DE102010034122B4

DE102010034122B4 - Microscope and lens, especially for TIRF microscopy

Info

Publication number: DE102010034122B4
Application number: DE102010034122.3A
Authority: DE
Inventors: Manfred Matthä; Ingo Fahlbusch; Werner Kleinschmidt; Dr. Kramer Matthias
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2020-03-26
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: DE102010034122A1

Abstract

Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie,mit einem Objektiv (1) zum Leiten von Anregungslicht (7) in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe (10) und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe (10) emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung (16),mit Mitteln (15) zum Leiten des Anregungslichts (7) auf das Objektiv (1) in einem ersten Azimutalwinkel (38) bezüglich der Objektivachse (4) und mit mindestens einer Segmentblende (31, 32) zum Blockieren von von der Probe (10) zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht (11), die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs (1) abdeckt und in einem zweiten Azimutalwinkel (39) bezüglich der Objektivachse (4) ausgerichtet ist,wobei die Segmentblende (31, 32) im Objektiv (1) integriert ist undwobei eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel (38, 39) einstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase (33, 34) aufweist.Microscope, in particular for TIRF microscopy, with an objective (1) for guiding excitation light (7) into a surface area of a sample (10) to be examined and for guiding light emitted from the surface area of the sample (10), in particular fluorescent light, back towards a detection device (16), with means (15) for directing the excitation light (7) onto the objective (1) at a first azimuthal angle (38) with respect to the objective axis (4) and with at least one segment aperture (31, 32) for blocking excitation light (11) returning from the sample (10), in particular reflected, which covers at least part of a circular sector of a cross section of an observation beam path of the objective (1) and aligned at a second azimuth angle (39) with respect to the objective axis (4) , the segment aperture (31, 32) being integrated in the objective (1) and an angle difference between the first and the second azimuthal angle (38, 39) being one can be set, characterized in that the segment diaphragm (31, 32) has a ring with an inwardly directed nose (33, 34).

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf ein Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.In a first aspect, the present invention relates to a microscope, in particular for TIRF microscopy, according to the preamble of claim 1.

In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 14.In a second aspect, the invention relates to an objective for use in a TIRF microscope according to the preamble of claim 14.

In der TIRF-Mikroskopie, das heißt in der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie, wird Anregungslicht auf eine zu untersuchende Probe geleitet und dort total reflektiert. Hierdurch wird die Probe in einem Oberflächenbereich angeregt und emittiert Licht, insbesondere Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht. Das emittierte Licht wird mit einer Nachweiseinrichtung gemessen.In TIRF microscopy, that is, in internal total reflection fluorescence microscopy, excitation light is directed onto a sample to be examined and is totally reflected there. As a result, the sample is excited in a surface area and emits light, in particular fluorescent or phosphorescent light. The emitted light is measured with a detection device.

Das Anregungslicht wird in der Regel von Lasern erzeugt und kann verschiedene Wellenlängen aufweisen, die zur Anregung der Probe geeignet sind. Das Anregungslicht wird unter einem flachen Winkel auf den Objektträger geleitet, so dass es an der Grenze des Objektträgers zur Probe zur internen Totalreflexion kommt. Bei der Totalreflexion tritt eine sogenannte evaneszente Welle in die Probe ein, wobei das elektrische Feld der evaneszenten Welle exponentiell mit der Tiefe innerhalb der Probe abklingt. Hierdurch wird die Probe nur in einem dünnen Oberflächenbereich, der eine Dicke von etwa 50 nm bis 400 nm hat, zur Fluoreszenz angeregt. Diese Eindringtiefe hängt von der Wellenlänge des Anregungslichts sowie vom Einfallswinkel auf die Grenzfläche Objektträger/Probe ab. Das Anregungslicht wird mit demselben Objektiv, das auch zur Beobachtung des von der Probe emittierten Lichts benutzt wird, auf die Probe geleitet. Nach der Totalreflexion tritt das Anregungslicht wieder in das Objektiv ein und muss von dem von der Probe emittierten Licht getrennt werden.The excitation light is usually generated by lasers and can have different wavelengths that are suitable for excitation of the sample. The excitation light is directed onto the slide at a flat angle, so that total internal reflection occurs at the specimen border at the sample. In total reflection, a so-called evanescent wave enters the sample, the electrical field of the evanescent wave decaying exponentially with the depth within the sample. As a result, the sample is excited to fluoresce only in a thin surface area which has a thickness of approximately 50 nm to 400 nm. This penetration depth depends on the wavelength of the excitation light and on the angle of incidence on the slide / sample interface. The excitation light is directed onto the sample with the same objective that is also used to observe the light emitted by the sample. After total reflection, the excitation light re-enters the lens and must be separated from the light emitted by the sample.

Ein gattungsgemäßes Mikroskop weist ein Objektiv zum Leiten von Anregungslicht in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung sowie Mittel zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv in einem ersten Azimutalwinkel bezüglich der Objektivachse auf. Zudem ist mindestens eine Segmentblende zum Blockieren von von der Probe zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht vorhanden, die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs abdeckt und in einem definierten Azimutalwinkel bezüglich der Objektivachse ausgerichtet ist. Dieser definierte Azimutalwinkel wird auch als zweiter Azimutalwinkel bezeichnet.A generic microscope has a lens for guiding excitation light into a surface area of a sample to be examined and for guiding light emitted from the surface area of the sample, in particular fluorescent light, back towards a detection device and means for guiding the excitation light onto the lens at a first azimuth angle with respect to the lens axis. In addition, at least one segment aperture for blocking excitation light returning from the sample, in particular reflected, is present, which covers at least part of a circular sector of a cross section of an observation beam path of the objective and is oriented at a defined azimuthal angle with respect to the objective axis. This defined azimuth angle is also referred to as the second azimuth angle.

Der erste und zweite Azimutalwinkel liegen also in einer Ebene, die senkrecht zur Objektivachse orientiert ist. Sie werden bezüglich einer grundsätzlich beliebigen, aber gemeinsamen Position in dieser Ebene gemessen. Die Lage der Ebene entlang der Objektivachse ist nicht bedeutsam, da sich der erste Azimutalwinkel des auf die Probe zulaufenden Anregungslichts entlang der Objektivachse nicht ändert. Der erste Azimutalwinkel kann beispielsweise bezogen auf einen Mittelpunkt des Querschnitts des Anregungslichts gemessen oder angegeben werden. Der zweite Azimutalwinkel kann zum Beispiel bis zu einer oder bezogen auf eine Mitte des abgedeckten Teils des oben definierten Kreissektors gemessen oder angegeben werden.The first and second azimuthal angles therefore lie in a plane which is oriented perpendicular to the objective axis. They are measured with regard to a basically arbitrary but common position in this plane. The position of the plane along the lens axis is not important since the first azimuthal angle of the excitation light running towards the sample does not change along the lens axis. The first azimuthal angle can be measured or specified, for example, based on a center point of the cross section of the excitation light. The second azimuthal angle can, for example, be measured or indicated up to or in relation to a center of the covered part of the circle sector defined above.

Ein gattungsgemäßes Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop weist einen feststehenden Teil auf, der in einem in einem TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand feststehend ist.A generic lens for use in a TIRF microscope has a fixed part which is fixed in a state installed in a TIRF microscope.

Ein Mikroskop der oben genannten Art für die TIRF-Mikroskopie ist in DE 101 43 481 A1 beschrieben. Bei diesem Mikroskop ist die Segmentblende jedoch außerhalb des Objektivs angeordnet, nämlich in einem Modul, das auch ein Prisma zum Lenken von Anregungslicht in das Objektiv aufweist. Nachteilig an dieser Ausführung ist, dass das Objektiv vollständig vom zurücklaufenden Anregungslicht durchquert wird, ehe dieses an der Segmentblende blockiert wird. Auf dem Weg durch das Objektiv kann durch das zurücklaufende Anregungslicht Falschlicht erzeugt werden, was im Folgenden näher beschrieben wird. In DE 101 43 481 A1 ist zudem eine alternative Ausgestaltung eines TIRF-Mikroskops beschrieben. Statt einer Segmentblende ist bei dieser Ausgestaltung ein Prisma im Objektiv vorhanden, welches das von der Probe zurücklaufende Licht aus dem Beobachtungsstrahlengang des Objektivs herausleitet. Damit das Prisma von dem zurücklaufenden Licht nicht verfehlt wird, weist das Objektiv dem Prisma gegenüberliegend eine Einrichtung zum Einkoppeln des Anregungslichts auf. Dadurch ist zwischen der Einkoppel-Einrichtung und dem Prisma immer eine feste Azimutalwinkeldifferenz bezüglich der Objektivachse von 180° gegeben. Nachteilig hieran sind unter anderem die großen baulichen Veränderungen des Objektivs. Zudem wird durch ein Prisma kein vollständiges Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts erreicht. Das von der Probe zurücklaufende Licht muss entweder aus dem Objektiv ausgekoppelt werden oder an anderer Stelle gedämpft werden.A microscope of the type mentioned above for TIRF microscopy is in DE 101 43 481 A1 described. In this microscope, however, the segment diaphragm is arranged outside the objective, namely in a module that also has a prism for directing excitation light into the objective. A disadvantage of this embodiment is that the returning excitation light is completely passed through the lens before it is blocked at the segment diaphragm. On the way through the lens, false light can be generated by the returning excitation light, which is described in more detail below. In DE 101 43 481 A1 an alternative embodiment of a TIRF microscope is also described. In this embodiment, instead of a segment diaphragm, a prism is present in the objective, which guides the light returning from the sample out of the observation beam path of the objective. So that the prism is not missed by the returning light, the lens has a device opposite the prism for coupling the excitation light. As a result, there is always a fixed azimuthal angle difference with respect to the objective axis of 180 ° between the coupling device and the prism. One disadvantage of this is the large structural changes to the lens. In addition, a complete blocking of the returning excitation light is not achieved by a prism. The light returning from the sample must either be coupled out of the lens or attenuated elsewhere.

Weitere TIRF-Mikroskope sind aus DE 10 2005 009 832 A1 sowie aus DE 103 44 410 A1 bekannt. Hierbei ist jeweils eine Blende im Objektiv integriert. Diese ist jedoch rotationssymmetrisch und farbselektiv, wozu ein innerer Kreis und ein äußerer Ring für verschiedene Wellenlängenbereiche von Licht durchlässig sind. Somit kann auf die Probe zulaufendes Anregungslicht die Blende im Bereich des äußeren Rings durchdringen und wird beim Zurücklaufen, also nach einer Reflexion an der Oberfläche der Probe, auf den inneren Kreis der Blende geleitet, welcher das zurücklaufende Anregungslicht blockiert.More TIRF microscopes are out DE 10 2005 009 832 A1 as well as from DE 103 44 410 A1 known. There is one aperture in the lens integrated. However, this is rotationally symmetrical and color-selective, for which purpose an inner circle and an outer ring are permeable to light for different wavelength ranges. Thus, excitation light running towards the sample can penetrate the diaphragm in the area of the outer ring and is guided back to the inner circle of the diaphragm, which blocks the returning excitation light, when it runs back, ie after a reflection on the surface of the sample.

Ein Nachteil der farbselektiven Blenden ist, dass für das Anregungslicht nur ein eingeschränkter Spektralbereich blockiert werden kann. Für andere Spektralbereiche müsste die Blende gewechselt werden, was nur unter hohem Aufwand möglich ist. Als zusätzlicher Nachteil wird ein hoher Anteil des von der Probe emittierten Lichts, also des nachzuweisenden Lichts, an dem für das nachzuweisende Licht undurchlässigen Ringbereich der Blende blockiert.A disadvantage of the color-selective diaphragms is that only a restricted spectral range can be blocked for the excitation light. For other spectral ranges, the aperture would have to be changed, which is only possible with great effort. As an additional disadvantage, a high proportion of the light emitted by the sample, that is to say the light to be detected, is blocked in the ring area of the diaphragm which is impermeable to the light to be detected.

US 2003/0058350 A1 beschreibt ein Mikroskop, welches insbesondere für die TIRF-Mikroskopie gestaltet ist. Ein Anregungslichtstrahl wird über ein Objektiv geleitet und an einer Oberfläche, an welcher eine Probe angeordnet wird, totalreflektiert. Das totalreflektierte Licht läuft im Objektiv zurück und wird in diesem blockiert. Hierzu umfasst das Objektiv eine drehbare Glasplatte mit absorbierender oder reflektierender Beschichtung. Wird die Glasplatte geeignet gedreht, gelangt das Anregungslicht auf dem Weg zur Probe durch die transparente Glasplatte und wird auf dem Rückweg von der Beschichtung gestoppt. Nachzuweisendes Fluoreszenzlicht gelangt durch die transparente Glasplatte zu einem Detektor. US 2003/0058350 A1 describes a microscope which is especially designed for TIRF microscopy. An excitation light beam is passed through a lens and totally reflected on a surface on which a sample is placed. The totally reflected light runs back in the lens and is blocked in it. For this purpose, the lens comprises a rotatable glass plate with an absorbent or reflective coating. If the glass plate is rotated appropriately, the excitation light passes through the transparent glass plate on the way to the sample and is stopped on the way back by the coating. The fluorescent light to be detected passes through the transparent glass plate to a detector.

Weitere Mikroskope, die auch für die TIRF-Mikroskopie eingesetzt werden können, sind aus DE 10 2008 059 328 A1 und W02006/127692 A2 bekannt.Other microscopes that can also be used for TIRF microscopy are out DE 10 2008 059 328 A1 and W02006 / 127692 A2 known.

Zudem sind TIRF-Schieber bekannt, über welche Anregungslicht in das Mikroskop eingekoppelt werden kann. Hierdurch kann ein gewöhnliches Mikroskop für die TIRF-Mikroskopie verwendet werden. Dabei durchläuft das von der Probe zurücklaufende Anregungslicht jedoch das komplette Objektiv bis zum TIRF-Schieber. Hierbei kann das zurücklaufende Anregungslicht auf dem gesamten Weg durch das Objektiv Falschlicht erzeugen.TIRF slides are also known, via which excitation light can be coupled into the microscope. As a result, an ordinary microscope can be used for TIRF microscopy. However, the excitation light returning from the sample passes through the entire lens up to the TIRF slider. Here, the returning excitation light can produce false light all the way through the lens.

Ein Objektiv, das zum Reduzieren von Fehlern der optischen Abbildung des Mikroskops in einem in das Mikroskop eingebauten Zustand drehbar ist, ist in DE 10 2005 023 972 A1 beschrieben. Dieses Objektiv kann jedoch zurücklaufendes Anregungslicht nicht blockieren und kann deshalb nicht ohne weiteres für die TIRF-Mikroskopie eingesetzt werden.A lens that can be rotated to reduce errors in the optical imaging of the microscope in a state built into the microscope is shown in DE 10 2005 023 972 A1 described. However, this lens cannot block back excitation light and can therefore not be used for TIRF microscopy.

Für eine gute Bildqualität ist es ein grundlegendes Ziel, das Entstehen von Falschlicht durch das zurücklaufende Anregungslicht zu vermeiden. Unter Falschlicht soll hier dasjenige Licht verstanden werden, das zu einer Verfälschung des Bildeindrucks führt, indem es nicht aus dem Oberflächenbereich der Probe stammt, aber dennoch in das Okular des Mikroskops oder auf einen Kamerasensor des Mikroskops gelangt. Die Entstehung des Falschlichts kann in die folgenden drei Kategorien eingeteilt werden.For good image quality, it is a fundamental goal to prevent false light from being generated by the returning excitation light. False light is to be understood here as the light which leads to a falsification of the image impression, since it does not originate from the surface area of the sample, but nevertheless reaches the eyepiece of the microscope or a camera sensor of the microscope. The emergence of the false light can be divided into the following three categories.

Bei vielen Mikroskopen werden mit einem Strahlteiler das von der Probe emittierte Licht und das zurücklaufende Anregungslicht getrennt. Hierbei kann allerdings ein geringer Anteil des zurücklaufenden Anregungslichts den Strahlteiler passieren und so zu Falschlicht führen. Selbst wenn durch den Strahlteiler das zurücklaufende Anregungslicht um den sehr großen Faktor 10¹⁰ unterdrückt wird, führt dies noch zu einer Beeinträchtigung der Bildqualität. Diese Art von Falschlicht wird auch bei dem Prisma aus DE 101 43 481 A1 sowie bei den farbselektiven Blenden aus DE 10 2005 009 832 A1 und DE 103 44 410 A1 erzeugt.In many microscopes, the light emitted by the sample and the returning excitation light are separated with a beam splitter. Here, however, a small proportion of the returning excitation light can pass the beam splitter and thus lead to false light. Even if the returning excitation light is suppressed by the very large factor 10 ¹⁰ by the beam splitter, this still leads to an impairment of the image quality. This type of false light is also seen on the prism DE 101 43 481 A1 as well as with the color-selective apertures DE 10 2005 009 832 A1 and DE 103 44 410 A1 generated.

Eine zweite Kategorie von Falschlicht kann dann auftreten, wenn das zurücklaufende Anregungslicht Optiken des Beobachtungssystems, wie zum Beispiel das Objektiv oder Adapterlinsen, durchläuft, bevor es durch beispielsweise einen Strahlteiler wegreflektiert wird. An diesen Optiken, insbesondere an Kittschichten an den Optiken, kann durch das zurücklaufende Anregungslicht parasitäres Fluoreszenzlicht angeregt werden. Dieses Fluoreszenzlicht kann zusammen mit dem von der Probe emittierten Licht einen farbselektiven Strahlteiler passieren und so als Falschlicht wahrgenommen werden. Diese Art von Falschlicht wird also durch die farbselektiven Blenden aus DE 10 2005 009 832 A1 und DE 103 44 410 A1 nicht blockiert. Bei der in DE 101 43 481 A1 beschriebenen Ausführung, bei welcher eine Segmentblende in einem Modul und nicht im Objektiv angeordnet ist, durchläuft das zurücklaufende Anregungslicht das gesamte Objektiv, so dass vergleichsweise viel parasitäres Fluoreszenzlicht verursacht werden kann.A second category of false light can occur if the returning excitation light passes through optics of the observation system, such as the objective or adapter lenses, before it is reflected away by a beam splitter, for example. At these optics, in particular at kit layers on the optics, parasitic fluorescent light can be excited by the returning excitation light. Together with the light emitted by the sample, this fluorescent light can pass through a color-selective beam splitter and can thus be perceived as false light. This type of false light is characterized by the color-selective apertures DE 10 2005 009 832 A1 and DE 103 44 410 A1 not blocked. At the in DE 101 43 481 A1 described embodiment, in which a segment diaphragm is arranged in a module and not in the lens, the returning excitation light passes through the entire lens, so that a comparatively large amount of parasitic fluorescent light can be caused.

Eine dritte Kategorie von Falschlicht entsteht dadurch, dass das zurücklaufende Anregungslicht an Grenzflächen im Objektiv reflektiert und auf die Probe zurückgeworfen werden kann. Dieses ungewollt zurückgeworfene Licht kann über die Oberflächenschicht hinaus tiefer in die Probe eindringen und dort Fluoreszenzlicht verursachen, welches als Falschlicht in den Beobachtungsstrahlengang gelangt. Das ist für TIRF-Mikroskopie, bei der durch Totalreflexion des Anregungslichts die Probe nur in einer Oberflächenschicht zur Fluoreszenz angeregt werden soll, unerwünscht. Das Risiko, das diese Art von Falschlicht entsteht, ist bei dem in DE 101 43 481 A1 beschriebenen Mikroskop mit einer außerhalb des Objektivs angeordneten Segmentblende hoch, da hier das zurücklaufende Anregungslicht das Objektiv vollständig durchläuft. Diese Art von Falschlicht tritt außerdem auch an den farbselektiven Blenden aus DE 10 2005 009 832 A1 und DE 103 44 410 A1 sowie dem Prisma aus DE 101 43 481 A1 auf.A third category of false light results from the fact that the returning excitation light is reflected at interfaces in the lens and can be reflected back onto the sample. This unintentionally reflected light can penetrate deeper into the sample beyond the surface layer and cause fluorescent light there, which enters the observation beam path as false light. This is undesirable for TIRF microscopy, in which the sample is to be excited to fluoresce only in one surface layer by total reflection of the excitation light. The risk that this type of false light arises is with the DE 101 43 481 A1 described microscope with a segment aperture arranged outside the objective, since here the returning excitation light passes completely through the objective. This type of false light also occurs on the color-selective bezels DE 10 2005 009 832 A1 and DE 103 44 410 A1 as well as the prism DE 101 43 481 A1 on.

Besondere Bedeutung kommt dem Falschlicht insbesondere wegen der hohen Intensität des zurücklaufenden Anregungslichts zu. Während bei normaler Fluoreszenz-Mikroskopie reflektiertes Anregungslicht nur eine sehr geringe Intensität aufweist, hat bei der TIRF-Mikroskopie das zurücklaufende Anregungslicht aufgrund der Totalreflexion nahezu dieselbe Intensität wie das auf die Probe zulaufende Anregungslicht.The false light is particularly important because of the high intensity of the returning excitation light. While excitation light reflected in normal fluorescence microscopy has only a very low intensity, in TIRF microscopy the returning excitation light has almost the same intensity as the excitation light approaching the sample due to the total reflection.

Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskop und ein Objektiv bereitzustellen, bei denen eine besonders gute Bildqualität erreichbar ist.It can be regarded as an object of the invention to provide a microscope and a lens in which particularly good image quality can be achieved.

Diese Aufgabe wird in einem ersten Aspekt durch das Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe durch das Objektiv mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst.This object is achieved in a first aspect by the microscope with the features of claim 1. In a second aspect, the object is achieved by the objective with the features of claim 14.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Mikroskops und des erfindungsgemäßen Objektivs sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren, beschrieben.Advantageous embodiments of the microscope according to the invention and the lens according to the invention are the subject of the dependent claims and are also described in the following description, in particular in connection with the figures.

Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop ist die Segmentblende im Objektiv integriert und eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel ist einstellbar.In the microscope according to the invention, the segment diaphragm is integrated in the objective and an angle difference between the first and the second azimuthal angle can be set.

Das Objektiv der oben genannten Art zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Segmentblende zum Blockieren von von einer Probe zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht vorhanden ist, dass die Segmentblende mindestens einen Teil eines Kreissektors einer Querschnittsfläche eines Beobachtungsstrahlengangs abdeckt, dass ein drehbarer Teil vorhanden ist, welcher in dem in ein TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand drehbar ist, und dass die Segmentblende mit dem drehbaren Teil mechanisch gekoppelt, insbesondere verbunden, ist.The objective of the type mentioned above for use in a TIRF microscope is characterized according to the invention in that there is at least one segment aperture for blocking excitation light returning, in particular reflected, from a sample, that the segment aperture covers at least part of a circular sector of a cross-sectional area of an observation beam path that there is a rotatable part which is rotatable in the state installed in a TIRF microscope, and that the segment diaphragm is mechanically coupled, in particular connected, to the rotatable part.

Als wesentliche Idee der Erfindung kann erachtet werden, die Segmentblende möglichst nah an der Probe anzuordnen, so dass nur wenige optische Elemente, wie zum Beispiel die Linsen eines Objektivs, vom zurücklaufenden Anregungslicht durchquert werden. Das zurücklaufende Licht durchquert also nicht alle Linsen des Objektivs. Dadurch wird vorteilhafterweise das Risiko reduziert, das parasitäres Fluoreszenzlicht an den optischen Elementen oder an Kittschichten der optischen Elemente erzeugt wird. Zudem trifft das zurücklaufende Anregungslicht so an weniger Grenzflächen, beispielsweise der optischen Elemente, an denen es zurück zur Probe geworfen werden kann und dort eine Fluoreszenzanregung bewirkt.An essential idea of the invention can be considered to arrange the segment diaphragm as close as possible to the sample, so that only a few optical elements, such as the lenses of a lens, are traversed by the returning excitation light. The returning light does not cross all lenses of the lens. This advantageously reduces the risk that parasitic fluorescent light is generated on the optical elements or on kit layers of the optical elements. In addition, the returning excitation light strikes at fewer interfaces, for example the optical elements, at which it can be thrown back to the sample and causes fluorescence excitation there.

Als ein Kerngedanke der Erfindung kann angesehen werden, dass nur ein möglichst geringer Teil eines Querschnitts des Beobachtungsstrahlengangs abgedeckt wird. Somit kann das von der Probe emittierte Licht fast vollständig das Objektiv durchlaufen. Die Segmentblende braucht also nicht einen vergleichsweise großen Ring des Querschnitts des Beobachtungsstrahlengangs abzudecken, wie dies beispielsweise bei farbselektiven Ringblenden der Fall ist, sondern nur einen Teil eines Kreissektors.A key concept of the invention can be seen in that only as small a part of a cross section of the observation beam path as possible is covered. Thus, the light emitted by the sample can pass through the lens almost completely. The segment diaphragm therefore does not need to cover a comparatively large ring of the cross section of the observation beam path, as is the case, for example, with color-selective ring diaphragms, but only part of a circle sector.

Dabei muss sichergestellt sein, dass das zurücklaufende Anregungslicht die Segmentblende auch trifft. Als wesentliche Idee der Erfindung hierzu kann erachtet werden, dass die relative Orientierung zwischen dem Anregungslicht und der Segmentblende eingestellt werden kann. Entscheidend ist hierbei die Orientierung in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse, also der Azimutwinkel bezüglich der Objektivachse zwischen dem Anregungslicht und der Segmentblende. Das zurücklaufende Anregungslicht trifft genau dann auf die Segmentblende, wenn das auf die Probe zulaufende Anregungslicht in einer Azimutalwinkeldifferenz von 180° zu der Segmentblende ausgerichtet ist.It must be ensured that the returning excitation light also hits the segment aperture. It can be regarded as an essential idea of the invention that the relative orientation between the excitation light and the segment diaphragm can be set. The decisive factor here is the orientation in a plane perpendicular to the lens axis, ie the azimuth angle with respect to the lens axis between the excitation light and the segment aperture. The returning excitation light strikes the segment aperture precisely when the excitation light approaching the sample is aligned in an azimuthal angle difference of 180 ° to the segment aperture.

Dieser Versatz zwischen dem auf die Probe zulaufenden Anregungslicht und der Segmentblende kann durch die Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel angegeben werden. Der erste Azimutalwinkel gibt die Orientierung des Anregungslichts in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse an. Da bei der TIRF-Mikroskopie das Anregungslicht nicht windschief zur Objektivachse auf das Objektiv geleitet wird, kann der erste Azimutalwinkel an einer beliebigen Stelle entlang der Objektivachse bestimmt werden. Indem die Winkeldifferenz zwischen dem ersten und zweiten Azimutalwinkel einstellbar ist, wird vorteilhafterweise sichergestellt, dass das zurücklaufende Anregungslicht immer von der Segmentblende blockiert werden kann.This offset between the excitation light approaching the sample and the segment diaphragm can be specified by the angle difference between the first and the second azimuthal angle. The first azimuthal angle indicates the orientation of the excitation light in a plane perpendicular to the lens axis. Since in TIRF microscopy the excitation light is not directed skew to the lens axis on the lens, the first azimuth angle can be determined at any point along the lens axis. The fact that the angle difference between the first and second azimuthal angles can be set advantageously ensures that the returning excitation light can always be blocked by the segment diaphragm.

Die Einstellbarkeit der Winkeldifferenz ist auch deshalb von Bedeutung, weil es nur unter hohem Aufwand möglich ist, Objektive und deren Aufnahmen in Objektivrevolvern so zu fertigen, dass ein Objektiv beim Einbau in den Objektivrevolver eine vordefinierte Drehstellung besitzt. Unter Einstellbarkeit soll deshalb ein Verändern während oder vor dem Betrieb des Mikroskops verstanden werden, insbesondere durch einen Benutzer. Hierzu sind mechanische Mittel vorhanden, die insbesondere von einem Benutzer manuell und/oder über eine motorisierte Steuereinrichtung bedient werden können.The adjustability of the angle difference is also important because it is only possible with great effort to manufacture lenses and their exposures in nosepiece so that a lens has a predefined rotational position when installed in the nosepiece. Under adjustability is therefore a change during or before the operation of the microscope can be understood, in particular by a user. For this purpose, mechanical means are available, which can be operated manually and / or by a motorized control device, in particular by a user.

Schließlich erlaubt es die Einstellbarkeit der Winkeldifferenz auch, dass das zurücklaufende Anregungslicht zu Justierzwecken hindurchgelassen werden kann und eine Nachweiseinrichtung erreicht. Dies ist hingegen nicht in einfacher Weise bei den bekannten TIRF-Mikroskopen möglich, bei denen beispielsweise in einem Modul eine Segmentblende feststehend zu einem Prisma zum Einkoppeln des Anregungslichts montiert ist, oder eine ringförmige farbselektive Blende vorhanden ist.Finally, the adjustability of the angle difference also allows the returning excitation light to be let through for adjustment purposes and to reach a detection device. However, this is not possible in a simple manner in the known TIRF microscopes, in which, for example, a segment diaphragm is fixed in a module to form a prism for coupling the excitation light, or an annular, color-selective diaphragm is present.

Insbesondere kann erfindungsgemäß die Segmentblende das zurücklaufende Anregungslicht durch Absorption blockieren. Gegenüber farbselektiven Blenden oder Prismen zum Abführen des zurücklaufenden Anregungslichts wird dann im Normalbetrieb vorteilhafterweise bewirkt, dass praktisch gar kein zurücklaufendes Anregungslicht die Nachweiseinrichtung trifft. Zudem wird wellenlängenunabhängig ein Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts erreicht.In particular, according to the invention, the segment diaphragm can block the returning excitation light by absorption. Compared to color-selective diaphragms or prisms for removing the returning excitation light, it is then advantageously achieved in normal operation that practically no returning excitation light hits the detection device. In addition, the returning excitation light is blocked regardless of the wavelength.

Da gemäß der Erfindung die azimutale Winkeldifferenz, also die relative Drehposition, zwischen der Segmentblende und dem Anregungslicht frei eingestellt werden kann, können die Segmentblende und die Mittel zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv unabhängig voneinander gebildet sein. Somit können die Mittel zum Leiten des Anregungslichts außerhalb des Objektivs angeordnet sein, wobei das auf die Probe zulaufende Anregungslicht alle Linsen des Objektivs durchläuft. Vorteilhafterweise wird so der Herstellungsaufwand des Objektivs vergleichsweise gering gehalten.Since, according to the invention, the azimuthal angle difference, that is to say the relative rotational position, between the segment diaphragm and the excitation light can be set freely, the segment diaphragm and the means for directing the excitation light onto the objective can be formed independently of one another. Thus, the means for guiding the excitation light can be arranged outside the objective, the excitation light approaching the sample passing through all lenses of the objective. Advantageously, the manufacturing effort for the lens is kept comparatively low.

Ein wesentlicher Gedanke des erfindungsgemäßen Objektivs kann darin gesehen werden, dass die Segmentblende drehbar zu einem feststehenden Objektivteil und somit im eingebauten Zustand auch drehbar zu dem Anregungslicht ist. Dadurch kann bewerkstelligt werden, dass die Segmentblende immer von dem zurücklaufenden Anregungslicht getroffen wird. Vorteilhafterweise sind dazu keine aufwendigeren Einrichtungen am Mikroskop zum Lenken des Anregungslichts auf das Objektiv notwendig.An essential idea of the objective according to the invention can be seen in the fact that the segment diaphragm can be rotated to a fixed objective part and thus also rotatable to the excitation light in the installed state. This allows the segment aperture to always be hit by the returning excitation light. Advantageously, no more complex devices on the microscope for directing the excitation light onto the objective are necessary.

Bei einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel die Segmentblende relativ zu einem feststehenden Teil des Objektivs drehbar. Hierbei wird also die Winkeldifferenz durch eine Veränderung des zweiten Azimutalwinkels eingestellt. Somit ist nicht erforderlich, dass auch der erste Azimutalwinkel einstellbar ist. Vorteilhafterweise können somit die Mittel zum Leiten des Anregungslichts vergleichsweise einfach, beispielsweise durch einen TIRF-Schieber, ausgeführt sein. Der feststehende Teil des Objektivs kann das Gewinde, mit dem das Objektiv im Mikroskop befestigt wird, umfassen. Bevorzugt ist der feststehende Teil des Objektivs eine Außenhülse. Vorzugsweise ist die Segmentblende mit einem drehbaren Teil des Objektivs, wie zum Beispiel einer Innenhülse, verbunden, der von einem Benutzer manuell oder über eine motorisierte Steuereinrichtung gedreht werden kann. In a preferred embodiment of the microscope according to the invention, the segment diaphragm can be rotated relative to a fixed part of the objective in order to set the angle difference between the first and the second azimuthal angle. Here, the angle difference is set by changing the second azimuthal angle. It is therefore not necessary that the first azimuth angle can also be set. Advantageously, the means for guiding the excitation light can thus be comparatively simple, for example by means of a TIRF slide. The fixed part of the objective can encompass the thread with which the objective is attached in the microscope. The fixed part of the objective is preferably an outer sleeve. The segment diaphragm is preferably connected to a rotatable part of the objective, such as an inner sleeve, which can be rotated by a user manually or via a motorized control device.

Alternativ oder zusätzlich kann bei einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops aber auch vorgesehen sein, dass zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel der erste Azimutalwinkel mit den Mitteln zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv veränderbar ist. Hier ist also das Anregungslicht frei in der Objektivpupille einstellbar. Somit kann hier die Segmentblende feststehend zum Rest des Objektivs ausgeführt sein.As an alternative or in addition, in a further variant of the microscope according to the invention it can also be provided that the first azimuth angle can be changed with the means for directing the excitation light onto the objective in order to set the angle difference between the first and the second azimuth angle. Here, the excitation light can be freely adjusted in the objective pupil. Thus, the segment diaphragm can be designed to be fixed to the rest of the lens.

Bei einer vorteilhaften Alternative des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs ist die Segmentblende zwischen einer Objektivpupille und einer der Probe zugewandten Frontlinse angeordnet. Dadurch wird vom zurücklaufenden Anregungslicht nur eine geringe Anzahl optischer Elemente durchlaufen, an denen es durch parasitäre Fluoreszenzanregung zu Falschlicht kommen kann. Zudem wird das Risiko verringert, dass das zurücklaufende Licht an einem optischen Element teilweise zurückgeworfen wird und in der Probe erneut eine Fluoreszenzanregung bewirkt.In an advantageous alternative of the microscope according to the invention or the objective according to the invention, the segment diaphragm is arranged between an objective pupil and a front lens facing the sample. As a result, the returning excitation light passes through only a small number of optical elements, on which false light can occur due to parasitic fluorescence excitation. In addition, the risk is reduced that the returning light is partially reflected on an optical element and again causes fluorescence excitation in the sample.

Besonders bevorzugt ist bei einer Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs die Segmentblende in einem für das von der Probe emittierte Licht divergenten Teil des Beobachtungsstrahlengangs angeordnet. Das heißt, die Segmentblende ist nahe an der Frontlinse, oder zumindest näher an der Frontlinse als an der Objektivpupille, angeordnet. Hierbei kann auch vorgesehen sein, dass die Segmentblende benachbart zu einer der drei zur Probe nächsten Linsen des Objektivs angeordnet ist. Das zurücklaufende Anregungslicht wird also besonders früh blockiert, wodurch das Entstehen von parasitärem Falschlicht an Linsen oder an einem Kitt an einer Linse weitestgehend vermieden wird. Zudem wird das Risiko einer Rückreflexion des zurücklaufenden Anregungslichts hin zur Probe verringert.In an embodiment of the microscope according to the invention or the objective according to the invention, the segment diaphragm is particularly preferably arranged in a part of the observation beam path which is divergent for the light emitted by the sample. This means that the segment diaphragm is arranged close to the front lens, or at least closer to the front lens than to the objective pupil. It can also be provided here that the segment diaphragm is arranged adjacent to one of the three lenses of the objective closest to the sample. The returning excitation light is thus blocked particularly early, as a result of which parasitic false light on lenses or on a putty on a lens is largely avoided. In addition, the risk of back reflection of the returning excitation light towards the sample is reduced.

Bei einer ebenfalls bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs weist das Objektiv mehrere Linsen auf und die Segmentblende ist benachbart zu einer Linse angeordnet, die sich direkt benachbart zur Objektivpupille befindet. Dabei soll die Eigenschaft „benachbart“ verstanden werden als „in Richtung der Objektivachse“ benachbart. In der Ebene der Objektivpupille ist das Anregungslicht fokussiert, damit es als paralleles Strahlenbündel auf die Probe trifft. Daher ist in der Nähe der Objektivpupille die Querschnittsfläche des Anregungslichts relativ klein. Vorteilhafterweise kann die Segmentblende hier besonders klein ausgeführt sein, wodurch sie nur wenig von der Probe emittiertes Licht blockiert. Da der Probenort und die Objektivpupille zueinander Fourier-konjugiert sind, wird bei einer Positionierung der Segmentblende in der Nähe der Objektivpupille das Sichtfeld des Mikroskops vorteilhafterweise weniger verringert.In a likewise preferred embodiment of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, the objective has a plurality of lenses and the segment diaphragm is arranged adjacent to a lens which is located directly is located adjacent to the objective pupil. The property “adjacent” should be understood as “adjacent in the direction of the lens axis”. The excitation light is focused in the plane of the objective pupil so that it hits the sample as a parallel beam. Therefore, the cross-sectional area of the excitation light is relatively small in the vicinity of the objective pupil. Advantageously, the segment diaphragm can be made particularly small here, as a result of which it blocks only a little light emitted by the sample. Since the sample location and the objective pupil are Fourier-conjugated to one another, the field of view of the microscope is advantageously reduced less when the segment diaphragm is positioned in the vicinity of the objective pupil.

Erfindungsgemäß weist die Segmentblende einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase auf. Dabei wird das zurücklaufende Anregungslicht von der Nase blockiert, während der Ring bevorzugt außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs liegt. Unter Beobachtungsstrahlengang soll der Strahlengang des von der Probe emittierten Lichts verstanden werden.According to the invention, the segment diaphragm has a ring with an inwardly directed nose. The returning excitation light is blocked by the nose, while the ring is preferably outside the observation beam path. The observation beam path is to be understood as the beam path of the light emitted by the sample.

Bevorzugt ist eine Ausdehnung der Nase nach innen gerade so groß, dass das zurücklaufende Anregungslicht blockiert werden kann.An inward extension of the nose is preferably just large enough that the returning excitation light can be blocked.

Zweckmäßigerweise ist bei einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs an einer Außenseite des Objektivs eine Markierung vorhanden, die den zweiten Azimutalwinkel anzeigt. Somit kann ein Benutzer in einfacher Weise die richtige Orientierung der Segmentblende, in der diese das zurücklaufende Anregungslicht blockiert, einstellen. Dabei ist die Markierung vorzugsweise an dem drehbaren Teil oder an einem Angriffsstück, mit dem der drehbare Teil gedreht werden kann, angebracht. Es ist außerdem bevorzugt, dass bei mehreren Segmentblenden für jede Segmentblende eine Markierung vorhanden ist.In an advantageous variant of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, a marking is expediently present on an outside of the objective, which indicates the second azimuthal angle. Thus, a user can easily set the correct orientation of the segment aperture in which it blocks the returning excitation light. The marking is preferably attached to the rotatable part or to an engagement piece with which the rotatable part can be rotated. It is also preferred that there is a marking for each segment aperture when there are several segment apertures.

Bei einer weiteren Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops weist die Nachweiseinrichtung einen Kamerasensor mit einem rechteckigen Sehfeld zum Messen des von der Probe emittierten Lichts auf und die Segmentblende ist benachbart zu einer Seite des Sehfelds, insbesondere zu einer langen Seite des Sehfelds, angeordnet. Vorteilhafterweise kann sich somit die Segmentblende in einem Bereich befinden, der vom Kamerasensor nicht erfasst wird. In diesem Fall reduziert die Segmentblende nicht die Intensität des von der Probe emittierten und auf den Kamerasensor fallenden Lichts. Hier ist die Segmentblende also gerade nicht benachbart zu einer Ecke des Sehfelds des Kamerasensors angeordnet.In a further embodiment variant of the microscope according to the invention, the detection device has a camera sensor with a rectangular field of view for measuring the light emitted by the sample, and the segment diaphragm is arranged adjacent to one side of the field of view, in particular to a long side of the field of view. The segment diaphragm can thus advantageously be located in an area that is not detected by the camera sensor. In this case, the segment aperture does not reduce the intensity of the light emitted by the sample and falling on the camera sensor. Here, the segment diaphragm is therefore not arranged adjacent to a corner of the field of view of the camera sensor.

Bei einem vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs sind mehrere, insbesondere zwei, Segmentblenden vorhanden, die in verschiedenen Positionen entlang der Objektivachse und in verschiedenen zweiten Azimutalwinkeln bezüglich der Objektivachse angeordnet sind. Die Segmentblenden liegen also in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse versetzt zueinander, so dass ausgewählt werden kann, welche Segmentblende das zurücklaufende Anregungslicht blockiert.In an advantageous embodiment of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, several, in particular two, segment diaphragms are provided, which are arranged in different positions along the objective axis and in different second azimuthal angles with respect to the objective axis. The segment diaphragms are thus offset from one another in a plane perpendicular to the lens axis, so that it can be selected which segment diaphragm blocks the returning excitation light.

Sind mehrere Segmentblenden vorhanden, sind diese bevorzugt gemeinsam und relativ zu einem feststehenden Teil des Objektivs drehbar. Somit kann in besonders einfacher Weise die gewünschte Segmentblende ausgewählt werden. Dabei kann eine der Segmentblenden im Bereich der Objektivpupille und eine andere der Segmentblenden nahe zur Frontlinse des Objektivs angeordnet sein.If there are several segment diaphragms, these are preferably rotatable together and relative to a fixed part of the objective. The desired segment aperture can thus be selected in a particularly simple manner. One of the segment diaphragms can be arranged in the region of the objective pupil and another of the segment diaphragms can be arranged close to the front lens of the objective.

Ein besonders hoher Benutzerkomfort wird erreicht, wenn ein Motor zum Drehen der Segmentblenden vorhanden ist. Hierbei kann vorgesehen sein, dass der Motor die Segmentblende automatisch in eine Position bewegen kann, in der das zurücklaufende Licht blockiert wird.A particularly high level of user comfort is achieved if there is a motor for rotating the segment diaphragms. It can be provided here that the motor can automatically move the segment diaphragm into a position in which the returning light is blocked.

In einer weiteren Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs ist die Segmentblende als eine Beschichtung der Linse des Objektivs oder einer im Objektiv angeordneten Glasplatte ausgebildet.In a further embodiment variant of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, the segment diaphragm is designed as a coating of the lens of the objective or of a glass plate arranged in the objective.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben. Hierin zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Objektivs;
3 eine schematische Darstellung eines Sichtfelds eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Segmentblende;
5 eine Schrägansicht des Ausführungsbeispiels der Segmentblende;
6 eine schematische Darstellung von zwei Segmentblenden; und
7 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Objektivs.

Further advantages and features of the invention are described below with reference to the attached schematic figures. Show here:

1 a schematic representation of an embodiment of a microscope according to the invention;
2nd a schematic representation of a first embodiment of an objective according to the invention;
3rd a schematic representation of a field of view of a microscope according to the invention;
4th a schematic representation of an embodiment of a segment diaphragm;
5 an oblique view of the embodiment of the segment diaphragm;
6 a schematic representation of two segment diaphragms; and
7 is a schematic representation of a second embodiment of an objective according to the invention.

Äquivalente Komponenten sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet. Equivalent components are identified with the same reference symbols in all figures.

1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 100 und eines erfindungsgemäßen Objektivs 1 zur Verwendung für die TIRF-Mikroskopie. 1 shows an embodiment of a microscope according to the invention 100 and an objective according to the invention 1 for use in TIRF microscopy.

Hierbei wird Anregungslicht 7 auf eine Probe 10 geleitet und dort total reflektiert. Dabei wird die Probe 10 angeregt und emittiert Licht, welches von dem Objektiv 1 zu einer Nachweiseinrichtung 16 weitergeleitet wird.This is excitation light 7 on a trial 10th directed and totally reflected there. Doing the sample 10th stimulates and emits light from the lens 1 to a verification facility 16 is forwarded.

Als Anregungslicht 7 wird in der Regel Laserlicht verwendet. Dabei können ein oder mehrere Lichtquellen zum Erzeugen von Anregungslicht 7 mit unterschiedlichen Wellenlängen vorhanden sein, wobei diese Lichtquellen im Mikroskop 100 einen gemeinsamen Strahlengang aufweisen.As an excitation light 7 laser light is usually used. One or more light sources can be used to generate excitation light 7 be available with different wavelengths, these light sources in the microscope 100 have a common beam path.

Das Mikroskop 100 weist Mittel 15 zum Leiten des Anregungslichts 7 auf das Objektiv 1 auf. Dabei leiten die Mittel 15 das Anregungslicht 7 in einem ersten Azimutalwinkel 38 bezüglich der Objektivachse 4 in das Objektiv 1. Bei einer einfachen Ausführung können die Mittel 15 ein TIRF-Schieber sein, mit dem der Abstand zur Objektivachse 4 einstellbar ist, mit dem das Anregungslicht 7 auf die Eintrittspupille des Objektivs 1 trifft. Dadurch kann der Winkel eingestellt werden, unter dem das Anregungslicht 7 auf die Probe 10 trifft. Oberhalb des Grenzwinkels für die Totalreflexion kann die Eindringtiefe des Anregungslichts 7 in die Probe 10 variiert werden. Bei solch einem TIRF-Schieber ist also der erste Azimutalwinkel 38 des Anregungslichts 7 bezüglich der Objektivachse 4 nicht veränderbar. In dem dargestellten Beispiel kann aber mit den Mitteln 15 das Anregungslicht frei in der Objektivpupille eingestellt werden. Es kann also der erste Azimutalwinkel 38 eingestellt werden.The microscope 100 shows means 15 for guiding the excitation light 7 on the lens 1 on. The funds guide it 15 the excitation light 7 at a first azimuth angle 38 with respect to the lens axis 4th into the lens 1 . In a simple execution, the means 15 be a TIRF slider with which the distance to the lens axis 4th is adjustable with which the excitation light 7 on the entrance pupil of the lens 1 meets. This allows the angle to be set at which the excitation light 7 put to the test 10th meets. The penetration depth of the excitation light can be above the critical angle for total reflection 7 in the rehearsal 10th can be varied. With such a TIRF slider, the first azimuthal angle is 38 of the excitation light 7 with respect to the lens axis 4th unchangeable. In the example shown, however, with the means 15 the excitation light can be freely set in the objective pupil. So it can be the first azimuth angle 38 can be set.

Das Anregungslicht 7 wird durch das Objektiv 1 auf die Probe 10 geleitet. Dabei durchläuft es ein Deckglas 14 und wird an der Grenzfläche 17 von der Probe 10 und dem Deckglas 14 total reflektiert. Der hierbei vorliegende Winkel zwischen dem Anregungslicht 7 und der Probe 10 wird durch den Polarwinkel zur Objektivachse 4 bestimmt, unter dem das auf die Probe zulaufende Anregungslicht 7 auf das Objektiv 1 trifft.The excitation light 7 is through the lens 1 put to the test 10th headed. It runs through a cover slip 14 and becomes at the interface 17th from the sample 10th and the coverslip 14 totally reflected. The angle between the excitation light 7 and the sample 10th becomes the lens axis by the polar angle 4th determined under which the excitation light arriving at the sample 7 on the lens 1 meets.

Das an der Grenzfläche 17 total reflektierte Anregungslicht 7 gelangt als zurücklaufendes Anregungslicht 11 wieder in das Objektiv 1. Gemäß der Erfindung wird dabei das zurücklaufende Anregungslicht 11 in dem Objektiv 1 absorbiert, so dass es dieses nicht vollständig durchläuft. Das von der Probe 10 emittierte Licht wird hingegen von dem Objektiv 1 in Richtung einer Nachweiseinrichtung 16 weitergeleitet. Die Nachweiseinrichtung 16 misst das emittierte Licht, so dass ein Bild der Probe erzeugt werden kann.That at the interface 17th totally reflected excitation light 7 arrives as a returning excitation light 11 back into the lens 1 . According to the invention, the returning excitation light 11 in the lens 1 absorbed so that it does not go through this completely. That from the rehearsal 10th emitted light, however, is from the lens 1 towards a detection facility 16 forwarded. The detection facility 16 measures the emitted light so that an image of the sample can be generated.

Der Verlauf des Anregungslichts 7 im Objektiv 1 ist in 2 dargestellt.The course of the excitation light 7 in the lens 1 is in 2nd shown.

Hierbei durchläuft das Anregungslicht 7 die Linsen des Objektivs 1 in einem äußeren Bereich und wird auf eine Probe 10 geleitet. Nach der Totalreflexion an der Probe 10 tritt das zurücklaufende Anregungslicht 11 wieder in das Objektiv 1 ein und durchläuft die Linsen diesmal auf der gegenüberliegenden Seite. Das auf die Probe zulaufende Anregungslicht 7 und das zurücklaufende Anregungslicht 11 stehen also bezüglich der Objektivachse 4 in einem Azimutalwinkel von 180° zueinander.The excitation light passes through here 7 the lenses of the lens 1 in an outer area and is put to a test 10th headed. After total reflection on the sample 10th the returning excitation light occurs 11 back into the lens 1 and passes through the lenses this time on the opposite side. The excitation light approaching the sample 7 and the returning excitation light 11 stand with respect to the lens axis 4th at an azimuthal angle of 180 ° to each other.

Da durch das Anregungslicht 7, 11 Falschlicht erzeugt werden kann, ist es vorteilhaft, wenn das Anregungslicht 7, 11 so wenig Linsen wie nötig durchläuft. Deshalb ist bei dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel eine Segmentblende 31 nah an der der Probe 10 zugewandten Frontlinse des Objektivs 1 angeordnet, nämlich benachbart zur dritten Linse von der Frontlinse aus gesehen.Because through the excitation light 7 , 11 False light can be generated, it is advantageous if the excitation light 7 , 11 passes through as few lenses as necessary. Therefore, in the embodiment shown here, there is a segment aperture 31 close to that of the sample 10th facing front lens of the lens 1 arranged, namely seen adjacent to the third lens from the front lens.

Eine weitere Segmentblende 32 ist benachbart zu derjenigen Linse, die im Bereich der Objektivpupille 9 liegt, angeordnet. Damit das Anregungslicht 7 bei der Reflexion an der Probe 10 einen möglichst parallelen Strahl aufweist, muss das Anregungslicht 7 in der Objektivpupille 9 fokussiert sein. Der Strahldurchmesser des einlaufenden Anregungslichts 7 sowie des zurücklaufenden Anregungslichts 11 ist also nahe der Objektivpupille 9 klein. Vorteilhafterweise kann deshalb die Segmentblende 32 kleiner ausgeführt sein als die Segmentblende 31.Another segment aperture 32 is adjacent to that lens in the area of the objective pupil 9 lies, arranged. So that the excitation light 7 when reflecting on the sample 10th If the beam is as parallel as possible, the excitation light must 7 in the lens pupil 9 be focused. The beam diameter of the incoming excitation light 7 as well as the returning excitation light 11 is close to the lens pupil 9 small. The segmental diaphragm can therefore advantageously be used 32 be made smaller than the segment aperture 31 .

Im dargestellten Beispiel befindet sich die Segmentblende 31 in einer Drehposition, das heißt in einem zweiten Azimutalwinkel, in welchem sie das zurücklaufende Anregungslicht 11 durchlässt. Die Segmentblende 32 hingegen befindet sich in einer Drehposition, in der sie das zurücklaufende Anregungslicht 11 blockiert.The segment aperture is in the example shown 31 in a rotational position, that is, in a second azimuthal angle, in which the returning excitation light 11 lets through. The segment aperture 32 on the other hand is in a rotational position in which it receives the returning excitation light 11 blocked.

Die Segmentblenden 31, 32 sind mit einem drehbaren Teil 2 des Objektivs 1 verbunden. Bei dem drehbaren Teil 2 handelt es sich hier um eine Innenhülse 2. Über ein Angriffsstück 6 ist der drehbare Teil 2 gegen einen feststehenden Teil 3 drehbar, so dass der zweite Azimutalwinkel der Segmentblenden 31, 32 eingestellt werden kann. Der feststehende Teil 3 ist hier eine Außenhülse 3. Um eine stabile Bauform zu erreichen, sind hier sämtliche Linsen des Objektivs 1 mit dem drehbaren Teil 2 verbunden.The segment panels 31 , 32 are with a rotating part 2nd of the lens 1 connected. The rotating part 2nd it is an inner sleeve 2nd . About an attack piece 6 is the rotatable part 2nd against a fixed part 3rd rotatable so that the second azimuthal angle of the segment apertures 31 , 32 can be adjusted. The fixed part 3rd here is an outer sleeve 3rd . In order to achieve a stable design, all lenses of the lens are here 1 with the rotatable part 2nd connected.

Die Größe der Segmentblende 31, 32 sollte zum sicheren Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts 11 größer als der Strahldurchmesser des zurücklaufenden Anregungslichts 11 sein. Gleichzeitig sollten die Segmentblenden 31, 32 möglichst klein sein, so dass sie möglichst wenig von der Probe emittiertes Licht blockieren.The size of the segment aperture 31 , 32 should safely block the returning excitation light 11 larger than the beam diameter of the returning excitation light 11 his. At the same time, the segment panels 31 , 32 be as small as possible so that they block as little light as possible emitted by the sample.

In 3 ist schematisch das Sichtfeld 21 eines erfindungsgemäßen Mikroskops 1 dargestellt. Hier wird durch die Segmentblende 31 ein Teil 23 des Sichtfelds 21 verdeckt oder abgeschattet. Dargestellt ist außerdem das Sichtfeld 22 eines Kamerasensors der Nachweiseinrichtung, welcher in der hochauflösenden PAL-Mikroskopie, Photo-Activated Localisation Microscopy, verwendet wird. Dieses Sichtfeld 22 des Kamerasensors ist rechteckig und kleiner als das Sichtfeld 21. Vorteilhafterweise befindet sich die Segmentblende beim Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts in einer Position, in der sie keine Auswirkungen auf das Sichtfeld 22 des Kamerasensors hat. Hierzu ist der durch die Segmentblende verdeckte Bereich 23 benachbart zu einer langen Seite des rechteckigen Bereichs 22 ausgerichtet.In 3rd is the field of vision 21 of a microscope according to the invention 1 shown. Here is through the segment aperture 31 a part 23 of the field of view 21 covered or shadowed. The field of vision is also shown 22 a camera sensor of the detection device, which is used in high-resolution PAL microscopy, photo-activated localization microscopy. This field of vision 22 the camera sensor is rectangular and smaller than the field of view 21 . When the returning excitation light is blocked, the segment diaphragm is advantageously in a position in which it has no effect on the field of vision 22 of the camera sensor. This is the area covered by the segment panel 23 adjacent to a long side of the rectangular area 22 aligned.

Ein erstes Ausführungsbeispiel einer Segmentblende 31, 32 eines erfindungsgemä-ßen Mikroskops oder eines erfindungsgemäßen Objektivs ist in den 4 und 5 dargestellt.A first embodiment of a segment aperture 31 , 32 of a microscope according to the invention or an objective according to the invention is shown in FIGS 4th and 5 shown.

Dabei umfasst die Segmentblende 31, 32 einen Ring sowie einen nach innen weisende Nase 33, 34. Während der Innenradius 37 des Rings derart dimensioniert ist, dass der Ring außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs des Mikroskops liegt, soll mit der Nase 33, 34 das zurücklaufende Anregungslicht blockiert werden. Die Nase 33, 34 misst eine Höhe 35, das heißt eine Ausdehnung zur Richtung des Ringmittelpunkts, eine Breite 36 senkrecht hierzu, sowie einen Winkel 40, der einen Kreissektor definiert. Prinzipiell kann die Nase 33, 34 aber eine beliebige Form innerhalb des Kreissektors, zum Beispiel ein N-Eck oder eine halbkreisartige Form, aufweisen.The segment aperture includes 31 , 32 a ring and an inward-facing nose 33 , 34 . During the inner radius 37 of the ring is dimensioned such that the ring lies outside the observation beam path of the microscope, should be with the nose 33 , 34 the returning excitation light can be blocked. The nose 33 , 34 measures a height 35 , that is an extension to the direction of the ring center, a width 36 perpendicular to it, as well as an angle 40 that defines a circular sector. In principle, the nose 33 , 34 but have any shape within the circle sector, for example an N-corner or a semicircular shape.

Eine Segmentblende 31 in der Nähe der Frontlinse kann kleiner ausgeführt sein als eine Segmentblende 32 in der Nähe der Objektivpupille. Bei einem hochaperturigen TIRF-Objektiv beträgt die Höhe 35 typischerweise etwa 3 mm bei einer Anordnung in der Nähe der Frontlinse und etwa 2 mm im Bereich der Objektivpupille. Damit sind die Höhen 35 nur geringfügig größer als die Ausdehnung des zurücklaufenden Anregungslichts. Der Winkel 40 der Segmentblenden 31, 32 beträgt typischerweise ca. 20°. Dieser Winkel ist groß genug, so dass die Segmentblenden 31, 32 leicht in die richtige Position zum Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts gebracht werden können.A segment aperture 31 near the front lens can be made smaller than a segment aperture 32 near the lens pupil. With a high aperture TIRF lens, the height is 35 typically about 3 mm for an arrangement near the front lens and about 2 mm in the area of the objective pupil. So that is the heights 35 only slightly larger than the extension of the returning excitation light. The angle 40 the segment diaphragms 31 , 32 is typically about 20 °. This angle is large enough so that the segment diaphragms 31 , 32 can easily be brought into the correct position to block the returning excitation light.

In 6 sind zwei Segmentblenden 31, 32 eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops oder eines erfindungsgemäßen Objektivs dargestellt. Der Aufbau der Segmentblenden 31, 32 gleicht jeweils dem mit Bezug auf die 4 und 5 beschriebenen Aufbau der Segmentblende 31, 32.In 6 are two segment apertures 31 , 32 an embodiment of a microscope according to the invention or an objective according to the invention. The structure of the segment panels 31 , 32 is the same with respect to the 4th and 5 described structure of the segment aperture 31 , 32 .

In 6 zeigt auch die Querschnittsfläche des auf die Probe zulaufenden Anregungslichts 7. Das zurücklaufende Anregungslicht 11 durchläuft das Objektiv 1 gegenüberliegend zu dem auf die Probe 10 zulaufenden Anregungslicht 7. Das heißt, das auf die Probe zulaufende Anregungslicht 7 und das zurücklaufende Anregungslicht 11 verlaufen relativ zueinander in einem Azimutalwinkel von 180° bezüglich der Objektivachse 4. Damit eine Segmentblende 31, 32 das zurücklaufende Anregungslicht 11 blockiert, muss diese ebenfalls derart ausgerichtet sein, nämlich relativ zu dem auf die Probe zulaufenden Anregungslicht 7 in einem Azimutwinkel von 180° bezüglich der Objektivachse 4. Mit anderen Worten soll die Winkeldifferenz zwischen dem ersten Azimutalwinkel 38 und dem zweiten Azimutalwinkel 39 gerade 180° betragen. Dabei werden der erste und zweite Azimutalwinkel 38, 39 ab einer beliebigen, aber gemeinsamen Stelle gemessen. Der zweite Azimutalwinkel 39 wird bis zu demjenigen Bereich der Segmentblenden 31, 32 gemessen, der das zurücklaufende Anregungslicht 11 blockiert, im dargestellten Fall also bis zum Mittelpunkt der Nasen 33, 34.In 6 also shows the cross-sectional area of the excitation light approaching the sample 7 . The returning excitation light 11 passes through the lens 1 opposite to that to the test 10th incoming excitation light 7 . That is, the excitation light approaching the sample 7 and the returning excitation light 11 run relative to each other at an azimuthal angle of 180 ° with respect to the lens axis 4th . So that a segment aperture 31 , 32 the returning excitation light 11 blocked, it must also be oriented in this way, namely relative to the excitation light approaching the sample 7 at an azimuth angle of 180 ° with respect to the lens axis 4th . In other words, the angle difference between the first azimuthal angle 38 and the second azimuth angle 39 be just 180 °. The first and second azimuthal angles 38 , 39 measured from any, but common place. The second azimuth angle 39 is up to that area of the segment diaphragms 31 , 32 measured, the returning excitation light 11 blocked, in the case shown up to the center of the noses 33 , 34 .

Die Segmentblenden 31, 32 sind in verschiedenen zweiten Azimutalwinkeln 39 ausgerichtet, so dass eingestellt werden kann, welche der beiden Segmentblenden 31, 32 das zurücklaufende Anregungslicht blockieren soll. Zur einfacheren Bedienung sind dabei die Segmentblenden 31 und 32 in einem unveränderbaren Azimutalwinkel zueinander angeordnet.The segment panels 31 , 32 are in different second azimuthal angles 39 aligned so that it can be set which of the two segment diaphragms 31 , 32 block the returning excitation light. The segment panels are for easier operation 31 and 32 arranged at an unchangeable azimuthal angle to each other.

Indem die beiden Segmentblenden 31, 32 direkt benachbarte Bereiche des Beobachtungsstrahlengangs verdecken, kann auch bei mehreren Segmentblenden erreicht werden, dass das Sichtfeld 22 eines Kamerasensors nicht verdeckt wird.By the two segment diaphragms 31 , 32 directly adjacent areas of the observation beam path can be achieved even with several segment diaphragms that the field of vision 22 of a camera sensor is not covered.

Um die Drehposition der Segmentblenden 31, 32 einzustellen, kann ein Motor vorhanden sein. Ein derartiges erfindungsgemäßes Objektiv 1 mit einem Motor 41 ist in 7 dargestellt. Dabei ist der Motor 41 an einem feststehenden Teil 3 des Objektivs 1 angebracht. Der Motor 41 ist über eine Koppelvorrichtung 42 mit dem Angriffsstück 6 verbunden, welches wiederum mit einem drehbaren Teil 2 des Objektivs verbunden ist. Indem die Segmentblenden 31, 32 ebenfalls mit dem drehbaren Teil 2 gekoppelt oder verbunden sind, können diese durch den Motor 41 gedreht werden. Die Koppelvorrichtung 42 kann ein Zahnrad oder einen Riemen aufweisen.The rotational position of the segment diaphragms 31 , 32 a motor may be present. Such a lens according to the invention 1 with an engine 41 is in 7 shown. Here is the engine 41 on a fixed part 3rd of the lens 1 appropriate. The motor 41 is via a coupling device 42 with the attack piece 6 connected, which in turn with a rotatable part 2nd of the lens is connected. By the segment apertures 31 , 32 also with the rotating part 2nd coupled or connected, this can be done by the motor 41 to be turned around. The coupling device 42 can have a gear or a belt.

Mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Mikroskop und dem erfindungsgemäßen Objektiv wird das bei der TIRF-Mikroskopie zurücklaufende Anregungslicht derart blockiert, dass durch das zurücklaufende Anregungslicht besonders wenig Falschlicht entsteht und dass möglichst wenig von der Probe emittiertes Licht blockiert wird. So wird eine besonders hohe Bildqualität ermöglicht.With the microscope according to the invention and the objective according to the invention described above, the excitation light returning in TIRF microscopy is blocked in such a way that the returning excitation light produces particularly little false light and that as little light as possible emitted by the sample is blocked. This enables a particularly high image quality.

Claims

Microscope, in particular for TIRF microscopy, with an objective (1) for guiding excitation light (7) into a surface area of a sample (10) to be examined and for guiding light emitted from the surface area of the sample (10), in particular fluorescent light, back towards a detection device (16), with means (15) for directing the excitation light (7) onto the objective (1) at a first azimuthal angle (38) with respect to the objective axis (4) and with at least one segment aperture (31, 32) for blocking excitation light (11) returning from the sample (10), in particular reflected, which covers at least part of a circular sector of a cross section of an observation beam path of the objective (1) and aligned at a second azimuth angle (39) with respect to the objective axis (4) The segment diaphragm (31, 32) is integrated in the objective (1) and an angle difference between the first and the second azimuthal angle (38, 39) is adjustable, characterized in that the segment diaphragm (31, 32) has a ring with an inwardly directed nose (33, 34).

Microscope after Claim 1 , characterized in that the segment diaphragm (31, 32) can be rotated relative to a fixed part (3) of the objective (1) in order to set the angle difference between the first and the second azimuthal angle (38, 39).

Microscope after Claim 1 or 2nd , characterized in that to set the angle difference between the first and the second azimuthal angle (38, 39) the first azimuthal angle (38) can be changed by means (15) for directing the excitation light (7) onto the objective (1).

Microscope according to one of the Claims 1 to 3rd , characterized in that the segment diaphragm (31, 32) is arranged between an objective pupil (9) and a front lens facing the sample (10).

Microscope according to one of the Claims 1 to 4th , characterized in that the segment diaphragm (31, 32) is arranged in a part of the observation beam path in which the light emitted by the sample (10) is divergent.

Microscope according to one of the Claims 1 to 5 , characterized in that the objective (1) has a plurality of lenses and that the segment diaphragm (31, 32) is arranged adjacent to a lens which is directly adjacent to the objective pupil (9).

Microscope according to one of the Claims 1 to 6 , characterized in that an extension (35) of the nose (33, 34) towards the inside is just large enough that the returning excitation light (11) can be blocked.

Microscope according to one of the Claims 1 to 7 , characterized in that there is a marking on an outside of the objective (1) which indicates the second azimuthal angle (39).

Microscope according to one of the Claims 1 to 8th , characterized in that the detection device (16) has a camera sensor with a rectangular field of view (22) for measuring the light emitted by the sample and that the segment diaphragm (31, 32) is adjacent to one side of the field of view (22), in particular to one long side of the field of view (22) is arranged.

Microscope according to one of the Claims 1 to 9 , characterized in that several, in particular two, segment diaphragms (31, 32) are provided, which are arranged in different positions along the objective axis (4) and in different second azimuthal angles with respect to the objective axis (4).

Microscope according to one of the Claims 1 to 10th , characterized in that the segment diaphragms (31, 32) can be rotated together and relative to a fixed part (3) of the objective (1).

Microscope according to one of the Claims 1 to 11 , characterized in that a motor (41) for rotating the segment diaphragm (31, 32) is present.

Microscope according to one of the Claims 1 to 12th , characterized in that the segment diaphragm (31, 32) is designed as a coating of a lens of the objective (1) or a glass plate arranged in the objective (1).

Objective for use in a TIRF microscope (100) with a fixed part (3) which is fixed when installed in a TIRF microscope, with at least one segment aperture (31, 32) for blocking a sample (10) returning, in particular reflected, excitation light (11), the segment diaphragm (31, 32) covering at least part of a circular sector of a cross-sectional area of an observation beam path, with a rotatable part (2), which in the state installed in a TIRF microscope (100) is rotatable, the segment diaphragm (31, 32) being mechanically coupled, in particular connected, to the rotatable part (2), characterized in that the segment diaphragm (31, 32) is a ring with an inwardly directed nose (33, 34) having.