beta-lactamases (and the bacteria producing them) form the so-called Extended Spectrum beta-lactamases (ESBL or ESBL bacterial strains), which were formed by point mutations of beta-lactamase-encoding genes in the plasmids and a large spectrum of beta Lactam antibiotics can cleave. ESBL bacterial strains are resistant against penicillins, cephalosporins (generation 1-4) and against monobactams. Mainly E. coli and Klebsiella (Gram-negative bacteria) carry ESBL-encoding genes. The rapid spread of this ESBL resistance is of great concern to microbiologists. It is in addition to the methicillin resistance of Staphylococcus aureus (MRSA) one of the most worrying focal points of infection research.

Ein Hilfsmittel gegen beta-Lactamasen sind beta-Lactamase Inhibitoren, welche zusammen mit einem beta-Lactam Antibiotikum als Kombinationspräparat verabreicht werden, um die Wirkung der beta-Lactamasen zu hemmen oder zumindest abzuschwächen. Beta-Lactamase Inhibitoren weisen derzeit einen beta-Lactamring auf, haben aber in der Regel keine nennenswerte antibakterielle Wirksamkeit. Es gibt zugelassene Kombinationspräparate mit Clavulansäure (1A), Sulbactam (1B) und Tazobactam (1C) als beta-Lactamase Inhibitoren, die in folgenden festen Kombinationen angewendet werden: Amoxicillin mit Clavulansäure, Ampicillin mit Sulbactam und Piperacillin mit Tazobactam. Es sind nicht alle Kombinationen optimal wirksam. Diese Hilfsmittel werden nur nach sorgfältiger Identifizierung der Bakterien und Resistenzbestimmung angewendet, da zu erwarten ist, dass auch gegen Kombinationspräparate sehr schnell Resistenzen gebildet werden.An adjunct to beta-lactamases are beta-lactamase inhibitors, which are administered together with a beta-lactam antibiotic as a combined preparation to inhibit or at least mitigate the effect of the beta-lactamases. Beta-lactamase inhibitors currently have a beta-lactam ring, but generally have no significant antibacterial activity. There are approved combined preparations with clavulanic acid ( 1A ), Sulbactam ( 1B ) and tazobactam ( 1C ) as beta-lactamase inhibitors used in the following fixed combinations: amoxicillin with clavulanic acid, ampicillin with sulbactam and piperacillin with tazobactam. Not all combinations are optimally effective. These aids are only used after careful identification of the bacteria and determination of resistance, since it is to be expected that resistance to combination drugs will be formed very quickly.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die inhibitorische Wirkung von Substanzen gegenüber beta-Lactamasen schnell und sicher bestimmt wird, insbesondere die inhibitorische Wirkung des Inhibitors eines Kombinationspräparates und damit die auf beta-Lactamasen beruhende Resistenz einer bakteriellen Probe gegenüber einem solchen Kombinationspräparat.It is the object of the invention to provide a method with which the inhibitory effect of substances against beta-lactamases is determined quickly and safely, in particular the inhibitory effect of the inhibitor of a combination preparation and thus based on beta-lactamases resistance of a bacterial sample against a such combination preparation.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Die erfindungsgemäßen Verfahren werden in den Ansprüchen 1, 9 und 19 beschrieben. Bevorzugte Ausführungsbeispiele sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 8 und 10 bis 18 ausgeführt.The processes of the invention are described in claims 1, 9 and 19. Preferred embodiments are set forth in the dependent claims 2 to 8 and 10 to 18.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Substanz gegenüber beta-Lactamasen, bei dem die Substanz mit einer beta-Lactamase und einem Substrat, das einen beta-Lactamring aufweist, zusammengeführt wird und danach ein Massenspektrum aufgenommen und dahingehend ausgewertet wird, ob das Substrat durch die beta-Lactamase enzymatisch modifiziert worden ist.The invention relates to a method for determining the inhibitory effect of a substance against beta-lactamases, in which the substance is combined with a beta-lactamase and a substrate having a beta-lactam ring, and then a mass spectrum is recorded and evaluated to see if the substrate has been enzymatically modified by the beta-lactamase.

Die zu untersuchende Substanz (Testsubstanz) wird mit dem Substrat bevorzugt in einem flüssigen Reaktionsansatz zusammengeführt, wobei nach einer gewissen Reaktionszeit von der Flüssigkeit oder einem Teil davon das Massenspektrum aufgenommen wird. Wird die enzymatische Tätigkeit der beta-Lactamasen durch die Testsubstanz nicht inhibiert, nimmt die Konzentration eines Substrates ab und die von Reaktionsprodukten steigt an, so dass das Massensignal des Substrates in dem Massenspektrum klein ist oder ganz fehlt und ein oder mehrere Massensignale von Reaktionsprodukten des Substrats in dem Massenspektrum vorhanden sind. Die Abnahme des Substrates aufgrund einer enzymatischen Modifikation wird bevorzugt aus dem Intensitätsverhältnis des Massensignals des Substrates zu dem Massensignal eines möglichen Reaktionsproduktes oder zu dem Massensignal einer Referenzsubstanz ermittelt.The substance to be investigated (test substance) is preferably combined with the substrate in a liquid reaction mixture, after which the mass spectrum is absorbed by the liquid or a part thereof after a certain reaction time. If the enzymatic activity of the beta-lactamases is not inhibited by the test substance, the concentration of a substrate decreases and that of reaction products increases, so that the mass signal of the substrate in the mass spectrum is small or absent and one or more mass signals of reaction products of the substrate are present in the mass spectrum. The decrease of the substrate due to an enzymatic modification is preferably determined from the intensity ratio of the mass signal of the substrate to the mass signal of a possible reaction product or to the mass signal of a reference substance.

Zu Beginn kann zudem ein weiteres Massenspektrum aufgenommen werden, um enzymatische Modifikationen aus den veränderten Signalintensitäten der entsprechenden Massensignalen in den beiden Massenspektren ermittelt zu können. Die im Verfahren verwendeten beta-Lactamasen können künstlich synthetisiert werden oder durch Bakterienstämme erzeugt werden, die eine beta-Lactamase Resistenz aufweisen. Beta-Lactamasen bewirken meist eine hydrolytische Spaltung des beta-Lactamringes des Antibiotikums, sodass ein Reaktionsprodukt um 18 atomare Masseneinheiten schwerer als das Antibiotikum ist.At the beginning of a further mass spectrum can be included to determine enzymatic modifications from the altered signal intensities of the corresponding mass signals in the two mass spectra. The beta-lactamases used in the process can be artificially synthesized or produced by bacterial strains that have beta-lactamase resistance. Beta-lactamases usually cause a hydrolytic cleavage of the beta-lactam ring of the antibiotic, so that a reaction product by 18 atomic mass units is heavier than the antibiotic.

Die Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Testsubstanz kann auch eine quantitative Bestimmung der inhibitorischen Wirkung, also die Stärke der inhibitorischen Wirkung, einschließen. Die Reaktionsgeschwindigkeit, mit der eine mehr oder weniger gehemmte beta-Lactamase ein Substrat umsetzt, ist ein Maß für die Stärke der inhibitorischen Wirkung einer Testsubstanz. Sind zu Beginn des Verfahrens die Konzentrationen der beta-Lactamase (bzw. der Menge des biologischen Materials), des Substrates und der Testsubstanz bekannt oder durch standardisierte Arbeitsanweisungen festgelegt, so kann die Reaktionsgeschwindigkeit aus den nach einer bestimmten Zeitdauer gemessenen Konzentrationen des Substrates und/oder dessen Reaktionsprodukten ermittelt werden (Einpunktmessung), wobei die Konzentrationen durch die Signalintensitäten der entsprechenden Massensignale (oder deren Verhältnisse zueinander) wiedergegeben werden. Es kann aber auch zu Beginn des Reaktionsverlaufes ein zusätzliches Massenspektrum (Zweipunktmessung) oder während des Reaktionsverlaufes mehrere zusätzliche Massenspektren (Mehrpunktmessung) aufgenommen werden, um aus den zeitlichen Veränderungen der Massensignale in den Massenspektren die Reaktionsgeschwindigkeit zu ermitteln. Wie in anderen massenspektrometrischen Verfahren üblich, kann am Ende des Reaktionsverlaufes die Konzentration des Substrates bzw. die Konzentrationen von Reaktionsprodukten aus Massensignalen von Kalibrierungssubstanzen abgeleitet werden, die dem Reaktionsansatz (bevorzugt am Ende des Reaktionsverlaufes) zugegeben werden und die nicht enzymatisch modifiziert werden.The determination of the inhibitory effect of a test substance can also include a quantitative determination of the inhibitory effect, ie the strength of the inhibitory effect. The reaction rate at which a more or less inhibited beta-lactamase converts a substrate is a measure of the strength of the inhibitory action of a test substance. If the concentrations of the beta-lactamase (or the amount of biological material), the substrate and the test substance are known at the beginning of the procedure or determined by standardized operating instructions, the reaction rate may be determined from the concentrations of the substrate measured after a certain period of time and / or whose reaction products are determined (one-point measurement), the concentrations being represented by the signal intensities of the corresponding mass signals (or their relationships to one another). However, it is also possible to record an additional mass spectrum (two-point measurement) or several additional mass spectra (multipoint measurement) during the course of the reaction in order to determine the reaction rate from the time changes of the mass signals in the mass spectra. As in common to other mass spectrometric methods, at the end of the course of the reaction, the concentration of the substrate or the concentrations of reaction products can be derived from mass signals from calibration substances which are added to the reaction mixture (preferably at the end of the course of the reaction) and which are not enzymatically modified.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die inhibitorische Wirkung einer Testsubstanz gegenüber mehreren beta-Lactamasen, die zu verschiedenen Klassen von beta-Lactamasen gehören können, gleichzeitig bestimmt werden. Da die Reaktionsprodukte von verschiedenen Substraten in einem Massenspektrum in der Regel gut zu unterscheiden sind, können zudem mehrere Substrate verwendet werden, die jeweils spezifisch für eine bestimmte beta-Lactamase oder für eine bestimmte Klasse von beta-Lactamasen sind, so dass die inhibitorische Wirksamkeit der Testsubstanz gegenüber verschiedenen beta-Lactamasen unterschieden werden kann.With the method according to the invention, the inhibitory effect of a test substance on several beta-lactamases, which may belong to different classes of beta-lactamases, can be determined simultaneously. In addition, since the reaction products of various substrates in a mass spectrum are usually well distinguishable, several substrates can be used, each specific for a particular beta-lactamase or for a particular class of beta-lactamases, so that the inhibitory potency of the Test substance to different beta-lactamases can be distinguished.

Die im Verfahren verwendeten Substrate können wirksame beta-Lactam Antibiotika oder Derivate von beta-Lactam Antibiotika sein. Für eine Erhöhung der Empfindlichkeit des Verfahrens ist es günstig, hohe Konzentrationen der Substrate einzusetzen. Allerdings werden dadurch die Bakterien, die die bevorzugte Quelle der beta-Lactamasen sind, zu schnell abgetötet, und zwar selbst solche mit einer beta-Lactamase Resistenz. Aus diesem Grund können Substrate verwendet werden, die eine geringere antibiotische Wirksamkeit als herkömmliche beta-Lactam Antibiotka aufweisen. Die Substrate bilden dabei in bevorzugter Weise die sterischen Formen von verschiedenen Antibiotika nach.The substrates used in the process may be effective beta-lactam antibiotics or derivatives of beta-lactam antibiotics. To increase the sensitivity of the process, it is advantageous to use high concentrations of the substrates. However, this kills bacteria, which are the preferred source of beta-lactamases, too quickly, even those with beta-lactamase resistance. For this reason, substrates having a lower antibiotic activity than conventional beta-lactam antibiotics can be used. The substrates in this case preferably reproduce the steric forms of various antibiotics.

Die Testsubstanz wird bevorzugt mit mehreren Substraten und resistenten Bakterien in eine Nährlösung gegeben, wobei insbesondere solche Bakterienstämme ausgewählt werden, die eine ausgeprägte beta-Lactamase Resistenz gegenüber bisherigen beta-Lactam Antibiotika und Kombinationspräparaten aufweisen. Nach einer Inkubationszeit wird von dem Überstand der Nährlösung oder einem Teil davon ein Massenspektrum aufgenommen.The test substance is preferably added to a nutrient solution with a plurality of substrates and resistant bacteria, in particular those bacterial strains are selected which have a pronounced beta-lactamase resistance to previous beta-lactam antibiotics and combination preparations. After an incubation period, a mass spectrum is taken up from the supernatant of the nutrient solution or a part thereof.

Das Massenspektrum kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren prinzipiell mit jeder Art von Massenspektrometer aufgenommen werden. Es ist jedoch besonders günstig, ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss zu benutzen, das bereits im Routinebetrieb für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt wird. Da der MALDI-Prozess im unteren Massenbereich von einigen hundert atomaren Masseneinheiten einen starken chemischen Untergrund erzeugt, ist es günstig, Substrate zu verwenden, die in untergrundarmen Massenbereichen liegen. Das gelingt beispielsweise durch den Einsatz von Substraten mit Molekulargewichten größer als 700 atomaren Masseneinheiten, bevorzugt zwischen 700 und 1200 atomaren Masseneinheiten. Außerdem ist es günstig, die Protonenaffinität der Substrate zu erhöhen, um sie besser ionisierbar zu machen. Eine chemische Derivatisierung des Substrates bezüglich des Molekulargewichtes, der Protonenaffinität und/oder eines kovalent gebundenen Ladungstags wird bevorzugt am Ende des Reaktionsverlaufes durchgeführt, um die chemischen Eigenschaften des Substrates während der Reaktion denen eines Antibiotikums möglichst ähnlich zu belassen, und kann auch Reaktionsprodukte des Substrates betreffen. Des Weiteren können die verwendeten Substrate eine Ankergruppe aufweisen, mit dem sie aus dem Medium, in dem die Reaktion angesetzt worden ist, extrahiert und angereichert werden können. Beispiele für Ankergruppen sind Biotin und ein 6-His-Tag aus einer Kette von sechs Histidin-Molekülen, die durch Streptavidin bzw. ein mit Nickelionen beladenes Chelat extrahiert werden, wobei die Bindungen reversibel sind und die extrahierenden Bindungspartner an den Wänden des Reaktionsgefäßes oder an Magnetkügelchen gebunden sein können.The mass spectrum can in principle be recorded in the method according to the invention with any type of mass spectrometer. However, it is particularly advantageous to use an axial ion injection MALDI time-of-flight mass spectrometer already in routine use for the mass spectrometric identification of microorganisms. Since the MALDI process generates a strong chemical background in the lower mass range of a few hundred atomic mass units, it is favorable to use substrates which lie in low-background mass ranges. This is achieved, for example, by the use of substrates having molecular weights greater than 700 atomic mass units, preferably between 700 and 1200 atomic mass units. In addition, it is beneficial to increase the proton affinity of the substrates to make them more ionizable. A chemical derivatization of the substrate in terms of molecular weight, the proton affinity and / or a covalently bonded charge tag is preferably carried out at the end of the reaction to leave the chemical properties of the substrate during the reaction as similar as possible to those of an antibiotic, and may also relate to reaction products of the substrate , Furthermore, the substrates used may have an anchor group with which they can be extracted and enriched from the medium in which the reaction has been started. Examples of anchor groups are biotin and a 6-His tag from a chain of six histidine molecules extracted by streptavidin or a nickel ion-loaded chelate, which bonds are reversible and the extracting binding partners on the walls of the reaction vessel or on Magnetic beads can be bound.

Ein Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, im Rahmen einer pharmakologischen Medikamentenentwicklung eine Substanzbibliothek zu durchmustern, um Leitstrukturen für beta-Lactamase Inhibitoren zu finden, die in Kombinationspräparaten zusammen mit einem Antibiotikum zum Einsatz kommen.One application of the method according to the invention is to screen a substance library as part of a pharmacological drug development in order to find lead structures for beta-lactamase inhibitors which are used in combination preparations together with an antibiotic.

Eine weitere Anwendung besteht darin, dass die inhibitorische Wirksamkeit von mehreren Substanzen, die gegenüber bestimmten Klassen von beta-Lactamasen unterschiedliche inhibitorische Wirkungen aufweisen, gegenüber einem Bakterienstamm mit einer beta-Lactamase Resistenz bestimmt wird und dass die beta-Lactamase des Bakterienstammes durch die inhibitorische Wirksamkeit bzw. Unwirksamkeit der Substanzen charakterisiert wird, und zwar insbesondere hinsichtlich des Kodierungsortes des Resistenzgens. Das Resistenzgen kann bei Bakterien in einem Plasmid oder im Bakterienchromosom kodiert sein. Da ein Resistenzgen auf einem Plasmid im Vergleich zu einem auf dem Bakterienchromosom leicht zwischen Bakterienstämmen verschiedener Arten und sogar Gattungen ausgetauscht werden kann, was die Verbreitungsgeschwindigkeit des Resistenzgenes und damit das Gefahrenpotential durch den Bakterienstamm erhöht, ist die Kenntnis des Kodierungsortes für die epidemiologische Bewertung der bakteriellen Probe von großer Bedeutung. Es ist beispielsweise bekannt, dass beta-Lactamasen der molekularen Gruppe A (Enzyme mit einer Serin-Gruppe) hauptsächlich plasmidal kodiert werden, aber durch Clavulansäure nicht oder nur geringfügig gehemmt werden, während beta-Lactamasen der molekularen Gruppe B (Metalloenzyme) chromosomal kodiert und durch Clavulansäure gehemmt werden.Another application is that the inhibitory potency of several substances which have different inhibitory effects on certain classes of beta-lactamases is determined against a bacterial strain having a beta-lactamase resistance and that the beta-lactamase of the bacterial strain is determined by the inhibitory activity or inefficiency of the substances is characterized, in particular with regard to the coding site of the resistance gene. The resistance gene may be encoded by bacteria in a plasmid or in the bacterial chromosome. Since a resistance gene on a plasmid can be easily exchanged between bacterial strains of various species and even genera on a bacterial chromosome, which increases the rate of spread of the resistance gene and thus the potential danger by the bacterial strain, the knowledge of the coding site for the epidemiological evaluation of the bacterial Sample of great importance. For example, it is known that beta-lactamases of molecular group A (enzymes with a serine group) are mainly plasmid-encoded, but are not or only slightly inhibited by clavulanic acid, while beta-lactamases of molecular group B (metalloenzymes) are chromosomally encoded and inhibited by clavulanic acid.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, mit dem festgestellt wird, ob eine bakterielle Probe gegenüber einem Kombinationspräparat durch die Bildung von beta-Lactamasen resistent ist, wobei insbesondere die inhibitorische Wirksamkeit des Inhibitors eines Kombinationspräparates gegenüber den beta-Lactamasen bestimmt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, dass die bakterielle Probe mit dem Kombinationspräparat zusammengeführt wird und danach ein Massenspektrum aufgenommen und dahingehend ausgewertet wird, ob ein beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates enzymatisch modifiziert worden ist. Ein Kombinationspräparat besteht mindestens aus einem Inhibitor und einem beta-Lactam Antibiotikum. Die Anzahl der Antibiotika und der Inhibitoren in einem Kombinationspräparat kann aber jeweils größer als eins sein.The invention further relates to a method with which it is determined whether a bacterial sample is resistant to a combination preparation by the formation of beta-lactamases, in particular the inhibitory activity of the inhibitor of a combination preparation is determined against the beta-lactamases. The inventive method is that the bacterial sample is combined with the combination preparation and then recorded a mass spectrum and is evaluated to see whether a beta-lactam antibiotic of the combination preparation has been enzymatically modified. A combination preparation consists of at least one inhibitor and one beta-lactam antibiotic. However, the number of antibiotics and the inhibitors in a combination preparation can each be greater than one.

Der Begriff ”bakterielle Probe” ist allgemein zu verstehen. Es kann sich dabei um eine Probe handeln, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie Bakterien enthält, oder die untersucht werden soll, ob sie Bakterien enthält. Eine bakterielle Probe kann beispielsweise eine Teilmenge einer bereits isolierten Bakterienkultur sein, die von einer Agarplatte geerntet wird, aber auch ein Bakterienpellet sein, das direkt aus einer Körperflüssigkeit wie Blut, Urin oder CSF (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) oder aus einer Nährlösung, wie einer Blutkultur oder Bouillonkultur, gewonnen wird. Ebenso gelten Abstriche von Schleimhäuten, insbesondere ein Abstrich der Nasen- oder Rachenschleimhaut, Wundabstriche oder Stuhlproben als bakterielle Proben, wie auch Wischproben in Krankenhäusern oder in Lebensmittel verarbeitenden Betrieben, und Lebensmittelproben selber. Eine bakterielle Probe kann Bakterien eines Stammes oder mehrerer Stämme enthalten.The term "bacterial sample" is to be understood generally. It may be a sample that is known or suspected to contain bacteria, or to be tested for its presence in bacteria. For example, a bacterial sample may be a subset of an already isolated bacterial culture harvested from an agar plate, but may also be a bacterial pellet derived directly from a body fluid such as blood, urine or CSF (cerebrospinal fluid) or from a nutrient solution such as a blood culture or broth culture. Likewise smears of mucous membranes, in particular smear of the nasal or pharyngeal mucosa, wound swabs or stool samples as bacterial samples, as well as wiping samples in hospitals or in food processing plants, and food samples themselves apply. A bacterial sample may contain bacteria of one or more strains.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die bakterielle Probe bevorzugt zusammen mit dem Kombinationspräparat in einer Nährlösung inkubiert und danach der Überstand der Nährlösung oder ein Teil davon einer massenspektrometrischen Messung zugeführt. Es ist allerdings auch möglich, dass die bakterielle Probe auf einem flächigen Nährmedium (z. B. einer Agarplatte) aufgebracht wird, das das Kombinationspräparat enthält. Das Massenspektrum wird dann von dem Nährmedium in der Nähe der bakteriellen Probe aufgenommen.In the method according to the invention, the bacterial sample is preferably incubated together with the combination preparation in a nutrient solution and then the supernatant of the nutrient solution or a part thereof supplied to a mass spectrometric measurement. However, it is also possible for the bacterial sample to be applied to a flat nutrient medium (eg an agar plate) containing the combination preparation. The mass spectrum is then taken up by the nutrient medium in the vicinity of the bacterial sample.

Es ist besonders bevorzugt, dass in einem zusätzlichen Reaktionsansatz die bakterielle Probe nur mit dem beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates zusammengeführt wird. Das zusätzliche Massenspektrum gibt Aufschluss darüber, ob die Bakterien der Probe beta-Lactamasen produzieren, die das beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates enzymatisch modifizieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin so modifiziert werden, dass nicht das Kombinationspräparat mit der bakteriellen Probe zusammengeführt wird, sondern dass der Inhibitor des Kombinationspräparates und ein Substrat, z. B. ein Derivat des beta-Lactam Antibiotikums, mit der bakteriellen Probe zusammengeführt werden.It is particularly preferred that in an additional reaction batch, the bacterial sample is combined only with the beta-lactam antibiotic of the combination preparation. The additional mass spectrum provides information on whether the bacteria of the sample produce beta-lactamases which enzymatically modify the beta-lactam antibiotic of the combination preparation. The inventive method can be further modified so that not the combination preparation is combined with the bacterial sample, but that the inhibitor of the combination preparation and a substrate, for. As a derivative of the beta-lactam antibiotic, are brought together with the bacterial sample.

Wie bereits oben beschrieben, kann aus dem Fehlen des Massensignals des beta-Lactam Antibiotikums oder aus dem Vorhandensein von einem oder mehreren Massensignalen von Reaktionsprodukten oder aus dem Intensitätsverhältnis des Massensignals des beta-Lactam Antibiotikums zu einem Massensignal eines Reaktionsproduktes oder zu dem Massensignal einer Referenzsubstanz auf eine enzymatische Modifikation des beta-Lactam Antibiotikums geschlossen werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit, mit der ein beta-Lactam Antibiotikum eines Kombinationspräparates umgesetzt wird, ist ein quantitatives Maß für die Stärke der beta-Lactamase Resistenz der Bakterien gegenüber dem Kombinationspräparat und kann aus einer Einpunkt-, Zweipunkt oder Mehrpunktmessung bestimmt werden. Die Bestimmung der Resistenz kann, wie in einem funktionellen Test üblich, für verschiedenen Konzentrationen des Kombinationspräparates durchgeführt werden, um die minimale Hemmkonzentration zu bestimmen.As already described above, from the absence of the mass signal of the beta-lactam antibiotic or from the presence of one or more mass signals of reaction products or from the intensity ratio of the mass signal of the beta-lactam antibiotic to a mass signal of a reaction product or to the mass signal of a reference substance an enzymatic modification of the beta-lactam antibiotic can be concluded. The reaction rate at which a beta-lactam antibiotic of a combination preparation is reacted is a quantitative measure of the strength of the beta-lactamase resistance of the bacteria to the combination preparation and can be determined from a single-point, two-point or multi-point measurement. Determination of resistance may be performed for various concentrations of the combination preparation, as is common in a functional assay, to determine the minimum inhibitory concentration.

Insbesondere für den Fall, dass das oder die Massenspektren mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer aufgenommen werden, ist es günstig, dass nach der Reaktion eine zusätzliche chemische Derivatisierung erfolgt, die das beta-Lactam Antibiotikum und/oder die gegebenenfalls vorhandenen Reaktionsprodukte so verändert, dass danach deren Molekulargewicht größer als 700 atomare Masseneinheiten ist, deren Protonenaffinität erhöht ist und/oder sie mindestens eine kovalent gebundene Ladung aufweisen.In particular, in the event that the mass spectra or mass spectra are recorded with a MALDI time-of-flight mass spectrometer, it is favorable that an additional chemical derivatization takes place after the reaction, which changes the beta-lactam antibiotic and / or the optionally present reaction products so that thereafter whose molecular weight is greater than 700 atomic mass units whose proton affinity is increased and / or they have at least one covalently bonded charge.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann schnell und zuverlässig getestet werden, ob eine bakterielle Probe eine beta-Lactamase Resistenz aufweist und ob ein Kombinationspräparat wirksam gegenüber vorhandenen beta-Lactamasen ist. Die Testdauer beträgt weniger als drei Stunden und ist damit sehr viel schneller als das Routineverfahren, in dem das Wachstum der Bakterien bzw. die Hemmung des Wachstums optisch nachgewiesen wird. Im Gegensatz zu genetischen Verfahren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Wirksamkeit von Kombinationspräparate gegenüber einer bakteriellen Probe mit einer beta-Lactamase Resistenz funktionell bestimmt werden.With the method according to the invention can be tested quickly and reliably, whether a bacterial sample has a beta-lactamase resistance and whether a combination preparation is effective against existing beta-lactamases. The test duration is less than three hours and is thus much faster than the routine method in which the growth of bacteria or the inhibition of growth is optically detected. In contrast to genetic methods, the method according to the invention can be used to functionally determine the efficacy of combination preparations in relation to a bacterial sample having a beta-lactamase resistance.

In den erfindungsgemäßen Verfahren kann das Massenspektrum prinzipiell mit jeder Art von Massenspektrometer aufgenommen werden, beispielsweise mit einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), einem Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (ICR-MS), einer elektrostatische Ionenfallen-Massenspektrometer oder einem Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometer. Für eine massenspektrometrische Bestimmung einer enzymatischen Modifikation des Substrats ist ein Triple-Quadrupolfilter-Massenspektrometer besonders geeignet, da sich mit ihm eine sehr hohe Empfindlichkeit erzielen lässt, so dass geringste Ausgangsmengen genügen, um die erfindungsgemäßen Verfahren durchführen zu können. Es ist jedoch erstrebenswert, dasselbe MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss zu verwenden, das bereits im Routinebetrieb für die taxonomische Identifizierung der Bakterien eingesetzt wird. Statt einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) können für die erfindungsgemäßen Verfahren andere Arten der Ionisierung, beispielsweise Elektrosprühen (ESI) oder Ionisierung durch matrixfreie Laserdesorption (nanostructure initiator mass spectrometry (NIMS)), verwendet werden. Dem einschlägigen Fachmann sind diese Massenspektrometer und Ionisierungsverfahren vertraut, so dass hier auf eine detaillierte Schilderung verzichtet wird.In the methods according to the invention, the mass spectrum can in principle be used with any type of Mass spectrometers may be included, for example, with an orthogonal ion impact time-of-flight mass spectrometer (OTOF), an ion cyclotron resonance mass spectrometer (ICR-MS), an electrostatic ion trap mass spectrometer, or a high frequency ion trap mass spectrometer. For a mass spectrometric determination of an enzymatic modification of the substrate, a triple-quadrupole filter mass spectrometer is particularly suitable because it allows a very high sensitivity to be achieved, so that the lowest initial quantities are sufficient to carry out the methods according to the invention. However, it is desirable to use the same axial ion injection MALDI time-of-flight mass spectrometer already in routine use for taxonomic identification of the bacteria. Instead of ionization by matrix-assisted laser desorption (MALDI), other types of ionization, for example electrospray (ESI) or ionization by nanostructure initiator mass spectrometry (NIMS), can be used for the methods according to the invention. Those skilled in the art are familiar with these mass spectrometers and ionization methods, so that a detailed description is omitted here.

Kurze Beschreibung der AbbildungenBrief description of the illustrations

Die bis zeigen die molekularen Strukturformeln von drei aus dem Stand der Technik bekannten beta-Lactamase Inhibitoren: Clavulansäure (1A), Sulbactam (1B) und Tazobactam (1C).The to show the molecular structural formulas of three known from the prior art beta-lactamase inhibitors: clavulanic acid ( 1A ), Sulbactam ( 1B ) and tazobactam ( 1C ).

Die zeigt einen schematischen Verfahrensablauf zur Bestimmung der inhibitorischen Wirksamkeit von Testsubstanzen für die Identifizierung von Leitstrukturen in einer pharmakologischen Wirkstoffsuche (Hochdurchsatzdurchmusterung, High-Throughput-Screening).The shows a schematic procedure for determining the inhibitory activity of test substances for the identification of lead structures in a pharmacological drug discovery (high throughput screening).

Die zeigt einen schematischen Verfahrensablauf zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Kombinationspräparates gegenüber einer bakteriellen Probe.The shows a schematic process flow for determining the effectiveness of a combination preparation against a bacterial sample.

Die bis zeigen vier gemessene MALDI-Massenspektren des Antibiotikums Ampillicin in einem Massenbereich zwischen 340 und 450 atomaren Masseneinheiten.The to show four measured MALDI mass spectra of the antibiotic ampicillin in a mass range between 340 and 450 atomic mass units.

Bevorzugte AusführungsbeispielePreferred embodiments

Die bis zeigen die molekularen Strukturformeln von drei aus dem Stand der Technik bekannten beta-Lactamase Inhibitoren: Clavulansäure (1A), Sulbactam (1B) und Tazobactam (1C). Diese Inhibitoren weisen alle einen beta-Lactamring auf, also ein zyklisches Amid mit einer Heteroringstruktur aus drei Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom.The to show the molecular structural formulas of three known from the prior art beta-lactamase inhibitors: clavulanic acid ( 1A ), Sulbactam ( 1B ) and tazobactam ( 1C ). These inhibitors all have a beta-lactam ring, that is a cyclic amide having a heterocyclic structure of three carbon atoms and one nitrogen atom.

Die zeigt den schematischen Verfahrensablauf zur Bestimmung der inhibitorischen Wirksamkeit von Testsubstanzen für die Identifizierung von Leitstrukturen in einer pharmakologischen Wirkstoffsuche. Pharmazeutische Firmen unterhalten große Substanzbibliotheken, die durchaus einige hundertausend verschiedene Substanzen enthalten können. Durch moderne chemische Verfahren, wie der kombinatorischen Synthese oder der hochparallelen Präparation von Naturstoffen, können in kurzer Zeit tausende Derivate von vorhandenen Ausgangssubstanzen hergestellt werden oder neue Ausgangssubstanzen gefunden werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, eine Vielzahl von Substanzen in kurzer Zeit auf ihre inhibitorische Wirksamkeit gegenüber beta-Lactamasen zu testen (Hochdurchsatzdurchmusterung, High-Throughput-Screening).The shows the schematic procedure for determining the inhibitory activity of test substances for the identification of lead structures in a pharmacological drug discovery. Pharmaceutical companies maintain large libraries of substances that can contain several hundred thousand different substances. By modern chemical processes, such as the combinatorial synthesis or the highly parallel preparation of natural substances, thousands of derivatives of existing starting materials can be prepared in a short time or new starting substances can be found. The method according to the invention makes it possible to test a large number of substances in a short time for their inhibitory activity against beta-lactamases (high-throughput screening, high-throughput screening).

Im Schritt A werden Testsubstanzen in einer Substanzplatte 100 bereitgestellt. Die Substanzplatte 100 ist eine Mikrotiterplatte mit 24 räumlich getrennten Näpfchen 101 bis 124 (engl. Wells), die in Reihen und Spalten angeordnet sind. Die genauen Abmessungen (Länge × Breite × Höhe) einer Mikrotiterplatte betragen gemäß ANSI-Standard auf Empfehlung der Society of Biomolecular Screening 127,76 mm × 85,48 mm × 14,35 mm. Es gibt eine Vielzahl an Formaten, z. B. mit 24 Näpfchen (4 × 6, Füllvolumen: 0,5–3 ml pro Näpfchen), 96 Näpfchen (8 × 12, Füllvolumen: 0,3–2 ml pro Näpfchen) oder 384 Näpfchen (16 × 24, Füllvolumen: 0,03–0,1 ml pro Näpfchen). Jedes Näpfchen der Substanzplatte 100 enthält in diesem Ausführungsbeispiel nur eine einzige Testsubstanz. Ein Pipettierautomat 10 überträgt die Testsubstanzen von der Substanzplatte 100 so auf eine Reaktionsplatte 200, dass jedes Näpfchen der Reaktionsplatte 200 eine einzige Testsubstanz enthält. Die Reaktionsplatte 200 ist eine Mikrotiterplatte mit 24 Näpfchen 201 bis 224. Die Pipetten des Pipettierautomaten 10 werden nach jedem Transfer ausgetauscht, um Kontaminationen der Testsubstanzen in den Näpfchen 201 bis 224 auszuschließen.In step A, test substances are in a substance plate 100 provided. The substance plate 100 is a microtiter plate with 24 spatially separated wells 101 to 124 (English Wells), which are arranged in rows and columns. The exact dimensions (length x width x height) of a microtiter plate are 127.76 mm × 85.48 mm × 14.35 mm according to the ANSI standard recommended by the Society of Biomolecular Screening. There are a variety of formats, eg. B. with 24 wells (4 × 6, filling volume: 0.5-3 ml per well), 96 wells (8 × 12, filling volume: 0.3-2 ml per well) or 384 wells (16 × 24, filling volume: 0.03-0.1 ml per well). Each cup of the substance plate 100 contains only a single test substance in this embodiment. An automatic pipetting machine 10 transfers the test substances from the substance plate 100 so on a reaction plate 200 that every well of the reaction plate 200 contains a single test substance. The reaction plate 200 is a microtiter plate with 24 wells 201 to 224 , The pipettes of the automatic pipettor 10 are exchanged after each transfer to contaminate the test substances in the wells 201 to 224 excluded.

Im Schritt B wird mit einem Dispenser 20 in jedes Näpfchen der Reaktionsplatte 200 ein Substratgemisch mit drei verschiedenen Substraten S1 bis S3 gegeben, die alle beta-Lactam Antibiotika sind. Das Dispensieren erfolgt kontaktfrei, um Kontaminationen zwischen den Reaktionsansätzen auszuschließen.In step B is using a dispenser 20 in each well of the reaction plate 200 a substrate mixture with three different substrates S1 to S3, all of which are beta-lactam antibiotics. The dispensing is done without contact to exclude contamination between the reaction mixtures.

Im Schritt C wird aus jedem Näpfchen der Reaktionsplatte 200 einige Mikroliter des Überstandes auf einen ersten MALDI-Probenträger 300 übertragen und dort präpariert. Der Probenträger 300 weist hier in Bezug auf die Probenorte das gleiche Format wie die Reaktionsplatte 200 auf, kann aber auch mehr als die 24 Probenorte 301 bis 324 haben, so dass auch Proben von anderen Reaktionsplatten auf dem MALDI-Probenträger 300 präpariert werden können. Nachdem die von der Reaktionsplatte 200 übertragenen Proben auf dem Probenträger 300 getrocknet sind, werden sie mit einem Mikroliter Matrixlösung überschichtet. Als Matrix wird α-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure (HCCA) in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in einer Mischung von Wasser, 50% Acetonitril und 2,5% Trifluoressigsäure verwendet. Die Übertragung der Proben sowie der Matrixlösung auf die Probenorte 301 bis 324 des MALDI-Probenträgers 300 erfolgt mit einem nicht dargestellten Pipettierautomat. Nach der Präparation wird der Probenträger 300 in ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer eingeführt und an jedem der MALDI-Probenorte 301 bis 324 ein Massenspektrum MSa1 bis MSa24 aufgenommen, von denen in der der Übersichtlichkeit halber nur die Massenspektren MSa1 und MSa24 dargestellt sind. Jedes der MALDI-Massenspektren MSa1 bis MSa24 enthält Massensignale der Substrate S1 bis S3 sowie der jeweiligen Testsubstanz, also beispielsweise der Testsubstanz T1 im Massenspektrum MSa1. Die im Schritt C aufgenommenen Massenspektren MSa1 bis MSa24 zeigen die Signalstärken der Substrate S1 bis S3 zu Beginn der nachfolgenden Inhibitionsreaktionen und ermöglichen somit die Bestimmung der inhibitorischen Stärke der zu untersuchenden Testsubstanzen T1 bis T24 in einer Zweipunktmessung.In step C, each well of the reaction plate becomes 200 a few microliters of the supernatant on a first MALDI sample carrier 300 transferred and prepared there. The sample carrier 300 here has the same format as the reaction plate with respect to the sample locations 200 but can do more than the 24 sample locations 301 to 324 so that also samples from other reaction plates on the MALDI sample carrier 300 can be prepared. After the of the reaction plate 200 transferred samples on the sample carrier 300 dried, they are overcoated with a microliter of matrix solution. The matrix used is α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) at a concentration of 10 milligrams per milliliter in a mixture of water, 50% acetonitrile and 2.5% trifluoroacetic acid. The transfer of the samples and the matrix solution to the sample locations 301 to 324 of the MALDI sample holder 300 done with a not shown pipetting. After the preparation, the sample carrier becomes 300 introduced into a MALDI time-of-flight mass spectrometer and at each of the MALDI sample locations 301 to 324 a mass spectrum MSa1 to MSa24 was recorded, of which in the For the sake of clarity, only the mass spectra MSa1 and MSa24 are shown. Each of the MALDI mass spectra MSa1 to MSa24 contains mass signals of the substrates S1 to S3 and of the respective test substance, that is to say, for example, the test substance T1 in the mass spectrum MSa1. The mass spectra MSa1 to MSa24 recorded in step C show the signal strengths of the substrates S1 to S3 at the beginning of the subsequent inhibition reactions and thus make it possible to determine the inhibitory strength of the test substances T1 to T24 to be examined in a two-point measurement.

Im Schritt D wird mit einem Dispenser 30 in jedes Näpfchen der Reaktionsplatte 200 ein Bakteriengemisch zugegeben. Das Dispensieren erfolgt wie in Schritt C kontaktfrei, um Kontaminationen zwischen den Reaktionsansätzen auszuschließen. Das Bakteriengemisch enthält verschiedene Bakterienstämme, bei denen eine beta-Lactamase Resistenz gegenüber den verwendeten Antibiotika bereits nachgewiesen worden ist. Anschließend wird die Reaktionsplatte 300 für drei Stunden bei 37° Celsius unter Schütteln inkubiert und danach zentrifugiert, um die Bakterienzellen an den Böden der Näpfchen abzutrennen.In step D is using a dispenser 30 in each well of the reaction plate 200 added a mixture of bacteria. The dispensing is done as in step C non-contact to exclude contamination between the reaction approaches. The bacterial mixture contains various bacterial strains in which a beta-lactamase resistance to the antibiotics used has already been detected. Subsequently, the reaction plate 300 incubated for three hours at 37 ° C with shaking and then centrifuged to separate the bacterial cells at the bottom of the wells.

Im Schritt E werden aus jedem Näpfchen der Reaktionsplatte 200 einige Mikroliter des Überstandes auf einen zweiten MALDI-Probenträger 400 übertragen und dort, wie in Schritt C beschrieben, präpariert. Der Probenträger 400 weist das gleiche Format wie der Probenträger 300 auf. Nach der Präparation wird der Probenträger 400 in das MALDI-Flugzeitmassenspektrometer eingeführt und für jeden der 24 MALDI-Probenorte 401 bis 424 jeweils ein Massenspektrum (MSb1 bis MSb24) aufgenommen. Die inhibitorische Wirksamkeit der Testsubstanzen kann aus dem Vergleich der entsprechenden Massensignale in den Massenspektren vor und nach der Inhibitionsreaktion bestimmt werden. Die Massensignale der Substrate S1 bis S3 sind beispielsweise im Massenspektrum MSb1 im Vergleich zum Massenspektrum MSa1 nicht verändert, d. h., es hat keine enzymatische Modifikation der Substrate S1 bis S3 stattgefunden. Die Testsubstanz T1 hat alle vom Bakteriengemisch produzierten beta-Lactamasen inhibiert. Demgegenüber fehlen im Massenspektrum MSb24 die Massensignale der Substrate S1 bis S3 und es sind Massensignale entsprechender Reaktionsprodukte R1 bis R3 vorhanden. Die Testsubstanz T24 hemmt also die beta-Lactamasen des Bakteriengemisches nicht.In step E, out of each well of the reaction plate 200 a few microliters of the supernatant on a second MALDI slide 400 transferred and there, as described in step C, prepared. The sample carrier 400 has the same format as the sample carrier 300 on. After the preparation, the sample carrier becomes 400 introduced into the MALDI time-of-flight mass spectrometer and for each of the 24 MALDI sample locations 401 to 424 in each case a mass spectrum (MSb1 to MSb24) was recorded. The inhibitory activity of the test substances can be determined from the comparison of the corresponding mass signals in the mass spectra before and after the inhibition reaction. The mass signals of the substrates S1 to S3 are not changed, for example, in the mass spectrum MSb1 in comparison to the mass spectrum MSa1, ie, no enzymatic modification of the substrates S1 to S3 has taken place. The test substance T1 has inhibited all beta-lactamases produced by the bacterial mixture. In contrast, the mass signals of the substrates S1 to S3 are absent in the mass spectrum MSb24 and there are mass signals of corresponding reaction products R1 to R3. The test substance T24 thus does not inhibit the beta-lactamases of the bacterial mixture.

Für die Durchsuchung von großen Substanzbibliotheken kann das Verfahren so durchgeführt werden, dass zunächst die inhibitorische Wirkung in einer Vielzahl von Multiplex-Ansätzen mit jeweils mehreren Testsubstanzen pro Näpfchen bestimmt wird und dass danach diejenigen Testsubstanzen einzeln getestet werden, bei denen sich in einem der Multiplex-Ansätze eine inhibitorische Wirkung gezeigt hat.For the search of large substance libraries, the method can be carried out in such a way that first the inhibitory effect is determined in a multiplicity of multiplex mixtures with in each case several test substances per well and, subsequently, those test substances are individually tested in which one of the multiplex Approaches has shown an inhibitory effect.

Die zeigt den schematischen Verfahrensablauf zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Kombinationspräparates gegenüber einer bakteriellen Probe.The shows the schematic procedure for determining the effectiveness of a combination preparation against a bacterial sample.

Im Schritt A werden von einer isolierten Bakterienkolonie 3, die in üblicher Weise auf einer Agarplatte kultiviert worden ist, jeweils kleine Mengen in zwei Eppendorf-Röhrchen 1 und 2 übertragen, die mit einem flüssigen Nährmedium aufgefüllt werden. Die Eppendorf-Röhrchen 1 und 2 werden danach in einem Vortexer für eine kurze Dauer geschüttelt, damit sich die Bakterien im Nährmedium verteilen. Für die Standardisierung des Testes wird die Anzahl der Bakterienzellen pro Volumeneinheit auf einen bestimmten Wert eingestellt, indem solange weitere Mikrobenmengen zugegeben werden, eine inkubierte Wachstumsphase folgt oder das Nährmedium verdünnt wird, bis die optische Dichte des Nährmediums einen bestimmten Wert hat.In step A are from an isolated bacterial colony 3 , which has been cultured on an agar plate in the usual way, in each case small amounts in two Eppendorf tubes 1 and 2 transferred, which are filled up with a liquid nutrient medium. The Eppendorf tubes 1 and 2 are then shaken in a vortexer for a short duration so that the bacteria are distributed in the nutrient medium. For the standardization of the test, the number of bacterial cells per unit volume is adjusted to a certain value by adding more microbial amounts, followed by an incubated growth phase or diluting the nutrient medium until the optical density of the nutrient medium has a specific value.

Im Schritt B wird dem Reaktionsansatz im Eppendorf-Röhrchen 1 das zu untersuchende Kombinationspräparat 5 zugeführt. Dem Reaktionsansatz im Eppendorf-Röhrchen 2 wird nur das Antibiotikum 6 des Kombinationspräparates zugeführt.In step B, the reaction mixture in the Eppendorf tube 1 the combination preparation to be examined 5 fed. The reaction mixture in the Eppendorf tube 2 will only be the antibiotic 6 supplied to the combined preparation.

In den Schritten C und D werden die beiden Eppendorf-Röhrchen 1 und 2 für drei Stunden bei 37° Celsius unter Schütteln inkubiert und danach für 2 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, um in den Eppendort-Röhrchen 1 und 2 jeweils einen zellfreien Überstand (7A, 8A) und ein Bakterienpellet (8A, 8B) am Boden der Röhrchen zu erhalten.In steps C and D, the two Eppendorf tubes 1 and 2 incubated for three hours at 37 ° C with shaking and then centrifuged for 2 min at 13,000 rpm to enter the eppendorf tube 1 and 2 each cell-free supernatant ( 7A . 8A ) and a bacterial pellet ( 8A . 8B ) at the bottom of the tubes.

Im Schritt E wird etwa ein Mikroliter aus dem Überstand 7A und dem Überstand 7B auf zwei getrennte Probenorte eines MALDI-Probenträger übertragen. Nach dem Trocknen der aus dem Überstand übertragenen Proben werden diese mit einem Mikroliter einer Matrixlösung überschichtet. Als Matrixlösung wird α-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure (HCCA) in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in einer Mischung von Wasser, 50% Acetonitril und 2,5% Trifluoressigsäure verwendet. Nachdem die Matrix durch Verdampfung der Lösungsmittel auskristallisiert ist, wird der Probenträger in ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer eingeführt und es werden MALDI-Massenspektren MS1 und MS2 im Massenbereich von 100 bis 1000 atomaren Masseneinheiten aufgenommen. Andere Matrices, Lösungsmittel und MALDI-Präparationsarten sind möglich.In step E, about one microliter of the supernatant 7A and the supernatant 7B transferred to two separate sample locations of a MALDI sample carrier. After drying, the samples transferred from the supernatant are mixed with a Overlaid microliter of a matrix solution. The matrix solution used is α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) at a concentration of 10 milligrams per milliliter in a mixture of water, 50% acetonitrile and 2.5% trifluoroacetic acid. After the matrix has crystallized out by evaporation of the solvents, the sample carrier is introduced into a MALDI time-of-flight mass spectrometer and MALDI mass spectra MS1 and MS2 in the mass range of 100 to 1000 atomic mass units are recorded. Other matrices, solvents and MALDI preparation types are possible.

Das Massenspektrum MS2 weist ein Massensignal des Antibiotikums A und eines Reaktionsproduktes R auf, d. h., dass das Antibiotikum A enzymatisch modifiziert worden ist und die Bakterienkolonie 3 eine beta-Lactamase Resistenz aufweist. Das Massenspektrum MS1 weist nur das Massensignal des Antibiotikums A auf, aber keine Massensignale von Reaktionsprodukten, d. h., dass der Inhibitor des Kombinationspräparates die von der Bakterienkolonie gebildeten beta-Lactamasen inhibiert und das Kombinationspräparat für eine Therapie gegen diesen Bakterienstamm eingesetzt werden kann.The mass spectrum MS2 has a mass signal of the antibiotic A and a reaction product R, ie that the antibiotic A has been enzymatically modified and the bacterial colony 3 has a beta-lactamase resistance. The mass spectrum MS1 has only the mass signal of the antibiotic A, but no mass signals of reaction products, ie that the inhibitor of the combination preparation inhibits the beta-lactamases formed by the bacterial colony and the combination preparation can be used for a therapy against this bacterial strain.

Die bis zeigen vier gemessene MALDI-Massenspektren mit dem Antibiotikum Ampillicin in einem Massenbereich zwischen 340 und 450 atomaren Masseneinheiten. Ampicillin hat eine molare Masse 349,41 g/mol und ist ein halbsynthetischer, antibiotischer Wirkstoff aus der Gruppe der β-Lactam Antibiotika, der seit 1961 eingesetzt wird. Aufgrund seiner Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien und einige gramnegative Bakterienarten wird es als Breitbandantibiotikum bezeichnet. Chemisch zählt Ampicillin zu den Aminopenicillinen. Die Probenvorbereitung (Beimpfung einer flüssigen Nährlösung, Inkubieren und Zentrifugieren) und die Präparation der MALDI-Proben entsprechen denen des Verfahrens aus .The to show four measured MALDI mass spectra with the antibiotic ampicillin in a mass range between 340 and 450 atomic mass units. Ampicillin has a molecular mass of 349.41 g / mol and is a semi-synthetic, antibiotic agent from the group of β-lactam antibiotics, which has been used since 1961. Due to its efficacy against Gram-positive bacteria and some Gram-negative bacterial species, it is called broad-spectrum antibiotic. Chemically, ampicillin is one of the aminopenicillins. The sample preparation (inoculation of a liquid nutrient solution, incubation and centrifugation) and the preparation of the MALDI samples correspond to those of the method ,

Das Massenspektrum in der zeigt ein Ampillicinspektrum nach der Inkubation mit dem Bakterienstamm DH5a der Art Escherichia Coli. Das Massenspektrum weist die Massensignale des protonierten Ampillicin ([M + H]+, 350 u) und eines Natriumadduktions des Ampillicin ([M + Na]+, 372 u), aber keine Massensignale von Reaktionsprodukten auf, die auf eine enzymatische Modifikation, wie z. B. einer hydrolytischen Spaltung des beta-Lactamringes, zurückzuführen sein können. Der Bakterienstamm DH5a weist keine beta-Lactamase Resistenz auf.The mass spectrum in the shows an Ampillicinspektrum after incubation with the bacterial strain DH5a the species Escherichia coli. The mass spectrum shows the mass signals of the protonated ampicillin ([M + H] + , 350 u) and a sodium adduction of the ampicillin ([M + Na] + , 372 u), but no mass signals of reaction products due to an enzymatic modification, such as z. As a hydrolytic cleavage of the beta-lactam ring, may be due. The bacterial strain DH5a has no beta-lactamase resistance.

Das Massenspektrum in der zeigt ein Ampillicinspektrum nach der Inkubation mit einem ESBL-Bakterienstamm der Art Escherichia coli. Die beiden Massensignale des Ampillicin bei 350 u und 372 u fehlen und es sind hydrolysierte Reaktionsprodukte bei 350 u + 18 u und 372 u + 18 u im Massenspektrum vorhanden. Der ESBL-Bakterienstamm produziert beta-Lactamasen, die das Ampillicin enzymatisch modifizieren, und ist dadurch resistent gegen Ampillicin.The mass spectrum in the shows an Ampillicinspektrum after incubation with an ESBL bacterial strain of the species Escherichia coli. The two mass signals of ampicillin at 350 u and 372 u are absent and there are hydrolyzed reaction products at 350 u + 18 u and 372 u + 18 u in the mass spectrum. The ESBL bacterial strain produces beta-lactamases that enzymatically modify ampicillin, making it resistant to ampicillin.

Die Massenspektren in den und zeigen Ampillicinspektren nach der Inkubation mit dem ESBL-Bakterienstamm aus der unter Zugabe von Clavulansäure bzw. Tazubactan. Im Gegensatz zum Massenspektrum der sind in beiden Fällen die Massensignale des nicht-modifizierten Ampillicin bei 350 u und 372 u vorhanden, während die hydrolysierten Reaktionsprodukte bei 350 + 18 u und 372 + 18 u fehlen. Clavulansäure und Tazubactan inhibieren die beta-Lactamasen des ESBL-Bakterienstammes. In Kombination mit Clavulansäure oder Tazubactan ist Ampillicin wirksam gegen den ESBL-Bakterienstamm.The mass spectra in the and show Ampillicinspektren after incubation with the ESBL bacterial strain from the with the addition of clavulanic acid or tazubactan. In contrast to the mass spectrum of In both cases, the mass signals of the unmodified ampicillin are present at 350 u and 372 u, while the hydrolyzed reaction products are absent at 350 + 18 u and 372 + 18 u. Clavulanic acid and tazubactan inhibit the beta-lactamases of the ESBL bacterial strain. In combination with clavulanic acid or tazubactan, Ampillicin is effective against the ESBL bacterial strain.

Zur Bestimmung der Resistenz von Kombinationspräparaten können einige oder alle dazu benötigten Verbrauchsmaterialien, wie z. B. MALDI-Probenträger, NIMS-Probenträger, Eppendorf-Röhrchen, eine MALDI-Matrix, Lösungsmittel, Antibiotika, Derivate von Antibiotika, Substrate, Inhibitoren oder Kombinationspräparate, in sterilen Packungen (Kits) bereitgestellt werden.To determine the resistance of combination preparations, some or all of the consumables required for this, such. As MALDI sample carriers, NIMS sample carriers, Eppendorf tubes, a MALDI matrix, solvents, antibiotics, derivatives of antibiotics, substrates, inhibitors or combination preparations, in sterile packs (kits) are provided.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • DE 102006021493 B4 [0011] DE 102006021493 B4 [0011]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray mass spectrometry” [0010] FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193-219: "Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption / ionization and electrospray mass spectrometry" [0010]
  • Jarman et al., Analytical Chemistry, 72[6], 1217–1223, 2000: „An algorithm for automated bacterial identification using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry” [0010] Jarman et al., Analytical Chemistry, 72 [6], 1217-1223, 2000: "An algorithm for automated bacterial identification using matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry" [0010]

Claims (19)

Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung einer Substanz gegenüber beta-Lactamasen, bestehend aus den Schritten: (a) Zusammenführen der Substanz mit mindestens einer beta-Lactamase und mindestens einem Substrat, das einen beta-Lactamring aufweist, (b) Aufnahme eines Massenspektrums, und (c) Auswertung des Massenspektrums, ob das mindestens eine Substrat in Schritt (a) enzymatisch modifiziert worden ist.Method for determining the inhibitory effect of a substance on beta-lactamases, consisting of the steps: (a) combining the substance with at least one beta-lactamase and at least one substrate having a beta-lactam ring, (b) recording a mass spectrum, and (c) evaluation of the mass spectrum, whether the at least one substrate has been enzymatically modified in step (a). Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das mindestens eine Substrat eine im Vergleich zu beta-Lactam Antibiotka geringe antibiotische Wirkung aufweist.The method of claim 1, wherein the at least one substrate has a low antibiotic activity compared to beta-lactam antibiotics. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem verschiedenartigen Substrate verwendet werden, die um den beta-Lactamring die sterischen Formen verschiedene Antibiotika nachbildenMethod according to one of claims 1 or 2, in which various substrates are used which simulate various antibiotics around the beta-lactam ring of the steric forms Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das mindestens eine Substrat ein beta-Lactam Antibiotikum ist.The method of claim 1, wherein the at least one substrate is a beta-lactam antibiotic. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem eine enzymatische Modifikation – durch das Vorhandensein von einem oder mehreren Massensignalen von Reaktionsprodukten des mindestens einen Substrats und/oder – durch das Intensitätsverhältnis des Massensignals des mindestens einen Substrates zu einem oder mehreren Massensignalen von dessen Reaktionsprodukten oder zu dem Massensignal einer Referenzsubstanz festgestellt wird.Method according to one of claims 1 to 4, wherein an enzymatic modification By the presence of one or more mass signals of reaction products of the at least one substrate and / or - Is determined by the intensity ratio of the mass signal of the at least one substrate to one or more mass signals of its reaction products or to the mass signal of a reference substance. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem in Schritt (c) ausgewertet wird, ob eine hydrolytische Spaltung mindestens eines Substrats stattgefunden hat.Method according to one of claims 1 to 5, wherein in step (c) it is evaluated whether a hydrolytic cleavage of at least one substrate has taken place. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem in Schritt (a) die Substanz, das mindestens eine Substrat und Bakterien in eine Nährlösung gegeben werden, wobei die Bakterien eine auf beta-Lactamasen beruhende Resistenz aufweisen.A method according to any one of claims 1 to 6, wherein in step (a) the substance, the at least one substrate and bacteria are added to a nutrient solution, the bacteria having a resistance based on beta-lactamases. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem für eine in Schritt (c) festgestellte enzymatische Modifikation die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt wird und aus der Reaktionsgeschwindigkeit die Stärke der Inhibition abgeleitet wird.Method according to one of claims 1 to 7, wherein for a detected in step (c) enzymatic modification, the reaction rate is determined and derived from the reaction rate, the strength of the inhibition. Verfahren zur Bestimmung einer auf der Bildung von beta-Lactamasen beruhenden Resistenz einer bakteriellen Probe gegenüber einem Kombinationspräparat, das mindestens aus einem beta-Lactam Antibiotikum und einem Inhibitor besteht, mit den Schritten: (a) Zusammenführen der bakteriellen Probe mit dem Kombinationspräparat, (b) Aufnahme eines Massenspektrums, und (c) Auswertung des Massenspektrums, ob ein beta-Lactam Antibiotikum des Kombinationspräparates in Schritt (a) enzymatisch modifiziert worden ist.A method for determining a resistance of a bacterial sample based on the formation of beta-lactamases to a combination preparation which consists of at least one antibiotic and an inhibitor of beta-lactamase, comprising the steps of: (a) combining the bacterial sample with the combined preparation, (b) recording a mass spectrum, and (c) Evaluation of the mass spectrum, whether a beta-lactam antibiotic of the combination preparation in step (a) has been enzymatically modified. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die bakterielle Probe mit dem Kombinationspräparat in einer Nährlösung inkubiert wird und das Massenspektrum von dem Überstand der Nährlösung oder einem Teil davon aufgenommen wird.The method of claim 9, wherein the bacterial sample is incubated with the combination preparation in a nutrient solution and the mass spectrum is taken up by the supernatant of the nutrient solution or a part thereof. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, bei dem eine enzymatische Modifikation durch das Vorhandensein von einem oder mehreren Massensignalen von Reaktionsprodukten eines beta-Lactam Antibiotikums des Kombinationspräparates festgestellt wird.A method according to any one of claims 9 or 10, wherein an enzymatic modification is detected by the presence of one or more mass signals of reaction products of a beta-lactam antibiotic of the combination preparation. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, bei dem eine enzymatische Modifikation durch das Intensitätsverhältnis des Massensignales eines beta-Lactam Antibiotikums des Kombinationspräparates zu einem oder mehreren Massensignalen von dessen Reaktionsprodukten oder zu dem Massensignal einer Referenzsubstanz festgestellt wird.Method according to one of claims 9 or 10, wherein an enzymatic modification by the intensity ratio of the mass signal of a beta-lactam antibiotic of the combination preparation to one or more mass signals of its reaction products or to the mass signal of a reference substance is determined. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem für eine in Schritt (c) festgestellte enzymatische Modifikation die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt wird und aus der Reaktionsgeschwindigkeit die Stärke der Resistenz abgeleitet wird.Method according to one of claims 9 to 12, wherein for a detected in step (c) enzymatic modification, the reaction rate is determined and the rate of resistance is derived from the reaction rate. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit aus dem einzelnen Massenspektrum und seinem Aufnahmezeitpunkt oder aus weiteren zu bestimmten Zeitpunkten aufgenommenen Massenspektrum bestimmt wird.The method of claim 13, wherein the reaction rate from the single mass spectrum and its recording time or from other recorded at certain times mass spectrum is determined. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem die Schritte (a) bis (c) für verschiedenen Konzentrationen des Kombinationspräparates durchgeführt werden.The method of any one of claims 9 to 13, wherein steps (a) to (c) are performed for different concentrations of the combination preparation. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, bei dem zwischen den Schritten (a) und (b) ein chemischer Derivatisierungsschritt eingefügt ist, wodurch die beta-Lactam Antibiotika des Kombinationspräparat und/oder die gegebenenfalls vorhandenen enzymatisch modifizierten Reaktionsprodukte so modifiziert werden, dass deren Massen jeweils größer als 700 atomare Masseneinheiten sind und/oder mindestens eine kovalent gebundene Ladung aufweisen.A method according to any of claims 9 to 15, wherein a chemical derivatization step is included between steps (a) and (b) whereby the beta-lactam antibiotics of the combination preparation and / or the optionally present enzymatically modified reaction products are modified such that theirs Each mass greater than 700 atomic mass units and / or have at least one covalently bonded charge. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, bei dem in Schritt (b) die Ionisierung durch eine matrixunterstützte Laserdesorption erfolgt.Method according to one of claims 9 to 16, wherein in step (b) the ionization is carried out by a matrix-assisted laser desorption. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem ein Teil der bakteriellen Probe zusätzlich nur mit dem Antibiotikum des Kombinationspräparates zusammengeführt wird, danach ein Massenspektrum aufgenommen und daraufhin ausgewertet wird, ob das Antibiotikum des Kombinationspräparates enzymatisch modifiziert worden ist. The method of claim 9, wherein a portion of the bacterial sample is additionally combined only with the antibiotic of the combination preparation, then recorded a mass spectrum and then evaluated whether the antibiotic of the combination preparation has been enzymatically modified. Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Wirkung der Inhibitoren eines Kombinationspräparates gegenüber einer durch die Bildung von beta-Lactamasen resistenten bakteriellen Probe, mit den Schritten: (a) Zusammenführen der resistenten bakteriellen Probe mit den Inhibitoren des Kombinationspräparates und Derivaten der beta-Lactam Antibiotika des Kombinationspräparates, (b) Aufnahme eines Massenspektrums, und (c) Auswertung des Massenspektrums, ob ein Derivat eines beta-Lactam Antibiotikums des Kombinationspräparates in Schritt (a) enzymatisch modifiziert worden ist.Method for determining the inhibitory effect of the inhibitors of a combination preparation on a bacterial sample which is resistant to the formation of beta-lactamases, comprising the following steps: (a) combining the resistant bacterial sample with the inhibitors of the combined preparation and derivatives of the beta-lactam antibiotics of the combined preparation, (b) recording a mass spectrum, and (c) Evaluation of the mass spectrum, whether a derivative of a beta-lactam antibiotic of the combination preparation in step (a) has been enzymatically modified.
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