KR20210084040A - Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae by Using MALDI-TOF - Google Patents

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KR20210084040A
KR20210084040A KR1020190176933A KR20190176933A KR20210084040A KR 20210084040 A KR20210084040 A KR 20210084040A KR 1020190176933 A KR1020190176933 A KR 1020190176933A KR 20190176933 A KR20190176933 A KR 20190176933A KR 20210084040 A KR20210084040 A KR 20210084040A
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Abstract

The present invention provides a method and a kit for verifying existence of various kinds of carbapenemase by using antibiotics decomposed by carbapenemase causing tolerance against carbapenem or a combination thereof. According to the present invention, the carbapenemase can be rapidly and accurately verified.

Description

MALDI-TOF를 이용한 카바페넴 분해효소-생성 장내세균 검출{Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae by Using MALDI-TOF}Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae by Using MALDI-TOF}

본 발명은 카바페넴 계열 항생제 변형을 유도하는 효소 및 기타 물질을 가지고 있는 미생물의 활성을 분석하여 미생물이 가지고 있는 항생제에 대한 내성을 검사하는 기술에 관한 것이다. 보다 자세하게는, MALDI-TOF MS(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometery) 분석법을 사용하여 미생물이 가지고 있는 효소에 의한 항생제의 화학적 변형을 검출함으로써 항생제에 대한 내성을 가진 미생물을 직접적으로 신속 정확하게 분석할 수 있는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a technique for examining the antibiotic resistance of microorganisms by analyzing the activity of microorganisms having enzymes and other substances that induce transformation of carbapenem-based antibiotics. More specifically, by using the MALDI-TOF MS (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometery) analysis method, microorganisms with resistance to antibiotics are directly detected by detecting the chemical transformation of the antibiotics by the enzymes of the microorganisms. It relates to technology that can quickly and accurately analyze

항생제 내성이란 미생물이 항생제의 효과를 견뎌내는 능력을 말하며, 이러한 저항 능력은 유전적 돌연변이와 미생물간의 플라스미드(plasmid) 교환을 통해 발전할 수 있다. 근래에 항생제 내성균은 지속적으로 증가하고 있고 이에 따라 기존 항생제의 치료효율이 급감하고 있는 상황이다. Antibiotic resistance refers to the ability of microorganisms to withstand the effects of antibiotics, and this resistance can be developed through genetic mutation and plasmid exchange between microorganisms. In recent years, the number of antibiotic-resistant bacteria is continuously increasing, and accordingly, the treatment efficiency of existing antibiotics is rapidly decreasing.

특히 질병 등으로 사람의 면역 체계가 약해져 있을때 해가 되는, 기회 감염성을 나타내는 항생제 내성균 중에 최근 관심이 집중되는 그룹 중의 하나가 장내세균(Enterobacteriaceae)이다. 예컨대 클레브시엘라 종(Klebsiella spp.), 대장균(Escherial coli) 등이 포함되는 이들 박테리아는 요로감염, 패혈증, 기도감염 및 설사와 연관된 기회 감염성 병원체이다. 옥시이미노 베타락탐과 같은 3세대 세팔로스포린(Cephalosporin) 항생제에 대해 이 박테리아들이 저항성을 나타낸다는 사실은 이미 오래전부터 알려져 왔고, 항생제 내성은 기하급수적으로 증가해 왔다. 3세대 세팔로스포린 계열 항생제를 가수분해하여 무력화할 수 있는 소위 ESBL 효소(Extended-Spectrum Beta-Lactamases)를 생성함으로써 항생제 내성을 지닌 변종들이 나타났고, 새로운 세팔로스포린 계열의 항생제가 광범위하게 사용되면서 새로운 ESBL들을 생성하는 박테리아들의 진화를 촉진시키는 악순환이 일어난 것이다.Among the antibiotic-resistant bacteria that exhibit opportunistic infection, which are particularly harmful when the human immune system is weakened due to diseases, etc., one of the recently focused groups of interest is Enterobacteriaceae. These bacteria, including for example Klebsiella spp., Escherial coli, etc., are opportunistic pathogens associated with urinary tract infections, sepsis, respiratory tract infections and diarrhea. It has long been known that these bacteria are resistant to third-generation cephalosporin antibiotics such as oxyimino beta-lactam, and antibiotic resistance has increased exponentially. Antibiotic-resistant strains appeared by generating so-called ESBL enzymes (Extended-Spectrum Beta-Lactamases) that can hydrolyze and incapacitate third-generation cephalosporin antibiotics, and as new cephalosporin antibiotics are widely used, A vicious cycle has arisen that promotes the evolution of bacteria that produce new ESBLs.

카바페넴(Carbapenem)은 기존 항생제 세팔로스포린이나 베타락탐제(β-lactamase) 계열 항생제 등에 내성을 지닌 세균 감염을 치료하기 위한 대안으로 개발된 항생제로, ESBL에 의해 가수분해되지 않으므로 ESBL을 생성하는 박테리아들에 의한 감염을 치료하는데 사용된다. 그러나, 이 항생제에도 반응하지 않는 장내세균이 등장하였고 이들을 카바페넴 내성 장내세균(CRE: Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae)이라 한다. 이 CRE는 여러 종류의 항생제에 내성이 있는 다제내성균(multidrug resistant bacteria) 또는 슈퍼박테리아의 일종이다.Carbapenem is an antibiotic developed as an alternative to treat bacterial infections resistant to existing antibiotics such as cephalosporins or β-lactamase antibiotics. It is used to treat infections caused by bacteria. However, enterobacteria that do not respond to these antibiotics have emerged, and these are called Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae (CRE). This CRE is a type of multidrug resistant bacteria or superbacteria that are resistant to several types of antibiotics.

CRE는 현존하는 가장 강력한 항생제 중의 하나인 카바페넴에 내성을 가질 뿐만 아니라 다른 세균에게 카바페넴 내성을 전파할 가능성이 있다. 미 보건당국의 자료에 의하면 2001년에는 이 세균이 전체의 1.2%에 불과했지만 2011년에는 4.2%로 10년간 3.5배 정도 증가한 것으로 나타났다. CRE는 아무 증상 없이 장내에 존재하여 대변으로 배출되거나 또는 피부의 상처에 묻어서 존재하고 있는 경우부터 인체에 직접적인 증상을 일으키는 경우까지 매우 다양한 형태로 인체에 존재할 수 있다. CRE가 분리되더라도 정상 면역을 가진 사람에게는 별다른 문제를 일으키지 않지만, 일반 장내세균처럼 요로감염, 폐렴, 폐혈증 등 다양한 감염 질환을 일으키며, 특히 주로 중환자실에 장기 입원하거나 면역체계가 떨어진 중증 환자들이 감염되는 경우 치사율이 40~50%에 이르게 된다.CRE is not only resistant to carbapenem, one of the most potent antibiotics in existence, but also has the potential to transmit carbapenem resistance to other bacteria. According to data from the U.S. health authorities, in 2001, the bacteria accounted for only 1.2% of the total, but in 2011 it was 4.2%, a 3.5-fold increase over 10 years. CRE can exist in the human body in a wide variety of forms, from being present in the intestine without any symptoms and excreted in the feces or being buried in a wound on the skin to causing direct symptoms in the human body. Even if CRE is isolated, it does not cause any particular problems in people with normal immunity, but like general enteric bacteria, it causes various infectious diseases such as urinary tract infection, pneumonia, and sepsis. In some cases, the fatality rate is 40-50%.

그런데 최근 CRE 중에서도 카바페넴 항생제를 직접 분해할 수 있는 카바페넴 분해효소(carbapenemase)라는 효소를 생성하는 유전자를 가진 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE: Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae)이 출현하고 있다. CPE는 플라스미드에 의해 다른 균주에까지 내성을 전달하는 능력이 있어 의료계가 더욱 주목하는 내성균이다. 대표적인 CPE로는 KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM(New Delhi metallo-β-lactamse) 등이 있고, 2013년 국내 역학조사 당시 집단감염된 'OXA-232' 유형은 세계적으로도 유일하게 한 사례만 보고된 것으로, 인도로부터 들어온 희귀한 슈퍼박테리아가 허술한 국내 내성균 감시관리 체계를 뚫고 순식간에 60명 이상에게 옮겨졌다. 보건당국은 이 사건을 계기로 CRE와 같은 항생제 내성균에 대한 감시체계를 '표본감시'에서 모든 의료기관이 반드시 보고해야 하는 '전수감시' 방식으로 바꾸었다.However, among CRE, carbapenemase-producing Enterobacteriaceae (CPEs), which have genes that produce an enzyme called carbapenemase that can directly degrade carbapenem antibiotics, have recently emerged. CPE has the ability to transmit resistance to other strains by means of a plasmid, so it is a resistant bacterium that is receiving more attention from the medical community. Representative CPEs include Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) and New Delhi metallo-β-lactamse (NDM). , a rare superbacterium from India broke through the domestic resistant bacteria monitoring and management system and was transferred to more than 60 people in an instant. With this incident as an opportunity, the health authorities changed the monitoring system for antibiotic-resistant bacteria such as CRE from 'sample monitoring' to 'complete monitoring', which must be reported by all medical institutions.

이러한 상황하에서 환자에 적절한 항생제를 처방하여 효율적인 치료를 도모하고 항생제 내성균의 저감화를 동시에 유도하기 위해서는 보다 신속한 항생제 내성균 검출 및 확인 방법이 필요하다. 이를 통해 국내외적으로 항생제 내성균의 모니터링 뿐만 아니라 일선 병원에서 항생제 처방시 항생제 내성균의 보유 여부, 항생제 내성 특성의 스펙트럼을 신속하게 확인하여 치료효율을 높일 수 있다.In such a situation, a more rapid method of detecting and identifying antibiotic-resistant bacteria is needed in order to prescribe an appropriate antibiotic to the patient, promote efficient treatment, and simultaneously induce reduction of antibiotic-resistant bacteria. Through this, it is possible not only to monitor antibiotic-resistant bacteria at home and abroad, but also to quickly check the spectrum of antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance characteristics when prescribing antibiotics at frontline hospitals to increase treatment efficiency.

가장 일반적인 항생제 감수성 검사로는 미생물 배양 및 AGAR DILUTION 방법에 의한 특정 최소억제농도(MIC: Minimum Inhibition Concentration) 확인 방법이 있다. 그러나 대부분 배양시간이 길고 비용이 많이 소요되어 적시에 환자에 필요한 항생제를 선정하는데에 적절하지 않다는 단점이 있다.The most common antibiotic susceptibility test includes a method of confirming a specific minimum inhibitory concentration (MIC: Minimum Inhibition Concentration) by microbial culture and AGAR DILUTION method. However, most of them have a disadvantage in that they are not suitable for selecting antibiotics needed for a patient in a timely manner due to long culture time and high cost.

그에 따라 항생제 내성 균주에 특이적인 유전자를 진단하는 방법 및 기기들이 개발되기 시작했다. 실시간 유전자 증폭기술(Real-time Polymerzse Chain Reaction) 방법을 사용하여 균주의 유전자를 증폭시켜 3종류의 항생제(Beta-lactams, Fluoroquinolones, Macrolides) 관련 내성에 연관된 유전자를 검출하는 진단 시약과 진단기기 등이 그 예라고 할 수 있다.Accordingly, methods and devices for diagnosing genes specific to antibiotic-resistant strains have begun to be developed. Diagnostic reagents and diagnostic devices that amplify the strain's genes using the Real-time Polymerzse Chain Reaction method to detect genes related to resistance to three types of antibiotics (Beta-lactams, Fluoroquinolones, Macrolides) That could be an example.

하지만 이러한 유전자 진단기술 역시 유전자 추출 및 증폭 과정 등의 시료 전처리 단계가 복잡하고 비용이 많이 소요되며 항생제 내성과 연관된 미생물의 유전자를 알고 있는 경우에 한정되어 진단이 된다는 한계를 가지고 있다.However, this genetic diagnosis technology also has limitations in that the sample pretreatment steps such as gene extraction and amplification are complicated and expensive, and the diagnosis is limited to cases in which the genes of microorganisms related to antibiotic resistance are known.

따라서 미생물의 내성에 대한 신속하고 정확한 분석이 가능한 장치의 개발이 여전히 요구된다.Therefore, there is still a need to develop a device capable of rapidly and accurately analyzing the resistance of microorganisms.

질량분석법 중 MALDI(Matrix-Assisted Laser Desoprtion Ionization)는 고분자 물질에 대해 시료의 분해없이 기화/이온화가 가능한 방법으로 일반적으로 질량이 크고 열에 불안정한 생체 고분자나 합성 고분자에 매우 이상적으로 적용될 수 있는 방법으로 알려져 있다. 또한 TOF(Time-of-Flight) 분석기와 결합하여 고분자 연구 분야에서 가장 각광받고 있는 질량 분석법이다. 이러한 특징으로 인해 MALDI-TOF는 생물학, 특히 단백질체학이나 생물정보학 분야에서 각광을 받고 있으며 생체 물질들의 특이성, 예를 들면 항원-항체 반응이나 DNA-DNA 혼성, 생체적합성 실험을 위한 단백질 흡착 등을 분석하는 방법으로도 응용이 되고 있다.Among mass spectrometry methods, MALDI (Matrix-Assisted Laser Desoprtion Ionization) is a method that allows vaporization/ionization of polymer materials without sample decomposition. have. In addition, combined with TOF (Time-of-Flight) analyzer, it is the most popular mass spectrometry method in the field of polymer research. Due to these characteristics, MALDI-TOF is in the spotlight in biology, especially proteomics and bioinformatics, and analyzes the specificity of biological materials, such as antigen-antibody reaction, DNA-DNA hybridization, protein adsorption for biocompatibility experiments, etc. It is also being applied as a method.

보다 최근에 이르러 MALDI-TOF 기술은 항생제에 대한 미생물의 내성을 검출하기 위해, 특히 베타-락타메이즈 유형 효소의 분비로 인한 베타-락탐 유형 항생제의 가수분해에 관여하는 표현형(phenotype)을 동정하기 위해 사용되어 왔다. 이는 미생물의 유전자를 검출하는 방식으로서, 미생물의 잠재적인 내성여부를 판단하는 방식에 해당한다.More recently, MALDI-TOF technology has been used to detect microbial resistance to antibiotics, in particular to identify phenotypes involved in the hydrolysis of beta-lactamase type antibiotics due to the secretion of beta-lactamase type enzymes. has been used This is a method of detecting a microorganism's gene, and corresponds to a method of determining whether the microorganism has potential resistance.

한편, MALDI-TOF를 포함한 질량분석법에 의해 베타-락탐 유형 항생제 분해효소의 활성을 측정하는 방식도 개발되어 왔는데 이는 분해효소에 의한 항생제의 화학적인 구조 변형을 직접 관찰함으로써 내성균의 실제 항생제 내성 여부를 직접적으로 측정하는 방식이다.Meanwhile, a method for measuring the activity of beta-lactam-type antibiotic degrading enzymes by mass spectrometry including MALDI-TOF has also been developed. A direct measurement method.

예컨대 하기 반응식에 도시된 바와 같이 베타-락타메이즈 효소에 의한 가수분해 작용으로 베타-락탐 유형 항생제의 베타 락탐 고리가 끊어지고, 후속하여 탈탄산 반응이 일어난다. 가수분해로 인해 우선 +18 질량의 변화가 발생한 생성물과 후속하는 탈탄산 반응에 의한 -44 질량의 변화가 발생한 생성물을 감지함으로써 항생제 내성균의 활성을 직접 검사하는 방식이다.For example, as shown in the following scheme, the beta-lactam ring of the beta-lactam type antibiotic is broken by hydrolysis by the beta-lactamase enzyme, followed by a decarboxylation reaction. It is a method to directly test the activity of antibiotic-resistant bacteria by detecting a product with a mass change of +18 due to hydrolysis and a product with a mass change of -44 due to a subsequent decarboxylation reaction.

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국제공개특허공보 제WO 2012/113699호International Patent Publication No. WO 2012/113699 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0041773호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0041773 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0054921호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2019-0054921

본 발명자들은 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0054921호에서 (a) 다양한 항생제의 분자량과 나트륨(Na), 포타슘(K) 등의 부가체(adduct)로 이루어진 항생제 질량 데이타베이스, 락타메이즈(lactamase)에 의해 가수분해되고 탈탄산반응(decarboxylation) 된 후의 항생제의 분자량 데이터베이스, 및 질량분석 과정에서 발생하는 항생제 분해 산물(cleavage product)에 대한 데이터베이스를 저장하는 저장부, (b) 데이터베이스와 획득한 질량분석 데이터를 매칭하는 매칭부, 및 (c) 각 항생제에 대한 내부 표준(internal standard)을 첨가하고 이를 이용한 상대적인 정량을 분석하는 분석부를 포함하는 항생제 내성 분석 장치를 개시한 바 있다.The present inventors in Korea Patent Publication No. 10-2019-0054921 (a) antibiotic mass database, lactamases consisting of molecular weights of various antibiotics and adducts such as sodium (Na) and potassium (K) ) by hydrolysis and decarboxylation, the molecular weight database of the antibiotic and the storage unit for storing the database for the antibiotic cleavage product generated in the mass spectrometry process, (b) the database and the obtained mass An antibiotic resistance analysis device including a matching unit for matching analysis data, and (c) an analysis unit for adding an internal standard for each antibiotic and analyzing the relative quantification using the same has been disclosed.

다만 상기 문헌에서는 항생제 내성을 유발하는 효소로서 광범위한 개념의 베타-락타메이즈에 의한 항생제 변형을 측정함으로써 항생제 내성균을 확인하는 일반적인 분석 방향을 제시하고 있으나 카바페넴 분해효소라는 특정한 효소에 주목하여 CPE 분석에 최적화된 구체적인 분석 방법을 제시하는 데에까지는 이르지 못하였다.However, in the above literature, a general analysis direction for identifying antibiotic-resistant bacteria by measuring antibiotic modification by beta-lactamase of a broad concept as an enzyme that induces antibiotic resistance is presented, but a specific enzyme called carbapenem degrading enzyme is focused on CPE analysis. It has not reached the point of suggesting an optimized specific analysis method.

또한, 지금까지 매우 다양한 카바페넴 분해효소가 확인되어 왔는데, 이들은 앰블러 분류(Ambler Classification)에 따라 A, B, C 및 D 클래스로 분류되며, 대표적인 6종은 클래스 A에 속하는 KPC(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase), GES(Guiana Extended Spectrum), 클래스 B에 속하는 NDM(New Delhi Metallo-β-lactamase), VIM(Verona Integron-encoded Metallo-β-lactamase), IMP(Imipenem-resistant Pseudomonas)유형 carbapenemase 및 클래스 D에 속하는 OXA(Oxacillinase)이다. 이들 중 하나라도 유전형시험(PCR)을 통해 확인된 경우 CPE 확진을 하고 있으므로, 검출 범위가 이들을 모두 포함할 수 있는 검출 방법이 요구된다.In addition, a wide variety of carbapenem-degrading enzymes have been identified so far, which are classified into A, B, C, and D classes according to Ambler Classification, and the representative six species are Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) belonging to class A. ), Guiana Extended Spectrum (GES), New Delhi Metallo-β-lactamase (NDM) belonging to class B, Verona Integron-encoded Metallo-β-lactamase (VIM), Imipenem-resistant Pseudomonas (IMP) type carbapenemases and class D. It belongs to Oxacillinase (OXA). If any one of these is confirmed through genotyping (PCR), CPE is confirmed, so a detection method that can include all of them is required.

나아가, 시험 대상인 CPE가 어느 부류에 속하는 것인지를 확인할 수 있는 검출 방법이 요구된다.Furthermore, there is a need for a detection method capable of confirming which class the CPE to be tested belongs to.

대한민국 공개특허공보 제10-2019-0054921호에 개시된 검출 방법은 다양한 항생제의 분자량과 나트륨(Na), 포타슘(K) 등의 부가체(adduct)로 이루어진 항생제 질량 데이타베이스, 락타메이즈(lactamase)에 의해 가수분해되고 탈탄산반능(decarboxylation) 된 후의 항생제의 분자량 데이터베이스, 및 질량분석 과정에서 발생하는 항생제 분해 산물(cleavage product)에 대한 데이터베이스 등과 실험 결과를 비교, 확인하는 과정을 포함하나, 본 발명에 따른 방법은 항생제의 질량분석 스펙트럼 상에서 특정 피크의 이동뿐만 아니라 항생제가 가지고 있는 모든 변형된 구조가 나타내는 질량분석 스펙트럼 패턴을 전체적으로 비교함으로써 확인한다. 이를 위해 상기한 데이터베이스를 포함하여, 획득한 MALDI-TOF 데이터의 전구간 패턴을 이용하여 기계 학습 방법으로 카바페넴 분해효소 및 그의 변형된 형태들의 MALDI-TOF 스펙트럼 패턴을 저장하고 있는 데이터베이스를 구축하고, 실험결과를 이것과 패턴비교하는 방식, 즉 여러 피크의 위치(질량) 및 강도를 전체적으로 비교함으로써 카바페넴 분해효소를 확인한다.The detection method disclosed in Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2019-0054921 is based on the antibiotic mass database, lactamase, consisting of the molecular weight of various antibiotics and adducts such as sodium (Na) and potassium (K). Including the process of comparing and confirming the experimental results, such as the molecular weight database of the antibiotic after hydrolysis and decarboxylation, and the database for the antibiotic cleavage product generated in the mass spectrometry process, but in the present invention The method is confirmed by comparing the mass spectral patterns of all the modified structures of the antibiotic as well as the movement of a specific peak on the mass spectrometry spectrum of the antibiotic as a whole. For this purpose, including the above database, a database storing MALDI-TOF spectral patterns of carbapenem degrading enzymes and their modified forms is constructed by a machine learning method using the entire pattern of the obtained MALDI-TOF data, and experiments The carbapenem-degrading enzyme is identified by comparing the results with this pattern as a whole, i.e., by comparing the positions (mass) and intensities of several peaks as a whole.

상기에서 "패턴"이라 함은 200~800 m/z 영역에서 나타나는 질량분석 스펙트럼의 전체 피크들을 말한다. 감수성 균주와 항생제가 반응시 항생제 스펙트럼 패턴(A)과, 내성균주와 항생제가 반응시 항생제 패턴(B)이 다른 특징을 확인할 수 있다. (A)와 (B)의 차이점을 기계학습으로 학습하여 모델을 만들고, 이 모델을 이용하여 미지의 시료로부터 얻은 질량분석 스펙트럼을 평가하는 방식이다.As used herein, the term "pattern" refers to all peaks of the mass spectrometry spectrum appearing in the 200-800 m/z region. It can be seen that the antibiotic spectrum pattern (A) when the susceptible strain reacts with the antibiotic and the antibiotic pattern (B) when the resistant strain and the antibiotic react are different. It is a method to learn the difference between (A) and (B) by machine learning to make a model, and to evaluate the mass spectral spectrum obtained from an unknown sample using this model.

본 발명은 카바페넴 내성을 유발하는 카바페넴 분해효소에 의해 분해되는 항생제 또는 이들의 조합을 이용함으로써 다양한 종류의 카바페넴 분해효소의 존재 유무를 확인하는 방법 및 키트를 제공한다.The present invention provides a method and kit for determining the presence or absence of various types of carbapenem-degrading enzymes by using an antibiotic that is degraded by carbapenem-degrading enzymes that induce carbapenem resistance or a combination thereof.

본 발명에 따라 다양한 카바페넴 분해효소에 대한 활성을 확인할 수 있는 항생제 또는 이들의 조합 및 최적 농도를 발견하였고, 이를 이용함으로써 빠른 시간 안에 카바페넴 분해효소를 확인할 수 있다.According to the present invention, antibiotics capable of confirming activity against various carbapenem degrading enzymes or combinations thereof and optimal concentrations were found, and by using the antibiotics, carbapenem degrading enzymes can be identified in a short time.

대표적인 CPE 6종인 클래스 A에 속하는 KPC, GES, 클래스 B에 속하는 NDM, VIM, IMP 및 클래스 D에 속하는 OXA 중 KPC와 NDM 유전형을 가지고 있을 경우 확실한 항생제 가수분해 반응을 보인 반면, GES와 OXA의 경우 항생제 감수성 시험으로 확인할 경우 감수성이 약간 저하되는 정도로 보이며 구분이 어렵다. 본 발명에 따른 방법은 특정한 항생제의 조합 및 농도를 채택함으로써 OXA 유형까지도 구분 가능하다.Among the six representative CPE types, KPC, GES, Class B, NDM, VIM, IMP, and Class D, OXA belonging to class A, KPC and NDM genotypes showed a definite antibiotic hydrolysis response, whereas in the case of GES and OXA, When confirmed by an antibiotic susceptibility test, the sensitivity appears to be slightly lowered and it is difficult to distinguish. The method according to the present invention can discriminate even OXA types by adopting a specific combination and concentration of antibiotics.

또 다른 일면에 따르면, 본 발명은 적절한 카바페넴 분해효소 억제제(inhibitor) 또는 이들의 조합을 이용하여 시험 대상 미생물이 분비하는 카바페넴 분해효소의 부류(Class)를 확인할 수 있는 방법 및 키트를 제공한다. According to another aspect, the present invention provides a method and kit for identifying the class of carbapenem-degrading enzyme secreted by a test target microorganism using an appropriate carbapenem-degrading enzyme inhibitor or a combination thereof. .

세 가지 주요 부류인 클래스 A, B 및 D에 속하는 카바페넴 분해효소들은 각각 특정한 억제제에 의해 억제된다. 예컨대, 클래스 A 카바페넴 분해효소의 경우 보로네이트(boronate)에 의해 억제되고, 클래스 B 카바페넴 분해효소의 경우에는 EDTA가 효과적인 억제제이다. 클래스 D인 OXA는 특별한 억제제는 없으며, 다만 테모실린(Temocillin)에 고도의 내성을 보인다.Carbapenem-degrading enzymes belonging to the three main classes, classes A, B and D, are each inhibited by specific inhibitors. For example, in the case of class A carbapenem lyase, it is inhibited by boronate, and in the case of class B carbapenem lyase, EDTA is an effective inhibitor. Class D, OXA, has no specific inhibitor, but is highly resistant to temocillin.

이러한 특징으로 인해, 카바페넴 항생제 + 부류를 모르는 CPE 균주의 상층액에 각각의 억제제를 추가하여 분석한 결과들을 취합함으로써 시험 대상인 CPE 균주의 부류를 확인할 수 있다.Due to these characteristics, the class of the CPE strain to be tested can be identified by collecting the results of analysis by adding each inhibitor to the supernatant of the carbapenem antibiotic + the CPE strain of unknown class.

따라서, 본 발명에 따른 키트는 다음을 포함한다.Accordingly, the kit according to the present invention comprises:

(1) 1종 이상의 카바페넴 항생제,(1) one or more carbapenem antibiotics;

(2) 반응 버퍼, 및(2) a reaction buffer, and

(3) MALDI 플레이트.(3) MALDI plate.

한편, CPE의 부류(Class) 확인을 위한 시험에 사용하기 위한 본 발명에 따른 키트는 상기 키트의 구성 (1)~(3) 이외에 카바페넴 분해효소의 억제제를 추가로 포함할 수 있다.Meanwhile, the kit according to the present invention for use in a test for confirming the class of CPE may further include an inhibitor of carbapenem degrading enzyme in addition to the components (1) to (3) of the kit.

상기 키트들은 MALDI-TOF 실험에 필요한 기타 요소들, 예컨대 보정을 위한 내부 표준물질, 매트릭스 물질, 매트릭스 물질용 용매 등을 추가로 포함할 수 있다.The kits may further include other elements necessary for the MALDI-TOF experiment, such as an internal standard for calibration, a matrix material, a solvent for the matrix material, and the like.

본 발명에 따른 CPE 검출 방법은 대표적인 CPE 6종을 포함하는 카바페넴 분해효소들을 보다 신속, 용이하고 정확하게 확인할 수 있다.The CPE detection method according to the present invention can more rapidly, easily and accurately identify carbapenem-degrading enzymes including six representative CPE types.

본 발명에 따른 CPE 검출 키트는 MALDI-TOF 질량분석을 이용해 대표적인 CPE 6종을 포함하는 카바페넴 분해효소들을 보다 신속, 용이하고 정확하게 확인할 수 있는 수단을 제공한다.The CPE detection kit according to the present invention provides a means for quickly, easily and accurately identifying carbapenem degrading enzymes including six representative CPE types using MALDI-TOF mass spectrometry.

또한, 본 발명에 따른 CPE 검출 방법은 시험 대상인 CPE의 부류를 신속, 용이하고 정확하게 확인할 수 있다.In addition, the CPE detection method according to the present invention can quickly, easily and accurately identify the class of CPE to be tested.

또한, 본 발명에 따른 CPE 검출 키트는 MALDI-TOF 질량분석을 이용해 시험 대상인 CPE의 부류를 보다 신속, 용이하고 정확하게 확인할 수 있는 수단을 제공한다.In addition, the CPE detection kit according to the present invention provides a means to more quickly, easily and accurately identify the class of CPE to be tested using MALDI-TOF mass spectrometry.

도 1은 MALDI-TOF를 이용하여 CPE를 진단하는 절차를 나타내는 모식도이다.
도 2는 MALDI-TOF를 이용한 기존의 미생물 동정 과정을 나타내는 사진이다.
도 3은 CPE에 의한 항생제 메로페넴(Meropenem)의 변형을 나타내는 MALDI-TOF 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명에 따른 CPE 진단 키트 구성품의 일 예를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 CPE를 진단하는 절차를 나타내는 도면이다.
도 6은 CPE가 아닌 미생물(nonCPE)과 CPE로 각각 처리된 카바페넴 항생제 혼합물의 MALDI-TOF 스펙트럼 패턴을 비교한 그림이다.
도 7는 이미페넴(Imipenem)과 세포탁심(Cefotaxim) 혼합물의 농도 비율에 따라 nonCPE와 CPE의 PCA 플롯을 나타낸 도면이다. CPE와 nonCPE가 PCA 플롯상으로 모두 분리됨을 확인할 수 있으며, 마지막 농도 조건에서 가장 큰 차이를 나타낸 것을 확인할 수 있다.
도 8은 카바페넴 분해효소 클래스 유형별 (Class A, B, D) MALDI-TOF 패턴 기계학습 모델을 예시한 그림이다.1 is a schematic diagram showing a procedure for diagnosing CPE using MALDI-TOF.
2 is a photograph showing a conventional microbial identification process using MALDI-TOF.
3 is a MALDI-TOF spectrum showing the modification of the antibiotic Meropenem by CPE.
4 is a view showing an example of a CPE diagnostic kit component according to the present invention.
5 is a diagram illustrating a procedure for diagnosing CPE according to the method of the present invention.
6 is a diagram comparing the MALDI-TOF spectrum patterns of non-CPE microorganisms (nonCPE) and carbapenem antibiotic mixtures treated with CPE, respectively.
7 is a view showing a PCA plot of nonCPE and CPE according to the concentration ratio of a mixture of imipenem and cefotaxim. It can be seen that both CPE and nonCPE are separated on the PCA plot, and it can be seen that the largest difference is shown in the last concentration condition.
8 is a diagram illustrating a MALDI-TOF pattern machine learning model for each carbapenem degrading enzyme class type (Class A, B, D).

도 1과 같이 카바페넴 항생제 (농도 조건 2~0.01 mg/mL) 와 함께 박테리아를 희석 후 37도에서 10분~2시간 동안 보관 후 상층액을 MALDI 시료 플레이트에 준비한다. 이후 MALDI-TOF로 저분자 영역(100~1000m/z)을 분석하여 항생제 변형패턴의 양상을 확인한다.As shown in Figure 1, after diluting the bacteria with carbapenem antibiotics (concentration conditions 2 to 0.01 mg/mL), and storing at 37 degrees for 10 minutes to 2 hours, the supernatant is prepared on a MALDI sample plate. Thereafter, the low-molecular region (100-1000 m/z) was analyzed with MALDI-TOF to confirm the antibiotic modification pattern.

상층액을 준비하는 방법뿐만 아니라 플레이트에 직접 균을 발라주는 방법으로도 항생제 변화 양상 스펙트럼을 얻을 수 있다. 균을 바른 플레이트 위에 항생제를 얹고, 마르지 않도록 주변에 물을 함께 넣어 37도 배양기에 30분~2시간 보관한다. 이후 건조한 다음 매트릭스를 얹고 MALDI 분석하여 항생제의 스펙트럼 변화 양상을 얻을 수 있다. Antibiotic change pattern spectrum can be obtained not only by preparing the supernatant but also by applying the bacteria directly to the plate. Put antibiotics on the plate with bacteria, add water to the surroundings to prevent drying, and store in a 37 degree incubator for 30 minutes to 2 hours. After drying, a matrix is placed on top and MALDI analysis is performed to obtain the spectrum change pattern of antibiotics.

내부 표준(internal standard)은 CHCA(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) 매트릭스 피크 및 항생제 자체 값으로 설정한다. 내부 표준 물질은 장기 보관하기 위해 50% 에탄올에서 고농도 (2~0.5 mg/mL) 항생제를 제조하여 사용한다. The internal standard is set as the CHCA (α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) matrix peak and the antibiotic itself value. As an internal standard, a high-concentration (2-0.5 mg/mL) antibiotic is prepared and used in 50% ethanol for long-term storage.

농도가 높을수록 항생제 피크는 선명하게 보이지만, OXA 등 카바페넴 분해효소가 약할경우에는 항생제 변형 패턴을 보는데 오랜 배양시간이 필요하다. 따라서 저농도 조건 (0.25~0.01mg/mL), 이미페넴(Imipenem) 항생제의 경우 최소 10분이내에 검출이 가능하며, 효소 작용이 느린 유형의 유전자를 가진 균은 최대 1시간이 소요된다. The higher the concentration, the clearer the antibiotic peak, but if the carbapenem degrading enzyme such as OXA is weak, a long incubation time is required to see the antibiotic transformation pattern. Therefore, in the case of low concentration conditions (0.25~0.01mg/mL), imipenem antibiotics can be detected in at least 10 minutes, and bacteria with a type of gene with slow enzyme action takes up to 1 hour.

이미페넴(Imipenem) 농도를 낮춘 경우, 0.125mg/mL 30분 배양 조건에서 OXA 유형 CPE 는 [이미페넴 + CHCA + H P] Peak이 사라져, CPE와 같은 피크 양상을 보이는 반면, GES 유형 CPE의 경우 nonCPE 스펙트럼과 동일한 [이미페넴 + CHCA + H] Peak이 남아있는 것을 확인하였다. When the concentration of imipenem is lowered, [imipenem + CHCA + HP] peak disappears in OXA type CPE under 0.125 mg/mL 30-minute incubation condition, showing the same peak pattern as CPE, whereas in the case of GES type CPE, the nonCPE spectrum and It was confirmed that the same [imipenem + CHCA + H] peak remained.

같은 농도의 이미페넴 조건에서, 세포탁심(Cefotaxime)이 첨가된 경우, GES 유형 CPE에서 [이미페넴 + CHCA + H] 피크가 사라져, 혼합물 조건에서 GES를 구별할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. When Cefotaxime was added at the same concentration of imipenem, the [imipenem + CHCA + H] peak disappeared in GES type CPE, confirming that GES could be distinguished in the mixture condition.

반복 실험을 수행해보았을 때, 30분~1시간 동안 균과 항생제를 보관 조건에서 모든 CPE type (OXA, KPC, NDM)에 대해 차이를 확인할 수 있었다.When repeated experiments were performed, differences were confirmed for all CPE types (OXA, KPC, NDM) under the storage conditions of bacteria and antibiotics for 30 minutes to 1 hour.

본 발명에 따른 CPE 검출 방법 및 키트는 각종 의료기관 및 연구기관에서 신속하고 정확하게 CPE를 확인할 수 있는 방법과 수단에 해당하여 산업상 이용가능성이 매우 높다.The method and kit for detecting CPE according to the present invention correspond to a method and means for quickly and accurately identifying CPE in various medical institutions and research institutions, and thus have very high industrial applicability.

Claims (10)

(1) 1종 이상의 카바페넴 항생제,
(2) 반응 버퍼, 및
(3) MALDI(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization) 질량분석 플레이트를 포함하는, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 키트.
(1) one or more carbapenem antibiotics;
(2) a reaction buffer, and
(3) A carbapenem-degrading enzyme-producing Enterobacteriaceae (CPE) detection kit comprising a Matrix-assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) mass spectrometry plate.
 제1항에 있어서, 1종 이상의 카바페넴 분해효소의 억제제를 추가로 포함하는, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 키트.
The carbapenem-degrading enzyme-producing Enterobacteriaceae (CPE) detection kit according to claim 1, further comprising an inhibitor of one or more carbapenem-degrading enzymes.
 제2항에 있어서, 상기 카바페넴 분해효소의 억제제는 보로네이트 또는 EDTA 또는 이들의 조합을 포함하는, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 키트.
The kit of claim 2, wherein the carbapenem-degrading enzyme inhibitor comprises boronate or EDTA or a combination thereof.
 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 표준물질, 매트릭스 물질, 매트릭스 물질용 용매 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 키트.
The carbapenem-degrading enzyme-producing Enterobacteriaceae (CPE) detection kit according to any one of claims 1 to 3, further comprising at least one of an internal standard material, a matrix material, and a solvent for the matrix material.
 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카바페넴 항생제는 이미페넴(Imipenem), 세포탁심(Cefotaxime), 메로페넴(Meropenem), 도리페넴(Doripenem), 에르타페넴(Ertapenem)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것인, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 키트.
The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the carbapenem antibiotic consists of Imipenem, Cefotaxime, Meropenem, Doripenem, and Ertapenem. One or more selected from the group, carbapenem-degrading enzyme-producing enterobacteriaceae (CPE) detection kit.
 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 카바페넴 항생제의 농도는 0.01 내지 2 mg/mL인, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 키트.
The kit according to any one of claims 1 to 3, wherein the concentration of the one or more carbapenem antibiotics is 0.01 to 2 mg/mL.
 1종 이상의 카바페넴 항생제 용액을 제공하는 단계,
상기 항생제 용액에 시험 대상 균을 가한 후 배양하는 단계,
상기 배양 용액의 상층액을 취하여 MALDI 질량분석 플레이트에 제공하는 단계, 및
MALDI-TOF 질량분석을 수행하여 항생제 스펙트럼의 변형 패턴을 확인하는 단계를 포함하는,
카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 방법.
providing a solution of one or more carbapenem antibiotics;
After adding the test target bacteria to the antibiotic solution, culturing;
taking the supernatant of the culture solution and providing it to a MALDI mass spectrometry plate, and
Containing the step of performing MALDI-TOF mass spectrometry to confirm the deformation pattern of the antibiotic spectrum,
Method for detecting carbapenem-degrading enzyme-producing enterobacteriaceae (CPE).
 MALDI 질량분석 플레이트에 시험 대상 균을 바르는 단계,
상기 균을 바른 플레이트 상에 1종 이상의 카바페넴 항생제를 추가하여 배양하는 단계,
MALDI-TOF 질량분석을 수행하여 항생제 스펙트럼의 변형 패턴을 확인하는 단계를 포함하는,
카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 방법.
Applying the test target bacteria to the MALDI mass spectrometry plate,
adding and culturing one or more carbapenem antibiotics on the plate coated with the bacteria;
Containing the step of performing MALDI-TOF mass spectrometry to confirm the deformation pattern of the antibiotic spectrum,
Method for detecting carbapenem-degrading enzyme-producing enterobacteriaceae (CPE).
 제7항 또는 제8항에 있어서, MALDI 질량분석 플레이트에 내부 표준물질을 추가하는 단계를 더 포함하는, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 방법.
The method of claim 7 or 8, further comprising adding an internal standard to the MALDI mass spectrometry plate.
 제7항 또는 제8항에 있어서, 사용한 1종 이상의 카바페넴 항생제와 상이한 카바페넴 항생제 또는 카바페넴 항생제의 조합을 사용하여 동일한 시험을 수행하는 단계 및 이들 시험의 결과를 비교하여 차이를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 카바페넴 분해효소-생성 장내세균(CPE) 검출 방법.
9. The method of claim 7 or 8, wherein the same test is performed using one or more carbapenem antibiotics used and a different carbapenem antibiotic or a combination of carbapenem antibiotics and the results of these tests are compared to determine the difference. A method for detecting carbapenem-degrading enzyme-producing Enterobacteriaceae (CPE) further comprising a.
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