DE102010034122B4 - Microscope and lens, especially for TIRF microscopy - Google Patents
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Abstract
Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie,mit einem Objektiv (1) zum Leiten von Anregungslicht (7) in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe (10) und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe (10) emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung (16),mit Mitteln (15) zum Leiten des Anregungslichts (7) auf das Objektiv (1) in einem ersten Azimutalwinkel (38) bezüglich der Objektivachse (4) und mit mindestens einer Segmentblende (31, 32) zum Blockieren von von der Probe (10) zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht (11), die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs (1) abdeckt und in einem zweiten Azimutalwinkel (39) bezüglich der Objektivachse (4) ausgerichtet ist,wobei die Segmentblende (31, 32) im Objektiv (1) integriert ist undwobei eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel (38, 39) einstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase (33, 34) aufweist.Microscope, in particular for TIRF microscopy, with an objective (1) for guiding excitation light (7) into a surface area of a sample (10) to be examined and for guiding light emitted from the surface area of the sample (10), in particular fluorescent light, back towards a detection device (16), with means (15) for directing the excitation light (7) onto the objective (1) at a first azimuthal angle (38) with respect to the objective axis (4) and with at least one segment aperture (31, 32) for blocking excitation light (11) returning from the sample (10), in particular reflected, which covers at least part of a circular sector of a cross section of an observation beam path of the objective (1) and aligned at a second azimuth angle (39) with respect to the objective axis (4) , the segment aperture (31, 32) being integrated in the objective (1) and an angle difference between the first and the second azimuthal angle (38, 39) being one can be set, characterized in that the segment diaphragm (31, 32) has a ring with an inwardly directed nose (33, 34).
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf ein Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.In a first aspect, the present invention relates to a microscope, in particular for TIRF microscopy, according to the preamble of
In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 14.In a second aspect, the invention relates to an objective for use in a TIRF microscope according to the preamble of claim 14.
In der TIRF-Mikroskopie, das heißt in der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie, wird Anregungslicht auf eine zu untersuchende Probe geleitet und dort total reflektiert. Hierdurch wird die Probe in einem Oberflächenbereich angeregt und emittiert Licht, insbesondere Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht. Das emittierte Licht wird mit einer Nachweiseinrichtung gemessen.In TIRF microscopy, that is, in internal total reflection fluorescence microscopy, excitation light is directed onto a sample to be examined and is totally reflected there. As a result, the sample is excited in a surface area and emits light, in particular fluorescent or phosphorescent light. The emitted light is measured with a detection device.
Das Anregungslicht wird in der Regel von Lasern erzeugt und kann verschiedene Wellenlängen aufweisen, die zur Anregung der Probe geeignet sind. Das Anregungslicht wird unter einem flachen Winkel auf den Objektträger geleitet, so dass es an der Grenze des Objektträgers zur Probe zur internen Totalreflexion kommt. Bei der Totalreflexion tritt eine sogenannte evaneszente Welle in die Probe ein, wobei das elektrische Feld der evaneszenten Welle exponentiell mit der Tiefe innerhalb der Probe abklingt. Hierdurch wird die Probe nur in einem dünnen Oberflächenbereich, der eine Dicke von etwa 50 nm bis 400 nm hat, zur Fluoreszenz angeregt. Diese Eindringtiefe hängt von der Wellenlänge des Anregungslichts sowie vom Einfallswinkel auf die Grenzfläche Objektträger/Probe ab. Das Anregungslicht wird mit demselben Objektiv, das auch zur Beobachtung des von der Probe emittierten Lichts benutzt wird, auf die Probe geleitet. Nach der Totalreflexion tritt das Anregungslicht wieder in das Objektiv ein und muss von dem von der Probe emittierten Licht getrennt werden.The excitation light is usually generated by lasers and can have different wavelengths that are suitable for excitation of the sample. The excitation light is directed onto the slide at a flat angle, so that total internal reflection occurs at the specimen border at the sample. In total reflection, a so-called evanescent wave enters the sample, the electrical field of the evanescent wave decaying exponentially with the depth within the sample. As a result, the sample is excited to fluoresce only in a thin surface area which has a thickness of approximately 50 nm to 400 nm. This penetration depth depends on the wavelength of the excitation light and on the angle of incidence on the slide / sample interface. The excitation light is directed onto the sample with the same objective that is also used to observe the light emitted by the sample. After total reflection, the excitation light re-enters the lens and must be separated from the light emitted by the sample.
Ein gattungsgemäßes Mikroskop weist ein Objektiv zum Leiten von Anregungslicht in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung sowie Mittel zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv in einem ersten Azimutalwinkel bezüglich der Objektivachse auf. Zudem ist mindestens eine Segmentblende zum Blockieren von von der Probe zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht vorhanden, die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs abdeckt und in einem definierten Azimutalwinkel bezüglich der Objektivachse ausgerichtet ist. Dieser definierte Azimutalwinkel wird auch als zweiter Azimutalwinkel bezeichnet.A generic microscope has a lens for guiding excitation light into a surface area of a sample to be examined and for guiding light emitted from the surface area of the sample, in particular fluorescent light, back towards a detection device and means for guiding the excitation light onto the lens at a first azimuth angle with respect to the lens axis. In addition, at least one segment aperture for blocking excitation light returning from the sample, in particular reflected, is present, which covers at least part of a circular sector of a cross section of an observation beam path of the objective and is oriented at a defined azimuthal angle with respect to the objective axis. This defined azimuth angle is also referred to as the second azimuth angle.
Der erste und zweite Azimutalwinkel liegen also in einer Ebene, die senkrecht zur Objektivachse orientiert ist. Sie werden bezüglich einer grundsätzlich beliebigen, aber gemeinsamen Position in dieser Ebene gemessen. Die Lage der Ebene entlang der Objektivachse ist nicht bedeutsam, da sich der erste Azimutalwinkel des auf die Probe zulaufenden Anregungslichts entlang der Objektivachse nicht ändert. Der erste Azimutalwinkel kann beispielsweise bezogen auf einen Mittelpunkt des Querschnitts des Anregungslichts gemessen oder angegeben werden. Der zweite Azimutalwinkel kann zum Beispiel bis zu einer oder bezogen auf eine Mitte des abgedeckten Teils des oben definierten Kreissektors gemessen oder angegeben werden.The first and second azimuthal angles therefore lie in a plane which is oriented perpendicular to the objective axis. They are measured with regard to a basically arbitrary but common position in this plane. The position of the plane along the lens axis is not important since the first azimuthal angle of the excitation light running towards the sample does not change along the lens axis. The first azimuthal angle can be measured or specified, for example, based on a center point of the cross section of the excitation light. The second azimuthal angle can, for example, be measured or indicated up to or in relation to a center of the covered part of the circle sector defined above.
Ein gattungsgemäßes Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop weist einen feststehenden Teil auf, der in einem in einem TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand feststehend ist.A generic lens for use in a TIRF microscope has a fixed part which is fixed in a state installed in a TIRF microscope.
Ein Mikroskop der oben genannten Art für die TIRF-Mikroskopie ist in
Weitere TIRF-Mikroskope sind aus
Ein Nachteil der farbselektiven Blenden ist, dass für das Anregungslicht nur ein eingeschränkter Spektralbereich blockiert werden kann. Für andere Spektralbereiche müsste die Blende gewechselt werden, was nur unter hohem Aufwand möglich ist. Als zusätzlicher Nachteil wird ein hoher Anteil des von der Probe emittierten Lichts, also des nachzuweisenden Lichts, an dem für das nachzuweisende Licht undurchlässigen Ringbereich der Blende blockiert.A disadvantage of the color-selective diaphragms is that only a restricted spectral range can be blocked for the excitation light. For other spectral ranges, the aperture would have to be changed, which is only possible with great effort. As an additional disadvantage, a high proportion of the light emitted by the sample, that is to say the light to be detected, is blocked in the ring area of the diaphragm which is impermeable to the light to be detected.
Weitere Mikroskope, die auch für die TIRF-Mikroskopie eingesetzt werden können, sind aus
Zudem sind TIRF-Schieber bekannt, über welche Anregungslicht in das Mikroskop eingekoppelt werden kann. Hierdurch kann ein gewöhnliches Mikroskop für die TIRF-Mikroskopie verwendet werden. Dabei durchläuft das von der Probe zurücklaufende Anregungslicht jedoch das komplette Objektiv bis zum TIRF-Schieber. Hierbei kann das zurücklaufende Anregungslicht auf dem gesamten Weg durch das Objektiv Falschlicht erzeugen.TIRF slides are also known, via which excitation light can be coupled into the microscope. As a result, an ordinary microscope can be used for TIRF microscopy. However, the excitation light returning from the sample passes through the entire lens up to the TIRF slider. Here, the returning excitation light can produce false light all the way through the lens.
Ein Objektiv, das zum Reduzieren von Fehlern der optischen Abbildung des Mikroskops in einem in das Mikroskop eingebauten Zustand drehbar ist, ist in
Für eine gute Bildqualität ist es ein grundlegendes Ziel, das Entstehen von Falschlicht durch das zurücklaufende Anregungslicht zu vermeiden. Unter Falschlicht soll hier dasjenige Licht verstanden werden, das zu einer Verfälschung des Bildeindrucks führt, indem es nicht aus dem Oberflächenbereich der Probe stammt, aber dennoch in das Okular des Mikroskops oder auf einen Kamerasensor des Mikroskops gelangt. Die Entstehung des Falschlichts kann in die folgenden drei Kategorien eingeteilt werden.For good image quality, it is a fundamental goal to prevent false light from being generated by the returning excitation light. False light is to be understood here as the light which leads to a falsification of the image impression, since it does not originate from the surface area of the sample, but nevertheless reaches the eyepiece of the microscope or a camera sensor of the microscope. The emergence of the false light can be divided into the following three categories.
Bei vielen Mikroskopen werden mit einem Strahlteiler das von der Probe emittierte Licht und das zurücklaufende Anregungslicht getrennt. Hierbei kann allerdings ein geringer Anteil des zurücklaufenden Anregungslichts den Strahlteiler passieren und so zu Falschlicht führen. Selbst wenn durch den Strahlteiler das zurücklaufende Anregungslicht um den sehr großen Faktor 1010 unterdrückt wird, führt dies noch zu einer Beeinträchtigung der Bildqualität. Diese Art von Falschlicht wird auch bei dem Prisma aus
Eine zweite Kategorie von Falschlicht kann dann auftreten, wenn das zurücklaufende Anregungslicht Optiken des Beobachtungssystems, wie zum Beispiel das Objektiv oder Adapterlinsen, durchläuft, bevor es durch beispielsweise einen Strahlteiler wegreflektiert wird. An diesen Optiken, insbesondere an Kittschichten an den Optiken, kann durch das zurücklaufende Anregungslicht parasitäres Fluoreszenzlicht angeregt werden. Dieses Fluoreszenzlicht kann zusammen mit dem von der Probe emittierten Licht einen farbselektiven Strahlteiler passieren und so als Falschlicht wahrgenommen werden. Diese Art von Falschlicht wird also durch die farbselektiven Blenden aus
Eine dritte Kategorie von Falschlicht entsteht dadurch, dass das zurücklaufende Anregungslicht an Grenzflächen im Objektiv reflektiert und auf die Probe zurückgeworfen werden kann. Dieses ungewollt zurückgeworfene Licht kann über die Oberflächenschicht hinaus tiefer in die Probe eindringen und dort Fluoreszenzlicht verursachen, welches als Falschlicht in den Beobachtungsstrahlengang gelangt. Das ist für TIRF-Mikroskopie, bei der durch Totalreflexion des Anregungslichts die Probe nur in einer Oberflächenschicht zur Fluoreszenz angeregt werden soll, unerwünscht. Das Risiko, das diese Art von Falschlicht entsteht, ist bei dem in
Besondere Bedeutung kommt dem Falschlicht insbesondere wegen der hohen Intensität des zurücklaufenden Anregungslichts zu. Während bei normaler Fluoreszenz-Mikroskopie reflektiertes Anregungslicht nur eine sehr geringe Intensität aufweist, hat bei der TIRF-Mikroskopie das zurücklaufende Anregungslicht aufgrund der Totalreflexion nahezu dieselbe Intensität wie das auf die Probe zulaufende Anregungslicht.The false light is particularly important because of the high intensity of the returning excitation light. While excitation light reflected in normal fluorescence microscopy has only a very low intensity, in TIRF microscopy the returning excitation light has almost the same intensity as the excitation light approaching the sample due to the total reflection.
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskop und ein Objektiv bereitzustellen, bei denen eine besonders gute Bildqualität erreichbar ist.It can be regarded as an object of the invention to provide a microscope and a lens in which particularly good image quality can be achieved.
Diese Aufgabe wird in einem ersten Aspekt durch das Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe durch das Objektiv mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst.This object is achieved in a first aspect by the microscope with the features of
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Mikroskops und des erfindungsgemäßen Objektivs sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren, beschrieben.Advantageous embodiments of the microscope according to the invention and the lens according to the invention are the subject of the dependent claims and are also described in the following description, in particular in connection with the figures.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop ist die Segmentblende im Objektiv integriert und eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel ist einstellbar.In the microscope according to the invention, the segment diaphragm is integrated in the objective and an angle difference between the first and the second azimuthal angle can be set.
Das Objektiv der oben genannten Art zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Segmentblende zum Blockieren von von einer Probe zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht vorhanden ist, dass die Segmentblende mindestens einen Teil eines Kreissektors einer Querschnittsfläche eines Beobachtungsstrahlengangs abdeckt, dass ein drehbarer Teil vorhanden ist, welcher in dem in ein TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand drehbar ist, und dass die Segmentblende mit dem drehbaren Teil mechanisch gekoppelt, insbesondere verbunden, ist.The objective of the type mentioned above for use in a TIRF microscope is characterized according to the invention in that there is at least one segment aperture for blocking excitation light returning, in particular reflected, from a sample, that the segment aperture covers at least part of a circular sector of a cross-sectional area of an observation beam path that there is a rotatable part which is rotatable in the state installed in a TIRF microscope, and that the segment diaphragm is mechanically coupled, in particular connected, to the rotatable part.
Als wesentliche Idee der Erfindung kann erachtet werden, die Segmentblende möglichst nah an der Probe anzuordnen, so dass nur wenige optische Elemente, wie zum Beispiel die Linsen eines Objektivs, vom zurücklaufenden Anregungslicht durchquert werden. Das zurücklaufende Licht durchquert also nicht alle Linsen des Objektivs. Dadurch wird vorteilhafterweise das Risiko reduziert, das parasitäres Fluoreszenzlicht an den optischen Elementen oder an Kittschichten der optischen Elemente erzeugt wird. Zudem trifft das zurücklaufende Anregungslicht so an weniger Grenzflächen, beispielsweise der optischen Elemente, an denen es zurück zur Probe geworfen werden kann und dort eine Fluoreszenzanregung bewirkt.An essential idea of the invention can be considered to arrange the segment diaphragm as close as possible to the sample, so that only a few optical elements, such as the lenses of a lens, are traversed by the returning excitation light. The returning light does not cross all lenses of the lens. This advantageously reduces the risk that parasitic fluorescent light is generated on the optical elements or on kit layers of the optical elements. In addition, the returning excitation light strikes at fewer interfaces, for example the optical elements, at which it can be thrown back to the sample and causes fluorescence excitation there.
Als ein Kerngedanke der Erfindung kann angesehen werden, dass nur ein möglichst geringer Teil eines Querschnitts des Beobachtungsstrahlengangs abgedeckt wird. Somit kann das von der Probe emittierte Licht fast vollständig das Objektiv durchlaufen. Die Segmentblende braucht also nicht einen vergleichsweise großen Ring des Querschnitts des Beobachtungsstrahlengangs abzudecken, wie dies beispielsweise bei farbselektiven Ringblenden der Fall ist, sondern nur einen Teil eines Kreissektors.A key concept of the invention can be seen in that only as small a part of a cross section of the observation beam path as possible is covered. Thus, the light emitted by the sample can pass through the lens almost completely. The segment diaphragm therefore does not need to cover a comparatively large ring of the cross section of the observation beam path, as is the case, for example, with color-selective ring diaphragms, but only part of a circle sector.
Dabei muss sichergestellt sein, dass das zurücklaufende Anregungslicht die Segmentblende auch trifft. Als wesentliche Idee der Erfindung hierzu kann erachtet werden, dass die relative Orientierung zwischen dem Anregungslicht und der Segmentblende eingestellt werden kann. Entscheidend ist hierbei die Orientierung in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse, also der Azimutwinkel bezüglich der Objektivachse zwischen dem Anregungslicht und der Segmentblende. Das zurücklaufende Anregungslicht trifft genau dann auf die Segmentblende, wenn das auf die Probe zulaufende Anregungslicht in einer Azimutalwinkeldifferenz von 180° zu der Segmentblende ausgerichtet ist.It must be ensured that the returning excitation light also hits the segment aperture. It can be regarded as an essential idea of the invention that the relative orientation between the excitation light and the segment diaphragm can be set. The decisive factor here is the orientation in a plane perpendicular to the lens axis, ie the azimuth angle with respect to the lens axis between the excitation light and the segment aperture. The returning excitation light strikes the segment aperture precisely when the excitation light approaching the sample is aligned in an azimuthal angle difference of 180 ° to the segment aperture.
Dieser Versatz zwischen dem auf die Probe zulaufenden Anregungslicht und der Segmentblende kann durch die Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel angegeben werden. Der erste Azimutalwinkel gibt die Orientierung des Anregungslichts in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse an. Da bei der TIRF-Mikroskopie das Anregungslicht nicht windschief zur Objektivachse auf das Objektiv geleitet wird, kann der erste Azimutalwinkel an einer beliebigen Stelle entlang der Objektivachse bestimmt werden. Indem die Winkeldifferenz zwischen dem ersten und zweiten Azimutalwinkel einstellbar ist, wird vorteilhafterweise sichergestellt, dass das zurücklaufende Anregungslicht immer von der Segmentblende blockiert werden kann.This offset between the excitation light approaching the sample and the segment diaphragm can be specified by the angle difference between the first and the second azimuthal angle. The first azimuthal angle indicates the orientation of the excitation light in a plane perpendicular to the lens axis. Since in TIRF microscopy the excitation light is not directed skew to the lens axis on the lens, the first azimuth angle can be determined at any point along the lens axis. The fact that the angle difference between the first and second azimuthal angles can be set advantageously ensures that the returning excitation light can always be blocked by the segment diaphragm.
Die Einstellbarkeit der Winkeldifferenz ist auch deshalb von Bedeutung, weil es nur unter hohem Aufwand möglich ist, Objektive und deren Aufnahmen in Objektivrevolvern so zu fertigen, dass ein Objektiv beim Einbau in den Objektivrevolver eine vordefinierte Drehstellung besitzt. Unter Einstellbarkeit soll deshalb ein Verändern während oder vor dem Betrieb des Mikroskops verstanden werden, insbesondere durch einen Benutzer. Hierzu sind mechanische Mittel vorhanden, die insbesondere von einem Benutzer manuell und/oder über eine motorisierte Steuereinrichtung bedient werden können.The adjustability of the angle difference is also important because it is only possible with great effort to manufacture lenses and their exposures in nosepiece so that a lens has a predefined rotational position when installed in the nosepiece. Under adjustability is therefore a change during or before the operation of the microscope can be understood, in particular by a user. For this purpose, mechanical means are available, which can be operated manually and / or by a motorized control device, in particular by a user.
Schließlich erlaubt es die Einstellbarkeit der Winkeldifferenz auch, dass das zurücklaufende Anregungslicht zu Justierzwecken hindurchgelassen werden kann und eine Nachweiseinrichtung erreicht. Dies ist hingegen nicht in einfacher Weise bei den bekannten TIRF-Mikroskopen möglich, bei denen beispielsweise in einem Modul eine Segmentblende feststehend zu einem Prisma zum Einkoppeln des Anregungslichts montiert ist, oder eine ringförmige farbselektive Blende vorhanden ist.Finally, the adjustability of the angle difference also allows the returning excitation light to be let through for adjustment purposes and to reach a detection device. However, this is not possible in a simple manner in the known TIRF microscopes, in which, for example, a segment diaphragm is fixed in a module to form a prism for coupling the excitation light, or an annular, color-selective diaphragm is present.
Insbesondere kann erfindungsgemäß die Segmentblende das zurücklaufende Anregungslicht durch Absorption blockieren. Gegenüber farbselektiven Blenden oder Prismen zum Abführen des zurücklaufenden Anregungslichts wird dann im Normalbetrieb vorteilhafterweise bewirkt, dass praktisch gar kein zurücklaufendes Anregungslicht die Nachweiseinrichtung trifft. Zudem wird wellenlängenunabhängig ein Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts erreicht.In particular, according to the invention, the segment diaphragm can block the returning excitation light by absorption. Compared to color-selective diaphragms or prisms for removing the returning excitation light, it is then advantageously achieved in normal operation that practically no returning excitation light hits the detection device. In addition, the returning excitation light is blocked regardless of the wavelength.
Da gemäß der Erfindung die azimutale Winkeldifferenz, also die relative Drehposition, zwischen der Segmentblende und dem Anregungslicht frei eingestellt werden kann, können die Segmentblende und die Mittel zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv unabhängig voneinander gebildet sein. Somit können die Mittel zum Leiten des Anregungslichts außerhalb des Objektivs angeordnet sein, wobei das auf die Probe zulaufende Anregungslicht alle Linsen des Objektivs durchläuft. Vorteilhafterweise wird so der Herstellungsaufwand des Objektivs vergleichsweise gering gehalten.Since, according to the invention, the azimuthal angle difference, that is to say the relative rotational position, between the segment diaphragm and the excitation light can be set freely, the segment diaphragm and the means for directing the excitation light onto the objective can be formed independently of one another. Thus, the means for guiding the excitation light can be arranged outside the objective, the excitation light approaching the sample passing through all lenses of the objective. Advantageously, the manufacturing effort for the lens is kept comparatively low.
Ein wesentlicher Gedanke des erfindungsgemäßen Objektivs kann darin gesehen werden, dass die Segmentblende drehbar zu einem feststehenden Objektivteil und somit im eingebauten Zustand auch drehbar zu dem Anregungslicht ist. Dadurch kann bewerkstelligt werden, dass die Segmentblende immer von dem zurücklaufenden Anregungslicht getroffen wird. Vorteilhafterweise sind dazu keine aufwendigeren Einrichtungen am Mikroskop zum Lenken des Anregungslichts auf das Objektiv notwendig.An essential idea of the objective according to the invention can be seen in the fact that the segment diaphragm can be rotated to a fixed objective part and thus also rotatable to the excitation light in the installed state. This allows the segment aperture to always be hit by the returning excitation light. Advantageously, no more complex devices on the microscope for directing the excitation light onto the objective are necessary.
Bei einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel die Segmentblende relativ zu einem feststehenden Teil des Objektivs drehbar. Hierbei wird also die Winkeldifferenz durch eine Veränderung des zweiten Azimutalwinkels eingestellt. Somit ist nicht erforderlich, dass auch der erste Azimutalwinkel einstellbar ist. Vorteilhafterweise können somit die Mittel zum Leiten des Anregungslichts vergleichsweise einfach, beispielsweise durch einen TIRF-Schieber, ausgeführt sein. Der feststehende Teil des Objektivs kann das Gewinde, mit dem das Objektiv im Mikroskop befestigt wird, umfassen. Bevorzugt ist der feststehende Teil des Objektivs eine Außenhülse. Vorzugsweise ist die Segmentblende mit einem drehbaren Teil des Objektivs, wie zum Beispiel einer Innenhülse, verbunden, der von einem Benutzer manuell oder über eine motorisierte Steuereinrichtung gedreht werden kann. In a preferred embodiment of the microscope according to the invention, the segment diaphragm can be rotated relative to a fixed part of the objective in order to set the angle difference between the first and the second azimuthal angle. Here, the angle difference is set by changing the second azimuthal angle. It is therefore not necessary that the first azimuth angle can also be set. Advantageously, the means for guiding the excitation light can thus be comparatively simple, for example by means of a TIRF slide. The fixed part of the objective can encompass the thread with which the objective is attached in the microscope. The fixed part of the objective is preferably an outer sleeve. The segment diaphragm is preferably connected to a rotatable part of the objective, such as an inner sleeve, which can be rotated by a user manually or via a motorized control device.
Alternativ oder zusätzlich kann bei einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops aber auch vorgesehen sein, dass zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel der erste Azimutalwinkel mit den Mitteln zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv veränderbar ist. Hier ist also das Anregungslicht frei in der Objektivpupille einstellbar. Somit kann hier die Segmentblende feststehend zum Rest des Objektivs ausgeführt sein.As an alternative or in addition, in a further variant of the microscope according to the invention it can also be provided that the first azimuth angle can be changed with the means for directing the excitation light onto the objective in order to set the angle difference between the first and the second azimuth angle. Here, the excitation light can be freely adjusted in the objective pupil. Thus, the segment diaphragm can be designed to be fixed to the rest of the lens.
Bei einer vorteilhaften Alternative des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs ist die Segmentblende zwischen einer Objektivpupille und einer der Probe zugewandten Frontlinse angeordnet. Dadurch wird vom zurücklaufenden Anregungslicht nur eine geringe Anzahl optischer Elemente durchlaufen, an denen es durch parasitäre Fluoreszenzanregung zu Falschlicht kommen kann. Zudem wird das Risiko verringert, dass das zurücklaufende Licht an einem optischen Element teilweise zurückgeworfen wird und in der Probe erneut eine Fluoreszenzanregung bewirkt.In an advantageous alternative of the microscope according to the invention or the objective according to the invention, the segment diaphragm is arranged between an objective pupil and a front lens facing the sample. As a result, the returning excitation light passes through only a small number of optical elements, on which false light can occur due to parasitic fluorescence excitation. In addition, the risk is reduced that the returning light is partially reflected on an optical element and again causes fluorescence excitation in the sample.
Besonders bevorzugt ist bei einer Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs die Segmentblende in einem für das von der Probe emittierte Licht divergenten Teil des Beobachtungsstrahlengangs angeordnet. Das heißt, die Segmentblende ist nahe an der Frontlinse, oder zumindest näher an der Frontlinse als an der Objektivpupille, angeordnet. Hierbei kann auch vorgesehen sein, dass die Segmentblende benachbart zu einer der drei zur Probe nächsten Linsen des Objektivs angeordnet ist. Das zurücklaufende Anregungslicht wird also besonders früh blockiert, wodurch das Entstehen von parasitärem Falschlicht an Linsen oder an einem Kitt an einer Linse weitestgehend vermieden wird. Zudem wird das Risiko einer Rückreflexion des zurücklaufenden Anregungslichts hin zur Probe verringert.In an embodiment of the microscope according to the invention or the objective according to the invention, the segment diaphragm is particularly preferably arranged in a part of the observation beam path which is divergent for the light emitted by the sample. This means that the segment diaphragm is arranged close to the front lens, or at least closer to the front lens than to the objective pupil. It can also be provided here that the segment diaphragm is arranged adjacent to one of the three lenses of the objective closest to the sample. The returning excitation light is thus blocked particularly early, as a result of which parasitic false light on lenses or on a putty on a lens is largely avoided. In addition, the risk of back reflection of the returning excitation light towards the sample is reduced.
Bei einer ebenfalls bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs weist das Objektiv mehrere Linsen auf und die Segmentblende ist benachbart zu einer Linse angeordnet, die sich direkt benachbart zur Objektivpupille befindet. Dabei soll die Eigenschaft „benachbart“ verstanden werden als „in Richtung der Objektivachse“ benachbart. In der Ebene der Objektivpupille ist das Anregungslicht fokussiert, damit es als paralleles Strahlenbündel auf die Probe trifft. Daher ist in der Nähe der Objektivpupille die Querschnittsfläche des Anregungslichts relativ klein. Vorteilhafterweise kann die Segmentblende hier besonders klein ausgeführt sein, wodurch sie nur wenig von der Probe emittiertes Licht blockiert. Da der Probenort und die Objektivpupille zueinander Fourier-konjugiert sind, wird bei einer Positionierung der Segmentblende in der Nähe der Objektivpupille das Sichtfeld des Mikroskops vorteilhafterweise weniger verringert.In a likewise preferred embodiment of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, the objective has a plurality of lenses and the segment diaphragm is arranged adjacent to a lens which is located directly is located adjacent to the objective pupil. The property “adjacent” should be understood as “adjacent in the direction of the lens axis”. The excitation light is focused in the plane of the objective pupil so that it hits the sample as a parallel beam. Therefore, the cross-sectional area of the excitation light is relatively small in the vicinity of the objective pupil. Advantageously, the segment diaphragm can be made particularly small here, as a result of which it blocks only a little light emitted by the sample. Since the sample location and the objective pupil are Fourier-conjugated to one another, the field of view of the microscope is advantageously reduced less when the segment diaphragm is positioned in the vicinity of the objective pupil.
Erfindungsgemäß weist die Segmentblende einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase auf. Dabei wird das zurücklaufende Anregungslicht von der Nase blockiert, während der Ring bevorzugt außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs liegt. Unter Beobachtungsstrahlengang soll der Strahlengang des von der Probe emittierten Lichts verstanden werden.According to the invention, the segment diaphragm has a ring with an inwardly directed nose. The returning excitation light is blocked by the nose, while the ring is preferably outside the observation beam path. The observation beam path is to be understood as the beam path of the light emitted by the sample.
Bevorzugt ist eine Ausdehnung der Nase nach innen gerade so groß, dass das zurücklaufende Anregungslicht blockiert werden kann.An inward extension of the nose is preferably just large enough that the returning excitation light can be blocked.
Zweckmäßigerweise ist bei einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs an einer Außenseite des Objektivs eine Markierung vorhanden, die den zweiten Azimutalwinkel anzeigt. Somit kann ein Benutzer in einfacher Weise die richtige Orientierung der Segmentblende, in der diese das zurücklaufende Anregungslicht blockiert, einstellen. Dabei ist die Markierung vorzugsweise an dem drehbaren Teil oder an einem Angriffsstück, mit dem der drehbare Teil gedreht werden kann, angebracht. Es ist außerdem bevorzugt, dass bei mehreren Segmentblenden für jede Segmentblende eine Markierung vorhanden ist.In an advantageous variant of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, a marking is expediently present on an outside of the objective, which indicates the second azimuthal angle. Thus, a user can easily set the correct orientation of the segment aperture in which it blocks the returning excitation light. The marking is preferably attached to the rotatable part or to an engagement piece with which the rotatable part can be rotated. It is also preferred that there is a marking for each segment aperture when there are several segment apertures.
Bei einer weiteren Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops weist die Nachweiseinrichtung einen Kamerasensor mit einem rechteckigen Sehfeld zum Messen des von der Probe emittierten Lichts auf und die Segmentblende ist benachbart zu einer Seite des Sehfelds, insbesondere zu einer langen Seite des Sehfelds, angeordnet. Vorteilhafterweise kann sich somit die Segmentblende in einem Bereich befinden, der vom Kamerasensor nicht erfasst wird. In diesem Fall reduziert die Segmentblende nicht die Intensität des von der Probe emittierten und auf den Kamerasensor fallenden Lichts. Hier ist die Segmentblende also gerade nicht benachbart zu einer Ecke des Sehfelds des Kamerasensors angeordnet.In a further embodiment variant of the microscope according to the invention, the detection device has a camera sensor with a rectangular field of view for measuring the light emitted by the sample, and the segment diaphragm is arranged adjacent to one side of the field of view, in particular to a long side of the field of view. The segment diaphragm can thus advantageously be located in an area that is not detected by the camera sensor. In this case, the segment aperture does not reduce the intensity of the light emitted by the sample and falling on the camera sensor. Here, the segment diaphragm is therefore not arranged adjacent to a corner of the field of view of the camera sensor.
Bei einem vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs sind mehrere, insbesondere zwei, Segmentblenden vorhanden, die in verschiedenen Positionen entlang der Objektivachse und in verschiedenen zweiten Azimutalwinkeln bezüglich der Objektivachse angeordnet sind. Die Segmentblenden liegen also in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse versetzt zueinander, so dass ausgewählt werden kann, welche Segmentblende das zurücklaufende Anregungslicht blockiert.In an advantageous embodiment of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, several, in particular two, segment diaphragms are provided, which are arranged in different positions along the objective axis and in different second azimuthal angles with respect to the objective axis. The segment diaphragms are thus offset from one another in a plane perpendicular to the lens axis, so that it can be selected which segment diaphragm blocks the returning excitation light.
Sind mehrere Segmentblenden vorhanden, sind diese bevorzugt gemeinsam und relativ zu einem feststehenden Teil des Objektivs drehbar. Somit kann in besonders einfacher Weise die gewünschte Segmentblende ausgewählt werden. Dabei kann eine der Segmentblenden im Bereich der Objektivpupille und eine andere der Segmentblenden nahe zur Frontlinse des Objektivs angeordnet sein.If there are several segment diaphragms, these are preferably rotatable together and relative to a fixed part of the objective. The desired segment aperture can thus be selected in a particularly simple manner. One of the segment diaphragms can be arranged in the region of the objective pupil and another of the segment diaphragms can be arranged close to the front lens of the objective.
Ein besonders hoher Benutzerkomfort wird erreicht, wenn ein Motor zum Drehen der Segmentblenden vorhanden ist. Hierbei kann vorgesehen sein, dass der Motor die Segmentblende automatisch in eine Position bewegen kann, in der das zurücklaufende Licht blockiert wird.A particularly high level of user comfort is achieved if there is a motor for rotating the segment diaphragms. It can be provided here that the motor can automatically move the segment diaphragm into a position in which the returning light is blocked.
In einer weiteren Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs ist die Segmentblende als eine Beschichtung der Linse des Objektivs oder einer im Objektiv angeordneten Glasplatte ausgebildet.In a further embodiment variant of the microscope according to the invention or of the objective according to the invention, the segment diaphragm is designed as a coating of the lens of the objective or of a glass plate arranged in the objective.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben. Hierin zeigen:
-
1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops; -
2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Objektivs; -
3 eine schematische Darstellung eines Sichtfelds eines erfindungsgemäßen Mikroskops; -
4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Segmentblende; -
5 eine Schrägansicht des Ausführungsbeispiels der Segmentblende; -
6 eine schematische Darstellung von zwei Segmentblenden; und -
7 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Objektivs.
-
1 a schematic representation of an embodiment of a microscope according to the invention; -
2nd a schematic representation of a first embodiment of an objective according to the invention; -
3rd a schematic representation of a field of view of a microscope according to the invention; -
4th a schematic representation of an embodiment of a segment diaphragm; -
5 an oblique view of the embodiment of the segment diaphragm; -
6 a schematic representation of two segment diaphragms; and -
7 is a schematic representation of a second embodiment of an objective according to the invention.
Äquivalente Komponenten sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet. Equivalent components are identified with the same reference symbols in all figures.
Hierbei wird Anregungslicht
Als Anregungslicht
Das Mikroskop
Das Anregungslicht
Das an der Grenzfläche
Der Verlauf des Anregungslichts
Hierbei durchläuft das Anregungslicht
Da durch das Anregungslicht
Eine weitere Segmentblende
Im dargestellten Beispiel befindet sich die Segmentblende
Die Segmentblenden
Die Größe der Segmentblende
In
Ein erstes Ausführungsbeispiel einer Segmentblende
Dabei umfasst die Segmentblende
Eine Segmentblende
In
In
Die Segmentblenden
Indem die beiden Segmentblenden
Um die Drehposition der Segmentblenden
Mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Mikroskop und dem erfindungsgemäßen Objektiv wird das bei der TIRF-Mikroskopie zurücklaufende Anregungslicht derart blockiert, dass durch das zurücklaufende Anregungslicht besonders wenig Falschlicht entsteht und dass möglichst wenig von der Probe emittiertes Licht blockiert wird. So wird eine besonders hohe Bildqualität ermöglicht.With the microscope according to the invention and the objective according to the invention described above, the excitation light returning in TIRF microscopy is blocked in such a way that the returning excitation light produces particularly little false light and that as little light as possible emitted by the sample is blocked. This enables a particularly high image quality.
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