DE102010042073A1

DE102010042073A1 - Fusion von CT Volumen und histologischen Schnitten orientiert an natürlichen Merkmalspunkten

Info

Publication number: DE102010042073A1
Application number: DE102010042073A
Authority: DE
Inventors: Judith Mühl; Sonja Köstenbauer; Matthias Seise; Bernhard Kainz; Philipp Stiegler; Ursula Mayrhauser; Rupert Horst Portugaller
Original assignee: Technische Universitaet Graz; Medizinische Universitaet Graz; Forschungsholding TU Graz GmbH
Current assignee: Medizinische Universitaet Graz At; Technische Universitaet Graz At
Priority date: 2009-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2011-04-14

Abstract

Offenbart wird ein Verfahren zum Verschmelzen von Information von histologischen Bildern mit CT-Bildern, das Verfahren enthaltend: (a) Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten; (b) Fusion des histologischen Volumens mit einem CT-Bildvolumen. Gemäß anderer Ausführungsformen werden MRI-Bilder an Stelle von CT-Bildern verwendet. Aufeinanderfolgende histologische Schnitte können unter Verwendung verschiedener Farbstoffe gefärbt sein. Ein zu untersuchendes abdominales Organ kann durch Perfusion unter Verwendung von Formalin in situ fixiert werden.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Bildverarbeitung und insbesondere die Verarbeitung von Bildern von histologischen Schnitten.
Hintergrund
In einem Artikel „Efficient multi-modal dense field non-rigid registration: alignment of histological and section images", Medical Image Analysis 9 (2005), 538–546) haben Aloys du Bois d'Aische et al einen Algorithmus für eine nichtstarre Registrierung beschrieben, der auf eine Registrierung von histologischen Schnitten und Flachbett-gescannten Bildern des Larynx angewandt wurde.
Zusammenfassung der Erfindung
Vor medizinischen Eingriffen wird Information über eine Patientenanatomie – und manchmal auch Physiologie – von radiologischen Bildern abgeleitet. Auf diesen Einsichten stützen medizinische Doktoren ihre Einsichten für Verfahren und planen ihre Eingriffe. Noch ist ein Bild nur ein Bild. Um zu verstehen, was hinter diesem Bild liegt und was tatsächlich in dem Körper vorgeht und zu dem Bild führt, muss man einen Blick auf das Gewebe werfen und histologische Schnitte untersuchen. Mit unserem Verfahren sind wir in der Lage, Information von histologischen Bildern mit Computertomographie(CT)-Bildern zu verschmelzen.
Ein Ernten des Gewebes ist nur in Tierstudien praktikabel. Dennoch tritt der Wunsch auf, radiologische Daten mit dem Gewebe, das das Bild erzeugt hat, direkt zu vergleichen, um eine medizinische Recherche weiter zu unterstützen. Wir haben eine Studie über Hochfrequenzablation in gesunder Leber für Hausschweine durchgeführt. Während des Eingriffs wurden CT-Scans aufgenommen. Das Ergebnis des Eingriffs ist in den CT-Scans sichtbar, die nach dem Eingriff aufgenommen wurden. Nach dem Eingriff wurden die Schweine geopfert und das Gewebe geerntet und das gesamte Gebiet von. Interesse als histologische Schnitte präpariert. Eine Bildverarbeitung, die auf die aufgenommenen Daten angewandt wurde, und die halbautomatischen Registerverfahren erlauben dann das Platzieren des histologischen Volumens an der entsprechenden Position in dem CT-Scan.
Der Hauptbeitrag dieser Arbeit ist eine Mehr-Skalen-Fusion von histologischen Bildern mit CT-Daten. Details des Verfahrens werden innerhalb dieses Dokumentes angegeben, jedoch enthalten Höhepunkte unseres Ansatzes:

– Beide Modalitäten werden in medizinischen Verfahren erzeugt, welche angepasst sind an die Bedürfnisse von Computerprozessierung. Diese Verfahren enthalten noch keinen Schritt außerhalb von normalen medizinischen Verfahren. Durch Vermeidung von Bezugsmarkern und ähnlichen zusätzlichen Erfordernissen, sind die Verfahren einfach zu reproduzieren in jeder medizinischen Umgebung und die Ergebnisse sind konform mit Erwartungen von medizinischen Doktoren und besitzen keine künstlich induzierten Artefakte.
– Bilder von beiden Modalitäten können prozessiert werden unter Verwendung von Computer-Visionsalgorithmen und daher kann mehr nützliche Information für die Bewertung der Ablationszone extrahiert werden. Durch Vermeiden von künstlich induzierten Artefakten lösen die angewandten Algorithmen normale histologische Erscheinungen.
– Die Verwendung der bestmöglichen Beleuchtungsbedingungen erlaubt uns, sehr robuste Bildverarbeitungs- und Visualisierungstechniken für die histologischen Schnitte zu implementieren und zu erzielen.
– Die histologischen Schnitte können als volumetrische Daten beobachtet werden, in derselben Weise wie ein CT-Scan betrachtet werden kann. So kann Information erhalten werden durch Betrachten von virtuell rekonstruierten beliebigen Schnittebenen (von Daten, die von mehr als einem histologischen Schnitt erhalten werden). Die Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus Schnitten erlaubt die Untersuchung von Gewebeeffekten in 3D.
– Da Informationen von beiden Volumina nach der Volumenrekonstruktion verschmolzen werden, gibt es keine Fehlausrichtung durch Anpassen an eine gegebene Ebene – weder in räumlicher Distanz/Auflösung, noch in Volumenorientierung/Rotation oder Verzerrung. Wenn die histologischen Schnitte direkt auf CT- oder MRI-Bilder fusioniert werden, wird die implizite Annahme gemacht, dass der histologische Schnitt exakt dieselbe Schnittebene wie das ausgewählte CT- oder MRI-Bild zeigt. Tatsächlich ist der Fall, wo exakt dieselbe Schnittebene getroffen wird, höchst unwahrscheinlich (fast unmöglich). Durch Verschmelzen von Volumina vermeiden wir diese Art von Annahme.
– Ferner sind die Schnitte in der Präparation und Schneideprozedur einer unbekannten, nicht reproduzierbaren, nicht starren Deformation unterworfen, welche nicht einfach abgeleitet werden kann. Diese Deformationen können in dem histologischen Bild unsichtbar sein und machen die Wiederausrichtung eines Schnittes mit seiner Position in einem CT-Scan unmöglich ohne zusätzliche Information anzuwenden. Es ist sehr wahrscheinlich, dass ein histologischer Schnitt nicht parallel ist zu irgendeinem gegebenen CT- oder MRI-Schnitt, sondern vielmehr mehrere Schnitte schneidet, wie dies ein Berg mit einer 2D-Ansicht wie einer Karte machen würde. Das Verschmelzen von Volumina anstelle von einzelnen Schnitten erlaubt Freiform-Deformationen auf dem gesamten Volumen.
– Obwohl wir in unseren Beispielen mit Hochfrequenzablation und Lebergewebe arbeiten, kann unser Verfahren auch auf andere Fälle angewendet werden. Beim Arbeiten auf einem großen Organ wie der Leber, haben wir ein Verfahren entwickelt, welches anwendbar ist auf jedes Organ in dem Körper. Mit kleineren Organen kann leichter gearbeitet werden. Nicht deformierende Teile des Körpers verringern ebenfalls die Anforderung. Die Leber deformiert sich stark und repräsentiert daher den schlimmsten Fall (worst case).
– Unser Verfahren ist speziell entworfen zum Arbeiten mit Standardmedizin- und Büroausrüstung. Es wird keine spezielle Werkzeugentwicklung benötigt, was wiederum das Verfahren in anderen medizinischen Einrichtungen leichter reproduzierbar macht. Ferner ist die Handarbeit in dem Prozess so stark wie möglich verringert. Eine Datenaufnahme wie auch eine Datenverarbeitung ist daher vergleichsweise schnell, was das Verfahren wiederum attraktiv für eine kommerzielle Verwertung macht.

Was bereitgestellt werden muss, um unser Verfahren erfolgreich anzuwenden:

– Die Möglichkeit, einen CT-Scan eines Organs oder einer anatomischen Struktur aufzunehmen.
– Das interessierende Gebiet muss in dem CT-Scan sichtbar sein (z. B. das Ergebnis der RFA, aber ein Tumor würde auch gehen).
– Natürliche Merkmalspunkte müssen in dem CT-Scan sichtbar sein (meistens Blutgefäße).
– Das Verfahren ist auch anwendbar auf eine Fusion mit MRI(Magnetic Resonance Imaging)-Daten anstelle von CT.

Gemäß einem ersten Aspekt der hierin offenbarten Gegenstände wird ein Verfahren zum Verschmelzen von Information von histologischen Bildern mit Computertomographie-Daten bereitgestellt, das Verfahren enthaltend:
Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten; und Fusion des histologischen Volumens mit einem Computertomographie-Bildvolumen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der hierin offenbarten Gegenstände wird ein Verfahren zum Verschmelzen von Information von histologischen Bildern mit Magnetresonanztomographie-Daten bereitgestellt, das Verfahren enthaltend:
Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten; und Fusion des histologischen Volumens mit einem Magnetresonanztomographie-Bildvolumen.
Gemäß einer Ausführungsform sind von den histologischen Schnitten aufeinander folgende Schnitte unter Verwendung verschiedener Farbstoffe gefärbt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die histologischen Bilder aufgenommen unter Verwendung einer Kombination von Auflicht und transmittiertem Licht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die histologischen Bilder aufgenommen unter Verwendung eines Scanners, der einen schwarzen diffusen Reflektor aufweist, welcher in einem definierten Abstand zu dem untersuchten histologischen Schnitt platziert ist, um eine Auflichtquelle des Scanners aufgrund des Reflektors auch als eine Quelle für diffuses transmittiertes Licht zu verwenden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten ein Stapeln und in Registierung bringen der gescannten Bilder der Schnitte.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Fusion des histologischen Volumens mit einem Magnetresonanztomographie-Bildvolumen eine nicht-starre 3D-Registrierung der zwei Volumina, die beide Volumina in einem 3D-Raum ausrichtet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Fusion des histologischen Volumens mit einem Computertomographie-Bildvolumen eine nicht-starre 3D-Registrierung der zwei Volumina, die beide Volumina in einem 3D-Raum ausrichtet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die histologischen Schnitte Schnitte eines abdominalen Organes sind; wobei das abdominale Organ durch Perfusion unter Verwendung von Formalin in situ fixiert wurde.
Gemäß einem dritten Aspekt der hierin offenbarten Gegenstände wird ein Computerprogramm bereitgestellt, welches, wenn es von einer Prozessoreinheit ausgeführt wird, zum Durchführen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt, dem zweiten Aspekt oder einer Ausführungsform hiervon eingerichtet ist.
Gemäß einem vierten Aspekt der hierin offenbarten Gegenstände wird ein. Scanner zum Scannen eines histologischen Schnittes bereitgestellt, wobei der Scanner enthält: (a) eine Auflichtquelle; (b) einen schwarzen diffusen Reflektor, der in einem definierten Abstand zu dem histologischen Schnitt platziert ist, um die Auflichtquelle aufgrund des Reflektors auch als eine Quelle für diffuses transmittiertes Licht zu verwenden.
Im Sinne der vorliegenden Anmeldung ist die Erwähnung eines solchen Computerprogramm gleichbedeutend mit der Erwähnung eines Programm-Elements, eines Computerprogrammprodukts und/oder eines computerlesbaren Mediums, das Anweisungen zum Steuern eines Computersystems enthält, um die Arbeitsweise eines Systems bzw. eines Verfahrens in geeigneter Weise zu koordinieren, um die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verknüpften Wirkungen zu erreichen.
Gemäß einer Ausführungsform steht der hierin verwendete Begriff „Registrierung” (engl. registration) für „in Register bringen”. Gemäß einer Ausführungsform steht der hierin verwendete Begriff „registrieren” (engl. to register) für „in Register bringen”. Gemäß einer Ausführungsform stehen die Begriffe „Registrierung” oder „registrieren” für „zur Deckung bringen”. Gemäß weiteren Ausführungsformen gilt für von „registrieren abgeleitete Begriffe entsprechendes.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt schematisch eine Leber.
2 zeigt eine schematische Darstellung von Lebergewebe, wie es unter einem Mikroskop sichtbar ist.
3 zeigt eine schematische Darstellung für einen Prozessierschritt gemäß Ausführungsformen und Beispielen der hierin offenbarten Gegenstände.
4 zeigt eine schematische Darstellung für CT-Schnitte, die für die Leber zum Beispiel in axialer Orientierung aufgenommen wurden.
5 zeigt ein 3D-rekonstruiertes Bild eines Schweins in einem ray caster mit drei segementierten Gefäßbäumen.
6 zeigt einen 3μm-Schnitt, genommen in der Standard-histologischen Untersuchung.
7 zeigt eine schematische Darstellung zum Aufnehmen von aufeinanderfolgenden Schnitten mit verschiedenen Färbungen, um ein histologisches Volumen zu bilden.
8 veranschaulicht, dass die Kombination von transmittiertem Licht und einfallendem Licht mit einer Lichtquelle möglich ist durch Platzieren eines schwarzen diffusen Reflektors in einem definierten Abstand.
9 vergleicht verschiedene Standard-Scanmethoden mit hierin offenbarten Methoden.
10(a), (b) zeigt Histologiedaten eines gesunden Schweines mit einem Ablationsgebiet, (a) CAB gefärbter Schnitt und (b) MB gefärbter Schnitt.
11(a) bis (h) zeigen Ergebnisse eines Workflows für einen CAB-Schnitt.
12a) bis ii) zeigen einen unregistrierten Teil eines CAB-kolorierten Stapels von Histologien.
13(a) und (b) zeigen eine Kontrollpunktzuordnung in zwei benachbarten Bildern zu Gefäßen um die Läsion von dem Bildstapel, der in 12a) bis ii) dargestellt ist.
14(a) bis (ii) zeigt ein Registrierungsergebnis des Stapels in 12.
15(a)–(d) zeigt Beispiele von Volumina, die von histologischen Schnitten rekonstruiert sind, visualisiert unter Verwendung von Ray-casting.
Detaillierte Beschreibung
1. Hintergrund und verwandte Arbeiten
Die Beispielanwendung unseres Verfahrens ist eine Hochfrequenzablation (radio frequency ablation, RFA) von Lebertumoren. Eine Kurzbeschreibung des Eingriffs und ein sehr grober Überblick über die Leber wird hier kurz zusammengefasst, um dem Leser mehr Verständnis für die folgenden Beispielbilder zu geben.
1.1 Hochfrequenzablation von Lebertumoren
RFA dient als minimal-invasive Behandlung für Krebs. Diese Behandlung wird durchgeführt durch Platzieren einer Nadelelektrode innerhalb des Tumors, der zerstört werden soll. Unter Verwendung eines vor-operativen CT- oder MRI-Scans wird der optimale Weg zum Platzieren der Nadel entschieden. Sobald die Nadel platziert ist, wird der HF-Generator angeschaltet und das umgebende Gewebe erwärmt sich. Mehrere patientenspezifische Faktoren bestimmen die exakte Aufheizung und den Wärmetransportprozess. Am wichtigsten ist die Durchblutung durch nahegelegene Gefäße, da dies das Gewebe herunterkühlt und Zeilen am Aufheizen hindert.
Das Ergebnis des Eingriffs ist nicht zuverlässig abbildbar. Das Ziel ist es, alle Tumorzellen zu zerstören, ohne zu viel (oder das falsche) umgebende Gewebe zu beschädigen. Welche Zellen tot sind, kann nur in histologischen Untersuchungen untersucht werden.
Das institutionelle Tier-Komitee der Medizinischen Universität gab sein Urkunden-Einverständnis für diese Studie und alle Tierexperimente an Schweinen wurden ausgeführt gemäß dem Österreichischen Tiergesetz.
1.2 Die Leber
Die Leber ist ein Weichgewebeorgan. Neben dem Parenchym besitzt sie drei Gefäßbäume: die Arterie, welche sauerstoffangereichertes Blut von dem Herzen zu der Leber zuführt, die hepatische Vene, die Blut von der Leber zu dem Körper zurückgibt, und die Pfortvene, die Blut mit Nährstoffen der Leber zuführt zur Verarbeitung und Reinigung. Ferner, da die Leber Galle produziert, besitzt sie einen Baum von Gallengängen, welche in der Gallenblase enden. 1 zeigt schematisch eine Leber.
Auf mikroskopischer Skala erscheint die Leber anders Leberläppchen, die hauptsächlich aus Hepatozyten bestehen, sind durch verbindendes Gewebe separiert. Die Blutgefäße in der Leber verzweigen sich in kleinere Gefäßdurchmesser. An den Scheitelpunkten der Läppchen sind Pforttriase angeordnet, die Zweige der Pfortenvene zusammen mit Gallengängen und Zweigen der hepatischen Arterie aufweisen. In dem Zentrum eines Läppchens ist ein Zweig der hepatischen Vene angeordnet. 2 zeigt eine schematische Darstellung von Lebergewebe, wie es unter einem Mikroskop sichtbar ist.
So erscheint dasselbe Organ in sichtbaren Strukturen auf verschiedenen Skalen sehr verschieden.
2: Auf einer mikroskopischen Skala sind die Leberläppchen die grundlegende Struktur des Lebergewebes. Die Gallengänge, hepatische Arterie und Pfortvene enden in Pforttriasen. Die Zentralvenen führen zurück zu der hepatischen Vene.
1.3 Verwandte Arbeiten
Es gibt verschiedene Segmentierungsverfahren für die Leber selbst, mögliche Tumoren und Gefäßstrukturen. In dieser Arbeit wird das halbautomatische Verfahren von Unger et al. [UPTC08] angewandt für eine Segmentierung der Leber in CT-Bildern und ein Ansatz zur Segmentierung und Separation des Gefäßbaums der Leber, der basiert auf der Arbeit von Pock et al. [PO4] und [HEA09].
Der Zweck der histologischen Bildanalyse ist es, ein akkurates 3D-Modell des Ablationsgebietes einschließlich Information über die Anteile von toten und lebenden Zellen zu liefern. Ferner müssen andere Leberstrukturen segmentiert werden, um eine wohldefinierte und exakte Fusion der histologischen Daten mit dem 3D-Modell, welches von den CT-Daten erlangt wurde, zu erlauben.
Ein Ansatz ist es, das verbundene Segmentierungs- und Registrierungsproblem, z. B. in einem Variationsframework, zu formulieren [Erhardt et al. 2007]. Die Lösung dieser Formulierung ist für die großen Datensätze, die wir verwenden, rechnerisch zu aufwendig. Der andere Ansatz ist, die Aufgabe in zwei unabhängige Unteraufgaben zu teilen: Segmentierung von Gewebestrukturen von 2D-Histologie-Schnitten und zur Registrierung der 2D-Schnitte zur Rekonstruktion des 3D-Modells. In [Dercksen et al. 2008] wurde dieser Ansatz erfolgreich auf histologische Bilder eines Korns angewandt, aber sie verwendeten manuell geführte Registrierung, was wir, wenn möglich, vermeiden wollen.
Wir schlagen einen Algorithmus vor, welcher die Ideen von beiden Ansätzen kombiniert: Erstens werden die histologischen Schnitte in Merkmalsbilder konvertiert, welche die Wahrscheinlichkeit für jedes Pixel beschreiben, zu einem Gewebetyp zu gehören (Klassifikation). Unabhängig hiervon werden benachbarte Schnitte starr registriert gebracht. Unter Verwendung der Registrierungsergebnisse werden die Wahrscheinlichkeitsklassifikationsergebnisse dann auf benachbarte Schnitte fortgesetzt, um fest zusammenhängende Gewebestrukturen zu stärken und Rauschen zu eliminieren. Diese geglätteten Merkmalsbilder werden schließlich in Gefäße, Gebiete von totem und Gebiete von lebendem Gewebe durch ein Standard-Level-Set-Verfahren segmentiert [Yang 2006].
Ein ähnlicher Ansatz ist für Tumorsegmentierung von histologischen Daten verwendet worden [Braumann et al. 2005]. Aber anstelle die Klassifikationswahrscheinlichkeit fortzusetzen, haben diese ein volumetrisches Wahrscheinlichskeitsmodell für das Tumorgewebe gebildet, das unter Verwendung eines 3D-Level-Sets segmentiert wurde. Das wäre auch für uns der bevorzugte Ansatz gewesen, war aber wegen unseres großen Datensatzes rechnerisch nicht durchführbar.
Zur Klassifizierung von Gewebetypen verwenden wir einen nicht-überwachte-Standardmischung-von-Gauss-Verteilungen(GMM)-Klassifizierer, welcher weithin angewandt wird in Farbbild-Segmentierungsaufgaben [Wu et al. 2003]. Andere, meist überwachte, Klassifizierer sind auf die Histologie-Gewebeklassifikation angewandt worden (z. B. Hierarchischer AdaBoost und Entscheidungsbaum [Doyle et al. 2006], neuronale Netzwerke [Dercksen et al. 2008]). Diese sind für eine sensible Klassifizierung aus einem Hauptgrund notwendig: Ihre Daten bestehen aus Standard-Histologiebildern (typischerweise H&E-färbend), die von Pathologen für manuelle Klassifikation verwendet werden, die schwer automatisch zu klassifizieren ist. Wir haben auf der anderen Seite einen Datensatz, der speziell erzeugt wurde für eine gute automatische Unterscheidung zwischen Gewebetypen.
Freiform-Deformation (free form deformation, FDD) ist ein wichtiges Werkzeug in Computer-unterstütztem geometrischen Design und Animation. Barr [Barr84] hat ein Verfahren entwickelt, welches die Transformation verändert hat, während sie auf das Objekt angewandt worden ist. Eine allgemeinere Technik wurde später von Sederberg & Perry [SEDE86] entwickelt, welche Objekte deformierte durch Deformieren des Raums, in welchem das Objekt eingebettet ist. Ein anderes Verfahren wurde von Coquillard [Coquillard 90] entwickelt, welches ein anfängliches Gitter und B-Spline-Kontrollpunkte zum Approximieren der Form der beabsichtigten Deformation verwendete. Eine andere Verfeinerung wurde von Chang & Rockwood [Chang 94] durchgeführt.
Um Messungen in (z. B. Ablationsgröße, Gefäßgröße) oder Beschreibungen der Ablationsfläche durchzuführen, wird das behandelte Organ und das Gebiet von Interesse explantiert. Gemäß der Hypothese in den Experimenten gibt es einige wenige Methoden zum Präparieren der Organe für durchgeführte Messungen. Eine Möglichkeit ist, dass das Gebiet von Interesse unmittelbar nach der Explantation in einem spezifischen Abschnitt geschnitten wird, ein Foto aufgenommen wird, die Morphologie beschrieben wird und die Messungen von Interesse durchgeführt wurden.
Lu D. S. et al. [15] explantierte die RFA-behandelte Schweineleber, beschnitten auf das Gebiet von Interesse. Repräsentative Grob-Schnitte von Läsionen wurden fotografiert, verwendet für Messung, Bewertung und Beschreibung der Ablation. Auch wurden repräsentative histologische Proben präpariert, in 10% Formalin fixiert (Immersionsfixierung), eingebettet in Paraffin und danach histologisch gefärbt. Diese Strategie wurde auch von Patterson & Kollegen verwendet (17).
Eine Möglichkeit zum Bereitstellen von Abschnitten mit höherer morphologischer Qualität ist es, das Organ über Perfusionsfixierung zu fixieren. Hierbei wird das Organ mit einem Spülpuffer gespült, um Blut zu beseitigen, und die Gefäße wurden verwendet zum Liefern eines Fixiermittels (Formalin) an das Organ (Perfusionsfixierung). Danach wird das Organ explantiert, auf die Fläche von Interesse beschnitten und dieser Gewebeblock wird in Formalin aufbewahrt, bis die Fixierung fertig ist (das gesamte Gewebe ist mit dem Fixiermittel gesättigt). Wright & Kollegen (16) explantierten die RFA-behandelte Leber von einem Schwein nach dem Spülen und perfusieren es ex vivo mit 10% Formalin. Dann machten sie weiter durch Resektion des Gebietes von Interesse und Immersionsfixierung. Nach vollständiger Fixierung wurde das Gewebe in Millimeterintervallen sektioniert und Scans (300 dpi) wurden von diesen Grob-Schnitten aufgenommen und Messungen und pathologische Berechnungen wurden durchgeführt.
Geeignet für kleinere Tierlebern (8) und Gewebeblöcke, ist es möglich, Proben von Lebern nach der Immersionsfixierung in Paraffin einzubetten. Die Fixierung wie auch das Einbetten könnte in Routinelabors gemäß der verwendeten Standardprozedur zum Durchführen von Paraffinsektionen für pathologisches Phenotypirig durchgeführt werden.
Eine Studie (18, 19) über den Einfluss von laserinduzierter Koangulationsnekrose beschrieb ein sehr interessantes Verfahren zum Beurteilen des Effekts auf Zellniveau. Sie verwenden das NBTC-Verfahren, welches auf der Funktionalität des NAD/NADH-Systems in lebenden Zellen basiert, um zwischen toten und lebenden zu unterscheiden. Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid (NBTC) ist reduziert um freie Elektronen, die von dem NADH transferiert werden, oxidiert durch NADH-Diaphorase in NAD+. NBTC wechselt sofort in blaues Formazan. Diese Technik ist geeignet für unfixierte Kyrostatschnitte. Yoshimoto T. & Kollegen (11) verwendeten diese Technik zum Visualisieren der Nekrose-Fläche von in vivo durchgeführter RFA in Schweineleber.
Großschnitthistologie ist ein Verfahren, das verwendet für Histopathologie von Krebsleiden, bevorzugt in dem Gebiet von Gynäkologie und Obstetrik (20, 21). Dieses Verfahren basiert auf Fixierung und Dehydrierung (Alkoholserie, Xylol und Aceton-Inkubation) des Gewebes und Einbetten in Paraffin. Für jede Probe wird das Verfahren angepasst und aus diesem Grunde optimieren wir ebenfalls die Präparationsschritte für unser Gewebe.
In dem vorliegenden technischen Bericht beschreiben wir den Arbeitsprozess, um Abschnitte von ablatierten Lebern zu erhalten, in einer Qualität, die geeignet ist für weitere 3D-Rekonstruktion. Unsere Optimierung endet in einem optimierten Protokoll für in situ-Perfusion der Lebern in Kombination mit Immersionsfixierung, angepasst von verschiedenen Standardprotokollen (22–24).
Hierbei wird das anästhetisierte heparinisierte Schwein mit 0,9% NaCl gespült, um Bluttromben zu vermeiden und die Gefäße wurden verwendet, um dem Organ ein Fixiermittel (4% Formalin) zu liefern (Perfusionsfixierung). Danach wird das Organ explantiert und auf das Gebiet von Interesse beschnitten. Diese Gewebeblöcke werden in 4% Formalin gelagert, bis die Fixierung vollständig ist (das gesamte Gewebe mit Fixiermittel gesättigt ist). Diese zusätzliche Immersionsfixierung stellte sicher, dass es keine Änderung in der makroskopischen Morphologie in dem Gewebe gegeben hat. Zum Reduzieren der Anzahl an Schnitten pro Läsion optimieren wir auch ein Protokoll für großformatige Abschnitte von unseren RFA-Flächen. Reihen-Paraffinabschnitte der RFA-Fläche wurden optimiert und ein einziger Schnitt war groß genug, um einen vollständigen Überblick der RFA-Fläche und des umgebenden Gewebes zu geben.
An ein Betrachten des dreidimensionalen Ergebnisses von RFA wurde in [FMG 08] herangegangen. Die verwendeten Scheiben haben eine Dicke von einigen wenigen Millimetern (4–6) und eine starre Registrierung. Deshalb ist das Ergebnis nicht eine histologische Untersuchung. Darüber hinaus kann das in Scheiben geschnittene Gewebe nur grob mit einem MRI- oder CT-Scan verglichen werden, da niemals dieselbe Scheibe in dem Scan wie in dem Gewebe sichtbar ist und es keine Kompensation für das Schneiden entweder einer anderen parallelen Ebene oder andernfalls einer nichtparallelen Ebene gibt.
Grobes Gewebeschneiden wurde auch von [SEA 06] an einem menschlichen Gehirn verwendet. Das Gehirn deformiert sich auch weniger als die Leber, aufgrund seiner Lage in einem geschlossenen Schädel. [YEA 06] verwenden histologische Schnitte zum Verschmelzen mit MRI an einem Mäusegehirn. Das Mäusegehirn ist kein großes Volumen und unterliegt daher weniger Verzerrungen. Auch wird das gesamte Gehirn für Rekonstruktionszwecke verwendet, nicht elf Gebiet von Interesse in einem gesamten Gehirn. Last but not least, befasst sich der Verschmelzungsansatz mit einem Stapel von Bildern, die orientiert sind auf einem anderen Stapel von Bildern. Das Verfahren hängt daher davon ab, dass die Orientierung der Bildebenen ähnlich ist. Es wird keine 3D-Verzerrung eines gesamten Volumens berücksichtigt. Da die äußere Gestalt des Volumens ein wichtiges Maß für die Registrierung ist, ist kein Übergang von Skalen involviert. Last but not least, werden keine Segmentierungsalgorithmen auf die histologischen Volumen angewandt und daher wird keine zusätzliche Information erzielt außer das, was für das menschliche Auge ohnehin sichtbar ist.
[BLW 05] entwickelt eine Technik zum Verschmelzen von histologischen Schnitten zuerst mit Gewebe-Fotografien und von da mit MRI-Daten. Wiederum wird kein Volumen untersucht. Die Verschmelzung von Histologien mit MRI-Scans basiert auf Schnitten. Obwohl räumliche Verzerrung angesprochen wird, ist sie nicht ausreichend gelöst für stark deformierende Organe. Das histologische Volumen kann ferner nicht in 3D untersucht werden. Bildverarbeitung basiert auf rein manuellen Verfahren, wo unsere Verfahren nur einige wenige manuelle Eingriffe erfordern, wenn das automatische Prozessieren versagt. Speziell die Segmentierung von histologischen Strukturen/Geweben wird durchgeführt unter Verwendung des manuellen Live-Wire-Ansatzes, wohingegen wir die verschiedenen Farben verwenden, um die Strukturen automatisch zu identifizieren.
Die Verschmelzung von histologischer Information mit MRI-Scans ist ferner orientiert an dem Erscheinungsbild der Läsion, welche nicht automatisch segmentiert werden kann von Standard-H&E-Färbungen. Da die Korrelation der Läsion zwischen beiden Modalitäten aktuell Gegenstand von Untersuchungen ist, sollte es vermieden werden, MANUELL eine perfekte Übereinstimmung dieses Merkmals in dem Fusionsprozess zu erzeugen.
Das Verfahren basiert auf Bezugsmarkern und weist daher künstlich induzierte Artefakte auf. Last but not least, ist deren Verfahren auf kleinere Organe angewendet, welche viel leichter versteift werden können.
2. Computer-orientierte Datenaufnahme der Leber
In medizinischen Verfahren und Forschung werden Daten aufgenommen entsprechend Standardprozeduren, die akzeptiert sind, valide zu sein und die entsprechenden Ergebnisse liefern. Computervision nimmt die produzierten Daten und wendet Algorithmen an, um dieselbe Arbeit zu tun, die ein menschliches Wesen mit vergleichsweise höherem Aufwand durchführen könnte. Die Ergebnisse der Computervisions-Algorithmen sind oft weniger genau als manuelles Prozessieren und können manchmal ihre Aufgabe überhaupt nicht bewältigen. Ein Hauptgrund ist die Aufnahme von medizinischen Daten gemäß allgemeinem Verständnis und speziellen Wünschen für medizinische Forschung.
Automatisches Datenprozessieren wendet nicht dieselben Techniken an wie die menschliche Wahrnehmung und bestimmt daher andere Erfordernisse für ein optimales Datenprozessieren. Wenn die Daten, die in einem Computervisions-Prozessierschritt erzielt wurden, weiter verwendet werden sollen, muss das Ziel sein, das Maximum aus der Datenaufnahme herauszuholen, um in der Lage zu sein, jede einzelne aufgenommene Information zu prozessieren. Zur selben Zeit können bekannte Aufnahmetechniken nicht vollständig ersetzt werden ohne das Erfordernis, das Vertrauen eines Benutzers in die Informationen, die unter Verwendung eines neuen Verfahrens aufgenommen wurden, wiederherzustellen. Zum Beispiel, wenn ein neues Färben angewandt wurde, würde der erste Schritt sein, zu beweisen, dass die Färbung tatsächlich die beabsichtigte Klassifikation zeigt und die medizinische Gemeinschaft müsste davon überzeugt werden.
Unsere Forschungsfrage zielt auf die Fusion von makroskopischen Ansichten eines Organs mit der mikroskopischen Ansicht eines Gebietes von Interesse. Durch Aufnahme von histologischen Schnitten in einer Weise, die orientiert ist an Bildverarbeitungswünschen, kann eine Unsicherheit in weitem Maße ausgeschlossen werden, und die resultierenden Bilder kombiniert werden, um insgesamt viel mehr Informationen zu erhalten. Die wichtigsten Schwierigkeiten für automatische Blidverarbeitung treten aufgrund der folgenden Punkte auf:

– Deformationen, welche eine Schätzung von korrekter Position eines Merkmals für ein Modell gemäß Information aus Bildern behindert.
– Veränderungen in Modalität, Kontrast oder Farbe hindern die pixelweise Klassifikation von Pixeln in Kategorien.
– Starke Unterschiede in Auflösung oder Skalierung, da verschiedene Strukturen sichtbar werden.
– Kleine Bildgröße, welche eine Vielzahl von Schwierigkeiten für das Prozessieren der Bilder vermeidet.

Die Leber – als ein Weichgewebeorgan – deformiert sich stark bei vielen Gelegenheiten. Ein Abbilden des gesamten Organs wird in radiologischer Bildaufnahme durchgeführt. Gewebeaufnahmen werden gemacht durch Anfertigen einer Histologie. Beide Schritte durchführend, am besten ausgerichtet auf die Erfordernisse eines Computers, rekonstruieren wir zwei Volumina. Die radiologische Bildaufnahme unterstützt dies implizit und für die histologischen Daten registrieren wir aufeinanderfolgende Schnitte aufeinander. Dann werden beide Volumina registriert, durch Finden von Entsprechungen in natürlichen Merkmalen, die in beiden Modalitäten sichtbar sind – in unserem Fall Blutgefäße. 3 zeigt eine schematische Darstellung für den Prozessierschritt.
3. Abbilden der Leber als ein Organ
Ein Abbilden der Gefäßbäume in der Leber wird durchgeführt unter Verwendung von Kontrastmitteln. Das richtige Abbildungsprotokoll, angewendet in einer Tierstudie, ist in der Lage, Bilder von allen drei Gefäßbäumen ohne atmende Deformationen aufzunehmen [MKPSB09]. Bilder können mit einer hohen räumlichen Auflösung von 0,5 mm Abstand zwischen Schnitten aufgenommen werden. 4 zeigt eine schematische Darstellung für CT-Schnitte, die für die Leber zum Beispiel in axialer Orientierung aufgenommen wurden.
Auf diese Weise können die Gefäßbäume segmentiert werden unter Anwendung von Computervisions-Algorithmen und ein 3D-Modell kann rekonstruiert werden für eine tierische spezifische 3D-Leber. 5 zeigt ein 3D-rekonstruiertes Bild eines Schweins in einem ray caster mit drei segementierten Gefäßbäumen. Für dieses Bild folgte die Datenaufnahme dem Protokoll, welches beschrieben ist in [MKPSB09] und folglich können Gefäßbäume in einer hohen Auflösung gesehen werden.
Das Gebiet von Interesse ist in den CT-Scans sichtbar. Wenn die Ablation die nahegelegenen Gefäßstrukturen aufdeckt, können Bilder vor und nach dem Eingriff registriert werden, um zu sehen, wo die Gefäßbäume gesessen haben, bevor das Kontrastmittel die gesamte Ablation hervorgehoben hat.
3: Die Multiskalen-Datenfusionprozessierschritte sind hier dargestellt. Von der Leber als ein Organ, wird ein CT-Scan aufgenommen. Dann wird das Gewebe um das Gebiet von Interesse ausgeschnitten und in histologischer Aufbereitung in Scheiben geschnitten. Unter Verwendung von Bildverarbeitung werden die Scheiben gestapelt und das Volumen des geernteten Gewebes in der ursprünglichen Größe rekonstruiert. Das Volumen kann dann mit dem CT-Scan verschmolzen werden.
4. Abbilden von Lebergewebe
Beim Betrachten des Lebergewebes unter dem Mikroskop wird das Gewebe in sehr dünne Schnitte bis hinunter zu einigen wenigen Mikrometern Dicke geschnitten. Um in der Lage zu sein, diesen Schnittprozess durchzuführen, muss das Gewebe präpariert und fixiert werden. Das Fixierverfahren bestimmt die Steifheit und daher die Deformationen, die in der Schnittprozedur eingebracht werden. Dann kann das Gewebe unter einem Mikroskop betrachtet werden, und die oben beschriebenen Strukturen sind sichtbar. 6 zeigt einen 3μm-Schnitt, genommen in der Standard-histologischen Untersuchung.
Während auf radiologischen Bildern hervorgehobene Strukturen kontrastverstärkte anatomische Strukturen (Blutgefäße) betreffen, betrifft „hervorheben” auf histologischen Schnitten spezifische Farben für verschiedene Merkmale. Diese Farben geben Information, zum Beispiel, von welchem Typ von Zelle dies ist und ob die Zelle tot oder lebend ist. Blutgefäße scheinen in den Schnitten Löcher zu sein, aber nicht jedes Loch ist ein Blutgefäß. Ein Loch kann auch von einer Beschädigung in dem Prozessieren der Gewebeschnitte resultieren. Arterien haben dickere Wände als Venen und können daher leichter unterschieden werden.
5. Perfusionsfixierung
Während den Prozessen unserer Studie wurde eine Technik für histologische serielle Paraffinschnitte des RFA-Gebietes optimiert. Ein einziger großräumiger Abschnitt war groß genug, um einen vollständigen Überblick des RFA-Gebietes und des umgebenden Gewebes zu geben. Nachdem RFA in Schweinen durchgeführt wurde, wurde die Leber durch Perfusion (Durchschwemmung) fixiert (4% Formalin), um das Organ vor der Entfernung in Form zu halten. Gewebeblöcke von Interesse bis zu 3 × 3 × 5 cm wurden aus dem Lebergewebe herausgeschnitten, fixiert und eingebettet. Die zusätzliche Immersionsfixierung stellte sicher, dass es keine Veränderung an makroskopischer Morphologie in dem Gewebe gab. Fixierung, Dehydrierung und Einbettungsprotokolle wurden sorgfältig optimiert für diese großen Gewebeblöcke. Großangelegte, serielle Schnitte wurden durchgeführt, gefärbt und gescannt in hoher Auflösungsqualität (4.800 dpi) für eine weitere Analyse.
Anästhesie an Schweinen wurde durchgeführt durch einen Veterinärfachmann unter Verwendung von Remifentanil (Ultiva) 1 mg ad 50 ml NaCl, 0,9% (20 g/ml), 0,08–0,1 g/kg/KG/h und Sevofluran (SEVOfluoran) 2% ET. Nach Intubation wurde ein Katheter in der Vena Cava für die Sammlung von Blutproben und Anwendung von Medikamentierung, falls nötig, platziert.
Dann wurden Thorakotomie und eine mittlere Laparotomie durchgeführt. Zur Perfusionsfixierung wurde die Leber mobilisiert, ohne das Parenchym oder Blutgefäße zu schneiden. Die gemeinsamen iliakalen Arterien wurden freigelegt und umschlungen unter Verwendung von Vicryl-2-Ligation. Eine dritte Ligation wurde um die abdominale Aorta platziert. Ferner wurde die Vena Cava Inferior infra-renal wie auch supradiaphragmatikalisch freigelegt. Vor der Anwendung von Heparin (10.000 IE) wurde die Aorta Thorakalis über dem Diaphragma freigelegt, wo eine Aortenklemme platziert wurde.
4 CT-Bildaufnahme: Hochauflösungs-CT-Scans können die Leber mit einem Schnittabstand von 0,5 mm abbilden.
5: Das Szenario zeigt einen CT-Scan eines Schweins aufgenommen mit Hochauflösung, und die segmentierten Gefäßbäume der Leber innerhalb des Abdomens. Eine HF-Nadel ist ebenfalls segmentiert.
Die iliakalischen Arterien wurden abgebunden und eine Kanüle, gespült mit 0,9% NaCl, wurde in der Aorta Abdominalis platziert und fixiert unter Verwendung der Ligatur der Aorta wie auch der rechten iliakalen Arterie. Dann wurde die Vena Cava infra-renal wie auch supra-diaphragmatikalisch geschnitten und ein Sauger wurde in dem abdominalen Teil platziert. Die Aorta Thorakalis wurde geklammert und die abdominalen Organe wurden perfusiert mit 3.000 ml kalter 0,9% NaCl um das verbleibende Blut auszuspülen. In der Zwischenzeit wurde eine Organkühlung durchgeführt durch Spülen kalter 0,9% NaCl und zerstoßenem Eis in die abdominale Kavität. Als all das Blut aus den abdominalen Organen ausgewaschen war, wurde die Perfusion unter Verwendung von Formalin (4% Formalin/PBS) fortgesetzt, um die Organe in situ zu fixieren. Die Verwendung dieses Verfahrens garantiert, dass die Organe ihre Form innerhalb des Körpers und während sie für weitere Analyse seziert werden, beibehalten.
Für eine Präparation der Leber wurde das Ligamentum hepatoduodenale präpariert und der Gallengang, die Pfortvene wie auch die hepatische Arterie wurden abgebunden und geschnitten. Dann wurde die Leber von dem Diaphragma freigelegt ohne die Vena Cava zu schneiden. Nach dem Freilegen des rechten wie auch des linken Lappens des Organs, wird die Leber für eine Hintertisch-Präparation entfernt.
Schließlich wurden grob die interessierenden Teile der Leber herausgeschnitten unter Verwendung eines Messers und in Formalin gelegt bis zur weiteren Verarbeitung.
Gemäß einer Ausführungsform wird optional zumindest ein Teil der hierein beschriebenen Verfahrensschritte, beispielsweise die Perfusionsfixierung, an einem bereits toten Tier, beispielsweise einem toten Schwein, durchgeführt.
6. Fixierung, Einbettung und Aufteilung
Nach dem Entfernen der Leber wurde das Gebiet von RFA ausgeschnitten. Dieses Gebiet wurde geschnitten in Gewebeblocks bis zu 5 × 5 × 3 cm im Durchmesser. Ein einziges RFA-Gebiet enthielt ein bis drei Gewebeblöcke. Dehydrierung der Blöcke wurde durchgeführt gemäß unserem optimierten Protokoll: 3 Tage 4% Formalin, 12h 70% Ethanol, 12h 90% Ethanol, 12h 96% Ethanol, 24–48h 100% Ethanol, 2–3h Aceton und 12h Xylol. Nach der Dehydrierung wurden die Blocks in Paraffin ausgebrütet (Schmelzpunkt 52) für 18–24h und das eingebettete in Paraffin (Schmelzpunkt 56C). Die Form zum Einbetten war ein Handelsprodukt (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie), zusammengesetzt aus vier Stahlwinkeln zum Variieren der Dimensionen des Paraffinblocks. In Intervallen von 100 μm, wurden 2 μm Paraffinschnitte durchgeführt. Die Schnitte wurden auf 76 × 90 × 0,13 mm Objektdeckgläser gebracht.
7. Färben
Die Schnitte wurden gefärbt mit einem Chromotrop-Anyllinblau(CAB) Trichrom Färbeverfahren und Methylen-Blau (MB). Wenn eine CAB-Lösung verwendet wurde, sind Kollagenfasern, reticuläre Fasern und Basalmembrane blau gefärbt. Der Kern ist in violett gefärbt und das Zytoplasma in verschiedenen Nuancen von blau. Diese Färbung hilft zwischen Gefäßen oder Artefakten zu unterscheiden. Auch die Koagulation des umgebenden Gebietes konnte demonstriert werden. Methylen-Blau färbt nur in blau. Das Gebiet der Läsion ist in intensiverem blau als die überlebenden Zellen darum gefärbt. Diese Färbung fokussiert auf den Unterschied zwischen der Farbintensität zwischen lebenden und toten Zellen.
Während ein Schnitt nicht in jeder Anzahl von Farben gefärbt werden kann, können aufeinanderfolgende Schnitte unter Verwendung von verschiedenen Farbstoffen gefärbt werden. Da das Nehmen der Schnitte und Färben derselben viel manuelle Arbeit ist, wird nicht der gesamte Gewebeblock prozessiert. Tatsächlich wird, nachdem genügend aufeinanderfolgende Schnitte, die direkt aufeinander folgen zur Anwendung der verschiedenen Färbung, aufgenommen wurden, ein vergleichsweise großer Teil des Blocks nicht prozessiert. Dann werden wieder die Schnitte für die verschiedenen Färbungen genommen. Auf diese Weise wird der Gewebeblock mit einer höheren Abtastrate prozessiert. Um keine Information zu verlieren und um in der Lage zu sein, beide Volumina zu verschmelzen, muss der Histologiestapel das Doppelte der Abtastrate des CT-Scans (Sampling Theorem, Nyquist/Shannon) haben. Da die CT-Bilder eine Auflösung von 0,5 mm = 500 μm zeigen, muss der Gewebeblock Information mit einer Auflösung von nicht mehr als 250 μm zeigen. Die Schnittprozedur wird entsprechend durchgeführt. 7 zeigt eine schematische Darstellung zum Aufnehmen von aufeinanderfolgenden Schnitten mit verschiedenen Färbungen, um ein histologisches Volumen zu bilden.
7: Das Schneiden der Histologien wird durchgeführt in einem Schema von drei zur selben Zeit. Zwei Schnitte werden in verschiedenen Färbungen koloriert. Die dritte ist ein Backup für den Fall, dass eine Färbung nicht erfolgreich ist. Dann wird ein großer Teil ausgelassen und das Schneiden wieder angewandt. Mehr verschiedene Färbungen würden zu mehr aufeinanderfolgenden Schnitten führen, die für jeden Satz aufgenommen werden. Solange die finale Schnittdistanz von einem Schnitt zu dem nächsten Schnitt derselben Farbe nicht den maximalen Abstand, der durch das Sampling-Theorem bestimmt ist, überschreitet, können mehr Schnitte aufgenommen werden.
Nach dem Färben wurden die Schnitte nur getrocknet, nicht durch ein Deckglas abgedeckt. Dann wurde jeder Schnitt der Läsion digitalisiert.
8. Scannen histologischer Schnitte
Um histologische Schnitte durch Computer prozessieren zu können, werden sie gescannt oder fotografiert und in einem beliebigen Bildformat (z. B. tiff) gespeichert. Aufnehmen der Fotos durch ein Mikroskop verlangt entsprechende Ausrüstung, kann aber erzielt werden unter Verwendung von medizinischer Standardtechnologie. Aufgrund der ungewöhnlichen Größe der Träger, passt die Standardausrüstung nicht auf den Prozess. Während es kein technisches Problem gibt, eine Scanmaschine zu bauen, welche Bilder von großen Trägern aufnehmen kann, werden im Moment die Bilder in einem Scanprozess mit geringerer Auflösung aufgenommen. Die geringe Auflösung zeigt immer noch alle Strukturen zum Beurteilen von Zelltod durch Färben, aber die Bilder können nicht auf den Zellkern heruntergezoomt werden.
Wenn das Standardmikroskop ausgerüstet würde zum Halten der großen Träger, könnte es Bilder in der gleichen Auflösung wie in der normalen Prozedur aufnehmen, aber die Aufnahmen würden Bilder nur von der kleineren Größe aufnehmen wie sie verwendbar sind mit den kleinen Trägern. Durch fernerhin Ausrüsten des Mikroskops mit einer feinabgestimmten Halterbewegungseinheit, könnten nachfolgende überlappende Bilder aufgenommen werden, welche dann leicht in ein großes Bild verschmolzen werden könnten unter Verwendung derselben starren Bildprozessier-Algorithmen wie eine normale Digitalkamera in ihrem Fotoheftmodus (photo stitching mode) durchführt.
Mangels des Standardmikroskops verwenden wir einen digitalen. Tischscanner von der Stange, welcher eine Auflösung von 4.800 ppi liefert, um digitale Bilder von histologischen Schnitten zu erhalten. Die resultierenden Bilder sind von einer ungefähren Größe von 10.000×10.000 Pixeln. Um den notwendigen Kontrast für die Segmentierung zu liefern, verwenden wir eine Kombination von Auflicht und transmittiertem Licht. Obwohl Tischscanner eine Quelle für transmittiertes Licht liefern können, liefern sie keine Option, um beides zu verwenden, transmittiertes Licht und Auflicht. Um dieses Problem zu bewältigen, verwenden wir einen schwarzen diffusen Reflektor, der mit 15 mm Abstand zu der untersuchten Histologie platziert wird. Dies versetzt uns in die Lage, die Auflichtquelle aufgrund des Reflektors auch als eine Quelle für diffuses transmittiertes Licht zu verwenden. 8 verdeutlicht diesen Aufbau.
8: Die Kombination von transmittiertem Licht und einfallendem Licht mit einer Lichtquelle ist möglich durch Platzieren eines schwarzen diffusen Reflektors in einem definierten Abstand.
Die Differenzen in dem Kontrast sind erheblich für CAB- und MB-kolorierte Histologien, verglichen mit Standard-Scanprozeduren (z. B. weißer direkter Reflektor ohne Abstand oder nur transmittiertes Licht). 9 vergleicht verschiedene Standard-Scanmethoden mit unseren.
9: (a) Fotografie von CAB-kolorierter Histologie mit 12 Millionen Pixeln, (b) Scan einer MB-kolorierten Histologie mit nur transmittiertem Licht, (c) Scan einer CAB-kolorierten Histologie mit nur Aufsicht, (d) unser Verfahren: Scan einer MB-kolorierten Histologie mit beidem, transmittiertem Licht und Auflicht.
Mit 10.000×10.000 Pixeln für die Auflösung ist es nicht möglich, hineinzuzoomen und Details in dem Zellkern zu betrachten. Doch gibt die Auflösung einen sehr guten Gewebeüberblick über das Gewebe auf dem Niveau von mehreren Zellen. Die Verwendung einer besseren Auflösung wäre möglich, aber benötigt dann Out-of-Core-Bildbearbeitungs- und Visualisierungstechniken.
9. Segmentierung histologischer Schnitte
In den aufgenommenen Bildern sind Bereiche von ablatiertem (totem) Gewebe wie auch großen Gefäßen, die im CT sichtbar sind, segmentiert. Die obige Bildaufnahmeprozedur liefert alle notwendigen Daten, um diese Segmentierungsarbeit in einem halbautomatischen Rahmen durchzuführen.
Obwohl die Histologieprozessierung und Bildaufnahme auf die Bedürfnisse einer automatisierten Prozessierung zugeschnitten Ist, können benachbarte Schnitte beträchtlich in Form und Struktur variieren, da Schneiden und Färben von Schnitten ein invasiver Prozess ist und in einem beschädigten Gewebe resultieren kann. Daher müssen die entwickelten Algorithmen robust sein gegen solches Rauschen und, letztlich kann eine manuelle Verfeinerung der Segmentierung. notwendig sein.
Ein weiteres Erfordernis ist, dass die Algorithmen leicht anpassbar sind an variierende Gewebeerscheinungsbilder. Neben der Möglichkeit, Tumorgewebe in weiteren Experimenten zu identifizieren und segmentieren, variieren die Erscheinungsbilder beträchtlich bereits zwischen lebenden Schweinen (10(a)) und sofort geopferten Schweinen (10(b)). Zusätzlich müssen die Algorithmen in der Lage sein, größere Datensätze (typischerweise 200 Schnitte der Größe 10.000×10.000 Pixel) in vernünftiger Zeit zu prozessieren.
Um diesen Erfordernissen Rechnung zu tragen, wird ein Multi-Auflösung-, halbautomatischer, probabilistischer Algorithmus für kombinierte Schnitt-für-Schnitt-Segmentierung und Registrierung entwickelt. Der Algorithmus verbindet Variationen der drei gundlegenden Algorithmen, welche wiederum beschrieben sind:

1. Wahrscheinlichkeitstheoretische Klassifikation: Der Klassifikationsschritt verwendet einen probabilistischen Mischung-von-Gauss-Kurven-Cluster-Algorithmus zum Kennzeichnen der Pixel in dem Histologiebild. Ferner gibt er die Wahrscheinlichkeit für jedes Pixel an, zu einer Gewebeklasse zu gehören, was interpretiert werden kann als probabilistisches Maß jeder Klassenmitgliedschaft. Das verwendete Wahrscheinlichkeitsmodell ist eine Multivariat-Gauss-Kurven-Mischung (GMM), welche trainiert wird unter Verwendung des Standard(unüberwachten)Erwartungsmaximierungs(EM)-Algorithmus. Parameter der GMM und EM werden alle manuell gesetzt abhängig von dem Färben und dem interessierenden Gewebetyp. Die wichtigen Einstellungen sind die Bildmerkmale und die Abbildungsfunktion von Klassifizierungskennzeichen zu Gewebetyp. Die Bildmerkmale werden manuell ausgewählt aus RGB(rot, grün und blau)- und HSV(Farbton, Sättigung, Wert)-Kanälen für maximale Unterscheidung zwischen Gewebetypen. Die Kennzeichenabbildung wird trainiert von einigen wenigen manuell-segmentierten Bildern. Eine Initialisierung der EM wird. automatisch durchgeführt, basierend auf den Ergebnissen von gröberen Auflösungen.
2. Schnitt-für-Schnitt-Registrierung: Schnitt-für-Schnitt-Registrierung wird durchgeführt unter Verwendung eines Standard-Multiauflösungs-Registrierungsrahmenwerks implementiert in ITK unter Verwendung von starren Transformationen, normalisierter wechselseitiger Information und einem genetischen Optimierungsalgorithmus. Registrierungsmerkmale sind der rote Kanal für zwei CAB-Bilder, der blaue Kanal für zwei MB-Bilder und der Wertekanal für ein CAB- und ein MB-Bild. Zur Robustheit werden typischerweise mehrere Auflösungsniveaus verwendet. Ferner wird der Registrierungsalgorithmus nicht nur auf aufeinanderfolgende Schnitte, sondern auf mehrere Nachbarn angewandt, um einen Nachprozessierschritt zu erlauben zum Detektieren und Eliminieren von schlecht ausgerichteten Schnitten.
3. Segmentierung: Die Segmentierung von Gewebestrukturen basiert auf der Klassifikation in diesem gegenwärtigen Schnitt und von benachbarten Schnitten. Die probabilistischen Klassifikationsergebnisse dieser Schnitte werden in ein Merkmalsbild kombiniert, welches gewichtet ist mit dem Abstand zu dem gegenwärtigen Schnitt und der Qualität der Registrierung. Das resultierende Merkmalsbild repräsentiert die Wahrscheinlichkeit für jedes Pixel zu einem Gewebetyp zu gehören, unter der Annahme dieser Wahrscheinlichkeit für die benachbarten Schnitte. Ein Level-Set-Algorithmus wird verwendet zum Segmentieren dieses Merkmalsbildes in glatte Gebiete von ähnlichen Wahrscheinlichkeitswerten. Die Level-Set-Parameter werden von Hand gesetzt, um in mehreren glatten Gebieten für die Gefäßsegmentierung und nur wenigen Gebieten für das Ablationsgebiet zu resultieren.

Die Histologiedaten werden auf zwei Auflösungsniveaus mit fast identischem Workflow prozessiert. Der Hauptunterschied ist, dass auf dem niedrigen Auflösungsniveau ganze Schnitte prozessiert werden und, nachfolgend, Gebiete von Interesse (region of interest, ROI) extrahiert werden. Die Vollauflösungsschnitte werden nur in diesen ROIs prozessiert zum Verfeinern der Ergebnisse des niedrigen Auflösungsniveaus.
Im Folgenden wird der Workflow erläutert für einen einzigen Schnitt (11 zeigt Ergebnisse für einen CAB-Schnitt). CAB- und MB-Schnitte werden mit denselben Algorithmen aber anderen Parametereinstellungen prozessiert. In einigen Schnitten ist das Gewebe nur ein kleiner Teil des gesamten Bildes; deshalb wird eine grobe Vordergrundmaske erzeugt zum Beschleunigen von nachfolgenden Berechnungen. Dieser Vorprozessierschritt verwendet den Klassifikationsalgorithmus, Schwellwertbetrachtungen und einfache morphologische Operationen (binäres Schließen, binäres Öffnen, verbundene Komponenten) zum Berechnen einer übersegmentierten Maske (11b). Die nächsten Schritte sind von der probabilistischen Klassifikation von verbindendem Gewebe (11c), totem Gewebe (11d), lebendem Gewebe (11e) und Vordergrundpixeln (11f). Die letzteren enthalten die Information über Gefäßkandidaten. Benachbarte Schnitte werden ausgerichtet und die Level-Set-Segmentierung wird verwendet zum Extrahieren der Konturen von Gefäßkandidaten (11f), Gebieten von totem und lebendem Gewebe (11h). Schweilwertprozessieren des resultierenden Level-Sets resultiert in dem ROI für das Vollauflösungs-Prozessieren.
11: Prozessieren eines CAB-Schnitts mit dem implementiertem Algorithmus auf dem niedrigen Auflösungsniveau. (a) CAB-Schnitt niedriger Auflösung, (b) grobe Vordergrundmaske, (c) verbindendes-Gewebe-Klassifikation (weiß ist Wahrscheinlichkeit 1, schwarz ist Wahrscheinlichkeit 0), (d) totes-Gewebe-Klassifikation, (e) lebendes-Gewebe-Klassifikation, (f) Vordergund-Klassifikation, (g) Gefäßkandidat nach Level-Set, (h) totes Gewebe nach Level-Set.
10. Rekonstruieren von Volumeninformation von histologischen Bildern
Um ein Volumen aus den gescannten Bildern heraus zu rekonstruieren, müssen Schnitte gestapelt und in Registrierung gebracht werden, um ein Volumen zu bilden. Um Deformationen von dem Schneideprozess Rechnung zu tragen, wird eine nicht-starre Registrierung benötigt.
Eine Registrierung von Schnitten, die nahe beieinander angeordnet sind, beinhaltet weniger notwendige Deformationen als Schnitte, die Teile des Volumens repräsentieren, die eher weit entfernt voneinander sind. Durch Registrierung aufeinanderfolgender verschieden gefärbter Schnitte wird Information über mehr als einen Aspekt in sehr nahen Positionen erhalten. Ein vollständiges Volumen wird gebildet durch Registrierung und Stapeln aller Schnitte, die für ein makroskopisches Volumen aufgenommen wurden.
Da die Histologien aus einem weichen Teil von Gewebe herausgeschnitten sind, ist die zugrundeliegende Transformation zwischen den Bildern tatsächlich nicht starr. Jedoch können wir zeigen, dass selbst eine starre Registrierung ausreichend sein kann für eine korrekte Läsionenrekonstruktion. 12 a) bis ii) zeigen Einzelbilder eines Teils von solch einem unregistrierten Stapel von Histologien, die in dem CAB-Modus gefärbt sind. Mit anderen Worten zeigt 12 einen unregistrierter Teil eines CAB-kolorierten Stapels von Histologien.
Für eine starre Registrierung wird zuerst ein Referenzschnitt ausgewählt, basierend auf den Registrierungsergebnissen zu seinen benachbarten Schnitten. Startend von diesem Schnitt und durch den Stapel bewegend, wird jeder Schnitt auf diesen Referenzschnitt in Register gebracht durch die beste Transformation. Diese Transformation wird gewählt von einem Satz von Kombinationen von den bereits berechneten Transformationen. Die Qualität der Registrierung wird gemessen durch Vergleichen der Gefäßkandidaten-Segmentierungen und Vordergrund-Segementierungen der transformierten Schnitte. Dies stellt sicher, dass ein schlecht ausgerichteter Schnitt nicht die Registrierung von anderen benachbarten Schnitten beeinflusst. Der nächste Schritt ist, das Paar von CAB- und MB-Schnitten, welche zusammengehören, in einen segmentierten Schnitt zu verschmelzen. Typischerweise sind die Segmentierungsergebnisse sehr ähnlich für beide Schnitte und die Fusion ist trivial. In dem anderen Fall wird das Segmentierungsergebnis, welches am besten in das Modell passt (gemessen als die Qualität der Registrierung von oben), beibehalten.
Das finale Modell wird visuell geprüft und verfeinert, wenn notwendig. Ein dezidiertes Werkzeug wird implementiert, welches Module für jeden der Prozessierschritte hat und eine manuelle Verfeinerung der Segmentierungen und Registrierungen erlaubt. Letzteres ist notwendig, wenn der Datensatz aus mehreren Blöcken von Lebergewebe besteht, welche nicht automatisch registriert werden können.
Man kann ebenso versuchen, die nicht-starren Transformationsparameter zu finden durch Wählen von starren Kontrollpunkten in zwei folgenden Bildern. Da die Probe mit Formaldehyd versteift wird, bevor sie aus der Leber geschnitten wird, können wir annehmen, dass die Gefäße fixiert sind. Ein Wählen von Kontrollpunkten an dem Rand dieser Gefäße resultiert in einem nützlichen nicht-starr registrierten Bildstapel. Ein Wählen der Kontrollpunkte ist in 13(a) und 13(b) dargestellt und ein nachfolgendes Registrierungsergebnis von 12 in 14. 13(a) und b) zeigen eine Kontrollpunktzuordnung in zwei benachbarten Bildern zu Gefäßen um die Läsion von dem Bildstapel, der in 12 dargestellt ist. Die Kontrollpunkte werden als Eingabe für einen 2D-Freiform-Deformations(FFD)-Algorithmus verwendet.
Der Bildstapel kann transformiert werden in eine volumetrische Datei formal wie Analyse 7.5 oder DICOM in einem nachfolgenden Schritt. Diese Maßnahme füllt die Schnitte eines Volumens mit den erwähnten Bildern in der auftretenden Reihenfolge.
Wenn dieselben Transformationsparameter auf die segmentierten Histologiebilder angewendet werden, erhält man direkt ein registriertes binäres Volumen der Läsion. Ein Marching-Cubes-Algorithmus kann nachfolgend verwendet werden zum Extrahieren einer triangulierten Oberfläche der Läsion oder das Volumen kann direkt dargestellt werden durch direktes Volumen-Rendering(DVR)[RTVG06]-Verfahren.
Da unsere gewählte Schnittmethode Schnitte mit verschiedenem Abstand zueinander erzeugt, müssen die Standard-Volumenformate entweder mit nur einem Satz von einer Farbe arbeiten oder andernfalls muss das Standardformat erweitert werden, um sich unterscheidende Distanzen auf mindestens einer Dimension einzuschließen. Der erste Ansatz führt zu zwei Volumen, welche ausgerichtet sind und deshalb leicht zusammen visualisiert werden können, selbst in einer ge-raycasteten Szene. Der zweite ist ein Definitionsansatz, der selten gewählt wird, aber in der Computergrafik nicht unbekannt ist. Algorithmen, die auf einem solchen Datenformat arbeiten, werden ausgewählt, um korrekt zu arbeiten, sind aber ebenfalls in der Computergrafik bekannt.
11. Fusion des histologischen Volumens mit dem CT-Bildvolumen
Der Stapel von prozessierten histologischen Bildern enthält eine Größe, die sichtbar ist, verglichen mit dem CT-Scan. Darüber hinaus ist das Gebiet von Interesse in dem CT-Scan ebenso sichtbar. Das Gebiet von Interesse ist entweder auch segmentiert oder visualisiert zusammen mit dem Modell in direkten Volumen-Rendering. 15(a)–(d) zeigt Beispiele von Volumina, die von histologischen Schnitten rekonstruiert sind, visualisiert unter Verwendung von Ray-casting. Insbesondere zeigt 15(a)–(d) Beispiele einer Volumendarstellung von histologischen Bildern. 15(a) zeigt einen Stapel von histologischen Schnitten, die nicht-strarr registriert sind. Die weißen Punkte sind große Blutgefäße, die durch den gesamten Block von Schnitten reichen. (b) derselbe Block in einer weniger transparenten Ansicht (c) segmentierte Gefäßbäume von histologischen Schnitten. Die großen Gefäße werden begleitet durch viele kleine Gefäßkandidaten. Ein Anwenden des selben Algorithmen wie auf CT volumina kann diese aussortieren und vollständige Baumfragmente erzeugen. (d) Die Läsion wie von den Schnittbildern segmentiert.
Während das histologische Volumen immer noch verzerrt ist verglichen mit dem CT-Volumen, zeigen beide dieselben natürlichen Merkmalspunkte-Blutgefäße, welche sehr groß sind auf der Skala von histologischen Bildern und sehr klein im Durchmesser auf der Skala von CT-Bildern. Darüber hinaus gleicht das histologische Volumen dem CT-Volumen in der Weise, wie Information gespeichert ist – Stapel von Bildern mit festen Abständen zwischen den Bildern in 3D-Koordinaten. So kann das histologische Volumen prozessiert und visualisiert werden in derselben Weise wie CT-Volumina.
Durch Anwenden derselben Technik für Segmentierung von Gefäßen in CT-Scans auf die Blutgefäße, die in den histologischen Stapeln sichtbar sind, können Algorithmen verwendet werden, um Gefäßbäume innerhalb des histologischen Volumens zu finden. Wenn der Algorithmus auf einem gegebenen Datensatz nicht gut genug arbeitet, sind Konfigurationen von großen Blutgefäßen immer noch für ein menschliches Augen sichtbar durch Anwenden von direktem Volumen-Rendering auf den histologischen Stapel. Auf diese Weise können wieder Kontrollpunkte manuell ausgewählt werden und eine Anwendung eines kommerziell erhältlichen Optimierungs-Algorithmus für eine nicht-starre 3D-Registrierung der zwei Volumina richtet beide Volumina in dem 3D-Raum aus. In dem Fall, dass weitere Unterstützung notwendig ist, kann eine Farbkodierung der Größe der Blutgefäße in den Histologien (orientiert an einem zu der senkrechten Ebene projizierten Umfang) das menschliche Auge in dem Identifizieren von Blutgefäßen von ähnlicher Größe in beiden Volumina unterstützt werden. Das Ergebnis ist ein verschmolzenes Volumen, welches sowohl CT- und histologische Information beinhaltet.
12. Ergebnisse
In unserem Verfahren beschreiben wir eine Lösung zum Verschmelzen von histologischen Daten mit CT-Scans. Unser Verfahren ist in der Lage, mit Weichgewebeorganen von beliebiger Größe zu arbeiten. Das einzige Erfordernis ist, dass das Gebiet von Interesse in dem CT-Scan sichtbar ist. Dies würde auch anwendbar sein zum Beispiel in Tumor-Untersuchungen. Die histologischen Schnitte, die für die Visualisierung verwendet werden, sind fixiert und aufgenommen in biologischen Standard-Prozeduren, welche spezifisch orientiert sind an automatischen Datenverarbeitungsbedürfnissen. Daher kann eine medizinische Forschung diese Art von Ergebnis leicht interpretieren und die Schnitte können weiter behandelt werden – zum Beispiel gefärbt werden – unter Verwendung von wiederum Standard-Prozeduren.
Zusammenfassend wird festgestellt: Offenbart wird insbesondere ein Verfahren zum Verschmelzen von Information von histologischen Bildern mit CT-Bildern, das Verfahren enthaltend: (a) Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten; (b) Fusion des histologischen Volumens mit einem CT Bildvolumen. Gemäß anderer Ausführungsformen werden MRI-Bilder an Stelle von CT-Bildern verwendet. Aufeinander folgende histologische Schnitte können unter Verwendung verschiedener Farbstoffe gefärbt sein. Ein zu untersuchendes abdominales Organ kann durch Perfusion unter Verwendung von Formalin in situ fixiert werden.
Bibliographie
[Ehrhardt et al 2007] A Variational Approach for Combined Segmentation and Estimation of Respiratory Motion in Temporal Image Sequences. IEEE International Conference on Computer Vision, pp. 1–7.
[Dercksen et al 2008] Towards Automatic Generation of 3D Models of Biological Objects Based on Serial Sections. Visualization in Medicine and Life Sciences, pp. 3–25
[Yang 2006] A Robust Region Based Level Set Framework for Medical Image Segmentation. Progress in Pattern Recognition, Image Analysis and Applications, pp. 336–344.
[Braumann et al 2005] Three-Dimensional Reconstruction and Quantification of Cervical Carcinoma Invasion Fronts from Histological Serial Sections. IEEE Transactions on Medical Imaging 24 (10), pp. 1286–1307.
[Wu et al 2003] Unsupervised color image segmentation based on Gaussian mixture model. Conference on Information, Communications and Signal Processing, pp. 541–544.
[Doyle et al 2006] Detecting prostatic adenocarcinoma from digitized histology using a multi-scale hierarchical classification approach. EMBS, pp. 47594762.
[Barr84]] Barr, A. H., Global and Local Deformations of Solid Primitives, Proceedings of SIGGRAPH 84, Computer Graphics 18, 3 (July 1984), 21–30.
[Sede86] Sederberg, T. W. and Parry, S. R., Free-Form Deformation of Solid Geometric Models, Proceedings of SIGGRAPH 86, Computer Graphics 20, 4 (August 1986), 151–159.
[Coquillart 90] Coquillart, S., Extended Free-Form Deformation: A sculpturing Tool for 3D Geometric Modeling, Proceedings of SIGGRAPH 90, Computer Graphics 24, 4 (August 1990), 187–196.
[Chang 94]] Chang, Y. and Rockwood, A. P., A Generalized de Casteljau Approach to 3D Free-form Deformation, Proceedings of SIGGRAPH 94, Computer Graphics (July 1994), 257–260.
[RTVG06] Markus Hadwiger, Joe M. Kniss, Christof Rezk-salama, Daniel Weiskopf and Klaus Engel: Real-time Volume Graphics. 2006, A. K. Peters, Ltd.
[UPTC08] M. Unger, T. Pock, W. Trobin, D. Cremers, and H. Bischof, TVSeg – interactive total variation based image segmentation, in British Machine Vision Conference 2008, Leeds, UK, Sept. 2008.
[P04] T. Pock, Robust segmentation of tubular structures in 3D volume data, 2004.
[HEA09] T. Heimann et al., Comparison and evaluation of methods for liver segmentation from CT datasets, IEEE Transactions on Image Processing, 2009, accepted for future publication.
[MKPSB09] J. Muehl et al. "Computer oriented image acquisition of the liver: Toward a better numerical model for radiofrequency ablation", Proc. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2009.
[FMG08] "Hepatic radiofrequency ablation using perfusion electrodes in a pig model: effect of the Pringle manoeuvre", Eur J Surg Oncol, 32 (5) 527ff, 2008.
[YEA06] "3D Mouse Brain Reconstruction from Histology Using a Coarse-to-Fine Approach", Biomedical Image Registration, 4057, pp. 230–237, Springer Verlag, 2006.
[SEA06] "From Human MRI to Microscopy: Co-registration of Human Brain Images to Postmortem Histological Sections", Nuclear Science Symposium Conference Record, 2006. IEEE, Vol. 4, pp. 1982–1985.
[BLW05] "Correcting spatial distortion in histological images", Computerized Medical Imaging and Graphics Volume 29, Issue 6, September 2005, Pages 405–417.
1. El-Serag HB. Translational research: the study of community effectiveness in digestive and liver disorders. Gastroenterology 2007; 132: 8–10.
2. Petrowsky H, Busuttil RW. Evolving surgical approaches in liver transplantation. Semin Liver Dis 2009; 29: 121–133.
3. Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. Resection and liver transplantation for hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 2005; 25: 181–200.
4. Rossi S, Fornari F and L Buscarini. Percutanous ultrasound-guided radiofrequency electrocautery for the treatment of small hepatocellular carcinoma. J Interv Radiol 1993; 8: 97–103.
5. Goldberg SN, Gazelle GS, Compton CC, Mueller PR, Tanabe KK. Treatment of intrahepatic malignancy with radiofrequency ablation: radiologic-pathologic correlation. Cancer 2000; 88: 2452–2463.
6. Scudamore CH, Lee SI, Patterson EJ, et al. Radiofrequency ablation followed by resection of malignant liver tumors. Am J Surg 1999; 177: 411–417.
7. Cosman ER, Jr., Cosman ER, Sr. Electric and thermal field effects in tissue around radiofrequency electrodes. Pain Med 2005; 6: 405–424.
8. Bhardwaj N, Strickland AD, Ahmad F, Atanesyan L, West K, Lloyd DM. A comparative histological evaluation of the ablations produced by microwave, cryotherapy and radiofrequency in the liver. Pathology 2009; 41: 168–172.
9. Buscarini L, Rossi S. Technology for Radiofrequency Thermal Ablation of Liver Tumors. Semin Laparosc Surg 1997; 4: 96–101.
10. Organ LW. Electrophysiologic principles of radiofrequency lesion making. Appl Neurophysiol 1976; 39: 69–76.
11. Yoshimoto T, Kotoh K, Horikawa Y, et al. Decreased portal flow volume increases the area of necrosis caused by radio frequency ablation in pigs. Liver Int 2007; 27: 368–372.
12. Mandarano S, Mandarano, G., Sim, J. H. The sonographers role in RFA therapy of liver lesions. Biomedical Imaging and Intervention Journal 2009; 5: e8.
13. McGhana JP, Dodd GD, 3rd. Radiofrequency ablation of the liver: current status. AJR Am J Roentgenol 2001; 176: 3–16.
14. Ikeda M, Okada S, Ueno H, Okusaka T, Kuriyama H. Radiofrequency ablation and percutaneous ethanol injection in patients with small hepatocellular carcinoma: a comparative study. Jpn J Clin Oncol 2001; 31: 322–326.
15. Lu DS, Raman SS, Vodopich DJ, Wang M, Sayre J, Lassman C. Effect of vessel size on creation of hepatic radiofrequency lesions in pigs: assessment of the "heat sink" effect. AJR Am J Roentgenol 2002; 178: 47–51.
16. Wright AS, Sampson LA, Warner TF, Mahvi DM, Lee FT, Jr. Radiofrequency versus microwave ablation in a hepatic porcine model. Radiology 2005; 236: 132–139.
17. Patterson EJ, Scudamore CH, Owen DA, Nagy AG, Buczkowski AK. Radiofrequency ablation of porcine liver in vivo: effects of blood flow and treatment time on lesion size. Ann Surg 1998; 227: 559–565.
18. Neumann RA, Knobler RM, Leonhartsberger H, Bohler-Sommeregger K, Gebhart W. Histochemical evaluation of the coagulation depth after argon laser impact on a port-wine stain. Lasers Surg Med 1991; 11: 606–615.
19. Neumann RA, Knobler RM, Pieczkowski F, Gebhart W. Enzyme histochemical analysis of cell viability after argon laser-induced coagulation necrosis of the skin. J Am Acad Dermatol 1991; 25: 991–998.
20. Lampe B, Kurzl. R, Hantschmann P. Prognostic factors that predict pelvic lymph node metastasis from endometrial carcinoma. Cancer 1994; 74: 2502–2508.
21. Tabar L, Dean PB. Mammography and breast cancer: the new era. Int J Gynaecol Obstet 2003; 82: 319–326.
22. Abcam. Perfusion fixation. In: www.abcam.com/technical.
23. Frauenlob L. Wirkung des Erythropins auf den neurologischen Status nach hypothermem Kreislaufstillstand. Eine Studie am Schweinemodell. In:Medical Department. Tbingen: Eberhard Karls University, 2007.
24. Khan MA, Angus BM. Histochemical acitivity of acid phosphatase in rat liver after perfusion fixation. Acta Anat (Basel) 1980; 106: 327–329.
25. Nicoli N, Casaril A, Hilal MA, et al. A case of rapid intrahepatic dissemination of hepatocellular carcinoma after radiofrequency thermal ablation. Am J Surg 2004; 188: 165–167.
26. Poon RT, Ng KK, Lam CM, Ai V, Yuen J, Fan ST. Radiofrequency ablation for subcapsular hepatocellular carcinoma. Ann Surg Oncol 2004; 11: 281–289.
27. Seki T, Tamai T, Ikeda K, et al. Rapid progression of hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization and percutaneous radiofrequency ablation in the primary tumour region. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001; 13: 291–294.
28. Solbiati L, Livraghi T, Goldberg SN, et al. Percutaneous radio-frequency ablation of hepatic metastases from colorectal cancer: long-term results in 117 patients. Radiology 2001; 221: 159–166.
29. Takada Y, Kurata M, Ohkohchi N. Rapid and aggressive recurrence accompanied by portal tumor thrombus after radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma. Int J Clin Oncol 2003; 8: 332–335.
30. Solazzo SA, Liu Z, Lobo SM, et al. Radiofrequency ablation: importance of background tissue electrical conductivity-an agar phantom and computer modeling study. Radiology 2005; 236: 495–502.
31. Mertyna P, Dewhirst MW, Halpern E, Goldberg W, Goldberg SN. Radiofrequency ablation: the effect of distance and baseline temperature on thermal dose required for coagulation. Int J Hyperthermia 2008; 24: 550–559.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Efficient multi-modal dense field non-rigid registration: alignment of histological and section images”, Medical Image Analysis 9 (2005), 538–546 [0002]
Unger et al. [UPTC08] [0043]
Pock et al. [PO4] [0043]
[HEA09] [0043]
[Erhardt et al. 2007] [0045]
[Dercksen et al. 2008] [0045]
[Yang 2006] [0046]
[Braumann et al. 2005] [0047]
[Wu et al. 2003] [0048]
[Doyle et al. 2006] [0048]
[Dercksen et al. 2008] [0048]
[Barr84] [0049]
Sederberg & Perry [SEDE86] [0049]
[Coquillard 90] [0049]
Chang & Rockwood [Chang 94] [0049]
Lu D. S. et al. [0051]
[FMG 08] [0058]
[SEA 06] [0059]
[YEA 06] [0059]
[BLW 05] [0060]
[MKPSB09] [0067]
[MKPSB09] [0068]
[Ehrhardt et al 2007] A Variational Approach for Combined Segmentation and Estimation of Respiratory Motion in Temporal Image Sequences. IEEE International Conference on Computer Vision, pp. 1–7 [0115]
[Dercksen et al 2008] Towards Automatic Generation of 3D Models of Biological Objects Based on Serial Sections. Visualization in Medicine and Life Sciences, pp. 3–25 [0116]
[Yang 2006] A Robust Region Based Level Set Framework for Medical Image Segmentation. Progress in Pattern Recognition, Image Analysis and Applications, pp. 336–344 [0117]
[Braumann et al 2005] Three-Dimensional Reconstruction and Quantification of Cervical Carcinoma Invasion Fronts from Histological Serial Sections. IEEE Transactions on Medical Imaging 24 (10), pp. 1286–1307 [0118]
[Wu et al 2003] Unsupervised color image segmentation based on Gaussian mixture model. Conference on Information, Communications and Signal Processing, pp. 541–544 [0119]
[Doyle et al 2006] Detecting prostatic adenocarcinoma from digitized histology using a multi-scale hierarchical classification approach. EMBS, pp. 47594762 [0120]
[Barr84]] Barr, A. H., Global and Local Deformations of Solid Primitives, Proceedings of SIGGRAPH 84, Computer Graphics 18, 3 (July 1984), 21–30 [0121]
[Sede86] Sederberg, T. W. and Parry, S. R., Free-Form Deformation of Solid Geometric Models, Proceedings of SIGGRAPH 86, Computer Graphics 20, 4 (August 1986), 151–159 [0122]
[Coquillart 90] Coquillart, S., Extended Free-Form Deformation: A sculpturing Tool for 3D Geometric Modeling, Proceedings of SIGGRAPH 90, Computer Graphics 24, 4 (August 1990), 187–196 [0123]
[Chang 94]] Chang, Y. and Rockwood, A. P., A Generalized de Casteljau Approach to 3D Free-form Deformation, Proceedings of SIGGRAPH 94, Computer Graphics (July 1994), 257–260 [0124]
[RTVG06] Markus Hadwiger, Joe M. Kniss, Christof Rezk-salama, Daniel Weiskopf and Klaus Engel: Real-time Volume Graphics. 2006, A. K. Peters, Ltd [0125]
[UPTC08] M. Unger, T. Pock, W. Trobin, D. Cremers, and H. Bischof, TVSeg – interactive total variation based image segmentation, in British Machine Vision Conference 2008, Leeds, UK, Sept. 2008 [0126]
[P04] T. Pock, Robust segmentation of tubular structures in 3D volume data, 2004 [0127]
[HEA09] T. Heimann et al., Comparison and evaluation of methods for liver segmentation from CT datasets, IEEE Transactions on Image Processing, 2009, accepted for future publication [0128]
[MKPSB09] J. Muehl et al. ”Computer oriented image acquisition of the liver: Toward a better numerical model for radiofrequency ablation”, Proc. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2009 [0129]
[FMG08] ”Hepatic radiofrequency ablation using perfusion electrodes in a pig model: effect of the Pringle manoeuvre”, Eur J Surg Oncol, 32 (5) 527ff, 2008 [0130]
[YEA06] ”3D Mouse Brain Reconstruction from Histology Using a Coarse-to-Fine Approach”, Biomedical Image Registration, 4057, pp. 230–237, Springer Verlag, 2006 [0131]
[SEA06] ”From Human MRI to Microscopy: Co-registration of Human Brain Images to Postmortem Histological Sections”, Nuclear Science Symposium Conference Record, 2006. IEEE, Vol. 4, pp. 1982–1985 [0132]
[BLW05] ”Correcting spatial distortion in histological images”, Computerized Medical Imaging and Graphics Volume 29, Issue 6, September 2005, Pages 405–417 [0133]
El-Serag HB. Translational research: the study of community effectiveness in digestive and liver disorders. Gastroenterology 2007; 132: 8–10 [0134]
Petrowsky H, Busuttil RW. Evolving surgical approaches in liver transplantation. Semin Liver Dis 2009; 29: 121–133 [0135]
Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. Resection and liver transplantation for hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 2005; 25: 181–200 [0136]
Rossi S, Fornari F and L Buscarini. Percutanous ultrasound-guided radiofrequency electrocautery for the treatment of small hepatocellular carcinoma. J Interv Radiol 1993; 8: 97–103 [0137]
Goldberg SN, Gazelle GS, Compton CC, Mueller PR, Tanabe KK. Treatment of intrahepatic malignancy with radiofrequency ablation: radiologic-pathologic correlation. Cancer 2000; 88: 2452–2463 [0138]
Scudamore CH, Lee SI, Patterson EJ, et al. Radiofrequency ablation followed by resection of malignant liver tumors. Am J Surg 1999; 177: 411–417 [0139]
Cosman ER, Jr., Cosman ER, Sr. Electric and thermal field effects in tissue around radiofrequency electrodes. Pain Med 2005; 6: 405–424 [0140]
Bhardwaj N, Strickland AD, Ahmad F, Atanesyan L, West K, Lloyd DM. A comparative histological evaluation of the ablations produced by microwave, cryotherapy and radiofrequency in the liver. Pathology 2009; 41: 168–172 [0141]
Buscarini L, Rossi S. Technology for Radiofrequency Thermal Ablation of Liver Tumors. Semin Laparosc Surg 1997; 4: 96–101 [0142]
Organ LW. Electrophysiologic principles of radiofrequency lesion making. Appl Neurophysiol 1976; 39: 69–76 [0143]
Yoshimoto T, Kotoh K, Horikawa Y, et al. Decreased portal flow volume increases the area of necrosis caused by radio frequency ablation in pigs. Liver Int 2007; 27: 368–372 [0144]
Mandarano S, Mandarano, G., Sim, J. H. The sonographers role in RFA therapy of liver lesions. Biomedical Imaging and Intervention Journal 2009; 5: e8 [0145]
McGhana JP, Dodd GD, 3rd. Radiofrequency ablation of the liver: current status. AJR Am J Roentgenol 2001; 176: 3–16 [0146]
Ikeda M, Okada S, Ueno H, Okusaka T, Kuriyama H. Radiofrequency ablation and percutaneous ethanol injection in patients with small hepatocellular carcinoma: a comparative study. Jpn J Clin Oncol 2001; 31: 322–326 [0147]
Lu DS, Raman SS, Vodopich DJ, Wang M, Sayre J, Lassman C. Effect of vessel size on creation of hepatic radiofrequency lesions in pigs: assessment of the ”heat sink” effect. AJR Am J Roentgenol 2002; 178: 47–51 [0148]
Wright AS, Sampson LA, Warner TF, Mahvi DM, Lee FT, Jr. Radiofrequency versus microwave ablation in a hepatic porcine model. Radiology 2005; 236: 132–139 [0149]
Patterson EJ, Scudamore CH, Owen DA, Nagy AG, Buczkowski AK. Radiofrequency ablation of porcine liver in vivo: effects of blood flow and treatment time on lesion size. Ann Surg 1998; 227: 559–565 [0150]
Neumann RA, Knobler RM, Leonhartsberger H, Bohler-Sommeregger K, Gebhart W. Histochemical evaluation of the coagulation depth after argon laser impact on a port-wine stain. Lasers Surg Med 1991; 11: 606–615 [0151]
Neumann RA, Knobler RM, Pieczkowski F, Gebhart W. Enzyme histochemical analysis of cell viability after argon laser-induced coagulation necrosis of the skin. J Am Acad Dermatol 1991; 25: 991–998 [0152]
Lampe B, Kurzl. R, Hantschmann P. Prognostic factors that predict pelvic lymph node metastasis from endometrial carcinoma. Cancer 1994; 74: 2502–2508 [0153]
Tabar L, Dean PB. Mammography and breast cancer: the new era. Int J Gynaecol Obstet 2003; 82: 319–326 [0154]
www.abcam.com/technical [0155]
Frauenlob L. Wirkung des Erythropins auf den neurologischen Status nach hypothermem Kreislaufstillstand. Eine Studie am Schweinemodell. In:Medical Department. Tbingen: Eberhard Karls University, 2007 [0156]
Khan MA, Angus BM. Histochemical acitivity of acid phosphatase in rat liver after perfusion fixation. Acta Anat (Basel) 1980; 106: 327–329 [0157]
Nicoli N, Casaril A, Hilal MA, et al. A case of rapid intrahepatic dissemination of hepatocellular carcinoma after radiofrequency thermal ablation. Am J Surg 2004; 188: 165–167 [0158]
Poon RT, Ng KK, Lam CM, Ai V, Yuen J, Fan ST. Radiofrequency ablation for subcapsular hepatocellular carcinoma. Ann Surg Oncol 2004; 11: 281–289 [0159]
Seki T, Tamai T, Ikeda K, et al. Rapid progression of hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization and percutaneous radiofrequency ablation in the primary tumour region. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001; 13: 291–294 [0160]
Solbiati L, Livraghi T, Goldberg SN, et al. Percutaneous radio-frequency ablation of hepatic metastases from colorectal cancer: long-term results in 117 patients. Radiology 2001; 221: 159–166 [0161]
Takada Y, Kurata M, Ohkohchi N. Rapid and aggressive recurrence accompanied by portal tumor thrombus after radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma. Int J Clin Oncol 2003; 8: 332–335 [0162]
Solazzo SA, Liu Z, Lobo SM, et al. Radiofrequency ablation: importance of background tissue electrical conductivity-an agar phantom and computer modeling study. Radiology 2005; 236: 495–502 [0163]
Mertyna P, Dewhirst MW, Halpern E, Goldberg W, Goldberg SN. Radiofrequency ablation: the effect of distance and baseline temperature on thermal dose required for coagulation. Int J Hyperthermia 2008; 24: 550–559 [0164]

Claims

Verfahren zum Verschmelzen von Information von histologischen Bildern mit Computertomographie-Daten, das Verfahren enthaltend: – Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten; – Fusion des histologischen Volumens mit einem Computertomographie-Bildvolumen.
Verfahren zum Verschmelzen von Information von histologischen Bildern mit Magnetresonanztomographie-Daten, das Verfahren enthaltend: – Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten; – Fusion des histologischen Volumens mit einem Magnetresonanztomographie-Bildvolumen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, – wobei von den histologischen Schnitten aufeinander folgende Schnitte unter Verwendung verschiedener Farbstoffe gefärbt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, – wobei die histologischen Bilder aufgenommen werden unter Verwendung einer Kombination von Auflicht und transmittiertem Licht.
Verfahren nach Anspruch 4, – wobei die histologischen Bilder aufgenommen werden unter Verwendung. eines Scanners, der einen schwarzen diffusen Reflektor aufweist, welcher in einem definierten Abstand zu dem untersuchten histologischen Schnitt platziert ist, um eine Auflichtquelle des Scanners aufgrund des Reflektors auch als eine Quelle für diffuses transmittiertes Licht zu verwenden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, – wobei die Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus histologischen Schnitten ein Stapeln und in Registierung bringen der gescannten Bilder der Schnitte umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, – wobei die Fusion eine nicht-starre 3D-Registrierung der zwei Volumina umfasst, die beide Volumina in einem 3D-Raum ausrichtet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, – wobei die histologischen Schnitte Schnitte eines abdominalen Organes sind; und – das abdominale Organ durch Perfusion unter Verwendung von Formalin in situ fixiert wurde.
Computerprogramm, welches, wenn es von einer Prozessoreinheit ausgeführt wird, zum Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 eingerichtet ist.
Scanner zum Scannen eines histologischen Schnittes enthaltend: – eine Auflichtquelle; – einen schwarzen diffusen Reflektor, der in einem definierten Abstand zu dem histologischen Schnitt platziert ist, um die Auflichtquelle aufgrund des Reflektors auch als eine Quelle für diffuses transmittiertes Licht zu verwenden.