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Die vorliegende Erfindung betrifft die Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von mikrobiellem Befall von Rosengewächsen der Gattung Erwinia. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Eisenkomplexbildnern zur Prophylaxe oder Behandlung von mikrobiellem Befall von Rosengewächsen, insbesondere Kernobstgewächsen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf Pflanzenschutzmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel mit antimikrobieller Wirkung gegenüber Mikroorganismen, insbesondere gegenüber dem Feuerbranderreger, wobei dieses Pflanzenschutzmittel einen Eisenkomplexbildner enthält. Schließlich werden Verfahren zur Behandlung von Pflanzenbefall mit mikrobiellen Schädlingen, insbesondere solchen, die Feuerbrand oder Apfelschorf hervorrufen, beschrieben.
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Stand der Technik
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Der mikrobielle Befall von Rosengewächsen (Rosaceae) stellt ein großes Problem im Nutz- und Ziergewächsbereich dar. So sind Infektionen und mikrobieller Befall von Kernobstgewächsen (Pyrinae), insbesondere der Pomoideae, wie Apfel, Birne, Quitte, Mistel, Speierling und/oder Eberesche ein häufiges Problem. Zum Beispiel die Infektion von Species der Pomodideae mit den Bakterien der Gattung Erwinia, wie z. B. Bakterium Erwinia amylovora, führt zur Krankheit Feuerbrand und damit zu einer der schwerwiegendsten Erkrankungen im Erwerbsobstbau. Der Feuerbrand, hervorgerufen. durch Erwinia amylovora befällt vor allem Kernobstgewächse und kann sich seuchenartig schnell ausbreiten. Obwohl für die Gesundheit des Menschen keine Gefahr besteht, stellt dieser Erreger im Nutzpflanzenbereich ein großes Problem dar. Feuerbrand ist eine meldepflichtige Erkrankung und wurde erstmals 1971 in Deutschland beobachtet. Der Feuerbrand verursacht hohe Ernteausfälle, so können bei betroffenen Obstplantagen Ertragsverluste zwischen 35 und 100% vorkommen.
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Das Krankheitsbild des Feuerbrands äußert sich dadurch, dass Blätter und Blüten befallener Pflanzen plötzlich vom Blattstiel welken und sich braun oder schwarz verfärben und entsprechend namensgebend für die Erkrankung sind. Ausgehend von Blättern verlaufen Infektionen zumeist entlang der Mittelrippe und der Hauptadern, erkennbar an schwarz-braunen Flecken an den entsprechenden Bereichen. Neben Blütenblättern und Zweigen können auch Früchte von der Infektion betroffen werden; auch hier kommt es zu einem Eintrocknen oder zu einer braun-schwarzen Verfärbung.
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Das Bakterium selbst überwintert in Cankern von Bäumen, die im Vorjahr befallen worden sind. Im Frühjahr werden die Bakterien bedingt durch die Reaktivierung des Pflanzenwachstums wieder aktiv, vermehren sich und dringen in gesundes Holzgewebe ein. Bakterienexudat kann aus den befallenen Bereichen austreten und entsprechend zahlreiche Insekten anlocken, die zur Weiterverbreitung des Erregers auf Narben von Blüten der Wirtspflanzen beitragen. Im Gewebe von Blüten und Blättern findet dann eine weitere Vermehrung der Bakterien statt.
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Die Kontrolle von Feuerbrand umfasst verschiedene Maßnahmen. Hierzu gehören die mechanische Bekämpfung mit der Reduktion des Inokulums, die Kontrolle feuerbrandverbreitender Insekten, Vorhersagmodelle zur Prognose der Erkrankung, die Anwendung chemischer Mittel wie Antibiotika, der Einsatz resistenter Apfel- oder Birnenkultivare sowie als Alternative die biologische Bekämpfung von Feuerbrand. So wird z. B. in manchen EU-Ländern mit Ausnahmegenehmigung das Antibiotikum Streptomycin zur Vorbeugung eingesetzt. Dies erlaubt eine Reduktion des Feuerbrands um rund 80%. Allerdings ist der Einsatz sehr umstritten, da Streptomycin auch in Honig nachgewiesen wurde und so zu Resistenzen seitens des Erregers und anderer Keime beitragen könnte. Der Einsatz von Antibiotika erfolgt präventiv. Außerdem ist aufgrund des Einsatzes dieser Antibiotika bei Feuerbrandinfektionen und in der Prophylaxe bereits ein großes Problem durch zunehmendes Auftreten Streptomycinresistenter Stämme entstanden. Solche wurden bereits sowohl in Nordamerika als auch in Israel beobachtet. In Deutschland gibt es kein zugelassenes antibiotikahaltiges Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung von Feuerbrand.
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Zur Bekämpfung von Feuerbrand ist außerdem bei frühzeitiger Prognose die Applikation von kupferhaltigen Pflanzenschutzmitteln beschrieben, allerdings ist dieses Verfahren nicht sehr zuverlässig. Darüber hinaus ist die Anwendung der Antibiotika z. B. in der europäischen Union untersagt, allerdings in Ausnahmefällen einmal pro Jahr möglich. In den USA wird als weitere Alternative die Applikation von bakteriellen Antagonisten durchgeführt, mit der eine 80%ige Reaktion des Pathogenbefalls erzielt werden kann. Weiterhin gibt es Versuche, in denen antagonistische Bakterien, wie Erwinia herbicola C9-1, Johnson und Stockwell, 1998, Annual Review of Phytopathology 36, 227–248, oder Hefen den betroffenen Pflanzen zugeführt werden. Bei den Hefen wird z. B. durch Ansäuerung der Umgebung das Wachstum von E. amylovora unterdrückt. Schließlich ist ein Bacillus subtillus QST713 Produkt zugelassen (Serenade, AgraQuest, Inc. USA). Hier ist eine bis zu 57%ige Hemmung beschrieben. Allen diesen Mitteln ist allerdings gemein, dass sie präventiv angewendet werden müssen. Mittel zur Behandlung von bereits befallenen Bereichen sind sehr eingeschränkt.
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Ein Befall von Nutzpflanzen mit Feuerbrand führte z. B. dazu, dass in Österreich oder der Schweiz 5% der Anbaufläche gerodet werden musste.
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Es besteht daher ein großer Bedarf an entsprechend geeigneten Mitteln, Feuerbrand zu bekämpfen.
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Nicht nur Feuerbrand sondern auch anderer mikrobieller Befall von Rosengewächsen führt zu großen Ernteausfällen. Ein weiteres Beispiel hierfür ist der Apfelschorf (Venturia inaequalis). Der Apfelschorf ist eine der wichtigsten Apfelbaumkrankheiten weltweit und wird durch den Schlauchpilz (Venturia inaequalis) verursacht. Der Apfelschorf zeigt sich an den Blättern mit mattolivgrünen, später braunen oder schwärzlichen Flecken, die zusammenfließen können, und in der Folge größere Nekrosen bilden, was zu einem vorzeitigen Blattverlust der Bäume führt. Die Früchte weisen meist dunkler gefärbte Flecken auf, in denen meist sternförmige Risse auftreten, die Fäulniserregern wie Monilia als Eintrittspforte dienen. Die Primärinfektion des Wirtes erfolgt im Frühjahr von den am Boden liegenden kranken Blättern des Vorjahres. Die Ausbreitung des Pilzes und damit der Krankheit im Sommer erfolgt durch die Konidien, die im Bereich der Flecken und Nekrosen in großer Zahl gebildet werden. Sie werden in erster Linie durch den Regen verspritzt. Als Maßnahmen zur Bekämpfung wird versucht, das Falllaub zu verringern bzw. das Laub zu entfernen, um eine Infektion im Frühjahr zu verhindern. Für die Behandlung von Pilzerkrankungen steht ein breites Spektrum von Wirkstoffklassen zur Verfügung. Allerdings ist ein großes Problem von den auf dem Markt befindlichen Mitteln, dass die Pilze schnell Resistenzen ausbilden oder die verwendeten Mittel sehr toxisch sind.
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Aus dem Obigen wird deutlich, dass eine effektive Bekämpfung von mikrobiellem Befall bzw. eine Prophylaxe eines mikrobiellen Befalls von Rosengewächsen, insbesondere von Kernobstgewächsen, wie Apfel, Birne, etc. nicht in ausreichendem Maße zur Verfügung gestellt werden können. Ziel der vorliegenden Anmeldung ist daher die Bereitstellung von Mitteln zur Prophylaxe gegen und/oder die Behandlung von mikrobiellem Befall von Rosengewächsen. Weiterhin werden Verfahren zur Bekämpfung oder Prophylaxe eines solchen mikrobiellen Befalls von Rosengewächsen sowie die Bereitstellung von entsprechenden Mitteln beschrieben.
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Beschreibung der Erfindung
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In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf die Verwendung eines Eisenkomplexbildners zur Prophylaxe gegen und/oder die Behandlung von mikrobiellem Befall von Rosengewächsen (Rosaceae) gemäß Anspruch 1.
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Vorliegend wurde gefunden, dass niedermolekulare Fraktionen von < 5000 Dalton in der Lage sind, das Wachstum des Mikroorganismus E. amylovora zu unterdrücken. Bei Analyse dieser niedermolekularen Fraktion zeigte sich, dass die Wirksubstanzen für eine Unterdrückung des Wachstums von Schadbefall durch Mikroorganismen Eisenkomplexbildner sind.
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In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bevorzugt isoliert vorliegenden Eisenkomplexbildner zur Prophylaxe gegen und/oder die Behandlung von mikrobiellem Befall in Kernobstgewächsen (Pyrinae), insbesondere der Pomoideae, wie Apfel, Birne, Quitte, Mistel, Speierling und/oder Eberesche verwendet. Unter dem Ausdruck „mikrobieller Befall” wird vorliegend ein Befall mit Mikroorganismen verstanden. Mikroorganismen schließen dabei sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Mikroorganismen ein. Insbesondere handelt es sich bei den Mikroorganismen um Bakterien aber auch um Pilze.
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Der mikrobielle Befall ist einer mit Bakterien, nämlich Bakterien der Gattung Erwinia, vorliegend von Erwinia amylovora. Das Bakterium Erwinia amylovora ist bekannt als Auslöser des Feuerbrands bei Kernobstgewächsen. Vorliegend konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Erwinia amylovora mit Eisenkomplexbildnern ein Wachstum dieses Bakteriums stark einschränkt und auch in vivo wurde gezeigt, dass Eisenkomplexbildner zur Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von mikrobiellem Befall des Bakteriums Erwinia amylovora geeignet sind.
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Die Verwendung des Eisenkomplexbildners ist erfindungsgemäß insbesondere zur Behandlung von Feuerbrand möglich. Im Gegensatz zu den meisten bekannten Mitteln gegen Feuerbrand, die im Wesentlichen prophylaktisch verabreicht werden, um ein Ausbreiten des Feuerbrands zu verhindern, zeigt die erfindungsgemäße Verwendung von Eisenkomplexbildnern auch eine prophylaktische Wirkung, d. h. ein Befall wird verhindert und die Behandlung von bereits befallenen Pflanzen ist möglich. Im Gegensatz zu bisherigen Pflanzenschutzmitteln, die zur Behandlung von vorliegendem mikrobiellen Befall, insbesondere mit Erwinia amylovora eingesetzt werden, sind die vorliegend verwendeten Eisenkomplexbildner in der Regel nicht toxisch. Eine Resistenzbildung wird ebenfalls verringert. Im Gegensatz zu bisher bekannten Systemen, wo antagonistische Bakterien eingesetzt werden, sind die vorliegend verwendeten Eisenkomplexbildner bevorzugt nicht in einer zellulären Form, sondern liegen isoliert z. B. als Fraktion vor. Es handelt sich bei dieser Fraktion um eine niedermolekulare, extrazellulären Fraktion von < 5000 Dalton von Pseudomonas-Kulturen, insbesondere Pseudomonas fluorescens-Kulturen. Der erfindungsgemäß verwendete Eisenkomplexbildner ist insbesondere ein Siderophor. Siderophore sind eine Stoffgruppe von bisher rund 200 beschriebenen, eisenbindenden Oligopeptiden mit komplexbildenden Eigenschaften, die von aeroben Bakterien, Pilzen und Pflanzenwurzeln gebildet werden. Sie weist eine hohe Affinität zu Fe(III)-Ionen auf. Siderophore haben üblicherweise ein Molekulargewicht von 300 bis 2000 Dalton. Siderophore sind z. B. für Enterobakterien beschrieben. Siderophore werden nur von aeroben Bakterien, Pilzen und Pflanzenwurzeln gebildet. Sie weisen eine wesentlich höhere Komplexbindungskonstante für Fe(III)-Ionen als Fe(II)-Ionen auf und können sehr selektiv Fe(III)-Ionen komplexieren.
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Des Weiteren eignen sich Eisenkomplexbildner zur Verwendung in der Prophylaxe und/oder Bekämpfung von Apfelschorf. Apfelschorf, hervorgerufen durch den Pilz Venturia inaequalis, ist ebenfalls eine große Bedrohung für Nutzpflanzen, insbesondere Apfekbäume. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur eine prophylaktische Behandlung sondern auch eine Behandlung von bereits befallenen Pflanzenbereichen durch die Verwendung eines Eisenkomplexbildners möglich ist. Dieser Eisenkomplexbildner ist insbesondere zur Hemmung der Konidienkeimung von Pilzen, insbesondere des Pilzes Venturia inaequalis geeignet.
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Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Eisenkomplexbildnern um nicht toxische Eisenkomplexbildner. Beispiele für erfindungsgemäße Eisenkomplexbildner sind insbesondere 1, 10-Phenanthrolin und Salicylsäure.
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Weiterhin werden Pflanzenschutzmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel mit antimikrobieller Wirkung beschrieben. Diese Pflanzenschutzmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel sind insbesondere solche wirksam gegenüber mikrobiellen Schädlingen, wie Bakterien und hier insbesondere solche der Art Erwinia, wie vor allem dem Erreger von Feuerbrand, Erwinia amylovora. Die Pflanzenschutzmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel zeichnen sich dadurch aus, dass sie einen Eisenkomplexbildner enthalten, wie in Anspruch 1 definiert.
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Die Pflanzenschutz- und Schädlingsbekämpfungsmittel sind insbesondere solche, die Siderophore, 1, 10-Phenanthrolin und/oder Salicylsäure enthalten.
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Die Pflanzenschutzmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel zur erfindungsgemäßen Verwendung können in bekannter Art und Weise bereitgestellt werden. Diese Mittel können in flüssiger oder fester Form bereitgestellt werden. Ein Aufbringen dieser Pflanzenschutzmittel kann in flüssiger Form z. B. durch Zerstäubung erfolgen.
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Die Pflanzenschutzmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel können darüber hinaus übliche Zusatzstoffe zu Pflanzenschutzmitteln und Schädlingsbekämpfungsmitteln enthalten.
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Schließlich werden Verfahren zur Behandlung von Pflanzenbefall mit mikrobiellen Schädlingen beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen mit Eisenkomplexbildnern behandelt werden. Diese Eisenkomplexbildner sind insbesondere Siderophore. Alternativ können auch isolierte oder durch synthetisierte Verbindungen eingesetzt werden, wie 1, 10-Phenanthrolin und/oder Salicylsäure. Dem Fachmann sind geeignete Darreichungsformen dieser Eisenkomplexbildner zur Behandlung mikrobiellen Befalls von Pflanzen bekannt.
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Der mikrobielle Schädling ist ein mikrobakterieller Schädling, Erwinia amylovora.
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Das Verfahren ist geeignet, Feuerbrand bei Pflanzen zu behandeln.
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Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen weiter erläutert ohne auf diese beschränkt zu sein.
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Beispiel 1 (Referenz)
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Fe-Komplex-Bildner bei Pilzen
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Die Hemmung der Konidienkeimung von Venturia inaequalis durch Fe-Komplexbildner auf 1% Wasseragar konnte gezeigt werden. Als Kontrollansatz wurden 7,5 μL Konidiensuspension mit 250 Koniden + 7,5 μL H2O zu einem Gesamtvolumen von 15 μL gemischt. Der Hemmansatz enthielt statt Wasser 7,5 μL Inhibitorlösung. Nach der Mischung wurde der Versuchansatz auf den 1% Wasseragar mit der entsprechenden Konzentration der Inhibitorlösung aufgebracht. Nachfolgend wurden die Wasseragarplatten bei 20°C inkubiert. Die Konidienkeimung wurde nach 24 h durch Auszählung der gekeimten Konidien ausgewertet. Zur Gewinnung des Wachstumsüberstandes und der niedermolekularen Fraktion des Bakteriums P. fluorescens Bk3 wurde dieses Bakterium zunächst für drei Tage bei 27°C in M9 Medium mit 10 mM Asparagin als Stichstoff und Kohlenstoffquelle auf dem Rundschüttler mit 100 Upm kultiviert. Danach erfolgte ein Zentrifugationsschritt für 15 Minuten bei 10000 xg. Der Überstand ist der Wachstumsüberstand.
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Zur Gewinnung der niedermolekularen Fraktion des Wachstumsüberstandes wurde der Wachstumsüberstand des Bakteriums P. fluorescens Bk3 durch einen Membranfilter (Vivascience, Göttingen) mit einer Durchlassgröße von 5000 Dalton zentrifugiert. Tabelle 1
Versuchsansatz | Hemmung |
H2O | Keine |
P.fluorescens Bk3 Wachstumsüberstand | Vollständig |
P. fluorescens Bk3 Wachstumsüberstand niedermolekulare Fraktion | Keine |
100 μM o-Phenanthrolin | Vollständig |
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Die Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit der vorliegend beschriebenen Eisenkomplexbildner auf das Wachstum des Apfelschorf-Erregers Venturia inaequalis.
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Beispiel 2
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Birnenscheibentest zur Wirksamkeit von Fe-Komplexbildner gegenüber dem bakteriellen Pathogen Erwinia amylovora
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Birnenscheiben von P. communis cv. Conference wurden mit sterilem destilliertem Wasser (dH
2O; mit 0,1% Tween20), 0,1–1,% Salizylsäure (in Wasser, mit 0,1% Tween20, pH 7), 0,25% 1,10-Phenanthrolin (in Wasser, mit 0,1% Tween20, pH 7) oder 0,1–0,5% Salizylsäure + 0,25% 1,10-Phenanthrolin (in Wasser, mit 0,1% Tween20, pH 7) eingesprüht, anschließend durch Besprühen mit E. amylovora 222::TnluxCDABE (Schmoock S. (2006), Diplomarbeit, Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover) (1 × 10
8 Zellen/ml in sterilem destilliertem Wasser) inokuliert. Die Auswertung auf Symptome einer Infektion mit Feuerbrand (Schleimbildung auf den Früchten) erfolgte nach 48 Stunden. Tabelle 2 Ergebnisse des „Pear Slide Assays”.
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Wie aus der Tabelle 2 zu entnehmen ist, zeigt die Kombination zweier Stoffe (0,25% Salizylsäure und 0,25% o-Phenanthrolin) im Birnenscheibentest eine vollständige Unterdrückung des Wachstums von E. amylovora. Zusätzlich befand sich in allen Versuchsansätzen eine Benetzungsmittel (Tween 20) damit die Oberflächenspannung der Versuchslösung herabgesetzt werden und diese mit den Fruchtflächen in Kontakt kommen können.
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Die Wirkung der niedermolekularen Wachstumsüberstände der mikrobiellen Antagonisten ist hier dagegen nur begrenzt gegeben.
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Beispiel 3
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Hemmhoftests mit Eisenkomplexbildner
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Eine vergleichbare Beobachtung wurde mit den Hemmhoftests auf Minimalmediumagarplatten gemacht
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Inhibitorische Tests mit einer Konzentrationsreihe von 0–1% Salizylsäurelösung (in Wasser, pH 7,2) sollten klären, ob diese an der Hemmung von E. amylovora 222::TnluxCDABE beteiligt sein kann. Die Hemmhoftests wurden wie folgt durchgeführt: Auf jede Platte wurden 9 × 107 Zellen (100 μl in dest. Wasser) von E. amylovora 222::TnluxCDABE ausplattiert. In Anschluss daran wurden mittig jeweils 40 μl der einzelnen Konzentrationsstufen an Salizylsäure aufgebracht. Nach 2 Tagen wurden dann die Hemmung des Wachstums von E. amylovora 222::TnluxCDABE erfasst. Als Kontrollexperiment wurden 40 μL dest. Wasser aufgebracht.
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Bei jeder Verdünnungsstufe konnte nach 24–48 Stunden die Ausbildung eines Hemmhofes, in dem kein Wachstum von E. amylovora 222::TnluxCDABE beobachtet werden konnte, gezeigt werden, wobei die Ausprägung des Hemmhofes mit steigender Konzentration an Salizylsäure leicht zunahm.
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Zusätzlich wurden überprüft, ob die inhibitorische Wirkung von Salizylsäure auf E. amylovora 222::TnluxCDABE durch die zusätzliche Supplementierung des Minimalmediums mit verschiedene Konzentrationen an FeCl3 aufgehoben werden kann.
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Das Minimalmedium wurde mit 145 μM Salizylsäure versetzt (in Wasser, pH 7,2, entspricht der 0,5%-igen Lösung) und 0, 29, 72, 145 und 290 μM FeCl3 zugegeben. Die inhibitorischen Tests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.
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Es konnte gezeigt werden, das eine Zugabe äquimolarer Mengen FeCl3 die Hemmung von E. amylovora 222::TnluxCDABE durch Salizylsäure zwar nicht vollständig aufgehoben werden konnte, aber doch verringern konnte.
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Die Ergebnisse zeigen, dass die inhibitorische Wirkung von Salizylsäure auf E. amylovora 222::TnluxCDABE auf die Eigenschaft von Salizylsäure als Siderophor, also als Eisen-rekrutierendes Molekül zurückzuführen sind, gegebenenfalls mit weiteren anderen antimikrobielle Eigenschaften dieser Verbindung.
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Eigentlich ist Salizylsäure ein Nebenprodukt bei der Synthese von Pyochelin, einem Siderophor, das auch von verschiedenen P. fluorescens-Stämmen gebildet werden kann. Es kann ebenfalls Eisen komplexieren und hat damit Siderophorartige Eigenschaften. Die Produktion von Salizylsäure wird vergleichbar wie die Pyoverdinsynthese durch Eisen reguliert, wobei eine Supplementierung des Kulturmediums ab 0,1 mM FeCl3 zu einer Herunterregulation führt.
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Salizylsäure war bei einer Konzentration von 145 μM in Minimalagar stark inhibitorisch auf E. amylovora 222::TnluxCDABE. Wurde der Hemmtest mit 145 μM 1,10 Phenanthrolin durchgeführt, ergab sich ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung auf das Wachstums von E. amylovora 222::TnluxCDABE.